JP4418058B2 - 走査型レーザ顕微鏡 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料上にレーザ光を走査させて画像を得る走査型レーザ顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
試料上にレーザ光を２次元走査させることで、生きた細胞や組織等の試料を傷つけることなく、光学的にスライスした断層像を得、複数の断層像から３次元画像を得ることが可能な走査型レーザ顕微鏡が従来より用いられている。
【０００３】
図８は一般的な走査型レーザ顕微鏡のシステム構成を例示するもので、レーザ光源４から射出されたレーザ光が、２次元走査光学系、対物レンズ、試料からの信号光を電気信号に変換する光電変換回路などから構成される光学ユニット１の２次元走査光学系と対物レンズを介して、測定対象である試料５へ導かれ、焦点面内で２次元走査される。
【０００４】
この走査により試料５から反射光または蛍光が発生すると、それが信号光として上記光学ユニット１の光電変換回路で取出され、信号光の強度を示す電気信号に試料５からの反射光または蛍光を変換した後に制御ユニット２へ送られる。
【０００５】
制御ユニット２では、入力手段７からの２次元走査光学系の２次元走査に対応するように、この電気信号を入力してデジタル値に変換し、上記２次元走査に従った上記焦点面の信号光の強度分布からなる濃淡画像を作成して表示装置６でモニタ表示させる。
【０００６】
また、制御ユニット２に接続された電気刺激発生器３は、制御ユニット２からの上記走査に同期したトリガ信号により、試料５に対して電気刺激を与え、該刺激により変化する試料５からの信号光の経時変化を測定する。
【０００７】
このような走査型レーザ顕微鏡の特徴を活かして、生理学や薬学、細胞生物学等の分野では細胞に対する刺激、例えば電気信号や、熱、薬品などの化学的な刺激に対する反応を３次元観測する機器として多く用いられている。
【０００８】
さらに最近では、上記刺激に対する経時変化を正確に測定するための測定器としての要求も高まっている。このように正確な経時変化を測定するためには、上記細胞などの試料５に対する刺激と、レーザ光の走査と画像の取込みとを正確に同期させる必要がある。
【０００９】
走査型レーザ顕微鏡からは、垂直および水平走査の始点あるいは有効期間を示す垂直同期信号及び水平同期信号が常時出力されており、この信号を試料５に刺激を与える電気刺激発生器３のトリガ入力端子に入力することで、得られる画像フレームの初めのタイミング、あるいはラインの初めのタイミングに上記刺激を発生させて、その後の試料５の経時変化を測定することが可能となる。
【００１０】
しかしながら、このような方法では、常に出力される同期信号を使用することから、任意のフレームあるいは任意のラインを選択して刺激を発生させたり、刺激の発生、停止を任意に制御することが困難となる。
【００１１】
そこで、フレーム内で任意のラインを選択して、刺激の発生、停止を選択できるような同期信号の発生回路を有する光走査型顕微鏡が特開平１０−１０４３６号公報（以下「第１の先行例」と称する）に開示されている。
【００１２】
この顕微鏡によれば、任意のフレームにおいて指定したラインでトリガ信号を発生させることが可能となる。
【００１３】
一方、同様の同期信号を用いて、走査型レーザ顕微鏡の照明光であるレーザの遮光手段を制御し、試料に対する照射位置を必要最小限にとどめる装置（以下「第２の先行例」と称する）も提案されている。具体的には、高速でレーザ光の透過／遮光を制御する音響光学素子に、あらかじめフレーム内でのレーザ照射位置をトリガ信号出力装置に記憶させ、レーザ光の２次元走査に同期して、レーザ光の試料への走査をオン／オフ制御している。
【００１４】
【発明が解決しようとする問題点】
しかしながら、上述した第１の先行例においては、指定したラインにおけるトリガの出力を任意のフレーム毎に制御できるものではあるが、出力するラインを指定する設定手段と、フレームを管理する同期回路との間には一切の同期関係がないため、フレーム毎に出力位置を変更することができない。
【００１５】
さらに、上記設定手段はライン単位で出力位置を管理するため、ライン上での出力位置を制御することができない。
【００１６】
また、上記第２の先行例においては、予めフレーム内のトリガ出力位置を設定するため、各フレームでの出力位置は同一であり、試料の位置的、化学的変化に応じて出力位置を変化させることができない。
【００１７】
また、上記第１及び第２の先行例いずれにおいても、用いる同期信号はオン／オフを制御するだけの２値のデジタル信号であり、出力レベルに応じたより細かい制御のための設定をすることができない。
【００１８】
本発明は上記のような実情に鑑みてなされたもので、その目的とするところは、トリガ信号を出力する位置が変更可能で、同期信号を発生させるタイミングを任意に設定可能とし、測定対象のどのような経時変化に対しても正確且つ精密な同期信号を出力することが可能な走査型レーザ顕微鏡を提供することにある。
【００１９】
【問題点を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、水平及び垂直の少なくとも一方の走査に同期した同期信号を出力する走査型レーザ顕微鏡において、各フレームまたは各ライン毎に任意に設定でき、且つ各フレームまたは各ライン上で同期信号の出力位置を画素単位で任意に設定できる出力位置設定手段を備えたことを特徴とする。
【００２０】
このような構成とすれば、各フレームあるいは各ライン毎に任意に設定でき、且つ各フレームまたは各ライン上で同期信号の出力位置を画素単位で任意に設定できるため、例えば、測定対象である細胞への刺激と、細胞の特定画素位置における経時変化を正確に測定することが可能となる。
【００２１】
請求項２記載の発明は、上記請求項１記載の発明において、上記出力位置設定手段は、測定された上記フレームまたはライン上のデータに基づいて以降のフレームまたはライン上での同期信号の出力位置を設定されることを特徴とする。
【００２２】
このような構成とすれば、上記請求項１記載の発明の作用に加えて、測定された上記フレームあるいはライン上のデータに基づいて同期信号の出力位置を設定することで、測定対象の経時変化に応じて、同期信号の出力位置を変更させることが可能となる。
【００２３】
請求項３記載の発明は、上記請求項１または２記載の発明において、上記出力位置設定手段は、出力する同期信号のレベルを可変設定することを特徴とする。
【００２４】
このような構成とすれば、上記請求項１または２記載の発明の作用に加えて、同期信号の出力位置と出力レベルが設定できるようになり、時間的な正確さと共に、得られるデータに対応して動作する、この走査型レーザ顕微鏡に外部接続された機器を精細に制御することが可能になる。
【００２５】
【発明の実施の形態】
（第１の実施の形態）
以下本発明の第１の実施の形態に係る走査型レーザ顕微鏡について図面を参照して説明する。
【００２６】
なお、走査型レーザ顕微鏡全体のシステム構成については、上記図８で示したものと基本的に同様であるため、同一部分には同一符号を付すものとして、その図示及び説明は省略する。
【００２７】
しかして、主として制御ユニット２内の構成について図１により説明する。
【００２８】
制御ユニット２は、光学ユニット１内の２次元走査光学系に使用されるスキャナへの駆動波形を発生するスキャナ波形発生回路１１、光学ユニットの光電変換回路から出力される電気信号をデジタルデータに変換するＡ／Ｄ変換回路１３、これらの回路を同期して動作させるための同期信号を発生する同期信号発生回路１２、上記Ａ／Ｄ変換回路１３により得られたデジタルデータから画像データを作成して上記表示装置６に表示させる画像表示回路１６、上記画像データやスキャナ波形発生回路１１で使用する波形データなどを保存するシステムメモリ１５、及びこれら各回路を統括制御するＣＰＵ１４などにより構成される。
【００２９】
スキャナ波形発生回路１１は、同期信号発生回路１２から発生する垂直／水平同期信号及びピクセルクロックに合せて、予め設定されているスキャナ駆動波形を発生し、上記レーザ光を試料５の焦点面内で２次元に走査するようスキャナを駆動する。これにあわせて光学ユニット１から出力される光強度を示す電気信号がＡ／Ｄ変換回路１３に入力され、そのデジタル出力を上記水平／垂直同期信号及びピクセルクロックによりサンプリングしてデジタルデータに変換する。
【００３０】
このデジタルデータは、上記光強度の情報であり、ＣＰＵ１４により、画像として画像表示回路１６を介してＣＲＴなどで構成される表示装置６へ表示させるか、画像データとしてシステムメモリ１５に格納、保存される。
【００３１】
次に図２を用いて上記同期信号発生回路１２内の詳細な回路構成を示す。
【００３２】
同図に示す如く、同期信号発生回路１２は同期信号用メモリ２１、クロック発生回路２３、及び同期信号メモリコントローラ２２から構成される。
【００３３】
同期信号メモリコントローラ２２は、その内部にクロック発生回路２３からのクロックにより動作するカウンタを有するもので、この同期信号メモリコントローラ２２からの信号を受けて記憶する同期信号用メモリ２１は、垂直同期用、水平同期用、トリガ信号用の少なくとも３ビットのデータ幅のデータを、最低でも１フレーム分のデータ長だけ記憶する容量が必要となる。
【００３４】
次いで上記実施の形態の動作について説明する。
【００３５】
図３は主として制御ユニット２のＣＰＵ１４による制御動作の処理内容を示すものであり、画像の取得に先立ってＣＰＵ１４は、取得する画像のサイズに合わせて同期信号用メモリ２１に１フレーム分の水平／垂直同期信号を書込み（ステップＳ１１）、また画像の取得範囲として使用する同期信号用メモリ２１の開始アドレスと使用するメモリ長を同期信号メモリコントローラ２２に設定し（ステップＳ１２）、それから同期信号メモリコントローラ２２のカウンタをスタートさせる。
【００３６】
該カウンタからの出力は、開始アドレスからクロック発生回路２３の出力するクロック毎にカウントアップされ、上記メモリ長に達したところで、開始アドレスに戻るようになっている。この出力により、同期信号用メモリ２１の内容が読出され、まず１フレーム分の画像が取得される（ステップＳ１３）。
【００３７】
この得られた１フレーム分の画像は画像表示回路１６により表示装置６で表示されるもので（ステップＳ１４）、この表示に対してこの走査型レーザ顕微鏡の操作者がマウスやキーボードなどの入力手段７を使用して設定入力を行なうのを待機する（ステップＳ１５）。
【００３８】
しかして、入力手段７からの入力があったと判断した時点で、入力手段７より表示装置６での表示に基づいて入力される、電気刺激を発生させるためのトリガ信号の出力位置のフレーム番号及び画像上の位置（ライン位置及び画素位置）を指定するデータを受付ける（ステップＳ１６）。
【００３９】
ＣＰＵ１４は入力されたデータを基に、同期信号用メモリ２１、同期信号メモリコントローラ２２に対して必要な設定を行い、同期信号メモリコントローラ２２内のカウンタを再度スタートさせ、画像の取込みを開始する（ステップＳ１７）。
【００４０】
以後、取得されるフレームが設定された番号のフレームであれば（ステップＳ１８）、電気刺激を画像中の任意位置で発生するようにトリガ信号の出力位置のセットを電気刺激発生器３に行なった上で（ステップＳ２０）、画像の取得を行なう（ステップＳ２１）。
【００４１】
また取得されるフレームが設定された番号のフレームでなければ（ステップＳ１８）、電気刺激のセットを行なわずに、単に画像の取得を行なう（ステップＳ１９）。
【００４２】
あらかじめ操作者が設定した任意のフレーム内の任意の画素位置においてのみ電気刺激を発生させることができるもので、こうして得られる試料５内の経時変化をとらえた複数の画像は順次表示装置６で表示させると共に（ステップＳ２２）、システムメモリ１５に記憶させる（ステップＳ２３）。
【００４３】
また、上述したステップを続けない場合は、処理を終了する（ステップＳ２４）。
【００４４】
上記第１の実施の形態では、設定するフレーム数分のメモリ長を確保しなければならないが、クロック発生回路２３で発信する周波数に対して、ＣＰＵ１４の速度が十分に速い場合には、同期信号用メモリ２１を、ＦＩＦ０メモリあるいはデュアルポートメモリとして構成し、走査の開始後、順次データを書込んでいくようにしてもよい。
【００４５】
また、ＣＰＵ１４の速度によらず、システムメモリ１５と同期信号用メモリ２１間でデータを直接に高速で転送ができるよう、同期信号メモリコントローラ２２にＤＭＡ（Ｄｉｒｅｃｔ Ｍｅｍｏｒｙ Ａｃｃｅｓｓ）機能を設けるようにしてもよい。
【００４６】
以上本発明の第１の実施の形態によれば、各フレームあるいは各ライン毎に同期信号の出力位置を画素単位で任意に設定できるようになり、例えば、測定対象である細胞への刺激と、細胞の経時変化を正確に測定することが可能となる。
【００４７】
なお、本実施の形態では、制御ユニット２に接続する外部接続機器として電気刺激発生器３を用いた場合を例示しているが、画像の取得と時間的な同期を確保する必要のあるような機器であれば、これに限定されるものではない。
【００４８】
（第２の実施の形態）
以下本発明の第２の実施の形態に係る走査型レーザ顕微鏡について図面を参照して説明する。
【００４９】
なお、走査型レーザ顕微鏡全体のシステム構成については上記図８で示したものと、制御ユニット２内の構成については図１で示したものと、そして同期信号発生回路１２内の詳細な回路構成については図２に示したものと、それぞれ基本的に同様であるものとして、同一部分には同一符号を付してその図示及び説明は省略する。
【００５０】
次いで上記実施の形態の動作について説明する。
【００５１】
図４は主として制御ユニット２のＣＰＵ１４による制御動作の処理内容を示すものであり、画像の取得に先立ってＣＰＵ１４は、取得する画像のサイズに合わせて同期信号用メモリ２１に１フレーム分の水平／垂直同期信号を書込み（ステップＳ３１）、また画像の取得範囲として使用する同期信号用メモリ２１の開始アドレスと使用するメモリ長を同期信号メモリコントローラ２２に設定し（ステップＳ３２）、それから同期信号メモリコントローラ２２のカウンタをスタートさせる。
【００５２】
該カウンタからの出力は、開始アドレスからクロック発生回路２３の出力するクロック毎にカウントアップされ、上記メモリ長に達したところで、開始アドレスに戻るようになっている。この出力により、同期信号用メモリ２１の内容が読出され、まず１フレーム分の画像が取得される（ステップＳ３３）。
【００５３】
この得られた１フレーム分の画像は画像表示回路１６により表示装置６で表示されるもので（ステップＳ３４）、この表示に対してこの走査型レーザ顕微鏡の操作者がマウスやキーボードなどの入力手段７を使用して設定入力を行なうのを待機する（ステップＳ３５）。
【００５４】
しかして、入力手段７からの入力があったと判断した時点で、入力手段７より表示装置６での表示に基づいて入力される、電気刺激を発生させるための第１の条件としての、トリガ信号の出力位置のフレーム番号及び画像上の位置（ライン位置及び画素位置）を指定するデータを受付ける（ステップＳ３６）。
【００５５】
ＣＰＵ１４は入力されたデータを基に、同期信号用メモリ２１、同期信号メモリコントローラ２２に対して必要な設定を行なう。
【００５６】
その後、電気刺激の発生状態を変更するための条件として、例えば各フレームまたはライン上の特定の画素データの位置と、その画素データの輝度値が超えるか否かを判断するためのしきい値を設定する（ステップＳ３７）。
【００５７】
その後、上記変更するための条件を満たした場合の電気刺激を発生させるための第２の条件として、やはりトリガ信号の出力位置の番号のフレーム及び画像上の位置（ライン位置及び画素位置）を指定するデータを受付ける（ステップＳ３８）。
【００５８】
こうして２つの電気刺激を発生させるための条件と、これを切換えるための条件とを設定し終えたこととなるので、同期信号メモリコントローラ２２内のカウンタを再度スタートさせ、画像の取込みを開始する（ステップＳ３９）。
【００５９】
以後、上記ステップＳ３７で設定された位置の画素データの輝度値が設定したしきい値を超えているか否かを判断し（ステップＳ４０）、超えていない場合には上記ステップＳ３６で設定した、電気刺激を発生させるための第１の条件に基づいて電気刺激を発生させながら画像の取得を行ない（ステップＳ４１）、またしきい値を超えている場合には電気刺激を発生させるための第２の条件に変更設定して電気刺激を発生させた上で（ステップＳ４２）、やはり画像の取得を行なうことで（ステップＳ４３）、あらかじめ操作者が設定した切換え条件に基づいて電気刺激を発生させるための条件を切換えて、観察を続行することができるもので、こうして得られる試料５内の経時変化をとらえた複数の画像は順次表示装置６で表示させると共に（ステップＳ４４）、システムメモリ１５に記憶させる（ステップＳ４５）。
【００６０】
また、上述したステップを続けない場合は、処理を終了する（ステップＳ４６）。
【００６１】
図５は、時系列で得られる図５（ａ）に示すような画像中の特定点位置Ｐの画素データの輝度値が予め設定したしきい値を超えた場合にのみ、同位置に電気刺激を発生させるべくトリガ信号を出力するように設定した場合の動作状態を例示するもので、図５（ｂ）に示すように該輝度値がしきい値Ｌthを超えたと判断した時点から、下回ったと判断される時点までの間、各フレーム毎にトリガ信号を出力し続けていることがわかる。
【００６２】
なお、上記ステップＳ３７で設定する電気刺激の発生状態を変更するための条件とは、他に例えば、画像データの各フレームまたは特定ライン位置範囲での平均値、分散値などが所定のしきい値を超えるか、あるいは下回るか、などといったことを選択することができるものとする。
【００６３】
このように本実施の形態によれば、測定されたフレームあるいはラインのデータから、同期信号の出力位置、出力状態を変更設定することで、測定対象の経時変化に応じて同期信号の出力条件を変更させることが可能となる。
【００６４】
（第３の実施の形態）
以下本発明の第３の実施の形態に係る走査型レーザ顕微鏡について図面を参照して説明する。
【００６５】
図６は走査型レーザ顕微鏡全体のシステム構成について示すもので、ほぼ基本的に上記図８で示したものと同様であるものとして、同一部分には同一符号を付してその説明は省略する。
【００６６】
しかして、制御ユニット２には電気刺激発生器３に代えてレーザ光量調節器３１が接続され、制御ユニット２はその制御を行なう。
【００６７】
レーザ光量調節器３１は、レーザ光源４と光学ユニット１との間に配設され、音響光学素子を用いて構成されるもので、レーザ光源４で発振されたレーザ光の光量を制御ユニット２からの制御に基づいて減衰調節した後に光学ユニット１に供給する。
【００６８】
上記制御ユニット２内の構成については上記図１で示したものとほぼ同様であるものとし、同一部分には同一符号を付してその図示及び説明は省略する。
【００６９】
次に、制御ユニット２内の同期信号発生回路１２′の構成について図７を用いて説明する。
【００７０】
同図において、同期信号発生回路１２′は、同期信号用メモリ２１′、クロック発生回路２３、及び同期信号メモリコントローラ２２から構成され、同期信号メモリコントローラ２２は、その内部にクロック発生回路２３からのクロックにより動作するカウンタを有するもので、この同期信号メモリコントローラ２２からの信号を受けて記憶する同期信号用メモリ２１′は、トリガ信号用に複数ｎビットのデータを記憶するもので、そのｎビットのデータはＤ／Ａコンバータ３２に出力されてアナログ化され、上記レーザ光量調節器３１へ供給される。
【００７１】
このような構成とすれば、２次元走査面内で、任意の位置にレーザ光量調節器３１によって任意の強度に調節したレーザ光を照明光として与えることが可能となる。
【００７２】
なお、レーザ光量調節器３１はＤ／Ａコンバータ３２でアナログ化した信号に基づいてレーザ光量を可変調節するものとして説明したが、複数ｂｉｔのデジタル信号を受付けることができる外部接続機器に対しては、Ｄ／Ａコンバータ３２を用いず、同期信号用メモリ２１′からのデジタル出力を直接送出することができる。
【００７３】
また、制御ユニット２に接続する外部接続機器としては、レーザ光量調節器３１に限らないことは勿論であり、本実施の形態によれば、そのような外部接続機器を時間的に正確に、且つ精細に制御することが可能になる。
【００７４】
なお、本発明は上記第１乃至第３の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲内で種々変形して実施することが可能であるものとする。
【００７５】
【発明の効果】
請求項１記載の発明によれば、各フレームあるいは各ライン毎に任意に設定でき、且つ各フレームまたは各ラインで同期信号の出力位置を画素単位で任意に設定できるため、例えば、測定対象である細胞への刺激と、細胞の特定画素位置における経時変化を正確に測定することが可能となる。
【００７６】
請求項２記載の発明によれば、上記請求項１記載の発明の効果に加えて、測定された上記フレームあるいはライン上のデータに基づいて同期信号の出力位置を設定することで、測定対象の経時変化に応じて、同期信号の出力位置を変更させることが可能となる。
【００７７】
請求項３記載の発明によれば、上記請求項１または２記載の発明の効果に加えて、同期信号の出力位置と出力レベルが設定できるようになり、時間的な正確さと共に、得られるデータに対応して動作する、この走査型レーザ顕微鏡に外部接続された機器を精細に制御することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係る制御ユニット内の構成を示すブロック図。
【図２】同実施の形態に係る同期信号発生回路内の詳細な回路構成を示すブロック図。
【図３】同実施の形態に係る動作時の処理内容を示すフローチャート。
【図４】本発明の第２の実施の形態に係る動作時の処理内容を示すフローチャート。
【図５】同実施の形態に係る動作状態を例示する図。
【図６】本発明の第３の実施の形態に係る走査型レーザ顕微鏡のシステム全体の構成を示すブロック図。
【図７】同実施の形態に係る同期信号発生回路内の詳細な回路構成を示すブロック図。
【図８】一般的な走査型レーザ顕微鏡のシステム全体の構成を示すブロック図。
【符号の説明】
１…光学ユニット
２…制御ユニット
３…電気刺激発生器
４…レーザ光源
５…試料
６…表示装置
７…入力手段
１１…スキャナ波形発生回路
１２，１２′…同期信号発生回路
１３…Ａ／Ｄ変換回路
１４…ＣＰＵ
１５…システムメモリ
１６…画像表示回路
２１，２１′…同期信号用メモリ
２２…同期信号メモリコントローラ
２３…クロック発生回路
３１…レーザ光量調節器
３２…Ｄ／Ａコンバータ
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料上にレーザ光を走査させて画像を得る走査型レーザ顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
試料上にレーザ光を２次元走査させることで、生きた細胞や組織等の試料を傷つけることなく、光学的にスライスした断層像を得、複数の断層像から３次元画像を得ることが可能な走査型レーザ顕微鏡が従来より用いられている。
【０００３】
図８は一般的な走査型レーザ顕微鏡のシステム構成を例示するもので、レーザ光源４から射出されたレーザ光が、２次元走査光学系、対物レンズ、試料からの信号光を電気信号に変換する光電変換回路などから構成される光学ユニット１の２次元走査光学系と対物レンズを介して、測定対象である試料５へ導かれ、焦点面内で２次元走査される。
【０００４】
この走査により試料５から反射光または蛍光が発生すると、それが信号光として上記光学ユニット１の光電変換回路で取出され、信号光の強度を示す電気信号に試料５からの反射光または蛍光を変換した後に制御ユニット２へ送られる。
【０００５】
制御ユニット２では、入力手段７からの２次元走査光学系の２次元走査に対応するように、この電気信号を入力してデジタル値に変換し、上記２次元走査に従った上記焦点面の信号光の強度分布からなる濃淡画像を作成して表示装置６でモニタ表示させる。
【０００６】
また、制御ユニット２に接続された電気刺激発生器３は、制御ユニット２からの上記走査に同期したトリガ信号により、試料５に対して電気刺激を与え、該刺激により変化する試料５からの信号光の経時変化を測定する。
【０００７】
このような走査型レーザ顕微鏡の特徴を活かして、生理学や薬学、細胞生物学等の分野では細胞に対する刺激、例えば電気信号や、熱、薬品などの化学的な刺激に対する反応を３次元観測する機器として多く用いられている。
【０００８】
さらに最近では、上記刺激に対する経時変化を正確に測定するための測定器としての要求も高まっている。このように正確な経時変化を測定するためには、上記細胞などの試料５に対する刺激と、レーザ光の走査と画像の取込みとを正確に同期させる必要がある。
【０００９】
走査型レーザ顕微鏡からは、垂直および水平走査の始点あるいは有効期間を示す垂直同期信号及び水平同期信号が常時出力されており、この信号を試料５に刺激を与える電気刺激発生器３のトリガ入力端子に入力することで、得られる画像フレームの初めのタイミング、あるいはラインの初めのタイミングに上記刺激を発生させて、その後の試料５の経時変化を測定することが可能となる。
【００１０】
しかしながら、このような方法では、常に出力される同期信号を使用することから、任意のフレームあるいは任意のラインを選択して刺激を発生させたり、刺激の発生、停止を任意に制御することが困難となる。
【００１１】
そこで、フレーム内で任意のラインを選択して、刺激の発生、停止を選択できるような同期信号の発生回路を有する光走査型顕微鏡が特開平１０−１０４３６号公報（以下「第１の先行例」と称する）に開示されている。
【００１２】
この顕微鏡によれば、任意のフレームにおいて指定したラインでトリガ信号を発生させることが可能となる。
【００１３】
一方、同様の同期信号を用いて、走査型レーザ顕微鏡の照明光であるレーザの遮光手段を制御し、試料に対する照射位置を必要最小限にとどめる装置（以下「第２の先行例」と称する）も提案されている。具体的には、高速でレーザ光の透過／遮光を制御する音響光学素子に、あらかじめフレーム内でのレーザ照射位置をトリガ信号出力装置に記憶させ、レーザ光の２次元走査に同期して、レーザ光の試料への走査をオン／オフ制御している。
【００１４】
【発明が解決しようとする問題点】
しかしながら、上述した第１の先行例においては、指定したラインにおけるトリガの出力を任意のフレーム毎に制御できるものではあるが、出力するラインを指定する設定手段と、フレームを管理する同期回路との間には一切の同期関係がないため、フレーム毎に出力位置を変更することができない。
【００１５】
さらに、上記設定手段はライン単位で出力位置を管理するため、ライン上での出力位置を制御することができない。
【００１６】
また、上記第２の先行例においては、予めフレーム内のトリガ出力位置を設定するため、各フレームでの出力位置は同一であり、試料の位置的、化学的変化に応じて出力位置を変化させることができない。
【００１７】
また、上記第１及び第２の先行例いずれにおいても、用いる同期信号はオン／オフを制御するだけの２値のデジタル信号であり、出力レベルに応じたより細かい制御のための設定をすることができない。
【００１８】
本発明は上記のような実情に鑑みてなされたもので、その目的とするところは、トリガ信号を出力する位置が変更可能で、同期信号を発生させるタイミングを任意に設定可能とし、測定対象のどのような経時変化に対しても正確且つ精密な同期信号を出力することが可能な走査型レーザ顕微鏡を提供することにある。
【００１９】
【問題点を解決するための手段】
請求項１記載の発明は、水平及び垂直の少なくとも一方の走査に同期した同期信号を出力する走査型レーザ顕微鏡において、各フレームまたは各ライン毎に任意に設定でき、且つ各フレームまたは各ライン上で同期信号の出力位置を画素単位で任意に設定できる出力位置設定手段を備えたことを特徴とする。
【００２０】
このような構成とすれば、各フレームあるいは各ライン毎に任意に設定でき、且つ各フレームまたは各ライン上で同期信号の出力位置を画素単位で任意に設定できるため、例えば、測定対象である細胞への刺激と、細胞の特定画素位置における経時変化を正確に測定することが可能となる。
【００２１】
請求項２記載の発明は、上記請求項１記載の発明において、上記出力位置設定手段は、測定された上記フレームまたはライン上のデータに基づいて以降のフレームまたはライン上での同期信号の出力位置を設定されることを特徴とする。
【００２２】
このような構成とすれば、上記請求項１記載の発明の作用に加えて、測定された上記フレームあるいはライン上のデータに基づいて同期信号の出力位置を設定することで、測定対象の経時変化に応じて、同期信号の出力位置を変更させることが可能となる。
【００２３】
請求項３記載の発明は、上記請求項１または２記載の発明において、上記出力位置設定手段は、出力する同期信号のレベルを可変設定することを特徴とする。
【００２４】
このような構成とすれば、上記請求項１または２記載の発明の作用に加えて、同期信号の出力位置と出力レベルが設定できるようになり、時間的な正確さと共に、得られるデータに対応して動作する、この走査型レーザ顕微鏡に外部接続された機器を精細に制御することが可能になる。
【００２５】
【発明の実施の形態】
（第１の実施の形態）
以下本発明の第１の実施の形態に係る走査型レーザ顕微鏡について図面を参照して説明する。
【００２６】
なお、走査型レーザ顕微鏡全体のシステム構成については、上記図８で示したものと基本的に同様であるため、同一部分には同一符号を付すものとして、その図示及び説明は省略する。
【００２７】
しかして、主として制御ユニット２内の構成について図１により説明する。
【００２８】
制御ユニット２は、光学ユニット１内の２次元走査光学系に使用されるスキャナへの駆動波形を発生するスキャナ波形発生回路１１、光学ユニットの光電変換回路から出力される電気信号をデジタルデータに変換するＡ／Ｄ変換回路１３、これらの回路を同期して動作させるための同期信号を発生する同期信号発生回路１２、上記Ａ／Ｄ変換回路１３により得られたデジタルデータから画像データを作成して上記表示装置６に表示させる画像表示回路１６、上記画像データやスキャナ波形発生回路１１で使用する波形データなどを保存するシステムメモリ１５、及びこれら各回路を統括制御するＣＰＵ１４などにより構成される。
【００２９】
スキャナ波形発生回路１１は、同期信号発生回路１２から発生する垂直／水平同期信号及びピクセルクロックに合せて、予め設定されているスキャナ駆動波形を発生し、上記レーザ光を試料５の焦点面内で２次元に走査するようスキャナを駆動する。これにあわせて光学ユニット１から出力される光強度を示す電気信号がＡ／Ｄ変換回路１３に入力され、そのデジタル出力を上記水平／垂直同期信号及びピクセルクロックによりサンプリングしてデジタルデータに変換する。
【００３０】
このデジタルデータは、上記光強度の情報であり、ＣＰＵ１４により、画像として画像表示回路１６を介してＣＲＴなどで構成される表示装置６へ表示させるか、画像データとしてシステムメモリ１５に格納、保存される。
【００３１】
次に図２を用いて上記同期信号発生回路１２内の詳細な回路構成を示す。
【００３２】
同図に示す如く、同期信号発生回路１２は同期信号用メモリ２１、クロック発生回路２３、及び同期信号メモリコントローラ２２から構成される。
【００３３】
同期信号メモリコントローラ２２は、その内部にクロック発生回路２３からのクロックにより動作するカウンタを有するもので、この同期信号メモリコントローラ２２からの信号を受けて記憶する同期信号用メモリ２１は、垂直同期用、水平同期用、トリガ信号用の少なくとも３ビットのデータ幅のデータを、最低でも１フレーム分のデータ長だけ記憶する容量が必要となる。
【００３４】
次いで上記実施の形態の動作について説明する。
【００３５】
図３は主として制御ユニット２のＣＰＵ１４による制御動作の処理内容を示すものであり、画像の取得に先立ってＣＰＵ１４は、取得する画像のサイズに合わせて同期信号用メモリ２１に１フレーム分の水平／垂直同期信号を書込み（ステップＳ１１）、また画像の取得範囲として使用する同期信号用メモリ２１の開始アドレスと使用するメモリ長を同期信号メモリコントローラ２２に設定し（ステップＳ１２）、それから同期信号メモリコントローラ２２のカウンタをスタートさせる。
【００３６】
該カウンタからの出力は、開始アドレスからクロック発生回路２３の出力するクロック毎にカウントアップされ、上記メモリ長に達したところで、開始アドレスに戻るようになっている。この出力により、同期信号用メモリ２１の内容が読出され、まず１フレーム分の画像が取得される（ステップＳ１３）。
【００３７】
この得られた１フレーム分の画像は画像表示回路１６により表示装置６で表示されるもので（ステップＳ１４）、この表示に対してこの走査型レーザ顕微鏡の操作者がマウスやキーボードなどの入力手段７を使用して設定入力を行なうのを待機する（ステップＳ１５）。
【００３８】
しかして、入力手段７からの入力があったと判断した時点で、入力手段７より表示装置６での表示に基づいて入力される、電気刺激を発生させるためのトリガ信号の出力位置のフレーム番号及び画像上の位置（ライン位置及び画素位置）を指定するデータを受付ける（ステップＳ１６）。
【００３９】
ＣＰＵ１４は入力されたデータを基に、同期信号用メモリ２１、同期信号メモリコントローラ２２に対して必要な設定を行い、同期信号メモリコントローラ２２内のカウンタを再度スタートさせ、画像の取込みを開始する（ステップＳ１７）。
【００４０】
以後、取得されるフレームが設定された番号のフレームであれば（ステップＳ１８）、電気刺激を画像中の任意位置で発生するようにトリガ信号の出力位置のセットを電気刺激発生器３に行なった上で（ステップＳ２０）、画像の取得を行なう（ステップＳ２１）。
【００４１】
また取得されるフレームが設定された番号のフレームでなければ（ステップＳ１８）、電気刺激のセットを行なわずに、単に画像の取得を行なう（ステップＳ１９）。
【００４２】
あらかじめ操作者が設定した任意のフレーム内の任意の画素位置においてのみ電気刺激を発生させることができるもので、こうして得られる試料５内の経時変化をとらえた複数の画像は順次表示装置６で表示させると共に（ステップＳ２２）、システムメモリ１５に記憶させる（ステップＳ２３）。
【００４３】
また、上述したステップを続けない場合は、処理を終了する（ステップＳ２４）。
【００４４】
上記第１の実施の形態では、設定するフレーム数分のメモリ長を確保しなければならないが、クロック発生回路２３で発信する周波数に対して、ＣＰＵ１４の速度が十分に速い場合には、同期信号用メモリ２１を、ＦＩＦ０メモリあるいはデュアルポートメモリとして構成し、走査の開始後、順次データを書込んでいくようにしてもよい。
【００４５】
また、ＣＰＵ１４の速度によらず、システムメモリ１５と同期信号用メモリ２１間でデータを直接に高速で転送ができるよう、同期信号メモリコントローラ２２にＤＭＡ（Ｄｉｒｅｃｔ Ｍｅｍｏｒｙ Ａｃｃｅｓｓ）機能を設けるようにしてもよい。
【００４６】
以上本発明の第１の実施の形態によれば、各フレームあるいは各ライン毎に同期信号の出力位置を画素単位で任意に設定できるようになり、例えば、測定対象である細胞への刺激と、細胞の経時変化を正確に測定することが可能となる。
【００４７】
なお、本実施の形態では、制御ユニット２に接続する外部接続機器として電気刺激発生器３を用いた場合を例示しているが、画像の取得と時間的な同期を確保する必要のあるような機器であれば、これに限定されるものではない。
【００４８】
（第２の実施の形態）
以下本発明の第２の実施の形態に係る走査型レーザ顕微鏡について図面を参照して説明する。
【００４９】
なお、走査型レーザ顕微鏡全体のシステム構成については上記図８で示したものと、制御ユニット２内の構成については図１で示したものと、そして同期信号発生回路１２内の詳細な回路構成については図２に示したものと、それぞれ基本的に同様であるものとして、同一部分には同一符号を付してその図示及び説明は省略する。
【００５０】
次いで上記実施の形態の動作について説明する。
【００５１】
図４は主として制御ユニット２のＣＰＵ１４による制御動作の処理内容を示すものであり、画像の取得に先立ってＣＰＵ１４は、取得する画像のサイズに合わせて同期信号用メモリ２１に１フレーム分の水平／垂直同期信号を書込み（ステップＳ３１）、また画像の取得範囲として使用する同期信号用メモリ２１の開始アドレスと使用するメモリ長を同期信号メモリコントローラ２２に設定し（ステップＳ３２）、それから同期信号メモリコントローラ２２のカウンタをスタートさせる。
【００５２】
該カウンタからの出力は、開始アドレスからクロック発生回路２３の出力するクロック毎にカウントアップされ、上記メモリ長に達したところで、開始アドレスに戻るようになっている。この出力により、同期信号用メモリ２１の内容が読出され、まず１フレーム分の画像が取得される（ステップＳ３３）。
【００５３】
この得られた１フレーム分の画像は画像表示回路１６により表示装置６で表示されるもので（ステップＳ３４）、この表示に対してこの走査型レーザ顕微鏡の操作者がマウスやキーボードなどの入力手段７を使用して設定入力を行なうのを待機する（ステップＳ３５）。
【００５４】
しかして、入力手段７からの入力があったと判断した時点で、入力手段７より表示装置６での表示に基づいて入力される、電気刺激を発生させるための第１の条件としての、トリガ信号の出力位置のフレーム番号及び画像上の位置（ライン位置及び画素位置）を指定するデータを受付ける（ステップＳ３６）。
【００５５】
ＣＰＵ１４は入力されたデータを基に、同期信号用メモリ２１、同期信号メモリコントローラ２２に対して必要な設定を行なう。
【００５６】
その後、電気刺激の発生状態を変更するための条件として、例えば各フレームまたはライン上の特定の画素データの位置と、その画素データの輝度値が超えるか否かを判断するためのしきい値を設定する（ステップＳ３７）。
【００５７】
その後、上記変更するための条件を満たした場合の電気刺激を発生させるための第２の条件として、やはりトリガ信号の出力位置の番号のフレーム及び画像上の位置（ライン位置及び画素位置）を指定するデータを受付ける（ステップＳ３８）。
【００５８】
こうして２つの電気刺激を発生させるための条件と、これを切換えるための条件とを設定し終えたこととなるので、同期信号メモリコントローラ２２内のカウンタを再度スタートさせ、画像の取込みを開始する（ステップＳ３９）。
【００５９】
以後、上記ステップＳ３７で設定された位置の画素データの輝度値が設定したしきい値を超えているか否かを判断し（ステップＳ４０）、超えていない場合には上記ステップＳ３６で設定した、電気刺激を発生させるための第１の条件に基づいて電気刺激を発生させながら画像の取得を行ない（ステップＳ４１）、またしきい値を超えている場合には電気刺激を発生させるための第２の条件に変更設定して電気刺激を発生させた上で（ステップＳ４２）、やはり画像の取得を行なうことで（ステップＳ４３）、あらかじめ操作者が設定した切換え条件に基づいて電気刺激を発生させるための条件を切換えて、観察を続行することができるもので、こうして得られる試料５内の経時変化をとらえた複数の画像は順次表示装置６で表示させると共に（ステップＳ４４）、システムメモリ１５に記憶させる（ステップＳ４５）。
【００６０】
また、上述したステップを続けない場合は、処理を終了する（ステップＳ４６）。
【００６１】
図５は、時系列で得られる図５（ａ）に示すような画像中の特定点位置Ｐの画素データの輝度値が予め設定したしきい値を超えた場合にのみ、同位置に電気刺激を発生させるべくトリガ信号を出力するように設定した場合の動作状態を例示するもので、図５（ｂ）に示すように該輝度値がしきい値Ｌthを超えたと判断した時点から、下回ったと判断される時点までの間、各フレーム毎にトリガ信号を出力し続けていることがわかる。
【００６２】
なお、上記ステップＳ３７で設定する電気刺激の発生状態を変更するための条件とは、他に例えば、画像データの各フレームまたは特定ライン位置範囲での平均値、分散値などが所定のしきい値を超えるか、あるいは下回るか、などといったことを選択することができるものとする。
【００６３】
このように本実施の形態によれば、測定されたフレームあるいはラインのデータから、同期信号の出力位置、出力状態を変更設定することで、測定対象の経時変化に応じて同期信号の出力条件を変更させることが可能となる。
【００６４】
（第３の実施の形態）
以下本発明の第３の実施の形態に係る走査型レーザ顕微鏡について図面を参照して説明する。
【００６５】
図６は走査型レーザ顕微鏡全体のシステム構成について示すもので、ほぼ基本的に上記図８で示したものと同様であるものとして、同一部分には同一符号を付してその説明は省略する。
【００６６】
しかして、制御ユニット２には電気刺激発生器３に代えてレーザ光量調節器３１が接続され、制御ユニット２はその制御を行なう。
【００６７】
レーザ光量調節器３１は、レーザ光源４と光学ユニット１との間に配設され、音響光学素子を用いて構成されるもので、レーザ光源４で発振されたレーザ光の光量を制御ユニット２からの制御に基づいて減衰調節した後に光学ユニット１に供給する。
【００６８】
上記制御ユニット２内の構成については上記図１で示したものとほぼ同様であるものとし、同一部分には同一符号を付してその図示及び説明は省略する。
【００６９】
次に、制御ユニット２内の同期信号発生回路１２′の構成について図７を用いて説明する。
【００７０】
同図において、同期信号発生回路１２′は、同期信号用メモリ２１′、クロック発生回路２３、及び同期信号メモリコントローラ２２から構成され、同期信号メモリコントローラ２２は、その内部にクロック発生回路２３からのクロックにより動作するカウンタを有するもので、この同期信号メモリコントローラ２２からの信号を受けて記憶する同期信号用メモリ２１′は、トリガ信号用に複数ｎビットのデータを記憶するもので、そのｎビットのデータはＤ／Ａコンバータ３２に出力されてアナログ化され、上記レーザ光量調節器３１へ供給される。
【００７１】
このような構成とすれば、２次元走査面内で、任意の位置にレーザ光量調節器３１によって任意の強度に調節したレーザ光を照明光として与えることが可能となる。
【００７２】
なお、レーザ光量調節器３１はＤ／Ａコンバータ３２でアナログ化した信号に基づいてレーザ光量を可変調節するものとして説明したが、複数ｂｉｔのデジタル信号を受付けることができる外部接続機器に対しては、Ｄ／Ａコンバータ３２を用いず、同期信号用メモリ２１′からのデジタル出力を直接送出することができる。
【００７３】
また、制御ユニット２に接続する外部接続機器としては、レーザ光量調節器３１に限らないことは勿論であり、本実施の形態によれば、そのような外部接続機器を時間的に正確に、且つ精細に制御することが可能になる。
【００７４】
なお、本発明は上記第１乃至第３の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲内で種々変形して実施することが可能であるものとする。
【００７５】
【発明の効果】
請求項１記載の発明によれば、各フレームあるいは各ライン毎に任意に設定でき、且つ各フレームまたは各ラインで同期信号の出力位置を画素単位で任意に設定できるため、例えば、測定対象である細胞への刺激と、細胞の特定画素位置における経時変化を正確に測定することが可能となる。
【００７６】
請求項２記載の発明によれば、上記請求項１記載の発明の効果に加えて、測定された上記フレームあるいはライン上のデータに基づいて同期信号の出力位置を設定することで、測定対象の経時変化に応じて、同期信号の出力位置を変更させることが可能となる。
【００７７】
請求項３記載の発明によれば、上記請求項１または２記載の発明の効果に加えて、同期信号の出力位置と出力レベルが設定できるようになり、時間的な正確さと共に、得られるデータに対応して動作する、この走査型レーザ顕微鏡に外部接続された機器を精細に制御することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係る制御ユニット内の構成を示すブロック図。
【図２】同実施の形態に係る同期信号発生回路内の詳細な回路構成を示すブロック図。
【図３】同実施の形態に係る動作時の処理内容を示すフローチャート。
【図４】本発明の第２の実施の形態に係る動作時の処理内容を示すフローチャート。
【図５】同実施の形態に係る動作状態を例示する図。
【図６】本発明の第３の実施の形態に係る走査型レーザ顕微鏡のシステム全体の構成を示すブロック図。
【図７】同実施の形態に係る同期信号発生回路内の詳細な回路構成を示すブロック図。
【図８】一般的な走査型レーザ顕微鏡のシステム全体の構成を示すブロック図。
【符号の説明】
１…光学ユニット
２…制御ユニット
３…電気刺激発生器
４…レーザ光源
５…試料
６…表示装置
７…入力手段
１１…スキャナ波形発生回路
１２，１２′…同期信号発生回路
１３…Ａ／Ｄ変換回路
１４…ＣＰＵ
１５…システムメモリ
１６…画像表示回路
２１，２１′…同期信号用メモリ
２２…同期信号メモリコントローラ
２３…クロック発生回路
３１…レーザ光量調節器
３２…Ｄ／Ａコンバータ
Claims (3)
- 水平及び垂直の少なくとも一方の走査に同期した同期信号を出力する走査型レーザ顕微鏡において、
各フレームまたは各ライン毎に任意に設定でき、且つ各フレームまたは各ライン上で同期信号の出力位置を画素単位で任意に設定できる出力位置設定手段を備えたことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。 - 上記出力位置設定手段は、測定された上記フレームまたはライン上のデータに基づいて以降のフレームまたはライン上での同期信号の出力位置を設定されることを特徴とする請求項１記載の走査型レーザ顕微鏡。
- 上記出力位置設定手段は、出力する同期信号のレベルを可変設定することを特徴とする請求項１または２記載の走査型レーザ顕微鏡。
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