JP4855009B2 - 走査型蛍光顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、蛍光色素で標識した標本の蛍光測定に用いられる走査型蛍光顕微鏡に関するものである。

顕微鏡システムには、蛍光色素で標識した標本に所定波長の光を照射して蛍光色素を励起し、この励起により発せられる蛍光を測定するようにしたものがある。

この場合、標本を蛍光標識するための蛍光色素は複数あり、蛍光色素によって励起光波長と蛍光波長が異なっている。そして、これらは、蛍光標識する細胞の部位などにより使い分けられている。また、１つの標本に複数の蛍光色素を用いた多重染色標本について、同時、又は切換えて観察する場合もある。

このような蛍光色素を用いて蛍光測定を行なう顕微鏡として、二次元走査される励起光により標本から発せられる蛍光を１個以上のダイクロイックミラー（ＤＭ）で波長分割し、さらにＰＭＴ（ホトマル）などの光検出器の前に設置されたバンドパスフィルタ(バリアフィルタＢＡ)により、所望の波長範囲にある複数の蛍光強度を走査点ごとに検出し、コンピュータによる画像化、グラフ化等の処理を経て被検体の生物学的諸特性を解析するようにした走査型蛍光顕微鏡がある。

図６は、このような走査型蛍光顕微鏡の一例を示すものである。１はアルゴンレーザやヘリウムネオンレーザなどの異なる複数の波長のレーザ光を１つ又は複数を選択的に発生するレーザ光源ユニットで、このレーザ光源ユニット１から発せられるレーザ光は、コリメータレンズ２で平行光に変換され、励起ダイクロイックミラー３に入射される。この励起ダイクロイックミラー３で反射したレーザ光は、ＸＹスキャナミラー４に至る。ＸＹスキャナミラー４は、直交する２方向に光を偏向するための不図示の２枚のガルバノミラーを有するもので、これらのミラーによりレーザ光を二次元方向、つまりＸＹ方向に走査するようになっている。ＸＹスキャナミラー４で二次元走査されたレーザ光は、瞳投影レンズ５、対物レンズ６を介して標本７（ここでは２種類の蛍光色素を標識した２重染色されたものが用いられている。）上の焦点位置に集光され蛍光を励起する。標本７で励起された蛍光は、レーザ光と逆の光路を辿り対物レンズ６、瞳投影レンズ５、ＸＹスキャナミラー４を介して励起ダイクロイックミラー３まで戻される。励起ダイクロイックミラー３まで戻された蛍光は、これを透過して結像レンズ８によって共焦点ピンホール９上に集光される。共焦点ピンホール９は、対物レンズ６の焦点と光学的に共役な位置に配置され、標本７からの蛍光のうち合焦の成分を通過し、非合焦の成分を遮断して光軸方向の高い空間分解能を与えるためのものである。共焦点ピンホール９を通過した蛍光は、分光用ダイクロイックミラー１０に入射される。分光用ダイクロイックミラー１０は、共焦点ピンホール９を通過した蛍光を波長によって光路分割する。分光用ダイクロイックミラー１０により分割された反射側光路には、バリアフィルタ１１ａを介して光電変換素子(ＰＭＴ)１２ａが配置され、また、透過側光路には、バリアフィルタ１１ｂを介して光電変換素子(ＰＭＴ)１２ｂが配置されている。これにより、分光用ダイクロイックミラー１０を反射した蛍光は、バリアフィルタ１１ａにより所定の波長範囲以外の蛍光が遮断され、光電変換素子(ＰＭＴ)１２ａにより蛍光強度が検出され、この蛍光強度が電気信号に変換され出力される。また、分光用ダイクロイックミラー１０を透過した蛍光についても、バリアフィルタ１１ｂで所定の波長範囲以外の蛍光が遮断され、光電変換素子(ＰＭＴ)１２ｂにより蛍光強度が検出され、この蛍光強度が電気信号に変換され出力される。これら光電変換素子(ＰＭＴ)１２ａ、１２ｂからの電気信号は、中央制御装置１３に入力される。中央制御装置１３は、制御部１３ａ、画像メモリ１３ｂ、画像処理装置１３ｃを有している。そして、制御部１３ａによりＸＹスキャナミラー４のＸＹ走査を必要により制御するとともに、ＸＹスキャナミラー４によるレーザ光の二次元走査に対応させて光電変換素子(ＰＭＴ)１２ａ、１２ｂからの電気信号をデジタル値に変換し、二次元走査にしたがって標本７上の蛍光の強度に応じた二次元濃淡画面を生成し、これを画像メモリ１３ｂに記憶させる。さらに、この二次元濃淡画像に対して画像処理装置１３ｃによってシェーディング補正やバックグラウンド補正等の処理が施され、各種分析ルーチンで必要な処理がなされた後、画像や分析結果のグラフ、数値等として表示部１４に表示される。

このようにした顕微鏡システムによれば、蛍光検出チャンネルが２チャンネル分用意されており、複数の蛍光色素を標識した多重染色標本に対して異なる２つの波長域の蛍光を同時に測定することができる。

ところで、最近の生体細胞の機能解析では、細胞内物質のたんぱく質領域まで掘り下げた研究がますます盛んになっており、これに伴い、蛍光検出チャンネルが２チャンネルしかないシステムでは、多重染色による同時観察の応用範囲が限定されてしまうという問題があった。

そこで、上述した分光用ダイクロイックミラー１０とバリアフィルタ１１ａ（１１ｂ）を複数種類用意し、これらを適宜切替えることで、蛍光検出チャンネルを４チャンネルに形成したものや、さらに、試料から発せられた検出光をスペクトル分解する凹面グレーティングを併用し、この凹面グレーティングを回転させることで予め定められたスペクトル領域を選択し、この選択された任意の波長領域の蛍光を光電変換素子(ＰＭＴ)により検出できるようにしたものが提案されている。

しかし、蛍光検出チャンネルを４チャンネルにしたものは、分光チャンネルが増えたものの光検出器が、これまでのＰＭＴのままであり、さらに、複数種類用意される分光用ダイクロイックミラーとバリアフィルタは、例えば、ターレット形式に形成され選択的に切替えられるようにして蛍光検出帯域数を増加させているが、蛍光検出チャンネルの増加とともに、ＰＭＴとターレット形式の分光用ダイクロイックミラーとバリアフィルタから構成される分光検出系は非常に大きなものになってしまい顕微鏡全体の大型化を招くという問題を生じる。また、ターレットごと、またはターレット上の分光用ダイクロイックミラーとバリアフィルタの光学素子を個々に交換可能とすることで分光検出帯域の組み合わせをさらに増加させることが考えられるが、これら光学素子の交換には多大な時間と手間がかかってしまい、蛍光測定の作業能率を大幅に低下させるという問題を生じる。

また、凹面グレーティングを併用したものは、スペクトル領域が選択可能で、任意の波長領域の蛍光を検出できるようになっているが、光検出器が、これまでのＰＭＴのままであるため、分光検出系としての小型化が難しいという問題があった。

本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、分光検出系の小型化を実現できるとともに、多重染色された標本の蛍光測定を効率よく行なうことができる走査型蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。

請求項１記載の発明は、レーザ光を発生するレーザ光源と、前記レーザ光源からのレーザ光を標本上に集光させる対物レンズと、前記レーザ光を前記標本上で２次元走査する光走査手段と、前記標本からの蛍光の光路に配置された共焦点ピンホールと、前記共焦点ピンホールを通過した前記蛍光を受光する複数の受光部を有してこれら受光部ごとの受光した光強度に応じた出力を発生する多チャンネルアレイ光検出器と、前記多チャンネルアレイ光検出器の前記複数の受光部に対応して設けられ、分光波長範囲が互いに異なる複数の分光用素子と、前記共焦点ピンホールを通過した蛍光の光路上に前記複数の分光用素子を配置するように前記複数の分光用素子を一体的に保持し、かつ前記複数の分光用素子を保持して移動又は着脱可能に構成された保持手段と、前記多チャンネルアレイ光検出器に対する前記保持手段の位置決めをする位置決め手段とを有する分光ユニットとを具備したことを特徴としている。

請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記保持手段は、前記複数の分光用素子を収容したホルダを有し、前記ホルダは、直進移動可能であり、前記分光用素子を前記多チャンネルアレイ光検出器の各受光部上に静止又は退避させることを特徴としている。

請求項３記載の発明は、請求項２記載の発明において、前記ホルダは、複数個重ねて設けられ、これらホルダは、前記分光用素子を選択的に前記多チャンネルアレイ光検出器の各受光部上に静止又は退避させることを特徴としている。

請求項４記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記保持手段は、前記複数の分光用素子を備えた回転式ターレットを有し、前記回転式ターレットは、回転することにより任意の前記分光用素子を前記多チャンネルアレイ光検出器の各受光部上に配置させることを特徴としている。

請求項５記載の発明は、請求項１乃至４のいずれかに記載の発明において、前記分光用素子の個数は、前記多チャンネルアレイ光検出器の前記受光部の数より少ないことを特徴としている。

請求項６記載の発明は、請求項１乃至５のいずれかに記載の発明において、さらに、前記標本からの蛍光の光路に配置され、該蛍光の光束を平行光に変換する光学素子を有することを特徴としている。

請求項７記載の発明は、請求項１乃至６のいずれかに記載の発明において、前記分光用素子は、分光用ダイクロイックミラー及びバリアフィルタからなることを特徴としている。

請求項８記載の発明は、請求項１乃至７のいずれかに記載の発明において、前記多チャンネルアレイ光検出器は、多チャンネル用のマルチアノードＰＭＴアレイであることを特徴としている。
請求項９記載の発明は、請求項１乃至８のいずれかに記載の発明において、前記分光ユニットが複数備えられていることを特徴としている。

本発明によれば、分光検出系の小型化を実現できるとともに、多重染色された標本の蛍光測定を効率よく行なうことができる走査型蛍光顕微鏡を提供できる。

以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。

（第１の実施の形態）
図１は、本発明の第１の実施の形態にかかる走査型蛍光顕微鏡の概略構成を示すもので、図６と同一部分には、同符号を付して異なる部分のみを説明する。

この場合、標本７は、複数（例えば４種類）の蛍光色素で標識した多重染色標本が用いられている。また、共焦点ピンホール９を通過した光路上には、第２のコリメータレンズ１５が配置されている。第２のコリメータレンズ１５は、共焦点ピンホール９を通過した光を平行光に変換するものである。

第２のコリメータレンズ１５からの平行光の光路上には、分光検出系を構成する分光ユニット１６が配置されている。分光ユニット１６は、図２に示すように多チャンネル光検出手段としての多チャンネル（図示例では８チャンネル）の受光部１７ａを有する多チャンネル光検出器１７と、各受光部１７ａに対応して設けられた複数の分光用素子１８から構成されている。

この場合、多チャンネル光検出器１７は、８チャンネルの受光部１７ａ、マルチアノード部１７ｂ、ブリーダ抵抗回路部１７ｃ、コネクタピン１７ｄから構成されるもので、各受光部１７ａにより受光した光強度に応じた電気信号を各別に出力する８チャンネル用のマルチアノードＰＭＴアレイ（例えば、浜松ホトニクス（株）製、ＰＭＴアレイＨ９５３０）が用いられている。

また、分光用素子１８は、分光用ダイクロイックミラー１８ａとバリアフィルタ１８ｂからなるもので、異なる分光波長範囲のものが複数（図示例では４個）用意されている。これら分光波長範囲の異なる複数の分光用素子１８の組み合わせは、ユーザの研究目的などの要求によって予め決定されている。

これら複数の分光用素子１８は、図３（ａ）に示すように共通のホルダ１９に収納されている。このホルダ１９は、スライドレバー２０を有するもので、スライドレバー２０の操作により複数の分光用素子１８を図示矢印方向（第２のコリメータレンズ１５からの平行光に沿った方向）に直進移動可能とし、多チャンネル光検出器１７の各受光部１７ａ上に静止又は退避可能にしている。この場合、ホルダ１９の直進移動は、不図示の駆動モータにより駆動することも可能である。

複数の分光用素子１８は、多チャンネル光検出器１７上に静止された状態で、各受光部１７ａに一つおき（図示例では２，４，６，８チャンネルの受光部１７ａ）に対応するようになっている。また、各分光用素子１８の分光用ダイクロイックミラー１８ａは、多チャンネル光検出器１７上に静止された状態で、第２のコリメータレンズ１５からの平行光の光路上に位置されており、それぞれ波長範囲の異なる蛍光を反射しバリアフィルタ１８ｂを介して多チャンネル光検出器１７の対応する受光部１７ａに入射させるようにしている。このため、ホルダ１９の多チャンネル光検出器１７上での位置決めには、精度の高い位置決め機構が用いられている。

また、このような複数の分光用素子１８を収納するホルダ１９は、分光波長範囲の異なる複数の分光用素子１８を有するものが複数種類用意され、これらが選択的に使用される。

図１に戻って、分光ユニット１６には、中央制御装置１３が接続されている。中央制御装置１３は、制御部１３ａ、画像メモリ１３ｂ、画像処理装置１３ｃを有するものである。制御部１３ａは、ＸＹスキャナミラー４のＸＹ走査を必要により制御する。また、制御部１３ａは、分光ユニット１６の多チャンネル光検出器１７の各チャンネル毎の電気信号を取り込んでデジタル値に変換し、ＸＹスキャナミラー４によるレーザ光の二次元走査にしたがって標本７上の蛍光の強度に応じた二次元濃淡画面を生成し、これらを画像メモリ１３ｂに記憶させる。また、画像処理装置１３ｃは、これら二次元濃淡画像に対してシェーディング補正やバックグラウンド補正等の処理を実行し、各種分析ルーチンで必要な処理をした後、画像や分析結果のグラフ、数値等として表示部１４に表示させる。

その他は、図６と同様である。

このような構成によっても、上述したと同様に、レーザ光源ユニット１からレーザ光が発生すると、コリメータレンズ２で平行光に変換され、励起ダイクロイックミラー３で反射したレーザ光は、ＸＹスキャナミラー４で二次元方向、つまりＸＹ方向に走査され、瞳投影レンズ５、対物レンズ６を介して標本７上の焦点位置に集光され蛍光を励起する。

標本７で励起された蛍光は、レーザ光と逆の光路を辿り励起ダイクロイックミラー３まで戻され、さらに、励起ダイクロイックミラー３を透過して結像レンズ８によって共焦点ピンホール９上に集光される。共焦点ピンホール９上に集光された蛍光は、共焦点効果によって、焦点深度の浅い蛍光画像(断層像)を形成する。共焦点ピンホール９を通過した蛍光は、第２のコリメータレンズ１５で平行光に変換され、分光ユニット１６に導かれる。この場合、分光ユニット１６の複数の分光用素子１８を収容したホルダ１９が多チャンネル光検出器１７の各受光部１７ａ上に静止して位置決めされているものとすると、第２のコリメータレンズ１５で平行光に変換された蛍光は、最初の分光用素子１８の分光用ダイクロイックミラー１８ａに入射される。そして、この分光用ダイクロイックミラー１８ａに対応する波長範囲の蛍光が分光（反射）され、バリアフィルタ１８ｂを介して多チャンネル光検出器１７の対応する受光部１７ａに入射される。続けて、最初の分光用ダイクロイックミラー１８ａを透過した蛍光は、２番目の分光用素子１８の分光用ダイクロイックミラー１８ａに入射される。そして、ここでも分光用ダイクロイックミラー１８ａに対応する波長範囲の蛍光が分光（反射）され、バリアフィルタ１８ｂを介して多チャンネル光検出器１７の対応する受光部１７ａに入射される。以下、同様にして、３番目、４番目の分光用ダイクロイックミラー１８ａでも、それぞれ分光された蛍光がバリアフィルタ１８ｂを介して多チャンネル光検出器１７の対応する受光部１７ａに入射される。

多チャンネル光検出器１７は、各受光部１７ａに入射された各波長範囲の蛍光強度に応じた電気信号を発生し、これら電気信号を中央制御装置１３に入力させる。中央制御装置１３は、制御部１３ａによりＸＹスキャナミラー４によるレーザ光の二次元走査に対応させて多チャンネル光検出器１７からの各分光波長範囲の蛍光強度に応じた電気信号をデジタル値に変換し二次元走査にしたがって標本７上の各蛍光の強度に応じた二次元濃淡画面を生成し、画像メモリ１３ｂに記憶させる。ここで、生成される二次元濃淡画面は、多重染色された標本７の各蛍光色素の蛍光に対応したものである。さらに、これら二次元濃淡画像に対して画像処理装置１３ｃによってシェーディング補正やバックグラウンド補正等の処理を施し、さらに各種分析ルーチンで必要な処理をした後、画像や分析結果のグラフ、数値等として表示部１４に表示させる。

ここで、異なる波長範囲の蛍光をさらに検出したい場合は、現在、多チャンネル光検出器１７上に配置されているホルダ１９を、スライドレバー２０の操作により取外し、他に用意された目的に合ったホルダ１９を、スライドレバー２０の操作により多チャンネル光検出器１７の受光部１７ａ上に静止させて位置決めするようにすればよい。

したがって、このようにすれば、共焦点ピンホール９を通過した蛍光の光路上に、８チャンネルの受光部１７ａを有する多チャンネル光検出器１７と、ホルダ１９に収納されスライドレバー２０の操作により多チャンネル光検出器１７の各受光部１７ａ上に静止又は退避可能とした、分光波長範囲の異なる４個の分光用素子１８を有する分光ユニット１６を設け、これら分光用素子１８により分光された波長範囲の異なる蛍光を各受光部１７ａで受光させるようにしたので、複数の蛍光色素を標識した多重染色の標本７に対して、異なる４つの波長域の蛍光を同時に効率よく測定することができる。これにより、分子レベルの生物現象研究現場や創薬の実験現場などにおいて、非常に使い勝手のよい観察及び計測装置として利用することができる。

また、分光ユニット１６は、８チャンネルの受光部１７ａを有する多チャンネル光検出器１７に対し、ホルダ１９に収納されユニット化された分光波長範囲の異なる４個の分光用素子１８を組み立てる構成としているので、分光ユニット１６全体をコンパクトにでき、分光検出系の小型化を実現することができる。

また、異なる波長範囲の蛍光をさらに検出したい場合は、現状のホルダ１９を、他に用意されたホルダ１９と差し替えるのみで対応できるので、これらホルダ交換のため時間も短くでき、蛍光検出のための作業効率を高めることができる。

さらに、分光ユニット１６の分光波長範囲の異なる４個の分光用素子１８には、共焦点ピンホール９を通過し第２のコリメータレンズ１５で平行光に変換された蛍光光束が入射されるので、各分光用素子１８のそれぞれの分光用ダイクロイックミラー１８ａが光路上に沿って並べられていても、これら分光用ダイクロイックミラー１８ａに入射される蛍光光束の光路長の違いによる影響が生じることがなくなり、各分光用ダイクロイックミラー１８ａを介して分光された精度の良い蛍光測定を行なうことができる。

さらに、多チャンネル光検出器１７の８チャンネルの受光部１７ａに対して複数の分光用素子１８を一つおき（図示例では２，４，６，８チャンネルの受光部１７ａ）に対応させて、隣合うチャンネルの使用を回避するようにしているので、受光部１７ａの各チャンネル間のクロストークを抑制することができ、蛍光測定の精度を高めることができる。

なお、上述では、多チャンネル光検出器１７上に、分光波長範囲の異なる４個の分光用素子１８を収納した１個のホルダ１９をスライドレバー２０により挿脱可能に配置するようにしたが、このようなホルダー１９を複数個重ねて配置し、これらを選択的に多チャンネル光検出器１７上に配置できるようにしても良い。こうすれば、分光波長範囲の種類をさらに増やすことができる。この場合、多チャンネル光検出器１７上に重ねて配置される各ホルダー１９の分光用素子１８に対して第２のコリメータレンズ１５で平行光に変換された蛍光光束が精度よく入射するような光路の上下切換え手段が必要となる。この場合、図３（ｂ）に示すように反射ミラー２２ａと分光波長範囲の異なる４個の分光用素子１８１ａを収納したホルダ１９ａの上段に、反射ミラー２２ｂと分光波長範囲の異なる４個の分光用素子１８１ｂを収納したホルダ１９ｂを配置し、これらホルダ１９ａ、１９ｂを選択的に多チャンネル光検出器１７上に位置させるようになる。これにより、ホルダ１９ｂをＯＵＴ方向に移動させ、ホルダ１９ａを多チャンネル光検出器１７上に位置させた場合は、反射ミラー２２ａで反射した第２のコリメータレンズ１５で平行光に変換された蛍光光束が各分光用素子１８１ａに入射され、また、ホルダ１９ａをＯＵＴ方向に移動させ、ホルダ１９ｂを多チャンネル光検出器１７上に位置させた場合は、反射ミラー２２ｂで反射した第２のコリメータレンズ１５で平行光に変換された蛍光光束が各分光用素子１８１ｂに入射されるようになる。この場合、下段にあるホルダ１９ｂの各分光用素子１８１ｂが上段にあるホルダ１９ａの各分光用素子１８１ａからの光路と干渉しないようにする工夫が必要であり、これには、例えばホルダ１９ａのＯＵＴ方向のストロークを大きくするとか、ホルダ１９ａの挿脱方向をホルダ１９ｂの挿脱方向と直交する方向に移動させるなどの方法が考えられる。

（変形例）
第１の実施の形態では、複数の分光用素子１８を共通のホルダ１９に収納し、このホルダ１９をスライドレバー２０の操作により直線移動させて、多チャンネル光検出器１７の各受光部１７ａ上に静止又は退避可能としたが、これに代えて、例えば図４に示すように回転式のターレット２１を用いることもできる。この場合、ターレット２１は、円板状の基体２１ａを有し、この基体２１ａの中心を軸２１ｂにより回転可能に支持されている。基体２１ａは、円周方向に沿って複数の分光用素子１８が放射状に配置されている。これら分光用素子１８は、上述した分光用ダイクロイックミラー１８ａとバリアフィルタ１８ｂを組み合わせたもので、分光波長範囲の異なるものが複数種類用意されている。これら分光波長範囲の異なる分光用素子１８の組み合わせは、ユーザの研究目的などの要求によって予め決定されている。そして、これら分光波長範囲の異なる分光用素子１８は、ユーザによるターレット２１の回転操作により、目的に合ったものが多チャンネル光検出器１７の各受光部１７ａ上に静止され位置決めされる。この場合も、ターレット２１による分光用素子１８の多チャンネル光検出器１７上での位置決めには、精度の高い位置決め機構が用いられている。

このようにしても、第１の実施の形態と同様な効果を得ることができる。さらに、ターレット２１の回転操作のみで目的に合った分光用素子１８を多チャンネル光検出器１７の受光部１７ａ上に位置決めできるので、分光用素子１８の交換時間をさらに短縮でき蛍光測定のための作業効率を高めることができる。また、ターレット２１には、比較的多くの分光用素子１８を搭載できるので、分光波長範囲の異なる分光用素子１８を多種類にわって用意することができ、さらにきめ細かい蛍光測定を実現することもできる。

なお、分光用素子１８を選択するためのターレット２１の操作は、手動による操作に限らず、例えば、制御部１３ａの指示により不図示の駆動モータにより自動的に回転させるようにもできる。

その他、上述した第１の実施の形態及び変形例では、多チャンネル光検出器１７の８チャンネルの受光部１７ａに対して４個の分光用素子１８を一つ置き（例えば２，４，６，８チャンネルの受光部１７ａ）に配置する例を述べたが、さらに分光用素子１８の数を減らして二つおきに配置したり、三つおきに配置するなど、一つ以上のチャンネルを空けて配置するようにもできる。このことは、例えば、用途によっては標本７の蛍光標識を２重染色で済ませられるような場合、８チャンネルの受光部１７ａの１チャンネルと８チャンネルのみを使用するような分光ユニット１６を用いれば良い。こうすれば、受光部１７ａのチャンネル間のクロストークを抑制することができ、蛍光検出の精度をさらに高めることができる。勿論、目的によっては、多少のクロストークを犠牲にしても、８チャンネル全てを用いることも可能であることは言うまでもない。

（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。

第１の実施の形態では、１個の分光ユニット１６を用いた例を述べたが、これによると、多チャンネル光検出器１７の８チャンネルの受光部１７ａに対して４種類の分光用素子１８による蛍光波長しか同時に測定することができない。

そこで、この第２の実施の形態では、さらに多くの異なる蛍光波長を同時に測定できるようにしている。

図５は、本発明の第２の実施の形態にかかる走査型蛍光顕微鏡の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付して異なる部分のみを説明する。

この場合、第２のコリメータレンズ１５からの平行光の光路上に、分光用ダイクロイックミラー３１が配置されている。この分光用ダイクロイックミラー３１は、短波長域の蛍光光束と長波長適の蛍光光東に分割するものである。そして、分光用ダイクロイックミラー３１を透過する短波長域の蛍光光束の光路には、第１の分光ユニット３２ａが配置され、分光用ダイクロイックミラー３１を反射する長波長域の蛍光光束の光路には、第２の分光ユニット３２ｂが配置されている。これら第１及び第２の分光ユニット３２ａ、３２ｂは、上述した分光ユニット１６と同様なものが用いられている。

このようにすれば、第１の実施の形態のものに比べ、検出波長範囲の組み合わせ数を２倍にすることができ、さらに多くの異なる蛍光波長を同時に測定することができる。この場合、分光用ダイクロイックミラー３１に相当するものを複数設けることで、検出波長範囲の組み合わせ数を必要に応じて、又蛍光の明るさが許す限りいくらでも増やすことができる。この場合、分光用ダイクロイックミラー３１は、様々な波長特性を持った複数のものが交換可能に用意されていることが必要である。

その他、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。例えば、上述した実施の形態では、一貫して８チャンネルの受光部１７ａを有する多チャンネル光検出器１７について述べたが、８チャンネルのものに限らず、複数チャンネルの受光部を有する多チャンネル光検出器に適用できることは勿論である。

さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。

本発明の第１の実施の形態にかかる走査型蛍光顕微鏡の概略構成を示す図。 第１の実施の形態に用いられる分光ユニットの概略構成を示す図。 第１の実施の形態に用いられるホルダとスライドレバーの概略構成を示す図。 第１の実施の形態の変形例に用いられる回転ターレットの概略構成を示す図。 本発明の第２の実施の形態にかかる走査型蛍光顕微鏡の概略構成を示す図。 従来の走査型蛍光顕微鏡の概略構成を示す図。

符号の説明

１…レーザ光源ユニット、２…コリメータレンズ
３…励起ダイクロイックミラー、４…ＸＹスキャナミラー
５…瞳投影レンズ、６…対物レンズ
７…標本、８…結像レンズ
９…共焦点ピンホール、１０…分光用ダイクロイックミラー
１１ａ、１１ｂ…バリアフィルタ
)１２ａ．１２ｂ…ＰＭＴ、１３…中央制御装置
１３ａ…制御部、１３ｂ…画像メモリ
１３ｃ…画像処理装置、１４…表示部
１５…第２のコリメータレンズ、１６…分光ユニット
１７…多チャンネル光検出器、１７ａ…受光部
１７ｂ…マルチアノード部、１７ｃ…ブリーダ抵抗回路部
１７ｄ…コネクタピン、１８、１８１ａ、１８１ｂ…分光用素子
１８ａ…分光用ダイクロイックミラー
１８ｂ…バリアフィルタ、１９、１９ａ、１９ｂ…ホルダ
２０…スライドレバー、２１…ターレット
２１ａ…基体、２１ｂ…軸
３１…分光用ダイクロイックミラー
３２ａ…第１の分光ユニット
３２ｂ…第２の分光ユニット

Claims (9)

1. レーザ光を発生するレーザ光源と、
   前記レーザ光源からのレーザ光を標本上に集光させる対物レンズと、
   前記レーザ光を前記標本上で２次元走査する光走査手段と、
   前記標本からの蛍光の光路に配置された共焦点ピンホールと、
   前記共焦点ピンホールを通過した前記蛍光を受光する複数の受光部を有してこれら受光部ごとの受光した光強度に応じた出力を発生する多チャンネルアレイ光検出器と、前記多チャンネルアレイ光検出器の前記複数の受光部に対応して設けられ、分光波長範囲が互いに異なる複数の分光用素子と、前記共焦点ピンホールを通過した蛍光の光路上に前記複数の分光用素子を配置するように前記複数の分光用素子を一体的に保持し、かつ前記複数の分光用素子を保持して移動又は着脱可能に構成された保持手段と、前記多チャンネルアレイ光検出器に対する前記保持手段の位置決めをする位置決め手段とを有する分光ユニットと
   を具備したことを特徴とする走査型蛍光顕微鏡。
2. 前記保持手段は、前記複数の分光用素子を収容したホルダを有し、
   前記ホルダは、直進移動可能であり、前記分光用素子を前記多チャンネルアレイ光検出器の各受光部上に静止又は退避させる
   ことを特徴とする請求項１記載の走査型蛍光顕微鏡。
3. 前記ホルダは、複数個重ねて設けられ、これらホルダは、前記分光用素子を選択的に前記多チャンネルアレイ光検出器の各受光部上に静止又は退避させることを特徴とする請求項２記載の走査型蛍光顕微鏡。
4. 前記保持手段は、前記複数の分光用素子を備えた回転式ターレットを有し、
   前記回転式ターレットは、回転することにより任意の前記分光用素子を前記多チャンネルアレイ光検出器の各受光部上に配置させる
   ことを特徴とする請求項１記載の走査型蛍光顕微鏡。
5. 前記分光用素子の個数は、前記多チャンネルアレイ光検出器の前記受光部の数より少ないことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の走査型蛍光顕微鏡。
6. さらに、前記標本からの蛍光の光路に配置され、該蛍光の光束を平行光に変換する光学素子を有することを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の走査型蛍光顕微鏡。
7. 前記分光用素子は、分光用ダイクロイックミラー及びバリアフィルタからなることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の走査型蛍光顕微鏡。
8. 前記多チャンネルアレイ光検出器は、多チャンネル用のマルチアノードＰＭＴアレイであることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の走査型蛍光顕微鏡。
9. 前記分光ユニットが複数備えられていることを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載の走査型蛍光顕微鏡。

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