JP2004212204A

JP2004212204A - 蛍光顕微鏡及び蛍光寿命の測定方法、並びに蛍光寿命の測定用プログラム

Info

Publication number: JP2004212204A
Application number: JP2002381807A
Authority: JP
Inventors: Tomio Endo; 富男遠藤
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2002-12-27
Filing date: 2002-12-27
Publication date: 2004-07-29

Abstract

【課題】安価な構成で相対的な蛍光寿命を測定すること。
【解決手段】発振器１１は一定の周期のＯＮ／ＯＦＦ信号を半導体レーザー１へ入力する。半導体レーザー１は発振器１１の信号に従い、発振器１１のＯＮ／ＯＦＦと同じタイミングでレーザー光をＯＮ／ＯＦＦする。ＣＣＤ９は、試料６から放射された蛍光を一定時間蓄積して蛍光を積分する機能を持つ。まず、所定の周期でレーザー光を試料６に照射し、ＣＣＤ９で蛍光像を撮像してコンピュータ１０に取り込む。これを蛍光画像Ａとする。次に、発振器１１の出力をＯＮにしたまま試料６に対してレーザー光を照射し、ＣＣＤ９で蛍光像を撮像してコンピュータ１０へ取り込む。この画像を、蛍光画像Ｂとする。そして、蛍光画像Ａを蛍光画像Ｂで除算することにより、相対的な蛍光寿命を測定することができる。
【選択図】図１

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、蛍光顕微鏡に関し、さらに詳しくは、安価な構成で相対的な蛍光寿命を測定できる蛍光顕微鏡及び蛍光寿命の測定方法、並びに蛍光寿命の測定用プログラムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛍光物質は適切な波長の励起光で励起するとエネルギー順位が上がるが、この状態は非常に不安定なので、再びもとの安定したエネルギー状態に戻ろうとする。このとき、蛍光物質は励起光よりも２０〜５０ｎｍ程度長い波長の蛍光を放出する。このような蛍光物質によって細胞や蛋白質等の試料を染色し、この蛍光物質を励起する励起光を照射してその蛍光を観察するものが蛍光顕微鏡である。このような蛍光顕微鏡については、例えば非特許文献１に開示されているので、必要があればこれを参照されたい。
【０００３】
蛍光顕微鏡における蛍光寿命の測定は、蛍光寿命によって複数の蛍光を分けたり、蛍光寿命によって生体の機能を解析したりすることに応用されている。このような蛍光寿命を測定する方法は、自家蛍光を利用して物質分析する方法に従来から用いられている。蛍光寿命は、周波数領域で測定する方法と時間領域で測定する方法とがあり、近年の蛍光顕微鏡では主として時間領域の測定法が用いられている。次に、従来の時間領域における蛍光寿命の測定手順について説明する。
【０００４】
図８は、従来の時間領域における蛍光寿命測定機能を持った蛍光顕微鏡の構成図である。まず、従来例における蛍光顕微鏡４００の構成について説明する。超短パルスで発光するチタン・サファイアレーザー等のパルスレーザー４０１から出射されるレーザー光の光路上には、ビームエキスパンダ４０２及びダイクロイックミラー４０３が配置されている。
【０００５】
ダイクロイックミラー４０３は、蛍光を励起する波長を反射し、且つ蛍光波長は透過する。そして、ダイクロイックミラー４０３の反射光路上には、第一結像レンズ４０４及び対物レンズ４０５を介して、観察対象である試料４０６が配置される。また、試料４０６から発生する蛍光がダイクロイックミラー４０３を透過した後の光路上には、第二結像レンズ４０７とイメージインテンシファイア（ＩｍａｇｅＩｎｔｅｎｓｉｆｉｅｒ：以下Ｉ．Ｉ．）４０８とＣＣＤカメラ４０９とが配置されている。
【０００６】
ＣＣＤカメラ４０９はコンピュータ４１０に接続されており、ＣＣＤカメラ４０９の画像出力はコンピュータ４１０に取り込まれる。また、ゲート発生器４１１はパルスレーザー４０１とＰＣ４１０とＩ．Ｉ．４０８とに接続されている。そして、ゲート発生器４１１は、パルスレーザー４０１の発振のトリガーを入力として、このトリガーにコンピュータ４１０から指令された一定時間の遅延Ｔｄが与えられた所定の時間幅Ｔｗを持つゲート信号をＩ．Ｉ．４０８に出力する。
【０００７】
次に、従来例における蛍光寿命の測定手順について説明する。パルスレーザー４０１からは、試料４０６の蛍光物質を励起して蛍光を発生させるためのレーザー光が出射する。出射したレーザー光は、ビームエキスパンダ４０２を通って、ダイクロイックミラー４０３で反射される。この反射光は、第一結象レンズ５０４を通り、対物レンズ４０５によって結像された後、試料４０６へ入射する。
【０００８】
試料４０６では、入射した励起光であるレーザー光によって蛍光物質から蛍光が発生する。この蛍光は、対物レンズ４０５、第一結像レンズ４０４を介してダイクロイックミラー４０３で蛍光である長い波長の光が第二結像レンズ４０７の方向に透過して、Ｉ．Ｉ．４０８に結像する。励起光（レーザー光）がインパルス状である場合には、励起された瞬間から試料４０６から蛍光の放射が始まり、時間の経過とともに徐々に蛍光の強度が弱くなっていく。この蛍光の時間による変化は、次に示す式（１）のようになる。
【０００９】
Ｆ（ｔ）＝Ｆ_０×ｅｘｐ（−ｔ／τ）・・・（１）
ここで、Ｆ_０は定数、ｔは蛍光時間であり、試料４０６が励起された瞬間の蛍光時間をｔ＝０としている。τは蛍光のｌｉｆｅｔｉｍｅ（寿命）と呼ばれる定数で、蛍光物質の種類や状態によって決まる。このτを求めることが蛍光寿命の測定である。パルスレーザー４０１にはチタン・サファイアレーザーがよく使用され、パルス幅は５０〜１００ｆｓｅｃ．程度である。一般に蛍光物質において、τは数ｎｓｅｃ．であることが多いので、励起光であるレーザー光はほとんどインパルスとみなすことができる。
【００１０】
図９は、レーザー光の発振タイミング等を示すタイミングチャートである。同図（ａ）に示すようなタイミングでレーザー光が発振されたときには、試料４０６からの蛍光は同図（ｃ）のように変化する。ここで、図９（ａ）に示すように、パルスレーザー４０１によって、一定の周期で且つ極めて短い時間だけレーザー光が発振したとする。ゲート発生器４１１には、パルスレーザー４０１のトリガー（図９（ｂ））が入力される。そして、ゲート発生器４１１は、コンピュータ４１０から指令された前記トリガーがＯＮとなるタイミングから一定の遅延Ｔｄをもち、且つ所定の時間幅Ｔｗのゲート信号（図９（ｄ））をＩ．Ｉ．４０８に出力する。
【００１１】
Ｉ．Ｉ．４０８では、ゲート発生器４１１のゲートがＯＮのときだけ、Ｉ．Ｉ．４０８に結像された蛍光を増幅してＣＣＤ４０９に出力する。ＣＣＤ４０９は、出力された蛍光の像を撮像し、この像を電気信号としてコンピュータ４１０へ出力する。そして、コンピュータ４１０は、前記一定の遅延Ｔｄを次々に変化させて、上記動作を繰り返す。
【００１２】
例えば、Ｔｄ及びＴｗをともに１ｎｓｅｃ．として蛍光像をコンピュータ４１０へ取り込み、次いでＴｄを３ｎｓｅｃ．、５ｎｓｅｃ．と順次変化させて蛍光画像をコンピュータ４１０へ取り込む。このようにして得られた３個の画像のうち、それぞれの１画素に注目して測定した蛍光強度の変化を時間に対してプロットすると、図１０に示すようになる。そして、測定点に対して（１）式をフィッテング計算することにより、寿命τを求めることができる。ここで、図１０は、時間に対する蛍光強度の変化を示す説明図である。
【００１３】
ＣＣＤ４０９からコンピュータ４１０へ取り込んだ各画素に対してτを求めれば、２次元の蛍光画像における蛍光寿命を測定することができる。なお、実際にはレーザーの励起パルスの時間幅は０ではないし、受光するＩ．Ｉ．４０８のゲートも立ち上がり及び立下りに時間を要する特性である。したがって、これらの特性を考慮して解析する技術が、特許文献１に開示されている。また、特許文献２にも、蛍光寿命を測定する方法が開示されている。
【００１４】
【特許文献１】
米国特許第４８５５９３０号明細書
【特許文献２】
特開２００２−３９９４３号公報
【非特許文献１】
稲澤譲治、津田均、小島清嗣具著「顕微鏡フル活用術イラストレイテッド」秀潤社出版、２０００年７月１５日
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、時間領域において蛍光寿命を測定する場合には、（１）式で表される蛍光の光量変化カーブを用いて解析するので、励起光であるパルスレーザーは、５０〜１００ｆｓｅｃ．程度という非常に小さいパルス幅であることが要求される。このようなパルス幅でレーザー光を出射できるチタン・サファイアレーザーは、２０００万円程度と非常に高価である。さらに、ゲートを高速で切り替えることのできるＩ．Ｉ．４０８が必要になるが、このようなＩ．Ｉ．も５００万円程度であり、相当の金額を要する。このため、従来の方法によって蛍光寿命を測定しようとすると、２５００〜３０００万円の機材が必要となってしまう。
【００１６】
また、従来における蛍光寿命の測定では、蛍光寿命は数値情報として得られるが、測定目的によっては必ずしも数値で蛍光寿命を求める必要はない。例えば、複数の蛍光物質からの蛍光の蛍光寿命を分けて観察したい場合や、蛍光寿命が場所によってどのように異なるかを観察したい場合等は、相対的な蛍光寿命の測定で十分である。
【００１７】
そこで、この発明は、上記に鑑みてなされたものであって、安価に相対的な蛍光寿命を測定できる蛍光顕微鏡及び蛍光寿命の測定方法、並びに蛍光寿命の測定用プログラムを提供することを目的とする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
上述の目的を達成するために、この発明に係る蛍光顕微鏡は、観測対象である試料に対して所定の周期で、又は連続して励起光を照射する光源と、前記試料から放射された蛍光を一定時間蓄積することにより蛍光の光量を積分する蛍光積分手段と、所定の周期で励起光を前記試料に照射した場合における積分された蛍光の光量を、連続して励起光を前記試料に照射した場合における積分された蛍光の光量で除算する演算手段と、を備えたことを特徴とする。
【００１９】
この蛍光顕微鏡は、励起光の光源により観測対象である試料に対して所定の周期、又は連続して励起光を照射する。そして、演算手段により、所定の周期で励起光を試料に照射した場合における積分された蛍光の光量を、連続して励起光を前記試料に照射した場合における積分された蛍光の光量で除算して、相対的な蛍光寿命を求める。このように、積分された蛍光の光量を用いて相対的な蛍光寿命を求めるので、従来のように、極めて高速に励起光の光源をＯＮ／ＯＦＦさせる必要はない。本発明においては、励起光の光源は数１０〜数１００ＭＨｚ程度でＯＮ／ＯＦＦさせればよく、Ｉ．Ｉ．も従来と比較して低速でゲートをＯＮ／ＯＦＦすることができる。これにより、励起光の光源に高価なチタン・サファイアパルスレーザーや高速ゲートのＩ．Ｉ．を使用する必要がないので、従来と比較して極めて安価に蛍光顕微鏡を構成することができる。
【００２０】
また、次の発明に係る蛍光顕微鏡は、観測対象である試料に対して所定の周期で、又は連続して励起光を照射する光源と、前記光源からの励起光を前記試料上の１点に収束させる対物レンズと、前記試料から放射された蛍光を光学的に共役な位置に再収束させる手段と、前記蛍光が再収束した位置に配置されるピンホールと、前記ピンホールを通過した蛍光を一定時間蓄積することにより蛍光の光量を積分する蛍光積分手段と、前記試料上に収束した励起光を当該励起光の光軸に対して垂直に２次元走査する走査手段と、所定の周期で励起光を前記試料に照射した場合における積分された蛍光の光量を、連続して励起光を前記試料に照射した場合における積分された蛍光の光量で除算する演算手段と、を備えたことを特徴とする。
【００２１】
この蛍光顕微鏡は、いわゆる共焦点形の蛍光顕微鏡であるが、このように、積分された蛍光の光量を用いて相対的な蛍光寿命を求めるので、従来のように、極めて高速に励起光の光源をＯＮ／ＯＦＦさせる必要はない。本発明においては、励起光の光源は数１０〜数１００ＭＨｚ程度でＯＮ／ＯＦＦさせればよく、蛍光の検出器も従来のようにＯＮ／ＯＦＦさせる必要はない。これにより、励起光の光源に高価なチタン・サファイアパルスレーザーや高速ゲートを備えたＰＭＴ（ＰｈｏｔｏＭｕｌｔｉｐｌｉｅｒＴｕｂｅ：ホトマルチプライヤーチューブ）を使用する必要がないので、従来と比較して極めて安価に共焦点形の蛍光顕微鏡を構成することができる。
【００２２】
また、次の発明に係る蛍光顕微鏡は、上記蛍光顕微鏡において、上記光源は一定の波長を持つ半導体レーザーであることを特徴とする。半導体レーザーはチタン・サファイアパルスレーザーと比較して極めて安価であるので、励起光の光源に要するコストを低減できる。その結果、従来と比較して極めて安価に蛍光顕微鏡を構成することができる。また、次の発明に係る蛍光顕微鏡のように、上記蛍光顕微鏡において、上記光源に発光ダイオードを使用すれば、さらに安価に蛍光顕微鏡を構成することができる。また、半導体レーザーや発光ダイオードは波長の種類が比較的豊富なので、蛍光物質との組み合わせの自由度を高くして、観測の幅を広げることができる。
【００２３】
また、次の発明に係る蛍光顕微鏡は、上記蛍光顕微鏡において、上記励起光は、上記試料に対して全反射する角度で入射することを特徴とする。このように、試料上で励起光を全反射させれば、試料中の蛍光物質が発する蛍光のみを観測できるので、蛍光寿命の測定精度を高くできる。
【００２４】
また、次の発明に係る蛍光寿命の測定方法は、励起光を所定の周期で観測対象である試料へ照射し、前記試料から放射された蛍光を一定時間蓄積して蛍光の光量を積分する工程と、励起光を連続して観測対象である試料に照射し、前記試料から放射された蛍光を一定時間蓄積して蛍光の光量を積分する工程と、励起光を所定の周期で前記試料に照射した場合における積分された蛍光の光量を、励起光を連続して前記試料に照射した場合における積分された蛍光の光量で除算する工程と、を有することを特徴とする。
【００２５】
また、次の発明に係る蛍光寿命の測定用プログラムは、励起光を所定の周期で観測対象である試料へ照射し、前記試料から放射された蛍光を一定時間蓄積して蛍光の光量を積分する手順と、励起光を連続して観測対象である試料に照射し、前記試料から放射された蛍光を一定時間蓄積して蛍光の光量を積分する手順と、励起光を所定の周期で前記試料に照射した場合における積分された蛍光の光量を、励起光を連続して前記試料に照射した場合における積分された蛍光の光量で除算する手順と、をコンピュータに実行させることを特徴とする。
【００２６】
この蛍光顕微鏡は、励起光の光源により観測対象である試料に対して所定の周期、又は連続して励起光を照射する。そして、所定の周期で励起光を試料に照射した場合における積分された蛍光の光量を、連続して励起光を前記試料に照射した場合における積分された蛍光の光量で除算して、相対的な蛍光寿命を求める。このように、積分された蛍光の光量を用いて相対的な蛍光寿命を求めるので、従来のように、極めて高速で励起光の光源をＯＮ／ＯＦＦさせる必要はない。これにより、励起光の光源に高価なチタン・サファイアパルスレーザーや高速ゲートのＩ．Ｉ．を使用する必要がないので、従来と比較して極めて安価に相対的な蛍光寿命を測定できる。また、本発明に係る蛍光寿命の測定用プログラムによれば、本発明に係る蛍光寿命の測定方法がコンピュータ上で実現できる。
【００２７】
【発明の実施の形態】
以下、この発明につき図面を参照しつつ詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。また、下記実施の形態における構成要素には、当業者が容易に想定できるもの或いは実質的に同一のものが含まれる。
【００２８】
（実施の形態１）
図１は、この発明の実施の形態１に係る蛍光顕微鏡の構成を示す説明図である。この蛍光顕微鏡１００は、所定の周期で励起光を試料６に照射した場合における積分された蛍光の光量を、連続して励起光を試料６に照射した場合における積分された蛍光の光量で除算して、相対的な蛍光寿命を求める点に特徴がある。
【００２９】
試料６中の蛍光物質を励起して蛍光を発生させるための励起光を発生する光源として、半導体レーザー１を用いる。半導体レーザー１は、発振器１１からの信号に基づいて、所定の周期でＯＮ／ＯＦＦされる。励起光の波長は、例えば４０５、４５０、４８８、５５０ｎｍ程度のものが使用される。なお、半導体レーザーは、波長の種類が比較的豊富なので、蛍光物質との組み合わせの自由度を高くして、観測の幅を広げることができる。
【００３０】
半導体レーザー１から出射されるレーザー光の光路上には、ビームエキスパンダ２及びダイクロイックミラー３が配置されている。ダイクロイックミラー３は、試料６中の蛍光物質を励起するレーザーの波長を反射し、且つ励起された蛍光物質から発生する蛍光の波長は透過するようになっている。
【００３１】
また、前記ダイクロイックミラー３の反射光路上には、第一結像レンズ４と対物レンズ５とが配置され、これらを介して観察対象である試料６が配置されている。試料６からの蛍光がダイクロイックミラー３を透過した後の透過光路上には、第二結像レンズ７とＩ．Ｉ．８とＣＣＤ９とが配置されている。そして、第二結像レンズ７を通過した蛍光は、Ｉ．Ｉ．８に結像する。
【００３２】
ＣＣＤ９の画像出力は、これに接続されたコンピュータ１０に取り込まれる。また、半導体レーザー１には発振器１１が接続されており、この発振器１１は一定の周期のＯＮ／ＯＦＦ信号を半導体レーザー１へ入力する。ここで、コンピュータ１０には、周辺機器として入力装置、表示装置などを接続し（いずれも図示省略）、これらの制御プログラムをメモリにロードして実行することにより前記周辺機器の機能を実現させてもよい。また、このコンピュータ１０には、周辺機器として入力装置、表示装置など（いずれも図示省略）が接続されるものとする。ここで、入力装置とはキーボード、マウス等の入力デバイスのことをいう。表示装置とはＣＲＴ（ＣａｔｈｏｄｅＲａｙＴｕｂｅ）や液晶表示装置などのことをいう。
【００３３】
本発明の実施の形態１に係る蛍光顕微鏡１００は、励起光の光源に安価な半導体レーザー１を用いる。また、光増幅機能を持つＩ．Ｉ．８は高速ゲートを持つ必要はない。このため、５０〜１００ｆｓｅｃ．といった高速でＯＮ／ＯＦＦできる高価なパルスレーザーや、高速ゲートを持つＩ．Ｉ．を必要とした従来の蛍光顕微鏡と比較して、およそ１／１０程度のコストで蛍光顕微鏡１００を構成することができる。また、５０〜１００ｆｓｅｃ．といった高速でレーザーをＯＮ／ＯＦＦする必要はなく、高速でＩ．Ｉ．のゲートをＯＮする必要もないので、比較的簡易な技術で蛍光顕微鏡１００を構成することができる。
【００３４】
半導体レーザー１から出射されたレーザー光は、ビームエキスパンダ２を通ってダイクロイックミラー３で反射される。ここで反射したレーザー光は第一結像レンズ４を通った後、対物レンズ５によって結像されて試料６へ入射する。試料６においては、この入射したレーザー光（励起光）によって試料６内の蛍光物質が励起され、この蛍光物質から蛍光が発生する。この蛍光は、対物レンズ５及び第一結像レンズ４を介してダイクロイックミラー３へ導かれる。ダイクロイックミラー３では、蛍光である長い波長が第二結像レンズ７の方向に透過してＩ．Ｉ．８に結像する。
【００３５】
このような蛍光顕微鏡１００の構成により、蛍光寿命を測定する手順について説明する。図２は、この発明の実施の形態１に係る蛍光顕微鏡の励起光の出射タイミング等を示すタイミングチャートである。また、図３は、この発明の実施の形態１に係る蛍光の測定方法を示すフローチャートである。図２（ａ）に示すように、発振器１１は、一定周期でＯＮ／ＯＦＦを繰り返す。半導体レーザー１は、発振器１１の信号に従い、発振器１１のＯＮ／ＯＦＦと同じタイミングでレーザー光をＯＮ／ＯＦＦする（ステップＳ１０１）。そして、半導体レーザー１がＯＮのタイミングで出射されるレーザー光によって、試料６中の蛍光物質が励起されて蛍光が発生する。この蛍光は、Ｉ．Ｉ．８で増幅された後、ＣＣＤ９へ出力される。
【００３６】
一般に、測定する蛍光寿命は数ｎｓｅｃ．程度であることが多い。この場合には、発振器１１の周波数を１００ＭＨｚ程度にし、発振器１１のＯＮ時間とＯＦＦ時間との比（以下デューティー比という）を５０％とする。この場合、半導体レーザー１は１００ＭＨｚの周期でＯＮ／ＯＦＦを繰り返すことになる。ここで、蛍光寿命が１ｎｓｅｃ．程度の場合を考える。このときには、図２（ｂ）に示すように、励起光であるレーザー光がＯＦＦになってから次にＯＮになるまでに、蛍光はほとんど０近くまで減少する。一方、蛍光寿命が５ｎｓｅｃ．程度の場合には、図２（ｄ）に示すように、レーザー光がＯＦＦになってから次にＯＮになるまでにおける減少程度は、蛍光寿命が１ｎｓｅｃ．程度の場合と比較して小さくなる。
【００３７】
Ｉ．Ｉ．８は周波数特性が良好であるので、このように変化する信号をそのまま増幅してＣＣＤ９へ入力させることができる。一方、ＣＣＤ９の周波数特性はＩ．Ｉ．８よりも劣るので、ＣＣＤ９はローパスフィルタとして作用する。すなわち、ＣＣＤ９は積分機能をもち、蛍光積分手段として機能する。その結果、半導体レーザー１からの出力（図２（ｂ）参照）に対するＣＣＤ９の出力は、図２（ｃ）のようになり、また、図２（ｄ）に対する出力は図２（ｅ）のようになる。ＣＣＤ９により蛍光像を撮像し、コンピュータ１０は、このＣＣＤ９からの出力を取り込む。ここで取り込んだ画像を、蛍光画像Ａとする（ステップＳ１０２）。
【００３８】
上記説明から、蛍光寿命の長いものほど蛍光の光量が多く、より明るく観察されるように考えられる。しかしながら、上記（１）式における定数Ｆ_０は、蛍光物質の種類、密度あるいは試料６の状態等に依存するので、蛍光が明るいからといって蛍光寿命が長いとは限らない。そこで、Ｆ_０の影響を除くために、発振器１１の出力をＯＮにしたまま試料６に対してレーザー光を出射し（ステップＳ１０３）、ＣＣＤ９で蛍光像を撮像してコンピュータ１０へ蛍光像の画像を取り込む。この画像を、蛍光画像Ｂとする（ステップＳ１０４）。
【００３９】
発振器１１をＯＮのままにした場合、励起光であるレーザー光は常にＯＮの状態で試料６へ照射される。このため、試料６からは常時一定の蛍光が放射される。ここで、（１）式から、Ｆ（ｔ）∝Ｆ_０の関係があるので、蛍光画像Ａを蛍光画像Ｂで除算した結果である蛍光画像Ａ／蛍光画像Ｂを画像表示すれば（ステップＳ１０５）、蛍光寿命の長いものほど明るいことになる。
【００４０】
このように、本発明の実施の形態１に係る蛍光顕微鏡１００及び蛍光寿命の測定方法では、励起光であるレーザー光をＯＮ／ＯＦＦして、試料６から放射される蛍光の光量変化を積分する。そして、この積分値を、連続的にレーザー光を照射したときにおける蛍光光量の積分値で除算することにより、相対的な蛍光寿命を測定する。これにより、安価な光源で蛍光寿命の長短を相対的に比較できる。また、相対的な蛍光寿命を求めることができるので、測定の目的に応じた蛍光顕微鏡を構成することができる。
【００４１】
上記蛍光画像の除算は、コンピュータ１０が実行するが、これの代わりに、処理部２１と記憶部２２とを含む専用のハードウェアとして演算手段である演算処理装置２０（図１（ｂ）参照）を構成して、上記手順を実行させてもよい。ここで、記憶部２２は、ハードディスク装置や光磁気ディスク装置、フラッシュメモリ等の不揮発性のメモリや、ＣＤ−ＲＯＭ等のような読み出しのみが可能な記憶媒体、あるいはＲＡＭ（ＲａｎｄｏｍＡｃｃｅｓｓＭｅｍｏｒｙ）のような揮発性のメモリ、あるいはこれらの組み合わせにより構成することができる。また、この処理部２１はメモリ及びＣＰＵ（中央演算装置）により構成され、処理部２１の機能を実現するためのプログラム（図示省略）をメモリにロードして実行することによりその機能を実現させるものであってもよい。
【００４２】
なお、半導体レーザー１の代わりに光源として発光ダイオード（以下ＬＥＤ）を使用してもよい。ＬＥＤも半導体レーザー１と同様に数１００ＭＨｚの周波数特性を持っているので、本発明に係る蛍光顕微鏡１００及び蛍光寿命の測定方法に対して十分適用できる。また、ＬＥＤは波長の種類が比較的多いので、蛍光試料との組み合わせの自由度を高くして、観測の幅を広げることができる。なお、本発明は、ピンホールやスリットを持つディスクを組み合わせて、ディスク走査型の共焦点顕微鏡に適用することもできる。
【００４３】
なお、実施の形態１に係る本発明の蛍光寿命の測定方法は、予め用意されたプログラムをパーソナル・コンピュータやワークステーションなどのコンピュータで実行することによって上記測定手順を実現することができる。このプログラムは、インターネットなどのネットワークを介して配布することができる。また、このプログラムは、ハードディスク、フレキシブルディスク（ＦＤ）、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＤＶＤなどのコンピュータで読み取り可能な記録媒体に記録され、コンピュータによって記録媒体から読み出されることによって実行することもできる。また、上記プログラムは、上記測定手順をコンピュータ１０にすでに記録されているプログラムとの組み合わせで実現できるものであってもよい。
【００４４】
（変形例１）
図４は、実施の形態１の第１変形例に係る蛍光顕微鏡を示す説明図である。この蛍光顕微鏡１０１は、実施の形態１に係る蛍光顕微鏡１００と略同様の攻勢であるが、励起光であるレーザー光を、試料６の観測領域に対して全反射する角度で入射させてエバネッセント照明を行い、試料６の蛍光物質が発する蛍光のみを観測する点が異なる。次の説明においては、実施の形態１に係る蛍光顕微鏡１００と同一の構成には同一の符号を付すとともに、その説明を省略する。また、蛍光の測定方法は実施の形態１で説明した通りなので、その説明を省略する。
【００４５】
半導体レーザー１から出射された励起光であるレーザー光は、ビームエキスパンダ２を構成するレンズの周辺部に向かって出射される。ビームエキスパンダ２を通ったレーザー光はダイクロイックミラー３で反射される。ここで反射したレーザー光は第一結像レンズ４を通った後、全反射対物レンズ５ａの周辺部へ入射する。
【００４６】
全反射対物レンズ５ａの周辺部から出射したレーザー光は、試料６の観測領域に対して全反射する角度で入射する。試料６においては、この入射したレーザー光（励起光）によってエバネッセント光が発生して試料６内の蛍光物質が励起され、この蛍光物質から蛍光が発生する。ここで、全反射対物レンズ５ａの周辺部から出射する光は全反射して、全反射レンズ５ａの光軸に対して対称な位置に入射する。全反射レンズ５ａから出射したこのレーザー光は、第１結像レンズ４を通り、ビームストッパ５１でさえぎられることになる。これにより、試料６中の蛍光物質から発生した蛍光だけが全反射対物レンズ５ａに入射し、第一結像レンズ４を介してダイクロイックミラー３へ導かれる。
【００４７】
ダイクロイックミラー３では、蛍光である長い波長が第二結像レンズ７の方向に透過してＩ．Ｉ．８に結像する。この蛍光顕微鏡１０１では、励起光であるレーザー光の影響を最小限にして、蛍光のみをＩ．Ｉ．８に結像させることができるので、より高い精度で蛍光寿命を求めることができる。
【００４８】
（変形例２）
図５は、実施の形態１の第２変形例に係る蛍光顕微鏡を示す説明図である。この蛍光顕微鏡１０２は、実施の形態１に係る蛍光顕微鏡１００と略同様の構成であるが、波長の異なる複数の光源を用意して、それぞれの光源に対応する複数の蛍光物質が発する複数の蛍光寿命を同時に求めるようにした点に特徴がある。なお、簡略化のため、図６においては、結像レンズ、対物レンズその他のレンズ類は省略してある。また、蛍光の測定方法は実施の形態１で説明した通りなので、その説明を省略する。
【００４９】
半導体レーザー１、１_２、１_３は、それぞれ波長の異なる励起光を出射する。ここで、励起光は３種類に限られるものではなく、観測対象の個数や蛍光物質の種類に応じて、励起光の波長及び個数を適宜選択できる。それぞれの半導体レーザー１、１_２、１_３には、発振器１１が接続されており、所定の周期（例えば数１０〜数１００ＭＨｚ）のＯＮ／ＯＦＦ信号を、それぞれの半導体レーザー１、１_２、１_３へ入力する。
【００５０】
半導体レーザー１_１、１_２、１_３から出射したレーザー光は、それぞれ励起光用ダイクロイックミラー３_１、３_２、３_３へ導かれる。前記３色のレーザー光は、励起光用ダイクロイックミラー３_１、３_２、３_３を通過する過程で合成され、白色のレーザー光となって反射ミラー１９へ入射する。反射ミラー１９へ入射した励起光であるレーザー光は、第一結像レンズ４を通った後、全反射対物レンズ５ａの周辺部へ入射する。そして、全反射対物レンズ５ａから出射したレーザー光は、透明のテンプレート６ｐ上に載せられた試料６の観測領域に対して全反射する角度で入射する。試料６においては、この入射したレーザー光（励起光）によってエバネッセント光が発生して試料６内の蛍光物質が励起され、この蛍光物質から蛍光が発生する。蛍光物質を励起した後のレーザー光は試料６の表面で全反射するので、蛍光物質から発生した蛍光だけが蛍光用ダイクロイックミラー３３_１へ導かれる。
【００５１】
蛍光用ダイクロイックミラー３３では、３色のレーザー光と蛍光物質とから発生した蛍光を分離する。すなわち、蛍光用ダイクロイックミラー３３_１では、半導体レーザー１_１、１_２、１_３のレーザー光によって励起された蛍光が反射して、Ｉ．Ｉ．８へ導かれる。Ｉ．Ｉ．８で増幅された蛍光は、ＣＣＤ９で積分された後、コンピュータ１０へ取り込まれ、実施の形態１で説明した手順で、各蛍光の相対的な寿命が求められる。ここで、半導体レーザー１_１、１_２、１_３から出射したそれぞれのレーザー光で励起される蛍光物質の蛍光寿命はそれぞれ異なる。したがって、蛍光寿命によって３つの蛍光を分離することができる。
【００５２】
このような構成により、この蛍光顕微鏡１０２では、複数の異なる複数の光源を用意して、それぞれの光源に対応する複数の蛍光物質が発する複数の蛍光寿命を同時に求めることで、蛍光を分離することができる。これにより、これまで蛍光の波長毎に必要だったダイクロイックミラーと検出器であるＩ．Ｉ．等とを、それぞれ１個にすることができる。また、蛋白質が結合した場合におけるエネルギー移動の観測に対しても応用できる。
【００５３】
（実施の形態２）
図６は、この発明の実施の形態２に係る蛍光顕微鏡を示す構成図である。また、図７は、この発明の実施の形態２に係る蛍光の測定方法を示すフローチャートである。この蛍光顕微鏡１０３は、本発明を共焦点形の蛍光顕微鏡に適用したものである。次の説明においては、実施の形態１と同一の構成要素には同一の符号を付する。
【００５４】
半導体レーザー１から出射されるレーザー光の光路上には、ダイクロイックミラー３が配置されている。このダイクロイックミラー３の反射光路上にはＸ及びＹ方向に走査可能な２個のガルバノミラー１５ｘ、１５ｙ、瞳リレーレンズ１６ａ、１６ｂ及び対物レンズ５が配置されている。そして、対物レンズ５の先には試料６が配置される。また、試料６の蛍光物質から発生した蛍光がダイクロイックミラー３を透過した後における透過光路上には、レンズ１７、ピンホール１８及びＰＭＴ１３が配置されている。ＰＭＴ１３は、積分回路１４を介してコンピュータ１０に接続されている。また、半導体レーザー１には発振器１１が接続されており、この発振器１１はＯＮ／ＯＦＦ信号を所定の周期（例えば数１０〜数１００ＭＨｚ）で半導体レーザー１へ入力する。
【００５５】
このような蛍光顕微鏡１０３の構成により、蛍光寿命を測定する手順について説明する。半導体レーザー１から出射されたレーザー光は、ダイクロイックミラー３で反射される。この反射光は、２個のガルバノミラー１５ｘ、１５ｙによってさらに反射された後、瞳リレーレンズ１６ａ、１６ｂを通って対物レンズ５に入射する。ここで、瞳リレーレンズ１６ａ、１６ｂは、ガルバノミラー１５ｘ、１５ｙの位置が、対物レンズ５の瞳面と共役にするような光学配置である。そして、ガルバノミラー１５ｘ、１５ｙの角度を変化させることにより、対物レンズ５の瞳面へ入射するレーザー光の入射角度が変化する。このようにすれば、焦点面でのレーザースポットは、光軸に対して垂直な平面内で２次元に走査することができる。
【００５６】
対物レンズ５に入射したレーザー光は、対物レンズ５の焦点近傍に配置された試料６へ入射する。試料６へ入射したレーザー光（励起光）により試料６内の蛍光物質が蛍光を発生する。この蛍光は、対物レンズ５、瞳リレーレンズ１６ａ、１６ｂ及びガルバノミラー１５ｘ、１５ｙを介してダイクロイックミラー３へ入射する。この蛍光は、励起光であるレーザー光よりも波長が長いので、ダイクロイックミラー３へ入射した後、レンズ１７の方向に透過して、レンズ１７でピンホール１８へ収束される。
【００５７】
ピンホール１８は、対物レンズ５と光学的に共役の位置に配置されているので、試料６からの蛍光のうち合焦の成分（焦点の合っている成分）はピンホール１８を通過できる。しかし、非合焦の成分はピンホール１８の面で広がってしまうので、ほとんどピンホール１８を通過できない。ピンホール１８を通過した焦点の合っている蛍光の成分は、ＰＭＴ１３で光電変換された後、電気信号として積分回路１４へ入力される。
【００５８】
上述した手順で得られるのは、試料６上の１点の情報である。ここで、ガルバノミラー１５ｘ、１５ｙは、互いに垂直な方向に動作し、一方がＸ軸を高速に、もう一方がＹ軸を低速に走査できるようになっている。例えば、１０００×１０００点の画素を得るときには、Ｘ軸のガルバノミラー１５ｘを１ｋＨｚで振動させ、Ｙ軸のガルバノミラー１５ｙは１秒間でＹ軸を走査させる。このとき、Ｘ軸は１秒間に１０００回往復走査されるので、画像の１ライン分の走査時間は約０．５ｍｓｅｃ．となる。また、１０００×１０００点の画素を得るので、１画素の情報取得に要する時間は約０．５μｓｅｃ．となる。
【００５９】
ここで、発振器１１は、１００ＭＨｚで、且つデューティー比が５０％でＯＮ／ＯＦＦする場合を考える。このとき半導体レーザー１の出力は、実施の形態１と同様にＯＮ／ＯＦＦされて（図２（ａ）参照）、所定の周期でレーザー光が出射される（ステップＳ２０１）。試料６からの蛍光はＰＭＴ１３で受光された後、積分回路１４で積分される。したがって、積分回路１４の出力は、実施の形態１と同様に、蛍光寿命が１ｎｓｅｃ．のときには図２（ｃ）、蛍光寿命が５ｎｓｅｃ．のときには図２（ｄ）のようになる。
【００６０】
また、半導体レーザー１も１００ＭＨｚでＯＮ／ＯＦＦするので、ＯＮ及びＯＦＦの時間はそれぞれ５ｎｓｅｃ．となり、１画素当たり５０回のＯＮ／ＯＦＦが繰り返される。積分回路１４からの出力、すなわち積分された蛍光の光量は、Ａ／Ｄ変換されてからコンピュータ１０に取得される（ステップＳ２０２）。ガルバノミラー１５ｘ、１５ｙが試料６上を走査している間、各画素について積分された蛍光の光量を取得し（ステップＳ２０３：Ｎｏ）、その結果をコンピュータ１０に取り込む。そして、例えば１０００×１０００の画素から構成される１枚の画像を得る。この画像を蛍光画像Ａとする（ステップＳ２０４）。
【００６１】
この動作だけでは、実施の形態１と同様に、蛍光寿命が各画素の明るさと対応しない。したがって、発振器１１の出力をＯＮのままにして、レーザー光を出射して（ステップＳ２０５）、積分された蛍光の光量をコンピュータ１０が取得する（ステップＳ２０６）。ガルバノミラー１５ｘ、１５ｙが試料６上を走査している間、各画素について積分された蛍光の光量を取得し（ステップＳ２０７：Ｎｏ）、その結果をコンピュータ１０に取り込む。そして、同様に、１０００×１０００の画素から構成される蛍光画像Ａとは異なる１枚の画像を得る。この画像を蛍光画像Ｂとする（ステップＳ２０８）。その後、実施の形態１と同様に、蛍光画像Ａを蛍光画像Ｂで除算すれば（ステップＳ２０９）、その結果である蛍光画像Ａ／蛍光画像Ｂは、蛍光寿命の長いものほど明るいことになる。
【００６２】
なお、上記説明においては、半導体レーザー１のＯＮ／ＯＦＦを繰り返す状態と、ＯＮのままの状態とで２回の走査を行って２枚の画像を得ている、ここで、半導体レーザー１が１００ＭＨｚでＯＮ／ＯＦＦしているならば、画像の１点では５０回ＯＮ／ＯＦＦすることになる。これを、蛍光画像Ａ点の前半のみ２５回のＯＮ／ＯＦＦの状態でデータを取り込み、後半はＯＮのままでデータを取り込んでもよい。このようにすれば、一回の走査で蛍光寿命を測定することができるので、測定時間を短縮できる。
【００６３】
このような蛍光顕微鏡１０３及び蛍光寿命測定手順によれば、走査型の共焦点顕微鏡においても、周期的に励起光であるレーザー光をＯＮ／ＯＦＦして、試料６から放射される蛍光の光量変化を積分することにより、安価な光源を用いて蛍光寿命の長短を相対的に比較できる。
【００６４】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明に係る蛍光顕微鏡によれば、従来と比較して極めて安価に蛍光顕微鏡や共焦点形の蛍光顕微鏡を構成することができる。
【００６５】
また、この発明に係る蛍光寿命の測定方法又は蛍光寿命の測定用プログラムによれば、従来と比較して極めて安価に相対的な蛍光寿命を測定できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】この発明の実施の形態１に係る蛍光顕微鏡の構成を示す説明図である。
【図２】この発明の実施の形態１に係る蛍光顕微鏡の励起光の出射タイミング等を示すタイミングチャートである。
【図３】この発明の実施の形態１に係る蛍光の測定方法を示すフローチャートである。
【図４】実施の形態１の第１変形例に係る蛍光顕微鏡を示す説明図である。
【図５】実施の形態１の第２変形例に係る蛍光顕微鏡を示す説明図である。
【図６】この発明の実施の形態２に係る蛍光顕微鏡を示す構成図である。
【図７】この発明の実施の形態２に係る蛍光の測定方法を示すフローチャートである。
【図８】従来の時間領域における蛍光寿命測定機能を持った蛍光顕微鏡の構成図である。
【図９】レーザー光の発振タイミング等を示すタイミングチャートである。
【図１０】時間に対する蛍光強度の変化を示す説明図である。
【符号の説明】
１半導体レーザー
２ビームエキスパンダ
３前記ダイクロイックミラー
４第一結像レンズ
５対物レンズ
６試料
７第二結像レンズ
１０コンピュータ
１１発振器
１４積分回路
１５ｘ、１５ｙガルバノミラー
１６ａ、１６ｂ瞳リレーレンズ
１７レンズ
１８ピンホール
１００、１０１、１０２、１０３蛍光顕微鏡

Claims

観測対象である試料に対して所定の周期で、又は連続して励起光を照射する光源と、
前記試料から放射された蛍光を一定時間蓄積することにより蛍光の光量を積分する蛍光積分手段と、
所定の周期で励起光を前記試料に照射した場合における積分された蛍光の光量を、連続して励起光を前記試料に照射した場合における積分された蛍光の光量で除算する演算手段と、
を備えたことを特徴とする蛍光顕微鏡。
観測対象である試料に対して所定の周期で、又は連続して励起光を照射する光源と、
前記光源からの励起光を前記試料上の１点に収束させる対物レンズと、
前記試料から放射された蛍光を光学的に共役な位置に再収束させる手段と、
前記蛍光が再収束した位置に配置されるピンホールと、
前記ピンホールを通過した蛍光を一定時間蓄積することにより蛍光の光量を積分する蛍光積分手段と、
前記試料上に収束した励起光を当該励起光の光軸に対して垂直に２次元走査する走査手段と、
所定の周期で励起光を前記試料に照射した場合における積分された蛍光の光量を、連続して励起光を前記試料に照射した場合における積分された蛍光の光量で除算する演算手段と、
を備えたことを特徴とする蛍光顕微鏡。
上記光源は一定の波長を持つ半導体レーザーであることを特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光顕微鏡。
上記光源は発光ダイオードであることを特徴とする請求項１又は２に記載の蛍光顕微鏡。
上記励起光は、上記試料に対して全反射する角度で入射することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡。
励起光を所定の周期で観測対象である試料へ照射し、前記試料から放射された蛍光を一定時間蓄積して蛍光の光量を積分する工程と、
励起光を連続して観測対象である試料に照射し、前記試料から放射された蛍光を一定時間蓄積して蛍光の光量を積分する工程と、
励起光を所定の周期で前記試料に照射した場合における積分された蛍光の光量を、励起光を連続して前記試料に照射した場合における積分された蛍光の光量で除算する工程と、
を有することを特徴とする蛍光寿命の測定方法。
励起光を所定の周期で観測対象である試料へ照射し、前記試料から放射された蛍光を一定時間蓄積して蛍光の光量を積分する手順と、
励起光を連続して観測対象である試料に照射し、前記試料から放射された蛍光を一定時間蓄積して蛍光の光量を積分する手順と、
励起光を所定の周期で前記試料に照射した場合における積分された蛍光の光量を、励起光を連続して前記試料に照射した場合における積分された蛍光の光量で除算する手順と、
をコンピュータに実行させることを特徴とする蛍光寿命の測定用プログラム。