JP2006276840A - 顕微鏡装置、その制御装置、及びプログラム - Google Patents

Abstract

【課題】より正確な分光測定を行える顕微鏡装置を提供するとともに、測定条件の変更に対応して、正確な分光測定を行う顕微鏡装置を提供する。
【解決手段】標本ＳＭからの光は、ダイクロイックミラー２２１を透過して光電変換素子２２８ｃに入射する。パーソナルコンピュータ３００は、光電変換素子２２８ｃがその光を変換して出力する光強度信号をデジタルデータで入力する。ＣＰＵ３０２は、記憶装置３０１に格納されているダイクロイックミラー２２１の波長特性を基に、その特性による減衰分を補正するための操作を光強度信号に対して行う。それにより、より正確な分光測定を実現させる。
【選択図】 図１

Description

本発明は、所望の波長範囲の光による標本の分光測定を適切に行うための技術に関する。

顕微鏡装置にはその種類の一つに共焦点走査型顕微鏡装置がある。その共焦点走査型顕微鏡装置は、走査光学系により、レーザ光等の光を標本上で２次元走査し、標本からの反射光、透過光、若しくは蛍光を光検出器に入射させる。それにより、光検出器が光の強度に応じて出力する光強度信号を、標本の輝度情報として得るようになっている。その輝度情報をＣＲＴ等の表示装置上に輝度の２次元分布として表示することにより、標本画像が観察される。

そのような共焦点走査型顕微鏡装置では、レーザ光等の指向性のある光を集光して標本をピンポイントで照射することで、光が集光する測定点以外からの散乱光を抑制することが行われている。また、光検出器の前段に空間フィルタとして配置されるピンホール（共焦点ピンホール）は、測定点と共役である。共焦点ピンホールによって、測定点以外からの反射光、透過光や蛍光などはカットされるので、３次元空間中の一点だけを測定することができる。生物標本の観察等に多様される蛍光観察の場合は、ピンホールの前段に特定の波長の光に対し透過性を持った透過フィルタが配置されているのが普通であり、そのフィルタを透過した光のみがそのピンホールに入射する。

分光測定を行うタイプの共焦点走査型顕微鏡装置では、共焦点ピンホールを透過した光は、分散素子によってスペクトル分解される。分散素子により生成されたスペクトル列のうち、可変開口機構（スリット）によって所望の波長範囲の光のみが抽出されて光検出器に入射し、標本画像を表す光強度信号に変換される。そのようにして、標本から得られる光のうち、所望波長範囲の光のみを検出する。分散素子の位置（向き）や可変開口機構の位置・開口幅を制御することにより、任意の波長範囲の光を検出して標本画像を取得することができる。

上述したような分光測定機能を備えた顕微鏡装置として、特許文献１に記載されたものがある。この文献に記載された従来の顕微鏡装置では、標本からの光を回折格子により分散させてスペクトル列を生成する。そして、検出波長範囲の中心波長を平面回折格子の回転角度により選択して、中心波長を含む所定幅の波長の光を光検出器で検出する。そのようにして得られた光強度信号を、回折格子の回転角度に応じた補正値で補正することにより、回折格子の回転角度によって生じる回折効率の変化を相殺して分光測定の精度を向上させている。

特許文献２には、多重染色標本の分光測定をより少ない数の光検出器で行う従来の顕微鏡装置が記載されている。その顕微鏡装置では、励起波長λ１、λ２、λ３のレーザ光を多重染色標本に照射し、その標本から発した波長λ１'、λ２'、λ３'の蛍光を、それらの波長の光を透過する特性を持つ１つのバリアフィルタに入射させ、そのフィルタを透過した蛍光を１つの光検出器により検出するようになっている。励起波長λ１、λ２、λ３毎の標本画像は、その光検出器から出力される光強度信号から形成し、形成したこれらの画像を合成して多重染色標本画像を取得するようになっている。なお、微弱な蛍光を感度良く検出するために、光検出器としてフォトマルチプライヤが一般的に採用される。
特開平２００４−２１２６００号公報 特開平２００２−２８７０３４号公報

特許文献１に記載された従来の顕微鏡装置は、光検出器が出力するアナログの光強度信号に対して分散素子の特性に応じた補正を行うことにより、より正確な分光測定を実現させているが、光検出器が出力する光強度信号には、その光検出器に入射する光が透過した透過フィルタの特性、その光検出器が光を光強度信号に変換する特性なども影響を及ぼす。このことから、より正確な分光測定を実現させるためには、そのような特性も考慮する必要があると言える。

より高分解能な分光測定を行う際には、可変開口機構の開口幅を狭めるので光検出器に入射する光の光量が減少する。光量の低下に伴い、光検出のＳ／Ｎ比が低下して分光測定の精度も低下する。一方、上記透過フィルタ、及び分散素子の各特性により、光検出器から出力される光強度信号の大きさは標本に照射する光の波長によって変化することから、標本に照射する光の波長を順次、切り換える場合、その波長による光量の変動が生じることになる。このようなことから、より正確な分光測定を行うためには、分光測定を行う際の波長分解能の変更、或いは標本に照射する光の波長の切り換えといった測定条件の変更に伴って生じる光検出器に入射する光の光量の変動に対応することも重要と言える。

本発明は、より正確な分光測定を行える顕微鏡装置を提供することを第１の目的とする。
また、本発明は、測定条件の変更に対応して、正確な分光測定を行う顕微鏡装置を提供することを第２の目的とする。

本発明の第１の態様の顕微鏡装置は、光源と、この光源から出射された光を標本に対して集光して照射し、該照射によって得られる該標本からの光を光検出器に入射させる光学系と、並びに光検出器が出力する光強度信号を、その光学系が備えた波長選択性光学素子、及びその光検出器がそれぞれ有する波長特性の少なくとも一つに基づいて調節する補正手段と、を具備する。上記波長選択性光学素子は、標本からの光のうち、指定範囲の波長の光のみを透過させるように、波長に応じて透過率の異なる素子である。光学系は他に、標本からの光をスペクトル分解する分散手段、及び分散手段によりスペクトル分解された光から所定波長範囲の光を選択する波長範囲選択手段、を備えている。

なお、上記補正手段は、波長選択性光学素子、及び光検出器がそれぞれ有する波長特性の少なくとも一つに基づいて、光検出器から出力された光強度信号に補正処理を行う光強度信号調節手段である、ことが望ましい。

第２の態様の顕微鏡装置は、上記光学系として、集光する光を標本上で光軸と交差する方向に相対的に移動させる走査手段を備えたものを有し、第１の態様における構成に加えて、走査手段における走査速度を、波長範囲選択手段の設定情報、及び該標本から得られる光の強度情報のうちの少なくとも一つに基づいて調節する走査調節手段を更に具備する。

本発明によれば、より正確な分光測定を行うことができる。また、測定条件の変更に対応して、正確な分光測定を行うことができる。

以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について述べる。
＜第１の実施の形態＞
図１は、第１の実施形態による顕微鏡装置の構成を示す図である。

第１の実施形態は、顕微鏡装置として、共焦点レーザ走査型顕微鏡装置に本発明を適用したものであり、レーザ光を出射する光源１００と、顕微鏡装置本体２００と、その制御装置であるパーソナルコンピュータ（以降「ＰＣ」と表記）３００と、そのＰＣ３００から出力される画像データを表示する表示装置４００と、例えばキーボードや、マウス等のポインティングデバイスなどが対応する入力装置５００と、を備えた構成となっている。第１の実施形態による制御装置は、本体２００と接続されたＰＣ３００として実現されている。

上記表示装置４００や入力装置５００が接続されたＰＣ３００は、例えばハードディスク装置である記憶装置３０１、全体の制御を行うＣＰＵ３０２、及びそのＣＰＵ３０２がワークに用いるメモリ３０３、を備えた構成となっている。顕微鏡装置の制御装置としての動作は、例えばそのための機能を搭載したプログラムをＣＰＵ３０２が記憶装置３０１から読み出して実行することで実現される。そのプログラムは、搭載、或いは接続された不図示の光ディスク装置、或いは通信ネットワークを介した通信を行うための通信制御装置などにより取得するできるものであっても良い。

上記入力装置５００は、ユーザが各種指示、或いはデータ入力のために操作するものである。このことから、ＣＰＵ３０２は、入力装置５００に対してユーザが行う操作を監視し、その操作によって行われる要求を実現させるための制御を行う。

顕微鏡装置本体２００では、光源１００から出射されたレーザ光はダイクロイックミラー２２１、及びミラー２２２にそれぞれ反射されて走査光学ユニット２２３に入射される。その光学ユニット２２３は、走査ミラー２２３ａ、２２３ｂを有し、これら走査ミラー２２３ａ、２２３ｂにより、レーザ光を偏向する。その偏向されたレーザ光は、対物レンズ２２４に入射し、ステージ２２５上に置かれた標本ＳＭ上に集光されて照射される。その標本ＳＭは、光が照射されると、蛍光指示薬が励起され、蛍光を発するようになっている。

標本ＳＭから発せられた蛍光は、レーザ光の入射時とは逆に、対物レンズ２２４、走査光学ユニット２２３、及びミラー２２２を介してダイクロイックミラー２２１に入射する。このダイクロイックミラー２２１は、特定波長の光を反射し、それ以外の波長の光を透過する特性を持っている。その特性により、光源１００から出射されたレーザ光は反射し、標本ＳＭからの蛍光は透過する。透過した蛍光が検出系で検出される。

その検出系は、共焦点ピンホール２２６、ミラー２２７、２２９、測光フィルタ２３０、第１の検出部２２８、及び第２の検出部２３１を備えたものである。第１の検出部２２８は、分散素子２２８ａ、レンズ２２８ｄ、スリット２２８ｂ、及び光電変換素子（光検出器）２２８ｃを有している。分散素子２２８ａとしては平面回折格子を採用し、その分散素子２２８ａの角度を変化させることにより、検出する蛍光の波長帯域の中心を選択するようになっている。図１では、分散素子２２８ａの角度調整を行う駆動部は省略している。第２の検出部２３１は、光電変換素子（光検出器）２３１ａを有している。第２の検出部２３１の前段に配置された測光フィルタ２３０は、特定波長の光のみを透過する特性を有している。光電変換素子２２８ｃ、２３１ａは、例えばフォトマルチプライヤ（ＰＭＴ）であって、入射した光を光電変換して、光量に応じた検出信号を出力する。分散素子２２８ａとしては、平面回折格子以外の素子を採用しても良い。例えば凹面回折格子を採用しても良い。

ダイクロイックミラー２２１を透過した蛍光は、共焦点ピンホール２２６を通過することによりレーザ光の集光位置（測定点）に対して光軸方向にずれた位置からの光がカットされる。それにより、光軸方向に測定点と同一な面からの蛍光だけがミラー２２７に入射される。

そのミラー２２７は、光を全反射するものか、或いは特定波長の光のみを透過する選択的透過性を有するものである。ここでは、全反射するものであると想定する。光を全反射するミラー２２７を採用した場合、それを光路上から退避させることにより、共焦点ピンホール２２６を通過した蛍光はミラー２２９、及び測光フィルタ２３０を介して第２の検出部２３１に入射される。

ミラー２２７で反射された蛍光は、第１の検出部２２８の分散素子（平面回折格子）２２８ａに入射し、その分散素子２２８ａによって波長毎に異なる角度に反射される。そのため、分散素子２２８ａを入射光と反射光の両方に垂直な軸周りに回転させると、その回転角度に応じてレンズ２２８ｄに入射する蛍光の波長範囲が変化する。レンズ２２８ｄに入射した蛍光は、スリット２２８ｂに集光される。そのスリット２２８ｂを通過した蛍光が光電変換素子２２８ｃに入射し、その強度に応じた電気信号が出力される。その光電変換素子２２８ｃから出力された電気信号は、デジタルデータに変換されてＰＣ３００に出力される。ＰＣ３００に出力されるデジタルデータは、標本ＳＭの画像を表す各画素の輝度データである。ＰＣ３００のＣＰＵ３０２は、入力されたデジタルデータを用いて画像データを生成して表示装置４００に出力することにより、標本画像を表示装置４００に表示させる。

図２は、第１の検出部２２８の構成を説明する図である。図２に示すように、第１の検出部２２８は、図１に示す構成の他に制御部２２８ｅを備えている。
分光測定する波長範囲（帯域）、及びその中心は共に、入力装置５００への操作により指定するようになっている。その波長範囲をユーザが指定すると、ＣＰＵ３０２は、その波長範囲からスリット２２８ｂに設定すべき開口幅を求めて制御部２２８ｅに送信する。それにより制御部２２８ｅは、不図示のスリット２２８ｂ用の駆動部を駆動して、ＣＰＵ３０２が指定の開口幅にスリット２２８ｂの開口幅を変更する。波長範囲の中心をユーザが指定した場合には、その中心の波長の光がスリット２２８ｂの開口の中央に入射するための分散素子２２８ａの回転角度を求めて、制御部２２８ｅに送信する。それにより制御部２２８ｅは、不図示の分散素子２２８ａ用の駆動部を駆動して、分散素子２２８ｅの回転角度をＣＰＵ３０２が指定の回転角度に変更する。

図３は、画像表示処理のフローチャートである。その画像表示処理は、例えばユーザが入力装置５００を操作して走査開始命令を入力した場合に、標本ＳＭの２次元走査画像を表示するために実行される処理である。例えばＰＣ３００のＣＰＵ３０２が、記憶装置３０１に格納されたプログラムを実行することで、この処理が実現される。次に図３を参照して、その表示処理について詳細に説明する。その表示処理の実行開始時には、分散素子２２８ａ、及びスリット２２８ｂはそれぞれユーザが所望する状態に調整されている。

先ず、ステップＳ１１では、走査光学ユニット２２３（の不図示の制御部）に走査を開始させるとともに、光電変換素子２２８ｃによる光の検出を開始させる。次のステップＳ１２では、記憶装置３０１から、ダイクロイックミラー２２１の波長特性を補正情報として読み出しメモリ３０３に書き込む。その波長特性は、例えば図４に示すようなものである。そのような特性により、ダイクロイックミラー２２１は、光源１００から入射した光だけでなく、標本ＳＭからの蛍光の一部も反射する。

なお、複数種類のダイクロイックミラー２２１を切り替えて使用する装置の場合には、それぞれの波長特性データを記憶装置３０１に格納しておく。また、ダイクロイックミラー２２１の切替装置とＰＣ３００を接続して、使用中のダイクロイックミラー２２１の種別情報をＰＣ３００が認識できるようにする。そして、現在要注視のダイクロイックミラー２２１に対応する波長特性データを補正情報として読み出す。

ステップＳ１２に続くステップＳ１３では、走査光学ユニット２２３に走査を行わせることによって光電変換素子２２８ｃから出力されてデジタルデータに変換される光強度信号を随時、取得する。そして取得した光強度信号に対し、図４に示すような波長特性を考慮した補正を行い、補正後の光強度信号を輝度情報としてメモリ３０３に格納する。その補正は、例えば取得した光強度信号の信号値がαλ、ダイクロイックミラー２１の波長特性がβλであった場合、波長λにおける補正後の信号値αλ'は以下の式で与えられる。

αλ'＝αλ／（βλ／１００） ・・・ （１）
（１）式による信号値αλ'の算出は、微小な波長間隔Δλ毎に行う。それにより、ダイクロイックミラー２２１の波長特性を排除した光強度信号、つまり波長特性が波長λ全域にわたって一定なものであった場合に得られるはずの光強度信号をデジタル処理により再現する。そのような再現により、より正確な光強度信号を得られることから、分光測定もより高精度に行うことができる。その再現は、ＰＣ（制御装置）３００に実行させるプログラムの変更によって既存の顕微鏡装置（その制御装置）に行わせることができる。

図５は、光強度信号に対して行う補正を説明する図である。その図５に示すように、ダイクロイックミラー２２１の透過率が低いことで信号値が実際よりも小さくなっている、つまり光強度信号が減衰している波長範囲では、その減衰分が補正されて、補正後の光強度信号の信号値は元のものより大きくなっている。

上記光強度信号の補正、及び補正後の光強度信号の保存は、光電変換素子２２８ｃからの光強度信号の全てを対象に行う。それにより、走査が終了して光電変換素子２２８ｃからの光強度信号を受信しなくなると、ステップＳ１４に移行して、メモリ３０３に格納した輝度情報から標本画像を形成し、表示装置４００に出力して表示させる。その後、一連の処理を終了する。

なお、本実施形態では、第１の検出部２２８の出力する光強度信号を補正の対象としているが、第２の検出部２３１の出力する光強度信号を補正の対象としても良い。標本ＳＭからの蛍光を第１、及び第２の検出部２２８、２３１にそれぞれ入射させる場合では、ミラー２２７は特定波長の光を透過する波長特性を持ったダイクロイックミラーにする必要がある。このことから、第２の検出部２３１では、より正確な分光測定を実現させるために、ダイクロイックミラー２２１の波長特性（図４）に応じた補正に加えて、ミラー２２７、及び測光フィルタ２３０の各波長特性に応じた補正も併せて行うことが望ましい。なお、ミラー２２７が全反射ミラーでなくダイクロイックミラーの場合には、第１の検出部２２８においてもミラー２２７の波長特性を加味した補正を行うことが望ましい。ミラー２２７、及び測光フィルタ２３０の各特性に応じた補正は、ダイクロイックミラー２２１の波長特性に応じた補正と同様な方法で行うことができるが、別の方法を採用しても良い。これはダイクロイックミラー２２１の波長特性に応じた補正でも同様である。何れの補正も、光電変換素子（光検出器）に入射する光に光学素子の特性が及ぼす影響を排除するものであることから、光学系の構成、つまりダイクロイックミラーや測光フィルタの個数、その配置等は限定されるものではなく、要旨を逸脱しない範囲で種々変形可能である。
＜第２の実施形態＞
上記第１の実施形態は、光電変換素子に入射する光に光学素子の特性が及ぼす影響を排除するものである。しかし、光電変換素子自身も、例えば図６に示すように、光を光強度信号に変換する検出効率が波長によって変動する。このようなことから、第２の実施形態は、光電変換素子の波長特性に応じた補正を行うことにより、分光測定をより正確に行えるようにしたものである。

第２の実施形態による顕微鏡装置の構成は、基本的に第１の実施形態におけるそれと同じである。このことから、第１の実施形態と同じ、或いは基本的に同じものには同じ符号をそのまま用いつつ、第１の実施形態から異なる部分についてのみ説明することとする。

第２の実施形態では、図３に示す画像表示処理において、ステップＳ１２、Ｓ１３が第１の実施形態から異なっている。このことから、それらステップＳ１２、Ｓ１３についてのみ詳細に説明する。

第２の実施形態では、ステップＳ１２において、記憶装置３０１から、光電変換素子２２８ｃの図６に示すような波長特性を補正情報として読み出しメモリ３０３に書き込む。次のステップＳ１３では、走査光学ユニット２２３に走査を行わせることによって光電変換素子２２８ｃから出力されてデジタルデータに変換される光強度信号を随時、取得し、取得した光強度信号に対し、図６に示すような波長特性を考慮した補正を行い、補正後の光強度信号を輝度情報としてメモリ３０３に格納する。その補正は、例えば第１の実施形態と同様の方法で行うことができる。

なお、第２の実施形態では、光学変換素子に入射する光に光学素子の特性が及ぼす影響の排除は行っていないが、その排除も併せて行うようにしても良い。一つの光学素子の特性が及ぼす影響を排除するようにしたとしても、分光測定は更に正確に行えるようになる。
＜第３の実施形態＞
光をスペクトル分解する分散素子２２８ａも波長特性を有している。第３の実施形態は、光学変換素子に入射する光に特性による影響を及ぼす光学素子として分散素子２２８ａに着目し、その分散素子２２８ａが有する波長特性による減衰分を補正して、より正確な分光測定を行えるようにしたものである。

第３の実施形態による顕微鏡装置の構成は、基本的に第１の実施形態におけるそれと同じである。このことから、第２の実施形態と同様に、第１の実施形態と同じ、或いは基本的に同じものには同じ符号をそのまま用いつつ、第１の実施形態から異なる部分についてのみ説明することとする。

第３の実施形態では、図３に示す画像表示処理において、ステップＳ１２、Ｓ１３が第１の実施形態から異なっている。このことから、それらステップＳ１２、Ｓ１３についてのみ詳細に説明する。

第３の実施形態では、ステップＳ１２において、記憶装置３０１から、分散素子２２８ａの波長特性を補正情報として読み出しメモリ３０３に書き込む。次のステップＳ１３では、走査光学ユニット２２３に走査を行わせることによって光電変換素子２２８ｃから出力されてデジタルデータに変換される光強度信号を随時、取得し、取得した光強度信号に対し、分散素子２２８ａの波長特性を考慮した補正を行い、補正後の光強度信号を輝度情報としてメモリ３０３に格納する。その補正も、例えば第１の実施形態と同様の方法で行うことができる。

なお、第３の実施形態では、光学変換素子に入射する光に特性が影響を及ぼす他の光学素子や、光電変換素子２２８ｃ等に応じた補正は行っていないが、それらのうちの少なくとも何れかに着目した補正も併せて行うようにしても良い。そのようにした場合には、分光測定は更に正確に行えるようになる。
＜第４の実施形態＞
より高分解能な分光測定を行うほど、スリット２２８ｂの開口幅は狭めることになる。開口幅を狭めることに伴い、それを透過する光の光量はより小さくなる。第４の実施形態は、そのような測定条件（開口幅）の変更に自動的に対応して、常に正確な分光測定を行うようにしたものである。

第４の実施形態による顕微鏡装置の構成は、基本的に第１の実施形態におけるそれと同じである。このことから、第２、及び第３の実施形態と同様に、第１の実施形態と同じ、或いは基本的に同じものには同じ符号をそのまま用いつつ、第１の実施形態から異なる部分についてのみ説明することとする。

スリット２２８ｂの開口幅が小さくなってそれを透過する光量が低下すると、光電変換素子２２８ｃが出力する光強度信号のＳ／Ｎ比も低下することになる。Ｓ／Ｎ比の低下をデジタル処理で対応するのは非常に困難である。このことから、第４の実施形態では、走査光学ユニット２２３に設定される走査速度を調整して、スリット２２８ｂの開口幅によって生じる、光電変換素子２２８ｃに入射する光量の変動を自動的に回避させている。検出光量の変動を抑えることによりＳ／Ｎ比を向上させ、常に正確に分光測定を行うことができる。スリット２２８ｂの開口幅の変更は、上述したように、ＣＰＵ３０２が、ユーザが指定した検出波長範囲（分解能）から決定した開口幅を制御部２２８ｅに送信することにより行われる。

図７は、スリット２２８ｂの開口幅、及び走査速度によって光電変換素子２８ｃに入射する光量の変化を説明する図である。同図（ａ）はスリット２２８ｂの開口幅によって光電変換素子２８ｃに入射する光量の変化、同図（ｂ）は走査速度によって光電変換素子２２８ｃに入射する光量の変化をそれぞれ表している。変化を示す光量としては、単位時間で検出される光量（蛍光量）を相対的に表した相対蛍光量、つまり図７（ａ）では、開口幅基準値Ｗ＿ｂａｓｅの開口幅で入射する光量との比、図７（ｂ）では、走査速度基準値Ｖ＿ｂａｓｅの走査速度で入射する光量との比、を採用している。

図７（ａ）に示すように、開口幅が小さくなるほど、光電変換素子２２８ｃに入射する光量は低下する。走査速度では、図７（ｂ）に示すように、速くなるほど、光電変換素子２２８ｃに入射する光量は低下する。そのような関係にあることから、新たに設定する開口幅をＷ＿ｎｅｗとすると、その開口幅Ｗ＿ｎｅｗに変更することに併せて、新たに設定すべき走査速度Ｖ＿ｎｅｗは以下の式によって算出している。その式中のγはスリット２２８ｂによって決定される定数である。

Ｖ＿ｎｅｗ＝γ・（Ｗ＿ｎｅｗ／Ｗ＿ｂａｓｅ）・
Ｖ＿ｂａｓｅ ・・・ （２）
スリット２２８ｂの開口幅を開口幅Ｗ＿ｎｅｗに変更することに併せて、（２）式により算出される走査速度Ｖ＿ｎｅｗに走査速度を自動的に変更して走査光学ユニット２２３に走査を行わせる。それにより、スリット２２８ｂの開口幅の変更に伴って生じる、光電変換素子２２８ｃに入射する光量の変動を回避させる。その変動の回避により、分光測定は常に正確に行えるようになる。

図８は、画像取得処理のフローチャートである。この処理は、例えばユーザが入力装置５００を操作して入力する走査開始命令に対応するための処理であり、例えばＰＣ３００のＣＰＵ３０２が、記憶装置３０１に格納されたプログラムを実行することで実現される。次に図８を参照して、その画像取得処理について詳細に説明する。

先ず、ステップＳ２１では、ユーザが入力装置５００を操作して走査開始命令を入力するのを待つ。入力装置５００を操作して行う分解能の指定等にもそのステップＳ２２で対応する。ユーザには、分解能といった測定条件を指定した後、走査開始命令を入力させるようになっている。それにより、走査開始命令を入力すると、ステップＳ２２に移行する。

ステップＳ２２では、記憶装置３０１から補正情報として、（２）式による走査速度Ｖ＿ｎｅｗの算出に必要なデータを読み出してメモリ３０３に書き込む。続くステップＳ２３では、（２）式により走査速度Ｖ＿ｎｅｗを算出する。その後に移行するステップＳ２４では、算出した走査速度Ｖ＿ｎｅｗに従って走査光学ユニット２２３に対する走査速度の設定を行い、走査を開始させる。その走査の開始により光電変換素子２２８ｃから出力されてデジタルデータに変換される光強度信号を随時、取得し輝度情報としてメモリ３０３に格納する。走査の終了後は、メモリ３０３に格納した輝度情報を用いて標本画像を表示装置４００に表示させてから一連の処理を終了する。

なお、第４の実施形態では、走査速度の変更は、光電変換素子２２８ｃに入射する光量の変動を回避させるように行っているが、その変換素子２２８ｃが出力する光強度信号の変動を回避させるように行っても良い。また、第１〜第３の実施形態の何れかと組み合わせても良い。その組み合わせは、ステップＳ２４で図３に示すような画像表示処理を実行させることで実現することができる。
＜第５の実施形態＞
標本ＳＭが多重染色蛍光標本のときには、その標本ＳＭに照射する光の波長を順次、切り換えて分光測定を行うことがある。そのように光の波長を切り換える場合、光電変換素子２２８ｃに入射する光量は標本ＳＭに照射する光の波長によって変動する。第５の実施形態は、そのような測定条件の変更に自動的に対応して、常に正確な分光測定を行うようにしたものである。

第５の実施形態による顕微鏡装置の構成は、基本的に第１の実施形態におけるそれと同じである。このことから、第２〜第４の実施形態と同様に、第１の実施形態と同じ、或いは基本的に同じものには同じ符号をそのまま用いつつ、第１の実施形態から異なる部分についてのみ説明することとする。

図１０は、試薬による波長特性の相違を説明する図である。
図１０に示すように、標本ＳＭの染色に用いる試薬の波長特性は全て同じではなく、各試薬Ａ、Ｂは固有の波長特性を持っている。そのため、励起させるために照射する光の波長は着目する試薬によって切り換える必要がある。しかし、光の波長を切り換えても、蛍光の強度（光量）は試薬によって変動する。その変動に伴い、光電変換素子２２８ｃに入射する光量が低下すると、光強度信号のＳ／Ｎ比が悪化して正確な分光測定が行えなくなる。第５の実施形態は、走査速度を調整することにより、そのようなことを回避して、常に正確に分光測定を行えるようにしている。図１０に示すような波長特性は記憶装置３０１に格納されている。

新たに設定すべき走査速度は、例えば試薬毎にピーク時における蛍光強度に着目する場合には、試薬のなかで基準とする試薬を選択し、選択した基準試薬の蛍光強度との比を試薬別に求め、求めた比、及び基準の走査速度を用いて算出することができる。その算出方法として別なものを採用しても良い。

標本ＳＭに照射する光の波長の切り換えには、例えば特許文献３に記載されているシーケンシャルスキャン方法を採用することができる。第５の実施形態では、光源１００として、波長の異なる複種類の光（レーザ光）を出射できるものを採用し、ダイクロイックミラー２２１としては、光源１００が出射する光を反射し、且つ蛍光ＳＭからの蛍光を透過する波長特性を持つものを採用している。

図９は、画像取得処理のフローチャートである。この処理は、第４の実施形態と同じく、例えばユーザが入力装置５００を操作して入力する走査開始命令に対応するための処理である。次に図９を参照して、第５の実施形態で実行される画像取得処理について詳細に説明する。

先ず、ステップＳ３１では、ユーザが入力装置５００を操作して走査開始命令を入力するのを待つ。入力装置５００を操作して行う標本ＳＭの選択（多重染色蛍光標本か否かの選択を含む）等にもそのステップＳ３２で対応する。ユーザには、指定すべき測定条件を全て指定した後、走査開始命令を入力させるようになっている。それにより、走査開始命令を入力すると、ステップＳ３２に移行する。

ステップＳ３２では、記憶装置３０１から補正情報として、図１０に示すような波長特性を読み出してメモリ３０３に書き込む。続くステップＳ３３では、上述したようにして設定すべき走査速度を算出する。その後に移行するステップＳ３４では、算出した走査速度に従って走査光学ユニット２２３に対する走査速度の設定を行い、光源１００に出射させる光の波長を設定した後、走査を開始させる。その走査の開始により光電変換素子２２８ｃから出力されてデジタルデータに変換される光強度信号を随時、取得し輝度情報としてメモリ３０３に格納する。走査の終了後は、ステップＳ３５に移行する。

ステップＳ３５では、走査が終了したか否か判定する。別の波長の光で行うべき走査が残っていた場合、判定はＮＯとなって上記ステップＳ３３に戻り、走査に用いる光の波長に応じた走査速度の算出を行う。それにより、標本ＳＭに照射した光の波長毎に輝度情報をメモリ３０３に保存する。一方、そうでない場合には、判定はＹＥＳとなってステップＳ３６に移行し、メモリ３０３に保存している光の波長毎の輝度情報を合成して、標本（多重染色蛍光標本）ＳＭの分光画像を生成し表示装置４００に表示させた後、一連の処理を終了する。

なお、第５の実施形態は、第１〜第４の実施形態の何れかと組み合わせても良い。第１〜第３の実施形態との組み合わせる場合には、例えばステップＳ３４において光強度信号の補正を行わせれば良い。また、本発明の要旨を逸脱しない範囲内で種々の変形を行っても良い。

第１の実施の形態による顕微鏡装置の構成を示す図である。 第１の検出部２２８の構成を説明する図である。 画像表示処理のフローチャートである。 ダイクロイックミラー２２１の波長特性例を説明する図である。 光強度信号に対して行う補正を説明する図である。 光電変換素子の波長特性例を説明する図である。 スリット２２８ｂの開口幅、及び走査速度によって光電変換素子２２８ｃに入射する光量の変化を説明する図である。 撮像処理のフローチャートである（第４の実施の形態）。 撮像処理のフローチャートである（第５の実施の形態）。 試薬による波長特性を説明する図である。

符号の説明

１００ 光源
２００ 顕微鏡装置本体
３００ 制御装置（ＰＣ）
３０１ 記憶装置
３０２ ＣＰＵ
３０３ メモリ
４００ 表示装置
５００ 入力装置
２２１、２２７、２２９ ダイクロイックミラー
２２２ ミラー
２２３ 走査光学ユニット
２２３ａ、２２３ｂ 走査ミラー
２２４ 対物レンズ
２２５ ステージ
２２６ 共焦点ピンホール
２２８ 第１の検出部
２２８ａ 分散素子
２２８ｂ スリット
２２８ｃ、２３１ａ 光電変換素子
２２８ｄ レンズ
２３０ 測光フィルタ
２３１ 第２の検出部

Claims (11)

1. 光源と、
   この光源から出射された光を標本に対して集光して照射し、該照射によって得られる該標本からの光を光検出器に入射させる、下記１−３の構成を含む光学系と、
   １）該標本からの光のうち、指定範囲の波長の光のみを透過させるように、波長に応じて透過率の異なる波長選択性光学素子、
   ２）該標本からの光をスペクトル分解する分散手段、
   ３）該分散手段によりスペクトル分解された光から所定波長範囲の光を選択する波長範囲選択手段、
   前記光検出器が出力する光強度信号を、前記波長選択性光学素子、及び前記光検出器がそれぞれ有する波長特性の少なくとも一つに基づいて調節する補正手段と、
   を具備することを特徴とする顕微鏡装置。
2. 前記補正手段は、前記波長選択性光学素子、及び前記光検出器がそれぞれ有する波長特性の少なくとも一つに基づいて、前記光検出器から出力された光強度信号に補正処理を行う光強度信号調節手段である、
   ことを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。
3. 前記光強度信号調節手段は、前記波長選択性光学素子の波長特性によって前記光検出器に入射する光のスペクトル成分に生じる変動分、及び前記光検出器における検出感度の波長特性によって前記光強度信号に生じる誤差分の少なくとも一方を補正するための調整を、該光強度信号に対してデジタル処理により行う、
   ことを特徴とする請求項２記載の顕微鏡装置。
4. 前記光学系は、集光する光を前記標本上で光軸と交差する方向に相対的に移動させる走査手段を備え、
   前記走査手段における走査速度を、前記波長範囲選択手段の設定情報、及び該標本から得られる光の強度情報のうちの少なくとも一つに基づいて調節する走査調節手段を更に具備する、
   ことを特徴とする請求項１、または２記載の顕微鏡装置。
5. 前記波長範囲選択手段の設定情報は、該波長範囲選択手段により選択される光の波長範囲の幅である、
   ことを特徴とする請求項４記載の顕微鏡装置。
6. 前記走査調節手段は、前記光の強度情報に基づいて、前記光源から出射されて前記標本に集光される光の波長の切り換えに対応して前記走査速度の調節を行う、
   ことを特徴とする請求項４記載の顕微鏡装置。
7. 前記標本は多重染色標本であり、前記標本から得られる光の強度情報は、当該標本に適用されている各蛍光色素の波長特性情報である、
   ことを特徴とする請求項６記載の顕微鏡装置。
8. 光源から出射された光を標本に対して集光して照射し、該照射によって得られる該標本からの光を光検出器に入射させる光学系に、該標本からの光のうち、指定範囲の波長の光のみを透過させる、波長に応じて透過率の異なる波長選択性光学素子、該標本からの光をスペクトル分解する分散手段、及び該分散手段によりスペクトル分解された光から所定波長範囲の光を選択する波長範囲選択手段を備えた顕微鏡装置本体を制御する制御装置において、
   前記光検出器が出力する光強度信号をデジタルデータで取得する信号取得手段と、
   前記信号取得手段が取得した光強度信号を、前記波長選択性光学素子、及び前記光検出器がそれぞれ有する波長特性の少なくとも一つに基づいて調節する光強度信号調節手段と、
   を具備することを特徴とする顕微鏡装置の制御装置。
9. 光源から出射された光を標本に対して集光して照射し、該照射によって得られる該標本からの光を光検出器に入射させる光学系に、該集光される光を該標本の走査のために光軸方向の交差方向に相対的に移動させる走査手段、該標本からの光をスペクトル分解する分散手段、及び該分散手段によりスペクトル分解された光から所定波長範囲の光を選択する波長範囲選択手段を備えた顕微鏡装置本体を制御する制御装置において、
   前記走査手段が前記集光される光を移動させる走査速度を、前記波長範囲選択手段の特性、及び該標本から得られる光の情報のうちの少なくとも一つに基づいて決定する速度決定手段と、
   前記速度決定手段が決定した走査速度により前記走査手段に走査を行わせる走査制御手段と、
   を具備することを特徴とする顕微鏡装置の制御装置。
10. 光源から出射された光を標本に対して集光して照射し、該照射によって得られる該標本からの光を光検出器に入射させる光学系に、該標本からの光のうち、指定範囲の波長の光のみを透過させる波長選択手段、該標本からの光をスペクトル分解する分散手段、及び該分散手段によりスペクトル分解された光から所定波長範囲の光を選択する波長範囲選択手段を備えた顕微鏡装置の制御装置として用いられるコンピュータに実行させるプログラムにおいて、
    前記光検出器が出力する光強度信号をデジタルデータで取得する機能と、
    前記取得する機能により取得した光強度信号を、前記波長選択手段、及び前記光検出器がそれぞれ有する波長特性の少なくとも一つに基づいて調節する機能と、
    を前記コンピュータに実現させるプログラム。
11. 光源から出射された光を標本に対して集光して照射し、該照射によって得られる該標本からの光を光検出器に入射させる光学系に、該集光される光を該標本の走査のために光軸方向の交差方向に相対的に移動させる走査手段、該標本からの光をスペクトル分解する分散手段、及び該分散手段によりスペクトル分解された光から所定波長範囲の光を選択する波長範囲選択手段を備えた顕微鏡装置本体を制御する装置として用いられるコンピュータに実行させるプログラムにおいて、
    前記走査手段が前記集光される光を移動させる速度を、前記波長範囲選択手段の特性、及び該標本から得られる光の情報のうちの少なくとも一つに基づいて決定する機能と、
    前記決定する機能により決定した速度により前記走査手段に走査を行わせる機能と、
    を前記コンピュータに実現させるプログラム。

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