JP4899648B2 - スペクトル観察方法及びスペクトル観察システム - Google Patents
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Description
そこで本発明は、励起波長の異なる複数種類の物質を含む被観察物の観察において、必要なデータを欠落無く取得することの可能なスペクトル観察方法及びスペクトル観察システムを提供することを目的とする。
また、本発明のスペクトル観察システムは、励起波長の異なる複数種類の物質を含む被観察物へ光を照射する照射手段と、前記被観察物から放射される光のスペクトルを検出する検出手段と、前記照射手段が照射する光の波長を切り替える波長切替手段と、を備えたスペクトル観察装置と、前記波長切替手段を制御することにより、前記照射する光の波長を、前記複数種類の物質の各々の励起波長の間で波長の長い順に切り替えると共に、前記照射する光の波長の異なる複数の状態の各々において前記検出手段を駆動することにより、前記複数種類の物質の各々のスペクトルデータを、励起波長の長い物質のものから順に取得する制御装置と、前記検出手段の一部のチャンネルを遮光し、かつ、前記検出手段の遮光チャンネルが切り替わる方向へ移動可能な遮光板とを備え、前記制御装置は、前記複数種類の物質の各々のスペクトルデータを取得する際は、前記検出手段による前記スペクトルの検出波長から、前記スペクトルデータの取得元となる物質の励起波長が排除されるように、前記遮光板の位置を制御することを特徴とする。
なお、前記複数種類の物質には、励起波長が相対的に長い第1物質と、励起波長が相対的に短い第2物質とが含まれ、前記第2物質の励起波長は、前記第1物質の吸収スペクトルの波長範囲に包含されており、前記第1物質の励起波長は、前記第2物質の吸収スペクトルの波長範囲から外れていてもよい。
また、前記被観察物へ照射する前記光は、レーザ光であってもよい。
以下、本発明の第1実施形態を説明する。本実施形態は、スペクトルイメージング蛍光レーザ顕微鏡システムの実施形態である。
先ず、本システムの構成を説明する。
図1は、本システムの構成図である。図1に示すとおり、本システムには、共焦点顕微鏡1と、スペクトル検出部2と、制御部3と、モニタ4とが備えられる。
グレーティング22は、グレーティングステージ22Mによって支持されており、光路に対する挿入角度が調節可能になっている。グレーティングステージ22Mは、グレーティング22と共に、格子ピッチの異なるグレーティング22’,22”を支持しており、光路に挿入されるグレーティングを、グレーティング22,22’,22”の間で切り替えることもできる。
また、CPU37は、スペクトルイメージングに当たり、レーザユニット12内の波長可変フィルタ124(又は各レーザシャッタ100)へ指示を与えることにより、レーザ光のオンオフ制御や、レーザ光の波長切り替え制御を行うことができる。
因みに、スペクトルディテクタ24の検出波長範囲を拡縮するには、光路に挿入されるグレーティングをグレーティング22,22’,22”の間で切り替えればよい。但し、スペクトルディテクタ24のチャンネル数は不変なので、その検出波長範囲を拡縮させると、それに応じて波長分解能も変化する。例えば、グレーティング22が光路へ挿入されたときには、検出波長範囲は80nm、波長分解能は2.5nnとなり、グレーティング22’が光路へ挿入されたときには、検出波長範囲は160nm、波長分解能は5nmとなり、グレーティング22”が挿入されたときには、検出波長範囲は320nm、波長分解能は10nmとなる。
また、スペクトルディテクタ24の検出波長範囲から特定の波長成分を除外するには、スペクトルディテクタ24の32個のチャンネルのうち、その特定の波長成分に対応するチャンネルに遮光板30を配置すればよい。
標本10Aは、GFP、RFPの2種類の蛍光試薬で多重染色された生体細胞の標本である。図2は、GFPに固有の特性を示す図であり、図3は、RFPに固有の特性を示す図である。図2,図3において、点線で示すのは、吸収スペクトルであり、実線で示すのは、放射スペクトルであり、太い直線で示すのは、励起波長である。
また、GFPとRFPとを別々に励起してスペクトルイメージングを行うとしても、励起波長の短いGFPのスペクトルイメージング(つまり励起に高いエネルギーを要する)を、励起波長の長いRFPのスペクトルイメージング(つまり励起に高いエネルギーを要しない)よりも先に行うと、RFPデータの取得前にRFPが反応し、その退色が始まってしまうので、RFPデータを正確に取得することができない。このことは、GFPの励起波長(図2の太い直線)が、RFPの吸収スペクトル(図3点線)の波長範囲に含まれることからも明らかである。
次に、CPU37の動作手順を説明する。CPU37は、以上の問題を回避するため、以下の手順で動作する。
その状態で、CPU37は、レーザ波長を543nmに設定し、スペクトルイメージングを行う(ステップS13)。CPU37は、取得したスペクトル画像データのうち、543nmよりも長波長側(551nm〜上限)の全データを、有効データとみなす。因みに、この543nmの励起光は、RFPを励起する一方で、それよりも励起波長の短いGFPを励起しないので、この有効データには、RFPデータのみが反映されていると考えられる。
その状態で、CPU37は、レーザ波長を488nmに設定し、スペクトルイメージングを行う(ステップS15)。CPU37は、取得したスペクトル画像データのうち、488nmよりも長波長側の全データ(496nm〜上限)を、有効データとみなす。因みに、この488nmの励起光は、GFPを励起するので、この有効データには、GFPデータが反映されている。また、488nmの励起光は、RFPを少しだけ励起し、有効データの波長範囲には、RFPの放射スペクトルの波長範囲も含まれている。よって、この有効データには、RFPデータも少しだけ反映されていると考えられる。
以上、本システムのCPU37は、レーザ光の波長を2つの蛍光試薬(RFP,GFP)の各々の励起波長の間で切り替えながらスペクトルイメージングを2回行い、主にRFPに関するスペクトルデータ(ステップS13の有効データ)と、主にGFPに関するスペクトルデータ(ステップS15の有効データ)とをシーケンシャルに取得する。
また、本システムのCPU37は、励起波長の長いスペクトルイメージング(RFPに関するスペクトルイメージング)を先に行ったので、或る蛍光試薬に関するスペクトルイメージングが他の蛍光試薬に干渉する(退色を招く)という事態は、回避される。したがって、2つの蛍光試薬のスペクトルデータは、それぞれ正確に取得される。
以下、本発明の第2実施形態を説明する。本実施形態もスペクトルイメージング蛍光レーザ顕微鏡システムの実施形態である。ここでは、第1実施形態との相違点のみ説明する。相違点は、標本10Aに添加された蛍光試薬と、CPU37の動作とにある。
先ず、本実施形態の標本10Aに添加された蛍光試薬を説明する。
図6は、CFPに固有の特性を示す図である。図6において、点線で示すのは、吸収スペクトルであり、実線で示すのは、放射スペクトルであり、太い直線で示すのは、励起波長である。図6に示すとおり、CFPの励起波長は、GFP及びRFPのそれよりも短い440nmであり、CFPの放射スペクトルの波長範囲は、約450nmから約600nmである。このようなCFPの標本10Aにおける寄与を本システムで知るためには、440nmのチャンネルを検出波長範囲から外し、440nmのレーザ光で励起しながらスペクトルイメージングを行えばよい。取得されたスペクトル画像データのうち、主として440nmより長波長側のデータに、CFPの寄与を示すデータ(CFPデータ)が現れる。
図7は、本実施形態のCPU37の動作フローチャートである。図7中の各ステップの内容を可視化すると、図8に示すとおりになる。これらの図7,図8に示すとおり、先ず、CPU37は、スペクトルディテクタ24の検出波長範囲を440〜600nm、波長分解能を10nmに設定する(ステップS21)。この検出波長範囲(440〜600nm)は、CFPの放射スペクトルの主な波長範囲と、GFPの放射スペクトルの主な波長範囲と、RFPの放射スペクトルの主な波長範囲とをカバーし、かつ、CFPの励起波長440nmから外れている。
その状態で、CPU37は、レーザ波長を543nmに設定し、スペクトルイメージングを行う(ステップS23)。CPU37は、取得したスペクトル画像データのうち、543nmよりも長波長側(558nm〜上限)の全データを有効データとみなす。因みに、この543nmの励起光は、RFPを励起する一方で、それよりも励起波長の短いGFP,CFPを励起しないので、この有効データには、RFPデータのみが反映されていると考えられる。
その状態で、CPU37は、レーザ波長を488nmに設定し、スペクトルイメージングを行う(ステップS25)。CPU37は、取得したスペクトル画像データのうち、488nmよりも長波長側かつ543nmよりも短波長側のデータ(503nm〜528nm)を有効データとみなす。因みに、この488nmの励起光は、GFPを励起するので、この有効データには、GFPデータが反映されている。また、488nmの励起光は、RFPを少しだけ励起するが、この有効データの波長範囲には、RFPの放射スペクトルの波長範囲が殆ど含まれない。よって、この有効データには、GFPデータのみが反映されていると考えられる。
その状態で、CPU37は、レーザ波長を440nmに設定し、スペクトルイメージングを行う(ステップS27)。CPU37は、取得したスペクトル画像データのうち、440nmよりも長波長側かつ488nmよりも短波長側のデータ(455nm〜473nm)を有効データとみなす(図8参照)。因みに、この440nmの励起光は、CFPを励起するので、この有効データには、CFPデータが反映されている。また、440nmの励起光は、GFPを少しだけ励起するが、この有効データの波長範囲にはGFPの放射スペクトルの波長範囲が殆ど含まれない。よって、この有効データには、CFPデータのみが反映されていると考えられる。
また、本システムのCPU37は、励起波長の長いスペクトルイメージングを先に行ったので、或る蛍光試薬に関するスペクトルイメージングが他の蛍光試薬に干渉する(退色を招く)という事態は、回避される。したがって、3つの蛍光試薬のスペクトルデータは、正確に取得される。
なお、以上の各実施形態では、蛍光顕微鏡システムを説明したが、本発明は、標本で生じた蛍光のスペクトルデータを取得するときだけでなく、標本で生じた燐光のスペクトルデータを取得するときにも有効である。
また、以上の各実施形態では、イメージング機能を備えた顕微鏡システムを説明したが、本発明は、標本の代表点(複数又は単一の点)のスペクトルデータを取得するときにも有効である。
Claims (9)
- 励起波長の異なる複数種類の物質を含む被観察物へ光を照射すると共に、その被観察物から放射される光のスペクトルを検出するスペクトル観察方法であって、
前記照射する光の波長を、前記複数種類の物質の各々の励起波長の間で波長の長い順に切り替えると共に、前記照射する光の波長の異なる複数の状態の各々において前記検出を行うことにより、前記複数種類の物質の各々のスペクトルデータを、励起波長の長い物質のものから順に取得し、
前記複数種類の物質の各々のスペクトルデータを取得する際は、前記スペクトルの検出波長から、前記スペクトルデータの取得元となる物質の励起波長を除外する
ことを特徴とするスペクトル観察方法。 - 請求項1に記載のスペクトル観察方法において、
前記取得した前記スペクトルデータを合成する
ことを特徴とするスペクトル観察方法。 - 励起波長の異なる複数種類の物質を含む被観察物へ光を照射する照射手段と、
前記被観察物から放射される光のスペクトルを検出する検出手段と、
前記照射手段が照射する光の波長を切り替える波長切替手段と、
を備えたスペクトル観察装置と、
前記波長切替手段を制御することにより、前記照射する光の波長を、前記複数種類の物質の各々の励起波長の間で波長の長い順に切り替えると共に、前記照射する光の波長の異なる複数の状態の各々において前記検出手段を駆動することにより、前記複数種類の物質の各々のスペクトルデータを、励起波長の長い物質のものから順に取得する制御装置と、
前記検出手段の一部のチャンネルを遮光し、かつ、前記検出手段の遮光チャンネルが切り替わる方向へ移動可能な遮光板とを備え、
前記制御装置は、
前記複数種類の物質の各々のスペクトルデータを取得する際は、前記検出手段による前記スペクトルの検出波長から、前記スペクトルデータの取得元となる物質の励起波長が排除されるように、前記遮光板の位置を制御する
ことを特徴とするスペクトル観察システム。 - 励起波長の異なる複数種類の物質を含む被観察物へ光を照射する照射手段と、
前記被観察物から放射される光のスペクトルを検出する検出手段と、
前記照射手段が照射する光の波長を切り替える波長切替手段と、
を備えたスペクトル観察装置と、
前記波長切替手段を制御することにより、前記照射する光の波長を、前記複数種類の物質の各々の励起波長の間で波長の長い順に切り替えると共に、前記照射する光の波長の異なる複数の状態の各々において前記検出手段を駆動することにより、前記複数種類の物質の各々のスペクトルデータを、励起波長の長い物質のものから順に取得する制御装置と、
前記検出手段の検出波長範囲を切り替える範囲切替手段とを備え、
前記制御装置は、
前記複数種類の物質の各々のスペクトルデータを取得する際は、前記検出手段による前記スペクトルの検出波長から、前記スペクトルデータの取得元となる物質の励起波長が排除されるように、前記範囲切替手段を制御する
ことを特徴とするスペクトル観察システム。 - 請求項3又は請求項4に記載のスペクトル観察システムにおいて、
前記制御装置は、
前記取得した前記スペクトルデータを合成する
ことを特徴とするスペクトル観察システム。 - 請求項1又は請求項2に記載のスペクトル観察方法において、
前記複数種類の物質には、励起波長が相対的に長い第1物質と、励起波長が相対的に短い第2物質とが含まれ、
前記第2物質の励起波長は、前記第1物質の吸収スペクトルの波長範囲に包含されており、前記第1物質の励起波長は、前記第2物質の吸収スペクトルの波長範囲から外れている
ことを特徴とするスペクトル観察方法。 - 請求項3〜請求項5の何れか一項に記載のスペクトル観察システムにおいて、
前記複数種類の物質には、励起波長が相対的に長い第1物質と、励起波長が相対的に短い第2物質とが含まれ、
前記第2物質の励起波長は、前記第1物質の吸収スペクトルの波長範囲に包含されており、前記第1物質の励起波長は、前記第2物質の吸収スペクトルの波長範囲から外れている
ことを特徴とするスペクトル観察システム。 - 請求項1、請求項2、請求項6の何れか一項に記載のスペクトル観察方法において、
前記被観察物へ照射する前記光は、レーザ光である
ことを特徴とするスペクトル観察方法。 - 請求項3、請求項4、請求項5、請求項7の何れか一項に記載のスペクトル観察システムにおいて、
前記照射手段が前記被観察物へ照射する前記光は、レーザ光である
ことを特徴とするスペクトル観察システム。
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