JP7064315B2 - 光検出装置およびレーザ走査型顕微鏡 - Google Patents
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Description
また、パルス状のレーザ光のパルス発振周波数を遥かに上回る周波数でレーザ光および蛍光の両方をサンプリングして、レーザ光による励起のタイミングに同期した蛍光のデータを用いた演算を行うレーザ走査型顕微鏡が知られている(例えば、特許文献2参照。)。
また、特許文献2のレーザ走査型顕微鏡によれば、そのような不都合はないが、高速にサンプリングを行うことができるA/D変換器が高価であってコストが嵩むという不都合がある。また、高速にサンプリングを行って取得される蛍光のデータが膨大となり、データ処理量および記憶容量が増大するという不都合もある。
本発明の一態様は、パルス状のレーザ光を射出する光源から出力される同期信号に基づいて、前記レーザ光のパルス周波数のN(Nは1以上の整数)倍の周波数を有しかつ前記レーザ光の位相と同期したクロックをフェイズロックループにより生成するクロック生成部と、該クロック生成部により生成された前記クロックの遅延量を調整してサンプリングクロックを生成する遅延調整部とを備えるPLL部と、該PLL部から出力される前記サンプリングクロックによって、前記レーザ光が照射されることにより試料から出力される信号光のサンプリングを行うA/D変換部と、該A/D変換部から出力されるサンプリングデータを連続してN個取得する毎に1つのデータ配列に格納する受信データ処理部とを備える光検出装置を提供する。
レーザ光の同期信号のN倍の周波数を有するサンプリングクロックを用いて信号光をサンプリングするので、N個のサンプリングデータを取得する時間周期とレーザ光のパルス発振周期とは完全に一致している。これにより、レーザ光のパルス発振周期の境目でデッドタイムを発生させることなく損失なくサンプリングデータを取得することができる。
このようにすることで、試料から出力される蛍光等の信号光のように、ピーク強度となった後に徐々に減衰するような信号光の形状を精度よく検出することができる。
このようにすることで、配列化開始トリガ生成部により、どのサンプリングデータからデータ配列を開始するかを決定する配列化開始トリガが生成されるので、光源からレーザ光が発せられてからA/D変換部においてサンプリングされるまでに発生する種々の遅延を含めた遅延量で配列化開始トリガを設定することができ、試料にレーザ光がパルス照射される度に発生する信号光を、そのパルス照射周期毎に区切って精度よく検出することができる。
このようにすることで、同期信号に同期して生成されるサンプリングクロックの数に換算された遅延差だけ同期信号から遅れた時点に配列化開始トリガを発生させることができ、レーザ光に対応する信号光を精度よく検出することができる。
本実施形態に係るレーザ走査型顕微鏡1は、図1に示されるように、パルス状のレーザ光を射出する光源2と、該光源2からのレーザ光を試料Xに照射し、試料Xにおいて発生する蛍光(信号光)を検出する顕微鏡本体3と、該顕微鏡本体3により検出された蛍光をサンプリングしてデジタルの蛍光強度信号を生成する光検出装置4と、顕微鏡本体3を制御するとともに、光検出装置4から受信した蛍光強度信号を用いて蛍光画像を生成する制御部5と、該制御部5により生成された蛍光画像を表示する表示部6とを備えている。
顕微鏡本体3は、光源2からのレーザ光を2次元的に走査するスキャナ(走査部)8と、該走査部8により走査されたレーザ光を試料Xに集光する一方、試料Xにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ(光学系)9と、該対物レンズ9により集光された蛍光をレーザ光の光路から分岐するダイクロイックミラー10と、該ダイクロイックミラー10により分岐された蛍光を検出する光検出器(例えば、光電子増倍管)11とを備えている。
クロック生成部14は、光源2から出力される同期信号に基づいて、レーザ光のパルス周波数のN(Nは1以上の整数)倍の周波数を有し、かつ、レーザ光の出射周期と同期したクロックをフェイズロックループにより生成するようになっている。
遅延調整部15は、クロック生成部14により生成されたクロックの第1の遅延量DT1を調整してサンプリングクロックを生成するようになっている。第1の遅延量DT1については後述する。
制御部5は、スキャナ8を駆動する走査位置情報と、1つのデータ配列に格納されたN個のサンプリングデータとを対応づけることにより、2次元的な蛍光画像を生成するようになっている。
光源2からは、図3に示されるように、所定の周期(パルス発振周期)でパルス状のレーザ光が射出され、光源2の同期信号出力部7からは、パルス状のレーザ光の射出周期に同期する同一周期の同期信号が出力される。
PLL部12に同期信号が入力されると、同期信号はクロック生成部14に入力され、クロック生成部14において、図3に示されるように、入力された同期信号を元にパルス状のレーザ光のパルス周波数のN倍の周波数を持ち、かつ、その位相がレーザ光の位相と同期したクロックが生成される。
そして、受信データ処理部16においては、A/D変換されたデータがN個ごとに配列化される。これにより、レーザ光の周期ごとに検出されたデータ列を生成することができる。
図3における第2の遅延量DT2については後述する。
また、遅延調整部15において調整するクロックの第1の遅延量DT1については、図4に示されるように、所望の信号を取得することができる第1の遅延量DT1に自動調整されることにしてもよい。例えば、第1の遅延量DT1を微少変動させ、取得されるサンプリングデータの信号レベルが最大値となる第1の遅延量DT1を採用してもよい。あるいは、光検出装置4にテストパターン生成装置(図示略)を接続し、入力されたテストパターンに基づいて設定することにしてもよい。
第2の遅延量DT2を設定する方法としては、例えば、図5に示されるように、試料Xを配置するステージに、試料Xに代えてミラー17を配置し、光源2から射出したレーザ光をミラー17によって反射させるようにする。
これにより、ミラー17において反射されたレーザ光が、光検出器11に入射され、検出信号として出力されてA/D変換器13によりサンプリングされる。
この場合、光検出器11は対物レンズ9の焦点と光学的共役位置に配置されたピンホールを経由した後に配置される点で、多光子励起レーザ顕微鏡を用いた場合と相違している。その他の点においては多光子励起レーザ顕微鏡を用いた場合と共通の構成と信号処理で蛍光検出を行うものである。
2 光源
4 光検出装置
8 スキャナ(走査部)
9 対物レンズ(光学系)
12 PLL部
13 A/D変換器(A/D変換部)
14 クロック生成部
15 遅延調整部
16 受信データ処理部
18 配列化開始トリガ生成部
X 試料
Claims (5)
- パルス状のレーザ光を射出する光源から出力される同期信号に基づいて、サンプリングクロックを生成するPLL部と、
該PLL部から出力される前記サンプリングクロックによって、前記レーザ光が照射されることにより試料から出力される信号光のサンプリングを行うA/D変換部と、
該A/D変換部から出力されるサンプリングデータを連続してN個取得する毎に1つのデータ配列に格納する受信データ処理部とを備え、
前記PLL部は、
前記レーザ光のパルス周波数のN(Nは2以上の整数)倍の周波数を有しかつ前記レーザ光の位相と同期したクロックをフェイズロックループにより生成するクロック生成部と、
該クロック生成部により生成された前記クロックの遅延量を調整してサンプリングクロックを生成する遅延調整部とを備え、
前記受信データ処理部が、前記A/D変換部から順次出力される前記サンプリングデータのうち、どの前記サンプリングデータから前記データ配列を開始するかの配列化開始トリガを生成する配列化開始トリガ生成部を備え、
該配列化開始トリガ生成部は、前記同期信号の立ち上がりに対する、前記信号光が前記A/D変換部によりサンプリングされるまでの遅延量に基づいて、前記配列化開始トリガを生成する、光検出装置。 - 前記クロックの遅延量は、検出される前記信号光のレベルが最大となる位置をサンプリングするように設定されている請求項1に記載の光検出装置。
- 前記配列化開始トリガ生成部が、前記同期信号と、前記レーザ光が前記試料において反射され前記A/D変換部にアナログ信号として伝達されるまでの到達時刻との遅延差をサンプリングクロック数に換算して前記配列化開始トリガのタイミングを決定する請求項1または請求項2に記載の光検出装置。
- 前記受信データ処理部は、さらに、前記レーザ光の各パルスに対応した前記N個のデータ配列のうち、各パルス射出後の特定の時間区間に検出されたサンプリングデータを抜き出してデータ処理を行う請求項1から請求項3のいずれかに記載の光検出装置。
- 前記光源からの前記レーザ光を2次元的に走査する走査部と、
該走査部により走査された前記レーザ光を前記試料に照射し、前記試料から発生する前記信号光を集光する光学系と、
該光学系により集光された前記信号光を検出する請求項1から請求項4のいずれかに記載の光検出装置とを備えるレーザ走査型顕微鏡。
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