JP4667571B2

JP4667571B2 - レーザ走査顕微鏡

Info

Publication number: JP4667571B2
Application number: JP2000280886A
Authority: JP
Inventors: 泰生大平; 佳弘島田
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1999-09-24
Filing date: 2000-09-14
Publication date: 2011-04-13
Anticipated expiration: 2020-09-14
Also published as: JP2001159734A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、レーザ走査顕微鏡において、パルスレーザを励起光源として用いたときの、蛍光信号のサンプリング機構に関する。
【０００２】
【従来の技術】
レーザ走査顕微鏡の概要は、例えば外国文献"HANDBOOK OF BIOLOGICAL CONFOCAL MICROSCOPY" (J. Pawley編、PLENUM PRESS, 1990)に記述されている。一般に、レーザ走査顕微鏡は、図５に示すように、レーザ光を発振する光源１と光源１からのレーザ光と後述するサンプル９からの光を分離するハーフミラー３と、レーザ光をＸ、Ｙ方向に走査するガルバノミラー５と、レーザ光をサンプル９に照射する対物レンズ７と、サンプル９からの光から散乱光等を除去して焦点位置だけの光を抽出するピンホール９と、ピンホール９を介した光を受光する受光素子１１と、受光素子１１にて光電変換された電気信号を供給する画像処理装置１５とから構成される。画像処理部１５は、独立した発振器などにより任意に定めたサンプリングクロックにより、デジタル信号に変換し、デジタル信号は図示しないラインメモリに記憶して、レーザ光の走査に同期した画像処理を行ないモニタディスプレイ１７上に表示している。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
サンプルにレーザを照射してサンプルからの蛍光を検出するレーザ走査顕微鏡は一般的には、ヘリウムネオンレーザのような連続発振型のレーザが用いられる。しかしながら、近年、研究対象となるサンプルの多様化からさまざまな波長のレーザが使用されるようになった。これらのレーザの中には、発振モード間の競合による平均出力の変動を抑えるために、Ｑスイッチやモード同期法によりパルス発振させるものも多い。
【０００４】
さらに、極めて高い光子密度で光をサンプルに照射して、サンプルからの多光子蛍光を検出するために、その光源としてモード同期超短パルスレーザがレーザ走査顕微鏡に利用されるようになった。これらパルスレーザを励起光源として用いると、サンプルからの蛍光信号は時間とともに減衰する信号となる。
【０００５】
このときレーザ光のパルス（以下、レーザパルスと称する。）とサンプリングパルスとは、一般的に同期していないため、必ずしも蛍光のピークをサンプリングするとは限らない。このため、得られている蛍光光量に対応した画像を生成することができないため、画像が暗くなるといった不具合が考えられる。特に、多光子過程における蛍光の発生率は低く、レーザパルスとサンプリングパルスが同期していないために、蛍光信号を効率良くサンプリングすることが困難であるといった不具合も考えられる。
【０００６】
本発明の目的は、パルスレーザ励起を用いたレーザ走査顕微鏡において、蛍光信号をそのピークを含めて確実にサンプリングすることのできるレーザ走査顕微鏡を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
請求項１記載のレーザ走査顕微鏡は、サンプルを励起させるパルスレーザを発振するパルスレーザ発振手段と、前記サンプルからの光を検出し、電気信号を出力する光検出部とを備えたレーザ走査顕微鏡において、前記光検出部からの電気信号を前記パルスレーザ発信手段からのパルスレーザの発振に同期してサンプリングするサンプリング手段と、前記サンプリング手段からのデータを蓄積するメモリ部とを備えたことを特徴とする。
【０００８】
請求項２記載のレーザ走査顕微鏡は、前記パルスレーザ発振手段からのパルスレーザの発振を検知し、前記パルスレーザの発振に同期した同期信号を出力する同期信号発生手段を備え、前記同期信号発生手段からの同期信号に同期して、前記サンプリング手段で前記光検出手段からの電気信号をサンプリングすることを特徴とする。
【０００９】
請求項３記載のレーザ走査顕微鏡の同期信号発生手段は、同期信号を任意の時間遅延させるトリガ信号を出力する遅延回路部を有し、前記遅延回路部で遅延させた同期信号に同期して前記光検出部からの電気信号をサンプリングすることを特徴とする。
【００１０】
請求項４記載のレーザ走査顕微鏡は、前記遅延回路部で遅延させた同期信号に同期してパルス信号を発振制御可能なパルス発生器を備え、前記パルス発生器からのパルス信号に応じたサンプリングを行うことを特徴とする。
【００１１】
請求項１記載のレーザ走査顕微鏡によれば、サンプリング手段で光検出部からの電気信号をパルスレーザ発信手段からのパルスレーザの発振に同期してサンプリングさせ、サンプリング手段からのデータをメモリ部に蓄積するようにしたので、パルスレーザの発振のタイミングとサンプリングのタイミングを一致させることができ、サンプルからの光のを確実にサンプリングできる。
【００１２】
請求項２記載のレーザ走査顕微鏡によれば、同期信号発生手段でパルスレーザ発信手段からのパルスレーザの発振を検知し、パルスレーザの発振に同期した同期信号を出力するようにしたので、同期信号発生手段からの同期信号に同期して、サンプリング手段で光検出部からの電気信号をサンプリングすることができる。
【００１３】
請求項３記載のレーザ走査顕微鏡によれば、遅延回路部を同期信号発生手段に設けたので、同期信号を任意の時間遅延させるトリガ信号を出力できるので、遅延回路部で遅延させた同期信号に同期して光検出部からの電気信号をサンプリングすることができる。
【００１４】
請求項４記載のレーザ走査顕微鏡によれば、パルス発生器により遅延回路部で遅延させた同期信号に同期してパルス信号を発振制御可能にしたので、パルス発生器からのパルス信号に応じたサンプリングを行うことができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
【００１６】
［第１の実施の形態］
図１はレーザ走査顕微鏡のサンプリング機構に関するシステムブロック図である。図１に示すサンプリング機構は、サンプル励起用パルスレーザ光（以下、レーザ光と称する。）を発するパルスレーザ装置（以下、レーザ装置と称する。）２１と、レーザ装置２１からのレーザ光をサンプル２３に照射することにより発せられたサンプル２３からの蛍光を光電変換するフォトディテクタあるいはフォトマルチプライヤ等で構成される光電変換部２５と、光電変換部２５からのアナログ信号をデジタル信号に変換し、且つ光電変換部２５からの信号をレーザ装置２１からのレーザ発振に同期してサンプリングを行える機能を備えたＡ／Ｄ変換部２７（サンプリング手段）と、Ａ／Ｄ変換部２７からのデジタル信号を記憶するメモリ２９と、メモリ２９から取り出したデジタルデータ画像（共焦点画像）を表示する画像表示手段３１と、Ａ／Ｄ変換部２７にサンプリングのためのクロック信号を供給するサンプリング制御部（同期信号発生手段）３３とで構成される。ここで、サンプリング制御部３３は、レーザ発振同期信号発生回路部３５と遅延回路部３７を有する。レーザ発振同期信号発生回路部３５は、レーザ装置２１からのレーザ発振を検出する検出部３６を有する。検出部３６は、例えばレーザ装置２１からレーザ発振と同期した電気信号として出力されるトリガ出力信号、あるいはレーザ光の一部を例えばフォトディテクタやフォトマルチプライヤなどにより光電変換した電気信号を用いてレーザ装置２１の発振を検出し、レーザ発振信号を出力する。レーザ発振同期信号発生回路部３５は検出部３６により検出されたレーザ発振信号に応答してレーザ発振同期信号を遅延回路部３７にレーザ発振同期信号を出力する。遅延回路部３７はレーザ発振同期信号発生回路部３５から出力されたレーザ発振同期信号を、外部入力回路３９から与えられた遅延時間（Δｔ１）だけ遅延させトリガ信号とし、トリガ信号はサンプリングクロックとしてＡ／Ｄ変換部２７に入力される。
【００１７】
上述のように構成されたこの発明の一実施形態の動作について図１および図２を参照して説明する。
【００１８】
図１において、レーザ装置２１は、図２（ａ）に示すパルスレーザがサンプル２３に対して発振されるとともに、レーザ装置２１からのレーザ発振に同期した電気信号をサンプリング制御部３３のレーザ発振同期信号発生回路部３５に出力する。レーザ発振同期信号発生回路部３５は検出部３６によりこのレーザ光のレーザ発振信号を検出し、図２（ｃ）に示すようなレーザ発振同期信号を生成し、遅延回路部３７に出力する。レーザ装置２１からのレーザ光はサンプル２３に照射され、図２（ｂ）に示すような蛍光信号が光電変換部２５に入力され、電気信号に変換される。
【００１９】
一方、遅延回路部３７は、入力されたレーザ発振同期信号を外部入力回路３９を介して与えられた遅延時間（Δｔ１）だけ遅延し、図２（ｄ）に示すトリガ信号３８をＡ／Ｄ変換部２７に出力する。Ａ／Ｄ変換部２７は、このトリガ信号をサンプリングクロックとして用いて、光電変換部２５からの電気信号（アナログ信号）をデジタル信号に変換する。このとき、図２（ｂ）に示す蛍光信号のピークと、図２（ｄ）に示すサンプリングタイミングを一致させることで、蛍光信号のピークをサンプリングすることができる遅延時間（Δｔ１）は、光電変換後の蛍光信号とトリガ信号を時間的に比較し、蛍光のピークとトリガ信号のタイミングを一致させるか、もしくは画像が最も明るくなるように、外部入力回路３９を用いて適宜調節することができる。Ａ／Ｄ変換部２７は、図２（ｅ）に示すようなサンプリングデータをメモリ２９に出力する。画像表示部３１は、一般的なレーザ走査顕微鏡と同様に、メモリ２９に記憶されたデータをリードするための制御信号をメモリ２９に出力し、メモリ２９に記憶されているサンプリングデータ（デジタルデータ）とアドレスを読み出し、レーザ光の走査位置に同期させて画面に表示する。
【００２０】
以上のように、トリガ信号をサンプリングクロックとして用いることにより、蛍光信号のピークのタイミングとサンプリングのタイミングを一致させることができ、蛍光信号のピークを確実にサンプリングできるようになる。
【００２１】
また、蛍光信号のピークを確実にサンプリングすることで、レーザパルスに同期させていないときに比べ、画像を明るくすることが可能となる。
【００２２】
さらに、蛍光発生の頻度が低く、必ずしもレーザパルス発生毎に蛍光信号が発生していなくても、レーザ発振に同期してサンプリングすることで、蛍光信号を効率よく取得することができる。
【００２３】
次に、この発明の第２の実施の形態について図３および図４を参照して説明する。なお、図３において、図１と同一部は同符号を付してその説明を省略する。
【００２４】
この実施の形態においては、Ａ／Ｄ変換部２７のサンプリングクロックとして、パルス発生器４５のパルス信号を用いる。パルス発生器４５は、遅延回路３７から出力されるトリガ信号３８に同期して図４（ｅ）に示すパルス信号を発生する。このパルスの繰り返し周波数ｆｐと出力時間（Δｔ２）は、外部入力回路３９により任意に設定可能である。すなわち、Ａ／Ｄ変換部２７では、遅延回路３７からのトリガ信号をサンプリングクロックとして用いてサンプリングするとともに、出力時間（Δｔ２）（図４（ｅ））の間のみ、サンプリングを行う。従って、トリガ信号を遅延回路部３７の遅延時間（Δｔ１）とパルス発生器４５のパルスの出力時間（Δｔ２）を調節することで、時間とともに減衰する蛍光信号の経時変化を、ピークを含めて確実にサンプリングすることができる。また、蛍光信号が発生していないところでは、サンプリングを行わないようにタイミング調節が可能である。例えば、２光子過程を用いたレーザ走査顕微鏡に上述した構成を用いる場合、２光子過程では、パルス幅１００［ｆｓ］のパルス繰り返し周波数８０［ＭＨｚ］のレーザ光が使用されるので、レーザ光のパルスが１回繰り返し中に１００回のサンプリングを行うとすれば、パルスの出力時間（Δｔ２）を１０［ｎｓ］以下、パルス発生器４５のパルス信号に１０［ＧＨｚ］程度に設定すれば適用できる。
【００２５】
このことにより、蛍光信号のピークを確実にサンプリングすることで、レーザ光のパルスに同期させていない場合に取得した画像にくらべ、更に明るくすることができる。また、蛍光の頻度が低くても必ずしもレーザパルスの発生ごとに蛍光信号が発生するとは限らない。このような場合にも、レーザ発振に同期してサンプリングし続けることで、効率よく蛍光信号を取得できる。また、蛍光信号のピークを含めて確実にサンプリングしてメモリ２９に格納しているため、デジタルデータから、例えば蛍光信号のデジタル積算、最大値の解析、蛍光信号の時定数の解析などの、デジタル処理を行うことが可能となる。また、蛍光信号の発生していない不要な部分のサンプリングを行わないことで、メモリを有効に使うことができる。
【００２６】
また、本発明は上述した実施の形態に限られるものではなく、発明の主旨を逸脱しない範囲で種々変更は可能であり、例えば遅延回路を介在させることなく、レーザ装置からのレーザ発振に同期して蛍光信号をサンプリングするようにしてもよい。また、光電変換部から発せられる蛍光信号を同期信号として用いることでサンプルから蛍光が発せられたタイミングに同期して蛍光信号をサンプリングしてもよい。なお、本発明のレーザ装置としては２光子励起用のモード同期超短パルスレーザであっても良いし、１光子励起用のパルスレーザでも良い。
【００２７】
【発明の効果】
この発明によれば、パルスレーザ励起を用いたマルチフォトンレーザ走査顕微鏡において、蛍光信号をそのピークを含めて確実にサンプリングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明のレーザ走査顕微鏡の一実施形態を示すブロック図。
【図２】図１に示すレーザ走査顕微鏡のタイミングチャートを示す図。
【図３】この発明のレーザ走査顕微鏡の他の実施形態を示すブロック図。
【図４】図３に示すレーザ走査顕微鏡の他の実施形態のタイミングチャートを示す図。
【図５】従来技術によるレーザ走査顕微鏡のシステムブロック図。
【符号の説明】
２３…サンプル
２５…光電変換部
２７…Ａ／Ｄ変換部
２９…メモリ
３１…画像表示部
３３…サンプリング制御部
３５…検出部
３７…遅延回路
３９…外部入力回路
４１…制御信号
４３…データ
４５…パルス発生器

Claims

サンプルを励起させるパルスレーザを発振するパルスレーザ発振手段と、
前記サンプルからの光を検出し、電気信号を出力する光検出部とを備えたレーザ走査顕微鏡において、
前記光検出部からの電気信号を前記パルスレーザ発振手段からのパルスレーザの発振に同期してサンプリングするサンプリング手段と、
前記サンプリング手段からのデータを蓄積するメモリ部とを備えたことを特徴とするレーザ走査顕微鏡。
前記レーザ走査顕微鏡は、
前記パルスレーザ発信手段からのパルスレーザの発振を検知し、前記パルスレーザの発振に同期した同期信号を出力する同期信号発生手段を備え、
前記同期信号発生手段からの同期信号に同期して、前記サンプリング手段で前記光検出部からの電気信号をサンプリングすることを特徴とする請求項１記載のレーザ走査顕微鏡。
前記同期信号発生手段は、
同期信号を任意の時間遅延させるトリガ信号を出力する遅延回路部を有し、前記遅延回路部で遅延させた同期信号に同期して前記光検出部からの電気信号をサンプリングすることを特徴とする請求項２記載のレーザ走査顕微鏡。
前記レーザ走査顕微鏡は、
前記遅延回路部で遅延させた同期信号に同期してパルス信号を発振制御可能なパルス発生器を備え、
前記パルス発生器からのパルス信号に応じたサンプリングを行うことを特徴とする請求項３記載のレーザ走査顕微鏡。
前記同期信号の遅延時間を与えるための外部入力部を備えることを特徴とする請求項３記載のレーザ走査顕微鏡。
前記光検出部が検出する光は前記パルスレーザの照射によって発生する蛍光であって、前記パルス信号に応じてサンプリングされ前記メモリ部に蓄積されたデジタルデータから、蛍光信号のデジタル積算、最大値の解析および蛍光信号の時定数解析の少なくとも一つのデジタル処理を行うことを特徴とする請求項４記載のレーザ走査顕微鏡。
前記パルスレーザ発生手段はモード同期超短パルスレーザであり、多光子励起によってサンプルからの蛍光を検出することを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載のレーザ走査顕微鏡。