JPH11132953A - 蛍光寿命測定方法および装置 - Google Patents
蛍光寿命測定方法および装置Info
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- JPH11132953A JPH11132953A JP9297321A JP29732197A JPH11132953A JP H11132953 A JPH11132953 A JP H11132953A JP 9297321 A JP9297321 A JP 9297321A JP 29732197 A JP29732197 A JP 29732197A JP H11132953 A JPH11132953 A JP H11132953A
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 蛍光の蛍光寿命または蛍光減衰曲線を効率良
く測定することができる蛍光寿命測定方法および装置を
提供する。 【解決手段】 励起光源部１０から出力されたパルス励
起光Ａは試料９０に照射され、その照射に伴い試料９０
から発生した蛍光Ｂは光検出器１０により検出される。
パルス励起光Ａの各パルス毎に、パルス励起光Ａが試料
９０に照射された時刻から最初の蛍光光子が光検出器２
０により検出された時刻までの蛍光光子検出時間が時間
測定部３０により測定され、また、光検出器２０により
検出された蛍光光子の個数が蛍光光子数測定部４０によ
り測定される。蛍光寿命または蛍光減衰曲線は、試料９
０に繰り返し照射されたパルス励起光Ａの各パルス毎に
測定された蛍光光子検出時間および蛍光光子の個数に基
づいて、蛍光寿命推定部５０により推定される。
く測定することができる蛍光寿命測定方法および装置を
提供する。 【解決手段】 励起光源部１０から出力されたパルス励
起光Ａは試料９０に照射され、その照射に伴い試料９０
から発生した蛍光Ｂは光検出器１０により検出される。
パルス励起光Ａの各パルス毎に、パルス励起光Ａが試料
９０に照射された時刻から最初の蛍光光子が光検出器２
０により検出された時刻までの蛍光光子検出時間が時間
測定部３０により測定され、また、光検出器２０により
検出された蛍光光子の個数が蛍光光子数測定部４０によ
り測定される。蛍光寿命または蛍光減衰曲線は、試料９
０に繰り返し照射されたパルス励起光Ａの各パルス毎に
測定された蛍光光子検出時間および蛍光光子の個数に基
づいて、蛍光寿命推定部５０により推定される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、励起光が照射され
た蛍光物質から発生する蛍光の蛍光寿命または蛍光減衰
曲線を測定する蛍光寿命測定方法および装置に関するも
のである。
た蛍光物質から発生する蛍光の蛍光寿命または蛍光減衰
曲線を測定する蛍光寿命測定方法および装置に関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】従来より、試料に含まれる蛍光物質から
発生する蛍光の蛍光寿命の測定方法として時間相関単一
光子計数法による方法が知られている。この時間相関単
一光子計数法による測定では、パルス励起光の１パルス
照射当たりに検出される蛍光の平均光子数が１より充分
に小さい値（例えば、０．０１）となるような強度の弱
いパルス励起光を試料に照射し、パルス励起光が試料に
照射された時刻から最初に蛍光光子を検出した時刻まで
の蛍光光子検出時間を測定する。そして、試料にパルス
励起光を繰り返し照射して蛍光光子検出時間についての
ヒストグラムを生成し、そのヒストグラムに基づいて蛍
光の蛍光寿命を測定するものである。なお、蛍光光子の
検出には光電子増倍管が通常用いられている。
発生する蛍光の蛍光寿命の測定方法として時間相関単一
光子計数法による方法が知られている。この時間相関単
一光子計数法による測定では、パルス励起光の１パルス
照射当たりに検出される蛍光の平均光子数が１より充分
に小さい値（例えば、０．０１）となるような強度の弱
いパルス励起光を試料に照射し、パルス励起光が試料に
照射された時刻から最初に蛍光光子を検出した時刻まで
の蛍光光子検出時間を測定する。そして、試料にパルス
励起光を繰り返し照射して蛍光光子検出時間についての
ヒストグラムを生成し、そのヒストグラムに基づいて蛍
光の蛍光寿命を測定するものである。なお、蛍光光子の
検出には光電子増倍管が通常用いられている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、時間相
関単一光子計数法による測定では、その原理上、パルス
励起光の１パルス照射当たりに検出される蛍光光子の個
数を非常に小さくし、パルス励起光の照射パルス数に対
して蛍光光子検出頻度を数％以下にする必要があること
から、その結果、蛍光寿命の測定精度は悪く、充分な精
度で蛍光寿命を求めるには長時間の測定を必要とすると
いう問題点がある。
関単一光子計数法による測定では、その原理上、パルス
励起光の１パルス照射当たりに検出される蛍光光子の個
数を非常に小さくし、パルス励起光の照射パルス数に対
して蛍光光子検出頻度を数％以下にする必要があること
から、その結果、蛍光寿命の測定精度は悪く、充分な精
度で蛍光寿命を求めるには長時間の測定を必要とすると
いう問題点がある。
【０００４】本発明は、上記問題点を解消する為になさ
れたものであり、蛍光の蛍光寿命または蛍光減衰曲線を
効率良く測定することができる蛍光寿命測定方法および
装置を提供することを目的とする。
れたものであり、蛍光の蛍光寿命または蛍光減衰曲線を
効率良く測定することができる蛍光寿命測定方法および
装置を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明に係る蛍光寿命測
定方法は、パルス励起光が試料に照射されて発生した蛍
光の蛍光寿命または蛍光減衰曲線を推定する蛍光寿命測
定方法であって、(1)パルス励起光を試料に繰り返し照
射して、パルス励起光の各パルス毎に、パルス励起光が
試料に照射された時刻から最初の蛍光光子が検出された
時刻までの蛍光光子検出時間を測定するとともに、検出
された蛍光光子の個数を測定し、(2) パルス励起光の各
パルス毎に測定された蛍光光子検出時間および蛍光光子
の個数に基づいて蛍光寿命または蛍光減衰曲線を推定す
る、ことを特徴とする。
定方法は、パルス励起光が試料に照射されて発生した蛍
光の蛍光寿命または蛍光減衰曲線を推定する蛍光寿命測
定方法であって、(1)パルス励起光を試料に繰り返し照
射して、パルス励起光の各パルス毎に、パルス励起光が
試料に照射された時刻から最初の蛍光光子が検出された
時刻までの蛍光光子検出時間を測定するとともに、検出
された蛍光光子の個数を測定し、(2) パルス励起光の各
パルス毎に測定された蛍光光子検出時間および蛍光光子
の個数に基づいて蛍光寿命または蛍光減衰曲線を推定す
る、ことを特徴とする。
【０００６】また、本発明に係る蛍光寿命測定装置は、
パルス励起光が試料に照射されて発生した蛍光の蛍光寿
命または蛍光減衰曲線を推定する蛍光寿命測定装置であ
って、(1) パルス励起光を出力し試料に照射する励起光
源部と、(2) 蛍光を入力し蛍光の光量に応じた個数の光
電子を放出する光電変換面と、光電変換面から放出され
た光電子を増倍して二次電子を発生させる電子増倍部
と、二次電子の入力に応じて電流パルス信号をそれぞれ
出力する２以上の所定数のアノード電極と、蛍光を透過
させる入射窓を有し光電変換面、電子増倍部および所定
数のアノード電極を内部に含む真空容器と、を有する光
検出器と、(3) パルス励起光が試料に照射された時刻か
ら最初の蛍光光子が光検出器により検出された時刻まで
の蛍光光子検出時間をパルス励起光の各パルス毎に測定
する時間測定部と、(4) 所定数のアノード電極のうち少
なくとも１個の蛍光光子に対応する電流パルス信号を出
力したアノード電極の個数に基づいて、光検出器により
検出された蛍光光子の個数をパルス励起光の各パルス毎
に測定する蛍光光子数測定部と、(5) 試料に繰り返し照
射されたパルス励起光の各パルス毎に時間測定部により
測定された蛍光光子検出時間および蛍光光子数測定部に
より測定された蛍光光子の個数に基づいて、蛍光寿命ま
たは蛍光減衰曲線を推定する蛍光寿命推定部と、を備え
ることを特徴とする。
パルス励起光が試料に照射されて発生した蛍光の蛍光寿
命または蛍光減衰曲線を推定する蛍光寿命測定装置であ
って、(1) パルス励起光を出力し試料に照射する励起光
源部と、(2) 蛍光を入力し蛍光の光量に応じた個数の光
電子を放出する光電変換面と、光電変換面から放出され
た光電子を増倍して二次電子を発生させる電子増倍部
と、二次電子の入力に応じて電流パルス信号をそれぞれ
出力する２以上の所定数のアノード電極と、蛍光を透過
させる入射窓を有し光電変換面、電子増倍部および所定
数のアノード電極を内部に含む真空容器と、を有する光
検出器と、(3) パルス励起光が試料に照射された時刻か
ら最初の蛍光光子が光検出器により検出された時刻まで
の蛍光光子検出時間をパルス励起光の各パルス毎に測定
する時間測定部と、(4) 所定数のアノード電極のうち少
なくとも１個の蛍光光子に対応する電流パルス信号を出
力したアノード電極の個数に基づいて、光検出器により
検出された蛍光光子の個数をパルス励起光の各パルス毎
に測定する蛍光光子数測定部と、(5) 試料に繰り返し照
射されたパルス励起光の各パルス毎に時間測定部により
測定された蛍光光子検出時間および蛍光光子数測定部に
より測定された蛍光光子の個数に基づいて、蛍光寿命ま
たは蛍光減衰曲線を推定する蛍光寿命推定部と、を備え
ることを特徴とする。
【０００７】この蛍光寿命測定装置によれば、励起光源
部から出力されたパルス励起光は試料に照射され、その
照射に伴い試料から発生した蛍光は光検出器により検出
される。パルス励起光の各パルス毎に、パルス励起光が
試料に照射された時刻から最初の蛍光光子が光検出器に
より検出された時刻までの蛍光光子検出時間は、時間測
定部により測定され、また、光検出器により検出された
蛍光光子の個数は、所定数のアノード電極のうち少なく
とも１個の蛍光光子に対応する電流パルス信号を出力し
たアノード電極の個数に基づいて、蛍光光子数測定部に
より測定される。そして、蛍光寿命または蛍光減衰曲線
は、試料に繰り返し照射されたパルス励起光の各パルス
毎に測定された蛍光光子検出時間および蛍光光子の個数
に基づいて、蛍光寿命推定部により推定される。
部から出力されたパルス励起光は試料に照射され、その
照射に伴い試料から発生した蛍光は光検出器により検出
される。パルス励起光の各パルス毎に、パルス励起光が
試料に照射された時刻から最初の蛍光光子が光検出器に
より検出された時刻までの蛍光光子検出時間は、時間測
定部により測定され、また、光検出器により検出された
蛍光光子の個数は、所定数のアノード電極のうち少なく
とも１個の蛍光光子に対応する電流パルス信号を出力し
たアノード電極の個数に基づいて、蛍光光子数測定部に
より測定される。そして、蛍光寿命または蛍光減衰曲線
は、試料に繰り返し照射されたパルス励起光の各パルス
毎に測定された蛍光光子検出時間および蛍光光子の個数
に基づいて、蛍光寿命推定部により推定される。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下、添付図面を参照して本発明
の実施の形態を詳細に説明する。尚、図面の説明におい
て同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省
略する。
の実施の形態を詳細に説明する。尚、図面の説明におい
て同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省
略する。
【０００９】図１は、本実施形態に係る蛍光寿命測定装
置の構成図である。この蛍光寿命測定装置１は、パルス
励起光Ａを出力して試料９０に照射する励起光源部１０
と、試料９０から発生した蛍光Ｂを検出して電流パルス
信号を出力する光検出器２０と、パルス励起光Ａが試料
９０に照射された時刻から最初の蛍光光子が光検出器２
０により検出される時刻までの蛍光光子検出時間をパル
ス励起光Ａの各パルス毎に測定する時間測定部３０と、
光検出器２０から出力される電流パルス信号に基づいて
光検出器２０により検出された蛍光光子の個数をパルス
励起光Ａの各パルス毎に測定する蛍光光子数測定部４０
と、時間測定部３０により測定された蛍光光子検出時間
および蛍光光子数測定部４０により測定された蛍光光子
の個数に基づいて蛍光の蛍光寿命または蛍光減衰曲線を
推定する蛍光寿命推定部５０と、を備えて構成される。
置の構成図である。この蛍光寿命測定装置１は、パルス
励起光Ａを出力して試料９０に照射する励起光源部１０
と、試料９０から発生した蛍光Ｂを検出して電流パルス
信号を出力する光検出器２０と、パルス励起光Ａが試料
９０に照射された時刻から最初の蛍光光子が光検出器２
０により検出される時刻までの蛍光光子検出時間をパル
ス励起光Ａの各パルス毎に測定する時間測定部３０と、
光検出器２０から出力される電流パルス信号に基づいて
光検出器２０により検出された蛍光光子の個数をパルス
励起光Ａの各パルス毎に測定する蛍光光子数測定部４０
と、時間測定部３０により測定された蛍光光子検出時間
および蛍光光子数測定部４０により測定された蛍光光子
の個数に基づいて蛍光の蛍光寿命または蛍光減衰曲線を
推定する蛍光寿命推定部５０と、を備えて構成される。
【００１０】励起光源部１０は、パルスレーザ光源１
１、フォトダイオード１７および波高弁別器１８等を備
えている。パルスレーザ光源１１は、パルス励起光を繰
り返し出力し、反射鏡１２は、そのパルス励起光を反射
し、半透鏡１３は、反射鏡１２により反射されたパルス
励起光の一部を反射させ、残部を透過する。レンズ１４
および１５は、半透鏡１３を透過したパルス励起光をコ
リメートして出力する。一方、レンズ１６は、半透鏡１
３で反射されたパルス励起光を集光し、フォトダイオー
ド１７は、その集光されたパルス励起光を受光して、そ
の光量に応じて電流信号を出力する。波高弁別器１８
は、その電流信号を入力し、パルス励起光が出力された
時刻を示すタイミング信号を出力する。
１、フォトダイオード１７および波高弁別器１８等を備
えている。パルスレーザ光源１１は、パルス励起光を繰
り返し出力し、反射鏡１２は、そのパルス励起光を反射
し、半透鏡１３は、反射鏡１２により反射されたパルス
励起光の一部を反射させ、残部を透過する。レンズ１４
および１５は、半透鏡１３を透過したパルス励起光をコ
リメートして出力する。一方、レンズ１６は、半透鏡１
３で反射されたパルス励起光を集光し、フォトダイオー
ド１７は、その集光されたパルス励起光を受光して、そ
の光量に応じて電流信号を出力する。波高弁別器１８
は、その電流信号を入力し、パルス励起光が出力された
時刻を示すタイミング信号を出力する。
【００１１】この励起光源部１０の半透鏡１３を透過し
たパルス励起光Ａは、レンズ８１により集光され試料９
０に照射される。そして、これに伴い試料９０に含まれ
る蛍光物質から発生した蛍光Ｂは、レンズ８２により集
光され、バンドパスフィルタ８４を通過して励起光の散
乱光等が除去された後、レンズ８３を経て光検出器２０
の入射窓２２の略全面に略一様に入射する。
たパルス励起光Ａは、レンズ８１により集光され試料９
０に照射される。そして、これに伴い試料９０に含まれ
る蛍光物質から発生した蛍光Ｂは、レンズ８２により集
光され、バンドパスフィルタ８４を通過して励起光の散
乱光等が除去された後、レンズ８３を経て光検出器２０
の入射窓２２の略全面に略一様に入射する。
【００１２】光検出器２０は、蛍光Ｂを透過させる入射
窓２２を有する真空容器２１内に、入射した蛍光Ｂの光
量に応じた個数の光電子を放出する光電変換面２３と、
その光電子を順次増倍して多数の二次電子を発生させる
複数段（この図では１１段）のダイノード２４からなる
電子増倍部と、その二次電子を入力して電流パルス信号
を出力する複数個（ここでは８個）のアノード電極２５
と、を備えるものである。８個のアノード電極２５は、
光電変換面２３と平行な面内にアレイ状に配置されてい
る。なお、電子増倍部は、例えば、光電子増倍管におけ
るような多段の格子状ダイノードであってもよいし、マ
イクロチャンネルプレートであってもよい。
窓２２を有する真空容器２１内に、入射した蛍光Ｂの光
量に応じた個数の光電子を放出する光電変換面２３と、
その光電子を順次増倍して多数の二次電子を発生させる
複数段（この図では１１段）のダイノード２４からなる
電子増倍部と、その二次電子を入力して電流パルス信号
を出力する複数個（ここでは８個）のアノード電極２５
と、を備えるものである。８個のアノード電極２５は、
光電変換面２３と平行な面内にアレイ状に配置されてい
る。なお、電子増倍部は、例えば、光電子増倍管におけ
るような多段の格子状ダイノードであってもよいし、マ
イクロチャンネルプレートであってもよい。
【００１３】この光検出器２０において、光電変換面２
３がアノード電極２５に対して低電位とされ、また、各
ダイノード２４それぞれにも所定の電圧が印加されてい
るときに、蛍光Ｂが光電変換面２３に入射すると、その
光量に応じた個数の光電子が光電変換面２３から放出さ
れる。この光電子は、各ダイノード２４により増倍され
て多数の二次電子が発生し、その二次電子は、８個のア
ノード電極２５のうちの何れかのアノード電極に到達す
る。このとき、光電変換面２３上における蛍光光子入射
すなわち光電子放出の位置関係を保持したまま各ダイノ
ード２４で二次電子は増倍される。したがって、二次電
子が到達して電流パルス信号を出力するアノード電極
は、蛍光Ｂの光子が光電変換面２３に入射した位置に対
応したものである。
３がアノード電極２５に対して低電位とされ、また、各
ダイノード２４それぞれにも所定の電圧が印加されてい
るときに、蛍光Ｂが光電変換面２３に入射すると、その
光量に応じた個数の光電子が光電変換面２３から放出さ
れる。この光電子は、各ダイノード２４により増倍され
て多数の二次電子が発生し、その二次電子は、８個のア
ノード電極２５のうちの何れかのアノード電極に到達す
る。このとき、光電変換面２３上における蛍光光子入射
すなわち光電子放出の位置関係を保持したまま各ダイノ
ード２４で二次電子は増倍される。したがって、二次電
子が到達して電流パルス信号を出力するアノード電極
は、蛍光Ｂの光子が光電変換面２３に入射した位置に対
応したものである。
【００１４】時間測定部３０は、増幅器３１、波高弁別
器３２、時間振幅変換器３３およびＡＤ変換器３４を備
えている。増幅器３１は、光検出器２０の電子増倍部の
最終段のダイノード２４から出力されるパルス信号を入
力し、このパルス信号を電圧パルス信号に変換し増幅し
て出力する。なお、ここで、ダイノード２４から出力さ
れるパルス信号を増幅器３１が入力するのは、ダイノー
ド２４は８個のアノード電極２５に対して共通であるか
らである。波高弁別器３２は、増幅器３１から出力され
た電圧パルス信号を入力し、その電圧パルス信号の波高
値が所定の閾値電圧より高い場合にタイミング信号を出
力する。すなわち、この波高弁別器３２から出力される
タイミング信号は、光検出器２０により蛍光Ｂの光子が
検出されたタイミングを示すものである。時間振幅変換
器３３は、波高弁別器１８および波高弁別器３２それぞ
れから出力されたタイミング信号を入力し、これらの２
つのタイミング信号に基づいて、パルス励起光Ａが試料
９０に照射された時刻から最初の蛍光Ｂの光子が光検出
器２０により検出された時刻までの蛍光光子検出時間に
応じた値の電圧信号を出力する。そして、ＡＤ変換器３
４は、時間振幅変換器３３から出力された電圧信号を入
力し、この電圧信号に応じたデジタル信号に変換して、
そのデジタル信号を出力する。このＡＤ変換器３４から
出力されたデジタル信号は、蛍光光子検出時間を表すも
のである。
器３２、時間振幅変換器３３およびＡＤ変換器３４を備
えている。増幅器３１は、光検出器２０の電子増倍部の
最終段のダイノード２４から出力されるパルス信号を入
力し、このパルス信号を電圧パルス信号に変換し増幅し
て出力する。なお、ここで、ダイノード２４から出力さ
れるパルス信号を増幅器３１が入力するのは、ダイノー
ド２４は８個のアノード電極２５に対して共通であるか
らである。波高弁別器３２は、増幅器３１から出力され
た電圧パルス信号を入力し、その電圧パルス信号の波高
値が所定の閾値電圧より高い場合にタイミング信号を出
力する。すなわち、この波高弁別器３２から出力される
タイミング信号は、光検出器２０により蛍光Ｂの光子が
検出されたタイミングを示すものである。時間振幅変換
器３３は、波高弁別器１８および波高弁別器３２それぞ
れから出力されたタイミング信号を入力し、これらの２
つのタイミング信号に基づいて、パルス励起光Ａが試料
９０に照射された時刻から最初の蛍光Ｂの光子が光検出
器２０により検出された時刻までの蛍光光子検出時間に
応じた値の電圧信号を出力する。そして、ＡＤ変換器３
４は、時間振幅変換器３３から出力された電圧信号を入
力し、この電圧信号に応じたデジタル信号に変換して、
そのデジタル信号を出力する。このＡＤ変換器３４から
出力されたデジタル信号は、蛍光光子検出時間を表すも
のである。
【００１５】蛍光光子数測定部４０は、光検出器２０の
アノード電極２５の個数と等しい組数の増幅器４１およ
び波高弁別器４２を備えている。この図では、８組の増
幅器４１および波高弁別器４２が設けられており、各組
それぞれは、８個のアノード電極２５の何れかに対応し
ている。増幅器４１は、アノード電極２５から出力され
た電流パルス信号を入力して電圧パルス信号に変換し、
その電圧パルス信号を増幅して出力する。波高弁別器４
２は、増幅器４１から出力された電圧パルス信号を入力
し、所定の閾値電圧よりも高い波高値を有する電圧パル
ス信号を弁別し、論理パルス信号を出力する。すなわ
ち、測定しようとする蛍光Ｂの蛍光光子少なくとも１個
に対応した波高値を有する電流パルス信号がアノード電
極２５から出力された場合にのみ波高弁別器４２は論理
パルス信号を出力するので、８個の波高弁別器４２のう
ち論理パルス信号を出力した波高弁別器４２の個数は、
光検出器２０により検出された蛍光Ｂの光子数に応じた
ものである。
アノード電極２５の個数と等しい組数の増幅器４１およ
び波高弁別器４２を備えている。この図では、８組の増
幅器４１および波高弁別器４２が設けられており、各組
それぞれは、８個のアノード電極２５の何れかに対応し
ている。増幅器４１は、アノード電極２５から出力され
た電流パルス信号を入力して電圧パルス信号に変換し、
その電圧パルス信号を増幅して出力する。波高弁別器４
２は、増幅器４１から出力された電圧パルス信号を入力
し、所定の閾値電圧よりも高い波高値を有する電圧パル
ス信号を弁別し、論理パルス信号を出力する。すなわ
ち、測定しようとする蛍光Ｂの蛍光光子少なくとも１個
に対応した波高値を有する電流パルス信号がアノード電
極２５から出力された場合にのみ波高弁別器４２は論理
パルス信号を出力するので、８個の波高弁別器４２のう
ち論理パルス信号を出力した波高弁別器４２の個数は、
光検出器２０により検出された蛍光Ｂの光子数に応じた
ものである。
【００１６】蛍光寿命推定部５０は、時間測定部３０の
ＡＤ変換器３４から出力されたデジタル信号と、蛍光光
子数測定部４０の各波高弁別器４２それぞれから出力さ
れた論理パルス信号とを、インターフェース５１を介し
て入力し、演算部５２において、これらデジタル信号お
よび論理パルス信号に基づいて蛍光Ｂの蛍光寿命または
蛍光減衰曲線を推定する。
ＡＤ変換器３４から出力されたデジタル信号と、蛍光光
子数測定部４０の各波高弁別器４２それぞれから出力さ
れた論理パルス信号とを、インターフェース５１を介し
て入力し、演算部５２において、これらデジタル信号お
よび論理パルス信号に基づいて蛍光Ｂの蛍光寿命または
蛍光減衰曲線を推定する。
【００１７】次に、この蛍光寿命測定装置１の作用とと
もに蛍光寿命測定部５０の演算部５２における処理内容
について説明し、併せて、本発明に係る蛍光寿命測定方
法の一実施形態について説明する。
もに蛍光寿命測定部５０の演算部５２における処理内容
について説明し、併せて、本発明に係る蛍光寿命測定方
法の一実施形態について説明する。
【００１８】励起光源部１０内のパルスレーザ光源１１
から繰り返し出力されたパルス励起光Ａは、反射鏡１
２、半透鏡１３、レンズ１４、レンズ１５およびレンズ
８１を経て試料９０に照射され、パルス励起光Ａの照射
に伴い試料９０内の蛍光物質から発生した蛍光Ｂは、レ
ンズ８２、バンドパスフィルタ８４およびレンズ８３を
経て光検出器２０の入射窓２２の略全面に略一様に入射
する。光検出器２０では、蛍光Ｂが入射窓２２を透過し
て光電変換面２３に入射すると、光電変換面２３から光
電子が放出され、複数段のダイノード２４からなる電子
増倍部により二次電子が増倍され、その二次電子が複数
のアノード電極２５の何れかに入射し、二次電子が入射
したアノード電極２５から電流パルス信号が出力され
る。アノード電極２５から出力された電流パルス信号
は、当該アノード電極２５に対応する蛍光光子数測定部
４０内の増幅器４１により電圧パルス信号に変換され、
その電圧パルス信号は、対応する波高弁別器４３に入力
して、論理パルス信号が出力される。このとき、光検出
器２０内に設けられているアノード電極２５の個数と比
較して、パルス励起光Ａの１パルス当たりにおける論理
パルス信号を出力するアノード電極２５の個数が充分に
小さければ、論理パルス信号を出力したアノード電極２
５の個数は、光検出器２０により検出された蛍光光子の
個数に等しいものと考えてよい。
から繰り返し出力されたパルス励起光Ａは、反射鏡１
２、半透鏡１３、レンズ１４、レンズ１５およびレンズ
８１を経て試料９０に照射され、パルス励起光Ａの照射
に伴い試料９０内の蛍光物質から発生した蛍光Ｂは、レ
ンズ８２、バンドパスフィルタ８４およびレンズ８３を
経て光検出器２０の入射窓２２の略全面に略一様に入射
する。光検出器２０では、蛍光Ｂが入射窓２２を透過し
て光電変換面２３に入射すると、光電変換面２３から光
電子が放出され、複数段のダイノード２４からなる電子
増倍部により二次電子が増倍され、その二次電子が複数
のアノード電極２５の何れかに入射し、二次電子が入射
したアノード電極２５から電流パルス信号が出力され
る。アノード電極２５から出力された電流パルス信号
は、当該アノード電極２５に対応する蛍光光子数測定部
４０内の増幅器４１により電圧パルス信号に変換され、
その電圧パルス信号は、対応する波高弁別器４３に入力
して、論理パルス信号が出力される。このとき、光検出
器２０内に設けられているアノード電極２５の個数と比
較して、パルス励起光Ａの１パルス当たりにおける論理
パルス信号を出力するアノード電極２５の個数が充分に
小さければ、論理パルス信号を出力したアノード電極２
５の個数は、光検出器２０により検出された蛍光光子の
個数に等しいものと考えてよい。
【００１９】一方、パルスレーザ光源１１から出力され
たパルス励起光の一部は、半透鏡１３により反射されレ
ンズ１６を経てフォトダイオード１７により受光され、
パルス励起光Ａが出力されたタイミングを示すタイミン
グ信号が、波高弁別器１８から出力される。また、光検
出器２０の電子増倍部の最終段のダイノード２４から出
力されたパルス信号に基づいて、光検出器２０により蛍
光Ｂの光子が検出されたタイミングを示すタイミング信
号が増幅器３１および波高弁別器３２により生成され
る。そして、時間振幅変換器３３により、波高弁別器１
８および波高弁別器３２それぞれから出力されたタイミ
ング信号に基づいて、パルス励起光Ａが試料９０に照射
された時刻から最初の蛍光Ｂの光子が光検出器２０によ
り検出された時刻までの蛍光光子検出時間に応じた値の
電圧信号が出力され、ＡＤ変換器３４により、時間振幅
変換器３３から出力された電圧信号に応じたデジタル信
号が出力される。
たパルス励起光の一部は、半透鏡１３により反射されレ
ンズ１６を経てフォトダイオード１７により受光され、
パルス励起光Ａが出力されたタイミングを示すタイミン
グ信号が、波高弁別器１８から出力される。また、光検
出器２０の電子増倍部の最終段のダイノード２４から出
力されたパルス信号に基づいて、光検出器２０により蛍
光Ｂの光子が検出されたタイミングを示すタイミング信
号が増幅器３１および波高弁別器３２により生成され
る。そして、時間振幅変換器３３により、波高弁別器１
８および波高弁別器３２それぞれから出力されたタイミ
ング信号に基づいて、パルス励起光Ａが試料９０に照射
された時刻から最初の蛍光Ｂの光子が光検出器２０によ
り検出された時刻までの蛍光光子検出時間に応じた値の
電圧信号が出力され、ＡＤ変換器３４により、時間振幅
変換器３３から出力された電圧信号に応じたデジタル信
号が出力される。
【００２０】パルスレーザ光源１１から繰り返し出力さ
れたパルス励起光Ａの各パルス毎に、蛍光光子数測定部
４０の各波高弁別器４２それぞれから出力された論理パ
ルス信号、および、時間測定部３０のＡＤ変換器３４か
ら出力されたデジタル信号は、蛍光寿命推定部５０のイ
ンターフェース５１を介して演算部５２に送信される。
演算部５２においては、蛍光光子数測定部４０から入力
された論理パルス信号に基づいて、光検出器２０により
検出された蛍光光子の個数が求められ、また、時間測定
部３０から入力されたデジタル信号に基づいて、パルス
励起光Ａが試料９０に照射された時刻から最初の蛍光光
子が光検出器２０により検出された時刻までの蛍光光子
検出時間が求められる。演算部５２には、パルス励起光
Ａの多数（以下ではＮとする）のパルスそれぞれについ
て、蛍光光子数ｎi および蛍光光子検出時間Ｔi （i=1,
2,3,…,N）が互いに対として記憶される。
れたパルス励起光Ａの各パルス毎に、蛍光光子数測定部
４０の各波高弁別器４２それぞれから出力された論理パ
ルス信号、および、時間測定部３０のＡＤ変換器３４か
ら出力されたデジタル信号は、蛍光寿命推定部５０のイ
ンターフェース５１を介して演算部５２に送信される。
演算部５２においては、蛍光光子数測定部４０から入力
された論理パルス信号に基づいて、光検出器２０により
検出された蛍光光子の個数が求められ、また、時間測定
部３０から入力されたデジタル信号に基づいて、パルス
励起光Ａが試料９０に照射された時刻から最初の蛍光光
子が光検出器２０により検出された時刻までの蛍光光子
検出時間が求められる。演算部５２には、パルス励起光
Ａの多数（以下ではＮとする）のパルスそれぞれについ
て、蛍光光子数ｎi および蛍光光子検出時間Ｔi （i=1,
2,3,…,N）が互いに対として記憶される。
【００２１】そして、演算部５２では、Ｎ対の蛍光光子
数ｎi および蛍光光子検出時間Ｔi（i=1,2,3,…,N）に
基づいて、蛍光Ｂの蛍光寿命または蛍光減衰曲線が以下
のようにして推定される。なお以下では、試料９０中の
蛍光物質から発生する蛍光Ｂの蛍光減衰曲線が蛍光寿命
の互いに異なる２つの指数関数の和で表される場合につ
いて説明する。
数ｎi および蛍光光子検出時間Ｔi（i=1,2,3,…,N）に
基づいて、蛍光Ｂの蛍光寿命または蛍光減衰曲線が以下
のようにして推定される。なお以下では、試料９０中の
蛍光物質から発生する蛍光Ｂの蛍光減衰曲線が蛍光寿命
の互いに異なる２つの指数関数の和で表される場合につ
いて説明する。
【００２２】その２つの蛍光寿命をそれぞれ１／λ1 お
よび１／λ2 とする。また、パルス励起光Ａの各パルス
が試料９０に照射された時刻を基準（時刻ｔ＝０）とし
て、時刻ｔから時刻ｔ＋ｄｔまでの時間に光検出器２０
により蛍光Ｂの光子が検出される確率は、
よび１／λ2 とする。また、パルス励起光Ａの各パルス
が試料９０に照射された時刻を基準（時刻ｔ＝０）とし
て、時刻ｔから時刻ｔ＋ｄｔまでの時間に光検出器２０
により蛍光Ｂの光子が検出される確率は、
【数１】 なる式で与えられるものとする。
【００２３】演算部５２では、Ｎ対の蛍光光子数ｎi お
よび蛍光光子検出時間Ｔi （i=1,2,3,…,N）に基づい
て、
よび蛍光光子検出時間Ｔi （i=1,2,3,…,N）に基づい
て、
【数２】 なる式で表される対数尤度が計算される。ここで、Ｐ
(Ｔ｜ｎ)は、ｎ個の蛍光光子が検出されたときに最初の
蛍光光子が時刻Ｔから時刻Ｔ＋ｄＴまでの時間に検出さ
れる確率密度であり、
(Ｔ｜ｎ)は、ｎ個の蛍光光子が検出されたときに最初の
蛍光光子が時刻Ｔから時刻Ｔ＋ｄＴまでの時間に検出さ
れる確率密度であり、
【数３】 で与えられる。したがって、上記 (2)式の対数尤度は、
【数４】 で表される。
【００２４】そして、演算部５２では、上記 (4)式で表
される対数尤度を最大化するλ1 およびλ2 それぞれの
値が推定され、蛍光寿命１／λ1 および１／λ2 それぞ
れの値または蛍光減衰曲線が推定される。なお、対数尤
度の最大化による推定に際しては、準ニュートン法等の
一般的な最適化アルゴリズムが好適に用いられる。
される対数尤度を最大化するλ1 およびλ2 それぞれの
値が推定され、蛍光寿命１／λ1 および１／λ2 それぞ
れの値または蛍光減衰曲線が推定される。なお、対数尤
度の最大化による推定に際しては、準ニュートン法等の
一般的な最適化アルゴリズムが好適に用いられる。
【００２５】次に、蛍光寿命の推定に関するシミュレー
ション結果について説明する。以下では、λ1 の値を
２．０とし、λ2 の値を１．０とし、パルス励起光の各
パルス当たりに検出される蛍光光子の個数の平均値を
２．０とした。また、Ｎの値を１０万とした。
ション結果について説明する。以下では、λ1 の値を
２．０とし、λ2 の値を１．０とし、パルス励起光の各
パルス当たりに検出される蛍光光子の個数の平均値を
２．０とした。また、Ｎの値を１０万とした。
【００２６】図２は、従来の時間相関単一光子計数法に
よる蛍光寿命推定のシミュレーション結果を示すグラフ
である。このグラフは、パルス励起光の各パルスが試料
に照射された時刻から最初の蛍光光子が検出された時刻
までの蛍光光子検出時間の頻度をヒストグラムとして表
したものであり、グラフ中の□印は、シミュレーション
結果の値を示し、グラフ中の曲線は、上記 (1)式につい
て最小二乗フィッティングを行った結果を示すものであ
る。これによれば、λ1 の値として５．０７が得られ、
また、λ2 の値として１．７２が得られ、何れの値も当
初設定した値とは大きく異なっている。
よる蛍光寿命推定のシミュレーション結果を示すグラフ
である。このグラフは、パルス励起光の各パルスが試料
に照射された時刻から最初の蛍光光子が検出された時刻
までの蛍光光子検出時間の頻度をヒストグラムとして表
したものであり、グラフ中の□印は、シミュレーション
結果の値を示し、グラフ中の曲線は、上記 (1)式につい
て最小二乗フィッティングを行った結果を示すものであ
る。これによれば、λ1 の値として５．０７が得られ、
また、λ2 の値として１．７２が得られ、何れの値も当
初設定した値とは大きく異なっている。
【００２７】図３は、本実施形態に係る蛍光寿命測定方
法による蛍光寿命推定のシミュレーション結果を示すグ
ラフである。このグラフは、縦軸、横軸をそれぞれλ1
およびλ2 として、上記 (4)式で表される対数尤度を等
高線表示したものである。この図から判るように、（λ
1，λ2）＝（2.0，1.0）の極近傍で対数尤度が最大とな
り、推定精度が優れていることが判る。
法による蛍光寿命推定のシミュレーション結果を示すグ
ラフである。このグラフは、縦軸、横軸をそれぞれλ1
およびλ2 として、上記 (4)式で表される対数尤度を等
高線表示したものである。この図から判るように、（λ
1，λ2）＝（2.0，1.0）の極近傍で対数尤度が最大とな
り、推定精度が優れていることが判る。
【００２８】本発明は、上記実施形態に限定されるもの
ではなく種々の変形が可能である。例えば、上記実施形
態に係る蛍光寿命測定装置では、アノード電極２５、増
幅器４１および波高弁別器４２を８組設けたが、これに
限定されるものではなく、１６組または６４組等であっ
てもよい。
ではなく種々の変形が可能である。例えば、上記実施形
態に係る蛍光寿命測定装置では、アノード電極２５、増
幅器４１および波高弁別器４２を８組設けたが、これに
限定されるものではなく、１６組または６４組等であっ
てもよい。
【００２９】
【発明の効果】以上、詳細に説明したとおり、本発明に
よれば、パルス励起光を試料に繰り返し照射して、パル
ス励起光の各パルス毎に、パルス励起光が試料に照射さ
れた時刻から最初の蛍光光子が検出された時刻までの蛍
光光子検出時間を測定するとともに、検出された蛍光光
子の個数を測定し、パルス励起光の各パルス毎に測定さ
れた蛍光光子検出時間および蛍光光子の個数に基づいて
蛍光寿命または蛍光減衰曲線を推定することとしたの
で、パルス励起光の１パルス当たりに検出される蛍光光
子の個数が多くても正確に蛍光寿命または蛍光減衰曲線
を推定することができる。また、従来の時間相関単一光
子計数法による測定の場合と比較して蛍光光子検出頻度
を１桁以上大きくすることができるので、蛍光寿命また
は蛍光減衰曲線を短時間に効率よく測定することができ
る。
よれば、パルス励起光を試料に繰り返し照射して、パル
ス励起光の各パルス毎に、パルス励起光が試料に照射さ
れた時刻から最初の蛍光光子が検出された時刻までの蛍
光光子検出時間を測定するとともに、検出された蛍光光
子の個数を測定し、パルス励起光の各パルス毎に測定さ
れた蛍光光子検出時間および蛍光光子の個数に基づいて
蛍光寿命または蛍光減衰曲線を推定することとしたの
で、パルス励起光の１パルス当たりに検出される蛍光光
子の個数が多くても正確に蛍光寿命または蛍光減衰曲線
を推定することができる。また、従来の時間相関単一光
子計数法による測定の場合と比較して蛍光光子検出頻度
を１桁以上大きくすることができるので、蛍光寿命また
は蛍光減衰曲線を短時間に効率よく測定することができ
る。
【図１】本実施形態に係る蛍光寿命測定装置の構成図で
ある。
ある。
【図２】従来の時間相関単一光子計数法による蛍光寿命
推定のシミュレーション結果を示すグラフである。
推定のシミュレーション結果を示すグラフである。
【図３】本実施形態に係る蛍光寿命測定方法による蛍光
寿命推定のシミュレーション結果を示すグラフである。
寿命推定のシミュレーション結果を示すグラフである。
１…蛍光寿命測定装置、１０…励起光源部、１１…パル
スレーザ光源、１２…反射鏡、１３…半透鏡、１４，１
５，１６…レンズ、１７…フォトダイオード、１８…波
高弁別器、２０…光検出器、２１…真空容器、２２…入
射窓、２３…光電変換面、２４…ダイノード、２５…ア
ノード電極、３０…時間測定部、３１…増幅器、３２…
波高弁別器、３３…時間振幅変換器、３４…ＡＤ変換
器、４０…蛍光光子数測定部、４１…増幅器、４２…波
高弁別器、５０…蛍光寿命推定部、５１…インターフェ
ース、５２…演算部、８１，８２，８３…レンズ、８４
…バンドパスフィルタ、９０…試料、Ａ…パルス励起
光、Ｂ…蛍光。
スレーザ光源、１２…反射鏡、１３…半透鏡、１４，１
５，１６…レンズ、１７…フォトダイオード、１８…波
高弁別器、２０…光検出器、２１…真空容器、２２…入
射窓、２３…光電変換面、２４…ダイノード、２５…ア
ノード電極、３０…時間測定部、３１…増幅器、３２…
波高弁別器、３３…時間振幅変換器、３４…ＡＤ変換
器、４０…蛍光光子数測定部、４１…増幅器、４２…波
高弁別器、５０…蛍光寿命推定部、５１…インターフェ
ース、５２…演算部、８１，８２，８３…レンズ、８４
…バンドパスフィルタ、９０…試料、Ａ…パルス励起
光、Ｂ…蛍光。
Claims (2)
- 【請求項１】 パルス励起光が試料に照射されて発生し
た蛍光の蛍光寿命または蛍光減衰曲線を推定する蛍光寿
命測定方法であって、 前記パルス励起光を前記試料に繰り返し照射して、前記
パルス励起光の各パルス毎に、前記パルス励起光が前記
試料に照射された時刻から最初の蛍光光子が検出された
時刻までの蛍光光子検出時間を測定するとともに、検出
された蛍光光子の個数を測定し、 前記パルス励起光の各パルス毎に測定された前記蛍光光
子検出時間および前記蛍光光子の個数に基づいて前記蛍
光寿命または前記蛍光減衰曲線を推定する、 ことを特徴とする蛍光寿命測定方法。 - 【請求項２】 パルス励起光が試料に照射されて発生し
た蛍光の蛍光寿命または蛍光減衰曲線を推定する蛍光寿
命測定装置であって、 前記パルス励起光を出力し前記試料に照射する励起光源
部と、 前記蛍光を入力し前記蛍光の光量に応じた個数の光電子
を放出する光電変換面と、前記光電変換面から放出され
た光電子を増倍して二次電子を発生させる電子増倍部
と、前記二次電子の入力に応じて電流パルス信号をそれ
ぞれ出力する２以上の所定数のアノード電極と、前記蛍
光を透過させる入射窓を有し前記光電変換面、前記電子
増倍部および前記所定数のアノード電極を内部に含む真
空容器と、を有する光検出器と、 前記パルス励起光が前記試料に照射された時刻から最初
の蛍光光子が前記光検出器により検出された時刻までの
蛍光光子検出時間を前記パルス励起光の各パルス毎に測
定する時間測定部と、 前記所定数のアノード電極のうち少なくとも１個の蛍光
光子に対応する電流パルス信号を出力したアノード電極
の個数に基づいて、前記光検出器により検出された蛍光
光子の個数を前記パルス励起光の各パルス毎に測定する
蛍光光子数測定部と、 前記試料に繰り返し照射された前記パルス励起光の各パ
ルス毎に前記時間測定部により測定された蛍光光子検出
時間および前記蛍光光子数測定部により測定された蛍光
光子の個数に基づいて、前記蛍光寿命または前記蛍光減
衰曲線を推定する蛍光寿命推定部と、 を備えることを特徴とする蛍光寿命測定装置。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9297321A JPH11132953A (ja) | 1997-10-29 | 1997-10-29 | 蛍光寿命測定方法および装置 |
| US09/170,998 US5990484A (en) | 1997-10-29 | 1998-10-14 | Method and apparatus for measuring fluorescence |
| GB9823506A GB2330904A (en) | 1997-10-29 | 1998-10-27 | Fluorescence lifetime measurement system |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9297321A JPH11132953A (ja) | 1997-10-29 | 1997-10-29 | 蛍光寿命測定方法および装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11132953A true JPH11132953A (ja) | 1999-05-21 |
Family
ID=17845001
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9297321A Pending JPH11132953A (ja) | 1997-10-29 | 1997-10-29 | 蛍光寿命測定方法および装置 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5990484A (ja) |
| JP (1) | JPH11132953A (ja) |
| GB (1) | GB2330904A (ja) |
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| JP2003004636A (ja) * | 2001-06-21 | 2003-01-08 | Mitsui Eng & Shipbuild Co Ltd | 二次元微弱放射検出装置 |
| WO2004113890A1 (ja) * | 2003-06-25 | 2004-12-29 | Hamamatsu Photonics K.K. | 時間分解測定装置および位置検出型電子増倍管 |
| KR100885927B1 (ko) | 2007-10-16 | 2009-02-26 | 광주과학기술원 | 형광수명 측정 방법 및 장치 |
| KR101209230B1 (ko) | 2010-06-29 | 2012-12-06 | 광주과학기술원 | 형광수명 측정 장치 및 방법 |
| WO2019026413A1 (ja) * | 2017-08-01 | 2019-02-07 | シャープ株式会社 | 液体中微粒子分析システムおよび液体中微粒子分析方法 |
| CN110462381A (zh) * | 2017-03-31 | 2019-11-15 | 延世大学校产学协力团 | 用于高速分析多指数衰减函数类型实验数据的荧光寿命测量装置及其测量方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| US6342701B1 (en) * | 1999-07-08 | 2002-01-29 | International Business Machines Corporation | Time correlated photon counting |
| US6657385B2 (en) * | 2000-06-20 | 2003-12-02 | Burle Technologies, Inc. | Diamond transmission dynode and photomultiplier or imaging device using same |
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| WO2002066986A2 (en) * | 2001-02-15 | 2002-08-29 | Medtronic Minimed, Inc. | Polymers functionalized with fluorescent boronate motifs |
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| DE10335471A1 (de) * | 2003-08-02 | 2005-03-03 | Leica Microsystems Heidelberg Gmbh | Detektor und Verfahren zur Detektion schwacher fluoreszenter Strahlung mit einem Mikroskopsystem |
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| FR2896877A1 (fr) * | 2006-01-31 | 2007-08-03 | Commissariat Energie Atomique | Appareil et procede de caracterisation d'un systeme de comptage de particules elementaires |
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