JPH1010436A - 光走査型顕微鏡 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 トリガ信号を与える直前・直後における細胞
に生じた生理現象を観察できる光走査型顕微鏡を提供す
る。 【解決手段】 レーザ光を細胞１５上で２次元走査する
スキャニングユニット５と、スキャニングユニット５の
動きを制御する同期信号発生回路２０と、細胞１５から
の光を検出する蛍光検出器８と、蛍光検出器８の出力と
同期信号発生回路２０の出力とに基づいて細胞１５の画
像を１フレームづつ得る画像処理回路９と、細胞１５に
刺激を与える電気刺激装置１１と、電気刺激装置１１を
起動するトリガ信号３０ａを出力するトリガ信号発生回
路３０とを備えた光走査型顕微鏡１において、トリガ信
号３０ａを出力すべき、フレームの水平走査ラインの位
置を指定するポインティングデバイス１３と、同期信号
発生回路２０の出力とポインティングデバイス１３の出
力との同期をとってトリガ信号発生回路３０からトリガ
信号３０ａを出力させるコンピュータ１２とを備える。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は光走査型顕微鏡に
関する。

【０００２】

【従来の技術】生物試料に光を照射し、生物試料に起き
る現象を観察する顕微鏡として光走査型顕微鏡が知られ
ている。

【０００３】上記光走査型顕微鏡、例えばレーザ走査型
顕微鏡は、レーザ光を細胞（試料）上で２次元的に走査
するスキャニングユニットと、スキャニングユニットの
動きを制御する同期信号発生回路と、試料からの光（蛍
光、反射光、透過光等）を検出する検出器と、この検出
器の出力と前記同期信号発生回路の出力とに基づいて試
料の画像を１フレームづつ得る画像処理回路と、モニタ
と、試料に電気や光による刺激を与える刺激装置と、刺
激装置を起動するトリガ信号を出力するトリガ信号発生
回路とを備える。

【０００４】このレーザ走査型顕微鏡を用いて、例えば
観察する細胞に刺激装置から電気刺激を与え、その直後
の細胞に起きる生理現象を観察する電気生理の実験が行
なわれる。

【０００５】一般的に電気刺激によって起こる生理現象
の反応は、非常に高速であるため、画像を取得するため
には、走査と電気刺激を与えるタイミングとの同期をと
る必要がある。

【０００６】そのため、画像を取得する際には、トリガ
信号発生回路から画像取得するフレームの最初に電気刺
激のためのトリガ信号を出力し、走査と電気刺激を与え
るタイミングとの同期をとるようにしていた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】ところで、最近では電
気刺激を与えた直後だけでなく、電気刺激を与える直前
の生理現象をも含めて観察したいという要求がでてきて
いる。

【０００８】しかし、従来の光走査型顕微鏡において
は、上記構成によって電気刺激を与えた後に画像が取得
されるため、刺激を与える直前の（場合によっては直後
も）生理現象を観察することはできなかった。

【０００９】この発明はこのような事情に鑑みてなされ
たもので、その課題はトリガ信号を与える直前及び直後
における細胞に生じた生理現象を観察できる光走査型顕
微鏡を提供することである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決すべく請
求項１に記載の発明の光走査型顕微鏡は、光ビームを試
料上で２次元的に走査する走査手段と、この走査手段の
動きを制御する同期信号発生回路と、前記試料からの光
を検出する検出手段と、この検出手段の出力と前記同期
信号発生回路の出力とに基づいて前記試料の画像を１フ
レームづつ得る画像処理手段と、前記試料に刺激を与え
る刺激装置と、前記刺激装置を起動するトリガ信号を出
力するトリガ信号発生回路とを備えた光走査型顕微鏡に
おいて、前記トリガ信号を出力すべき、前記フレームの
水平走査ラインの位置を指定する設定手段と、前記同期
信号発生回路の出力と前記設定手段の出力との同期をと
って前記トリガ信号発生回路からトリガ信号を出力させ
る制御手段とを備えることを特徴とする。

【００１１】設定手段によってフレームの任意の水平ラ
イン位置でトリガ信号を発生させることができるので、
トリガ信号を与える直前及び直後の細胞の生理現象を観
察することができる。

【００１２】請求項２に記載の発明の光走査型顕微鏡
は、請求項１に記載の光走査型顕微鏡において、前記制
御手段は、前記フレームの内から前記トリガ信号を出力
すべきフレームを指定することを特徴とする。

【００１３】フレーム毎にトリガ信号が制御されるの
で、任意のフレームにおける水平ラインでトリガ信号を
出力することができる。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、この発明の実施の形態を図
面に基づいて説明する。

【００１５】図１はこの発明の一実施形態に係るレーザ
走査型顕微鏡のブロック構成図である。

【００１６】レーザ走査型顕微鏡（光走査型顕微鏡）１
は、レーザ光源２と、レーザシャッタ３と、ダイクロイ
ックミラー４と、スキャニングユニット５と、同期信号
発生回路２０と、スキャナ制御回路６と、バリアフィル
タ７と、蛍光検出器８と、画像処理回路９と、モニタ１
０と、電気刺激装置１１と、トリガ信号発生回路３０
と、コンピュータ１２と、ポインティングデバイス１３
とを備える。

【００１７】レーザ光源２は、ステージ１４上に載置さ
れた細胞（試料）１５を照射するレーザ光を発する。

【００１８】レーザシャッタ３は、レーザ光ＬＢの透過
と遮断とを行ない、レーザシャッタ３としては、例えば
ＡＯＤ（音響光学変調器）が用いられる。

【００１９】ダイクロイックミラー４は、レーザ光ＬＢ
を反射し蛍光を透過させることでレーザ光ＬＢと蛍光と
を分離する。

【００２０】スキャニングユニット５は、ステージ１４
に載置された細胞１５上でレーザ光ＬＢを２次元的に走
査させるものであって、水平スキャナ５Ａ及び垂直スキ
ャナ５Ｂで構成される。

【００２１】スキャナ制御回路６は、同期信号発生回路
２０の出力信号２０ａに基づいて水平スキャナ５Ａ及び
垂直スキャナ５Ｂを制御する水平スキャナ制御信号ＨＤ
Ｄ及び垂直スキャナ制御信号ＶＤＤを出力する。

【００２２】同期信号発生回路２０は、システムをコン
トロールしているコンピュータ１２からの画像取得開始
指令１２ａに基づいて、出力信号（水平同期信号ＨＤ、
垂直同期信号ＶＤ、ピクセルクロックＰＣＬＫ）２０ａ
を出力する。

【００２３】蛍光検出器８は、細胞１５からの蛍光を検
出し、入力した蛍光を光強度信号８ａに変換する。

【００２４】バリアフィルタ７は、ダイクロイックミラ
ー４と蛍光検出器８との間に配置され、レーザ光をカッ
トする。

【００２５】画像処理回路９は、Ａ／Ｄ変換素子、フレ
ームメモリ（デジタルメモリ）、Ｄ／Ａ変換素子等の画
像化のための回路からなり、蛍光検出器８の出力信号８
ａと同期信号発生回路２０の出力信号２０ａとに基づき
画像信号９ａを出力する。

【００２６】モニタ１０は、例えばＣＲＴであり、細胞
１５の画像を表示する。

【００２７】ポインティングデバイス１３は、例えばタ
ブレット（デジタイザ）、ライトペン、マウスであり、
コンピュータ１２に接続されており、画像処理回路９を
介してモニタ１０上の任意の水平ライン（走査すること
によって生じる）を指示することができる。

【００２８】トリガ信号発生回路３０は、コンピュータ
１２の指示信号１２ｂと同期信号発生回路２０の出力信
号２０ａに基づいてポインティングデバイス１３で指定
された任意の水平ラインの位置にトリガ信号３０ａを出
力する。

【００２９】電気刺激装置１１は、トリガ信号３０ａに
同期して細胞１５に電気刺激信号１１ａを与える。

【００３０】上記レーザ走査型顕微鏡の動作を説明す
る。

【００３１】レーザ光源２から出射されたレーザ光ＬＢ
は、レーザシャッタ３を通過した後、ダイクロイックミ
ラー４で反射され、スキャニングユニット５へ導かれ、
水平スキャナ５Ａ及び垂直スキャナ５Ｂによって細胞１
５上で２次元走査される。

【００３２】レーザ光ＬＢの照射によって励起され細胞
１５から発せられた蛍光は同じ光路を逆行し、垂直スキ
ャナ５Ｂ及び水平スキャナ５Ａでデスキャニングされ、
ダイクロイックミラー４を透過し、レーザ光ＬＢと分離
される。

【００３３】ダイクロイックミラー４を透過した蛍光は
バリアフィルタ７で完全に蛍光だけになり、蛍光検出器
８に入射し、光強度電気信号８ａに変換される。

【００３４】この光強度電気信号８ａはＡ／Ｄ変換素子
で同期信号発生回路２０からのＰＣＬＫにてデジタル信
号に変換され、同期信号発生回路２０からの同期信号２
０ａにてフレームメモリに記憶され、コンピュータで各
種の処理を行った後、Ｄ／Ａ変換素子でデジタル信号か
らアナログ信号に戻され、画像信号９ａとしてモニタ１
０へ出力される。

【００３５】このとき、観察者はモニタ１０を静止画像
表示とし、この静止画像表示された蛍光画像を見ながら
ポインティングデバイス１３でトリガする水平ラインを
指示する。

【００３６】図２は同期信号発生回路の詳細ブロック図
であり、この図を参照して同期信号発生回路の動作を説
明する。同期信号発生回路２０は垂直同期信号発生回路
２１と、水平同期信号発生回路２２と、ピクセルクロッ
ク発生回路２３と、１水平ラインカウント回路２４と、
１フレームカウント回路２５とからなる。

【００３７】垂直同期信号発生回路２１はコンピュータ
１２から画像取得開始指令１２ａを受け、垂直走査を開
始させる垂直同期信号ＶＤをスキャナ制御回路６へ出力
する。

【００３８】この垂直同期信号ＶＤは、同時に水平同期
信号発生回路２２に入力され、水平走査を開始させる水
平同期信号ＨＤをスキャナ制御回路６へ出力する。

【００３９】水平同期信号ＨＤは、同時にピクセルクロ
ック発生回路２３に入力され、蛍光データをサンプリン
グするピクセルクロックＰＣＬＫを出力する。

【００４０】１水平ラインカウント回路２４は、水平同
期信号ＨＤとピクセルクロックＰＣＬＫとを入力し、水
平同期信号ＨＤの入力に同期してピクセルクロックＰＣ
ＬＫのカウントを開始し、予め設定されたクロック数
（１水平ラインの１周期に当たるピクセルクロックの
数）をカウントし終えると、トリガ信号ＴＲ１を水平同
期信号発生回路２２へ出力する。

【００４１】水平同期信号発生回路２２は、トリガ信号
ＴＲ１を入力すると、次のラインを走査するための水平
同期信号ＨＤを出力する。

【００４２】１フレームカウント回路２５は、垂直同期
信号ＶＤと水平同期信号ＨＤとを入力し、垂直同期信号
ＶＤの入力に同期して水平同期信号ＨＤのカウントを開
始し、予め設定された数（１フレームの１周期に当たる
水平同期信号の数）をカウントし終えると、トリガ信号
ＴＲ２を垂直同期信号発生回路２１へ出力する。

【００４３】垂直同期信号発生回路２１はトリガ信号Ｔ
Ｒ２を入力すると、次のフレームの走査を開始し、垂直
同期信号ＶＤを出力する。

【００４４】スキャナ制御回路６は、この同期信号発生
回路２０を用いて同期をとって水平スキャナ５Ａと垂直
スキャナ５Ｂとを駆動することでレーザ光ＬＢを２次元
的に走査する。

【００４５】図３はトリガ信号発生回路の詳細ブロック
図、図４はモニタ画面の一例を示す図であり、これらの
図を参照してトリガ信号発生回路の動作を説明する。

【００４６】トリガ信号発生回路３０は、水平同期信号
カウント回路３１と、コンパレータ３２と、トリガライ
ン設定回路３３と、ゲート回路３４とからなる。

【００４７】水平同期信号カウント回路３１は、垂直同
期信号ＶＤと水平同期信号ＨＤとを入力し、垂直同期信
号ＶＤの入力に同期して水平同期信号ＨＤのカウントを
開始し、カウント信号３１ａを比較値Ｂとして出力す
る。

【００４８】トリガライン設定回路３３は、コンピュー
タ１２からの指示信号１２ｂによってトリガすべき水平
ラインの位置を指定し、この指定された位置を示すトリ
ガライン設定信号３３ａを基準値Ａとして出力するとと
もに、この基準値Ａを新たな指示信号１２ｂが入力され
るまで保持する。

【００４９】コンパレータ３２は基準値Ａと比較値Ｂと
を入力し、両者の値が一致（Ａ＝Ｂ）したとき、例えば
Ｈレベルの出力信号３２ａを出力する。

【００５０】ゲート回路３４は、例えば２入力ＡＮＤゲ
ートであり、このＡＮＤゲートの一方の端子にはコンピ
ュータ１２からフレーム毎にＨレベル又はＬレベルのゲ
ート信号１２ｃが入力されている。

【００５１】したがって、ゲート回路３４はコンピュー
タ１２で指定されたフレーム（Ｈレベルのゲート信号１
２ｃが入力されたフレーム）のとき、電気刺激装置１１
にトリガ信号３０ａを出力する。その結果、このトリガ
信号３０ａに同期して電気刺激装置１１は電気刺激信号
１１ａを細胞１５（図１参照）へ出力する。

【００５２】この実施形態によれば、１フレームの任意
の水平ラインの位置１０ａで細胞１５に電気刺激を与え
ることができるので、観察者は電気刺激を与える直前及
び直後の細胞１５に生じた生理現象を容易に観察するこ
とができる。

【００５３】しかも、トリガ信号３０ａは水平同期信号
に同期して発生させるので、指定したトリガすべき水平
ラインの位置と１ラインのずれもなく発生させることが
できる。

【００５４】なお、上記実施形態においては観察者はモ
ニタ１０に静止画像表示された蛍光画像を見ながらポイ
ンティングデバイス１３でトリガする水平ラインの位置
を指示したが、観察者は観察に先立って（モニタ画像を
見ずに）コンピュータでトリガすべき水平ラインの位置
を指定するようにしてもよい。

【００５５】また、上記実施形態においては電気刺激の
場合を説明したが、この発明はこの場合に限るものでは
なく、光による刺激の場合などのように外部刺激をあた
える用途にも適用することができる。例えば細胞内に注
入されたケイジドコンパウンドを、紫外レーザ光を照射
するタイミングを決めて開裂させ、細胞内に予め注入さ
れている蛍光試薬と選択的に結合させ、発した蛍光を観
察するような場合にも適用することができる。

【００５６】

【発明の効果】以上に説明したように請求項１記載の発
明の光走査型顕微鏡によれば、設定手段によってフレー
ムの任意の水平ライン位置でトリガ信号を発生させるこ
とができるので、トリガ信号に同期する刺激によって引
き起こされる高速な生理現象であっても刺激を与える直
前、直後の細胞の生理現象を容易に観察することができ
る。

【００５７】請求項２記載の発明の光走査型顕微鏡によ
れば、フレーム毎にトリガ信号が制御されるので、任意
のフレームにおける水平ラインでトリガ信号を出力する
ことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はこの発明の一実施形態に係るレーザ走査
型顕微鏡のブロック構成図である。

【図２】図２は同期信号発生回路の詳細ブロック図であ
る。

【図３】図３はトリガ信号発生回路の詳細ブロック図で
ある。

【図４】図４はモニタ画面の一例を示す図である。

【符号の説明】

１ レーザ走査型顕微鏡 ２ 光源 ３ レーザシャッタ ４ ダイクロイックミラー ５ スキャニングユニット ６ スキャナ制御回路 ７ バリアフィルタ ８ 蛍光検出器 ９ 画像処理回路 １０ モニタ １１ 電気刺激装置 １２ コンピュータ １３ ポインティングデバイス １５ 細胞（試料） ２０ 同期信号発生回路 ３０ トリガ信号発生回路

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 光ビームを試料上で２次元的に走査する
   走査手段と、この走査手段の動きを制御する同期信号発
   生回路と、前記試料からの光を検出する検出手段と、こ
   の検出手段の出力と前記同期信号発生回路の出力とに基
   づいて前記試料の画像を１フレームづつ得る画像処理手
   段と、前記試料に刺激を与える刺激装置と、前記刺激装
   置を起動するトリガ信号を出力するトリガ信号発生回路
   とを備えた光走査型顕微鏡において、 前記トリガ信号を出力すべき、前記フレームの水平走査
   ラインの位置を指定する設定手段と、 前記同期信号発生回路の出力と前記設定手段の出力との
   同期をとって前記トリガ信号発生回路からトリガ信号を
   出力させる制御手段とを備えることを特徴とする光走査
   型顕微鏡。
2. 【請求項２】 前記制御手段は、前記フレームの内から
   前記トリガ信号を出力すべきフレームを指定することを
   特徴とする請求項１に記載の光走査型顕微鏡。