JP4512219B2 - 光走査型顕微鏡 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物、医学分野の研究に用いられる光走査型顕微鏡に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
生物、医学の研究において、レーザ光を用いた走査型共焦点顕微鏡(以下、LSMと称する)の利用が広く一般的になってきている。特に、LSMは、生きた細胞の生理現象の解明の研究に広く用いられてきており、この分野での研究の必須の道具になっている。
【0003】
一般的なLSMでは、2次元、3次元または時間変化を合わせて通称4次元での画像取得にその機能の主眼がおかれ、得られた画像をもとに3次元画像の構築や解析が行なわれている。
【0004】
ところで、LSMでの画像取得には、通常蛍光試薬が用いられ、レーザ光により細胞内に導入した蛍光試薬を励起し、細胞から発せられた蛍光を集光することで細胞の画像を得るようにしている。
【0005】
ところが、このような蛍光試薬は、レーザ光の照射強度と時間に比例して励起される蛍光強度が急激に減衰することが知られている。
【0006】
このため、蛍光試薬の退色を少しでもなくすため、特定の部分領域を任意に切り出す方法が考えられている。特開平9−189864号公報は、このような考えに基づくもので、レーザ光を発する光源から細胞(以下、試料と称する。)までの光路中に、レーザ光が試料に向かうのを阻止する状態と、試料に向かうのを許可する状態とを切り替えるレーザ光切り替え手段を設け、このレーザ光切り替え手段を走査位置情報に基づき走査範囲内の所定の部分領域で切り替えるようにしている。
【0007】
このような構成によれば、走査中にレーザ光を切り替えることで、所定の部分領域のみの画像を得ることが可能で、同時に、既に得られた画像をもとに所定領域のみを切り出し指定し、画像を得ることが可能になる。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、最近、脳・神経研究において、神経細胞相互間の繋ぎであるシナプスと呼ばれる部位の、より一層の厳密な解析が新たな研究テーマとして浮上してきている。
【0009】
ところが、ここで取り扱う、シナプス間の信号伝達は、数msec以下と非常に速く、こうした部位の変化を観察するには、上述した特開平9−189864号公報に開示された2次元走査するものでは、十分な観察を行なうことができない。
【0010】
このような事情から、レーザ光を一点に固定し、このポイントでの変化の観察を行なうことが考えられている。この場合、光学的な観察と、以前より実施されている電気信号計測による細胞の生理現象の観察とを同時に行なう必要があり、こうした電気信号による計測では、同期信号発生手段による信号と計測手段とを同期させて細胞への刺激を一定周期で繰り返してその変化を観察するようにしている。また、このような観察では、繰り返しの周期をより短くしたいとの要求もあり、こうした変化の観察は、短くて数分から数時間に至るまで行なわれる。
【0011】
本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、試料のより詳細な観察を可能にした光走査型顕微鏡を提供することを目的とする。
【0012】
【課題を解決するための手段】
請求項1記載の発明は、レーザ光を発する光源と、この光源からのレーザ光のスポットを試料の所定位置に保持させるスポット保持手段と、前記試料からの光を検出する検出手段と、前記試料に対して刺激を与えるトリガ信号を発生するトリガ発生手段と、前記トリガ発生手段のトリガ信号に同期して同期信号を発生する同期信号発生手段と、この同期信号発生手段の同期信号に応じて前記試料に対するレーザ光の照射の要否を切替えるレーザ光切替え手段とを具備したことを特徴としている。
【0013】
請求項2記載の発明は、請求項1記載の発明において、前記同期信号発生手段の2つの同期信号間に複数の同期信号を発生する高速同期信号発生手段を有し、前記レーザ光切替え手段は、前記高速同期信号発生手段の高速同期信号に応じて前記試料に対するレーザ光の照射の要否を切替えることを特徴としている。
【0014】
請求項3記載の発明は、請求項1または記載の発明において、前記スポット保持手段は、前記同期信号発生手段の同期信号に同期させてレーザ光のスポット保持位置を移動可能にしたことを特徴としている。
【0015】
請求項4記載の発明は、波長の異なるレーザ光を発する複数の光源と、これら光源からのレーザ光のスポットを試料の所定位置に保持させるスポット保持手段と、前記試料からの光を検出する検出手段と、前記試料に対して刺激を与えるトリガ信号を発生するトリガ発生手段と、前記トリガ発生手段のトリガ信号に同期して同期信号を発生する同期信号発生手段と、前記複数の光源に対応させて複数設けられ、前記同期信号発生手段の同期信号に応じて順に選択され、それぞれ前記試料に対する前記光源のレーザ光の照射の要否を切替えるレーザ光切替え手段とを具備したことを特徴としている。
【0016】
請求項5記載の発明は、請求項4記載の発明において、前記同期信号発生手段の2つの同期信号間に複数の同期信号を発生する高速同期信号発生手段を有し、前記レーザ光切替え手段は、前記高速同期信号発生手段の高速同期信号に応じて順に選択され、それぞれ前記試料に対するレーザ光の照射の要否を切替えることを特徴としている。
【0017】
この結果、本発明によれば、試料上の所定位置に対する変化を一定の周期で繰り返し観察することができる。
【0018】
本発明によれば、さらにレーザ光を高速に切替えることができる。
【0019】
本発明によれば、試料上のレーザ光のスポット位置を移動しながら、試料の詳細観察を実現できる。
【0020】
本発明によれば、異なる波長の蛍光を同時に励起し、これらの観察を行なうことができる。
【0021】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態を図面に従い説明する。
【0022】
(第1の実施の形態)
図1は、本発明が適用される光走査型顕微鏡の概略構成を示している。図において、1、2は、レーザ光を発生するレーザ光源で、これらレーザ光源1、2は、波長の異なるレーザ光を発するものである。そして、これらレーザ光源1、2から発せられるレーザ光は、レーザ光切換え部3を介して光分光器4に進む。
【0023】
レーザ光切替え部3は、後述するトリガ発生器13のトリガ信号に同期して制御部11より与えられるレーザ光切替え信号によりレーザ光が試料7に向かうのを許可する第1の状態とレーザ光が試料7に向かうのを阻止する第2の状態を切替えるもので、例えば、AOTFフィルタ(透過波長選択フィルタ)などが用いられる。光分光器4は、光を任意の波長で選択反射・透過するものである。
【0024】
そして、光分光器4で反射されたレーザ光は、光走査部5、対物レンズ6を介して試料7に照射される。ここで、光走査部5は、試料7に対しレーザ光を2次元的に走査するとともに、試料7の所定位置にレーザ光のスポットを保持させる機能を有している。
【0025】
また、試料7からの光は、対物レンズ6、光走査部5を介して光分光器4に進み、今度は、光分光器4を透過され、ピンホール14を介して光選択器8に入射される。光選択器8は、例えば、570nm以下の任意の波長の光を反射、570nm以上の波長の光を透過するものである。
【0026】
そして、光選択器8を透過された光は、第1の光検出器9で、光選択器8より反射された光は、第2の光検出器10でそれぞれ検出される。
【0027】
一方、制御部11は、パソコン12に接続されていて、パソコン12からの指令に基づいて同期信号発生手段のトリガ発生器13にトリガ信号を発生させ、このトリガ信号を試料7に対し刺激として与え、このときのトリガ信号に同期して、レーザ光切替え部3にレーザ光切替え信号を与えるようになっている。
【0028】
次に、このように構成した実施の形態の動作を説明する。
【0029】
まず、光走査部5によりレーザ光のスポット位置を移動して、試料7上の所望の位置に保持させる。
【0030】
この状態から、制御部11の指示により、トリガ発生器13より図2(a)に示すようなトリガ信号が発生し、試料7に刺激として与えられる。また、このトリガ信号に同期して同図(b)に示すようなレーザ光切替え信号がレーザ光切替え部3に与えられる。これにより、レーザ光切替え部3は、レーザ光源1(2)からのレーザ光が試料7に向かうのを阻止する第2の状態から試料7に向かうのを許可する第1の状態に切替え、この間、レーザ光は、光分光器4で反射され、光走査部5、対物レンズ6を介して試料7に照射される。また、試料7からの反射光または蛍光は、対物レンズ6、光走査部5を介して光分光器4に進み、ピンホール14を介して光選択器8に入射する。この光選択器8を透過された光は、第1の光検出器9で、光選択器8より反射された光は、第2の光検出器10でそれぞれ検出される。
【0031】
この場合、トリガ発生器13のトリガ信号の繰り返し周波数とレーザ光切替え部3での第1および第2の状態の切替え時間は任意に設定可能であるが、例えばトリガ信号の繰り返し周波数を1KHzとすると、レーザ光切替え信号の繰り返し周波数は、1KHzで、切替え時間は、0.7msecとなる。
【0032】
従って、このようにすれば、レーザ光のスポット位置を試料7の所望する1点に固定し、この状態からトリガ発生器13よりトリガ信号を発生し、試料7に刺激として与えるとともに、このトリガ信号に同期して、レーザ光切替え部3によりレーザ光の試料7へのレーザ光の照射の要否を切替え、試料7からの反射光または蛍光の検出を可能にしたので、例えば、上述したシナプスと呼ばれる部位の変化に対しても、一定周期で繰り返し刺激を与えながら、繰り返して変化を観察することができるようになり、この種試料のより詳細な観察を実現することができる。
【0033】
(第2の実施の形態)
図3は、本発明の第2の実施の形態の概略構成を示すもので、図1と同一部分には、同符号を付している。
【0034】
この場合、レーザ光源1、2にそれぞれ対応させてレーザ光切替え部21、22を設けている。その他は、図1と同様である。
【0035】
このようにしても、基本的には、第1の実施の形態と同様である。まず、光走査部5によりレーザ光のスポット位置を移動して、試料7上の所望の位置に保持させる。この状態から、制御部11の指示により、トリガ発生器13より図4(a)に示すようなトリガ信号が発生し、試料7に刺激として与えられ、また、このトリガ信号に同期して同図(b)に示すようなレーザ光切替え信号a、bがレーザ光切替え部21と22に交互に与えられ、レーザ光切替え部21、22が順に選択される。
【0036】
これにより、レーザ光切替え信号aがレーザ光切替え部21に与えられると、レーザ光源1のレーザ光が、試料7に照射され、試料7からの反射光または蛍光が第1および第2の光検出器9、10で検出され、また、レーザ光切替え信号bがレーザ光切替え部22に与えられると、レーザ光源2のレーザ光が、試料7に照射され、試料7からの反射光または蛍光が第1または第2の光検出器9、10で検出されるようになる。
【0037】
従って、このようにしても上述した第1の実施の形態と同様な効果が得られ、加えて、レーザ光源1、2から波長の異なるレーザ光が交互に試料7に照射するようにできるので、異なる波長の蛍光を同時に励起し、これらの観察を行なうことができる。
【0038】
(第3の実施の形態)
図5は、本発明の第3の実施の形態の概略構成を示すもので、図1と同一部分には、同符号を付している。
【0039】
この場合、トリガ発生器13からのトリガ信号の1周期内に複数の同期信号を発生する高速同期信号発生器31を設け、この高速同期信号発生器31からの高速同期信号に同期して、レーザ光切替え部3にレーザ光切替え信号を与えるようになっている。
【0040】
このようにしても、基本的には、第1の実施の形態と同様で、制御部11の指示により、トリガ発生器13より図6(a)に示すようなトリガ信号が発生し、試料7に刺激として与えられ、また、このトリガ信号に同期して高速同期信号発生器31より同図(b)に示すような高速同期信号が発生し、この高速同期信号に同期してレーザ光切替え信号をレーザ光切替え部3に与えられる。
【0041】
従って、このようにしても上述した第1の実施の形態と同様な効果が得られ、加えて、高速同期信号に同期して、さらにレーザ光を高速に切替えることができるので、試料のさらなる詳細な観察が可能になる。
【0042】
(第4の実施の形態)
第7は、本発明の第4の実施の形態の概略構成を示すもので、図2と同一部分には、同符号を付している。
【0043】
この場合、トリガ発生器13からのトリガ信号の1周期内に複数の同期信号を発生する高速同期信号発生器32を設け、この高速同期信号発生器32からの高速同期信号に同期して、レーザ光切替え信号a、bをレーザ光切替え部21、22に交互に与え、順に選択するようになっている。
【0044】
このようにしても、基本的には、第2の実施の形態と同様で、制御部11の指示により、トリガ発生器13より図8(a)に示すようなトリガ信号が発生し、試料7に刺激として与えられ、また、このトリガ信号に同期して高速同期信号発生器32より同図(b)に示すような高速同期信号が発生し、この高速同期信号に同期して同図(c)(d)に示すようにレーザ光切替え信号a、bがレーザ光切替え部21と22に交互に与えられる。
【0045】
従って、このようにしても上述した第2の実施の形態と同様な効果が得られ、加えて、高速同期信号に同期して、さらにレーザ光を高速に切替えることができるので、試料のさらなる詳細な観察が可能になる。
【0046】
(第5の実施の形態)
上述した実施の形態では、レーザ光のスポット位置を試料7上の所望する1点に固定するようにしたが、この第5の実施の形態では、レーザ光のスポット位置を固定せずに、任意に動かすことができるようになっている。
【0047】
この場合、基本的には、図7に示す第4の実施の形態で述べたものと同様で、制御部11の指示により、トリガ発生器13より図9(a)に示すようなトリガ信号が発生すると、このトリガ信号に同期して同図(b)に示すようにレーザ光のスポット位置がA点とB点との間で交互に切替えられる、また、トリガ信号に同期して高速同期信号発生器32より同図(c)に示すような高速同期信号が発生し、この高速同期信号に同期して同図(d)(e)に示すようにレーザ光切替え信号a、bがレーザ光切替え部21と22に交互に与えられる。
【0048】
従って、このようにすれば、レーザ光のスポット位置を移動しながら、試料のより詳細な観察を実現することができる。
【0049】
なお、上述した各実施の形態では、レーザ光切替え部3は、制御部11に接続される場合を述べているが、パソコン12に直接接続してもよい。また、トリガ信号は、トリガ発生器13より発生するようにしたが、外部からトリガ信号を入力するようにしてもよい。さらに、光選択器8は、570nmの波長を境に分光するものを説明したが、他の波長のものを用いてもよく、またハーフミラーを用いてもよい。さらにまた、上述では2個のレーザ光源1、2の場合を述べたが、レーザ光源は、1個でも3個以上であってもよい。
【0050】
また、上述した実施の形態では、各同期信号を一定周期で発生させたもので説明したが、これに限るものでなく、例えば、途中で周期を変えたり、任意に発生させるようにしてもよい。また、2個のレーザ光の切替えは、交互に行なわず例えば任意に選択するようにしてもよい。また、上述した実施の形態では、光走査部5でレーザ光を2次元的に走査させていたが、レーザ光を固定しておき試料(ステージ側)を2次元的に移動させてもよい。
【0051】
【発明の効果】
以上述べたように本発明によれば、試料上の所定位置にレーザ光のスポットを保持した状態で、同期信号に応じて、試料に照射されるレーザ光の要否を高速に切り替えることにより、試料のより詳細な観察を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の第1の実施の形態の概略構成を示す図。
【図2】第1の実施の形態の動作を説明するためのタイムチャート。
【図3】本発明の第2の実施の形態の概略構成を示す図。
【図4】第2の実施の形態の動作を説明するためのタイムチャート。
【図5】本発明の第3の実施の形態の概略構成を示す図。
【図6】第3の実施の形態の動作を説明するためのタイムチャート。
【図7】本発明の第4の実施の形態の概略構成を示す図。
【図8】第4の実施の形態の動作を説明するためのタイムチャート。
【図9】本発明の第5の実施の形態の動作を説明するためのタイムチャート。
【符号の説明】
1.2…レーザ光源
3…レーザ光切換え部
4…光分光器
5…光走査部
6…対物レンズ
7…試料
8…光選択器
9…第1の光検出器
10…第2の光検出器
11…制御部
12…パソコン
13…トリガ発生器
14…ピンホール
21、22…レーザ光切替え部
31、32…高速同期信号発生器
Claims (6)
- レーザ光を発する光源と、
この光源からのレーザ光のスポットを試料の所定位置に保持させるスポット保持手段と、
前記試料からの光を検出する検出手段と、
前記試料に対して刺激を与えるトリガ信号を発生するトリガ発生手段と、
前記トリガ発生手段のトリガ信号に同期して同期信号を発生する同期信号発生手段と、
この同期信号発生手段の同期信号に応じて前記試料に対するレーザ光の照射の要否を切替えるレーザ光切替え手段と
を具備したことを特徴とする光走査型顕微鏡。 - 前記同期信号発生手段の2つの同期信号間に複数の同期信号を発生する高速同期信号発生手段を有し、
前記レーザ光切替え手段は、前記高速同期信号発生手段の高速同期信号に応じて前記試料に対するレーザ光の照射の要否を切替えることを特徴とする請求項1記載の光走査型顕微鏡。 - 前記スポット保持手段は、前記同期信号発生手段の同期信号に同期させてレーザ光のスポット保持位置を移動可能にしたことを特徴とする請求項1または2記載の光走査型顕微鏡。
- 波長の異なるレーザ光を発する複数の光源と、
これら光源からのレーザ光のスポットを試料の所定位置に保持させるスポット保持手段と、
前記試料からの光を検出する検出手段と、
前記試料に対して刺激を与えるトリガ信号を発生するトリガ発生手段と、
前記トリガ発生手段のトリガ信号に同期して同期信号を発生する同期信号発生手段と、
前記複数の光源に対応させて複数設けられ、前記同期信号発生手段の同期信号に応じて順に選択され、それぞれ前記試料に対する前記光源のレーザ光の照射の要否を切替えるレーザ光切替え手段と
を具備したことを特徴とする光走査型顕微鏡。 - 前記同期信号発生手段の2つの同期信号間に複数の同期信号を発生する高速同期信号発生手段を有し、
前記レーザ光切替え手段は、前記高速同期信号発生手段の高速同期信号に応じて順に選択され、それぞれ前記試料に対するレーザ光の照射の要否を切替えることを特徴とする請求項4記載の光走査型顕微鏡。 - 前記スポット保持部は、前記同期信号発生手段の同期信号に同期させてレーザ光のスポット保持位置を移動可能にしたことを特徴とする請求項4または5記載の光走査型顕微鏡。
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