JP2005351703A - 走査型レーザ顕微鏡および検出波長範囲設定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 観察対象に対する最適な検出波長範囲（開始波長と取込み波長幅）を簡単に設定できる走査型レーザ顕微鏡および検出波長範囲設定方法を提供する。
【解決手段】 制御ユニット２９によりスリット２７のスペクトル列方向のスリット幅を観察対象の試薬の標準検出波長範囲Ａに設定し、フォトマルチプライヤー２８によりデータ取りを行ない、次いで、スリット２７のスペクトル列方向のスリット幅を標準検出波長範囲Ａより十分に小さい所定の波長範囲Ｘに設定し、回折格子ガルバノミラー２５の反射角度を制御し、波長範囲Ｘを波長幅単位として数ステップずらし走査しながらデータ取りを行なう。そして、このずらし走査により得られたデータを用いて、標準検出波長範囲Ａに対する加算、減算を実行し、検出開始波長、取込み波長幅をずらしながら、標準検出波長範囲Ａの周辺をまんべんなくデータ補完し、複数の補完データを生成し、これらデータから最適な検出波長範囲（開始波長と取込み波長幅）を設定する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、光源からの光を走査して試料に照射し、試料で発生する検出光をスペクトル分散してそのスペクトル列から任意の波長領域の検出光を検出したり、分光データを取得する走査型レーザ顕微鏡および検出波長範囲設定方法に関するものである。

顕微鏡の分野では、有機化合物である蛍光試薬やＧＦＰに代表される蛍光タンパ質のラインナップの増加などに伴ない、さまざまな蛍光を同時に検出することが望まれている。

そこで、従来、例えば、特許文献１に開示されるように、試料から発せられた検出光をスペクトル分解する手段（プリズム）と、予め定められたスペクトル領域を選択する手段およびこの選択手段を介して与えられる光を検出する検出装置とを備え、検出光をスペクトル分解する手段とスペクトル領域を選択する手段を互いに制御することで、任意の波長領域の光を検出装置により検出できるようにしたものが提案されている。
特開２００２−１２２７８７号公報

ところで、観察対象の試薬の蛍光波長特性は、例えば、図９（ａ）に示すようなグラフで表わすことができる。従って、このような蛍光波長特性に対して、あらかじめ試薬ごとに用意された推奨の標準検出波長範囲Ａ（開始波長と取り込み波長幅）を設定し、この標準検出波長範囲Ａについてデータを取得するようにすれば、最適なコントラストの蛍データを得ることができる。

ところが、実際の試料は、１種類の試薬で染色されているとは限らず、他の試薬で多重染色されていることがあり、また、試料自体に自家蛍光などが発生していることもある。この場合、これら他の試薬や自家蛍光による蛍光波長特性が図９（ｂ）に示すようになり、その波長範囲Ｂが観察対象の試薬の標準検出波長範囲Ａの一部と重なってしまうことがある。この状況では、観察対象の試薬の標準検出波長範囲Ａについてデータを取得しても、コントラストの高い蛍光データが得られないという問題が生じる。

そこで、特許文献１のものについても、コントラストの高いデータを得るには、観察対象の試薬について最適な検出波長範囲（開始波長と取り込み波長幅）を設定する必要がある。しかし、このような検出開始波長や波長幅をフレキシブルに選べることは検出の自由度が高い反面、検出開始波長と取込み波長幅の２つのパラメータをどのように変化させれば最適なデータが取得できるかなどを事前に予測するのが極めて難しい。

このため実際は、試料の種類や試薬の染まり具合に合わせて検出開始波長や取込み波長幅を決定したり、他の試薬との重なり具合をチェックしながら、検出開始波長または選択波長幅を少しづつシフトさせて得られたデータのコントラストから最適な状態を判断するなと、試行錯誤を繰り返しながら最良の検出開始波長と取込み波長幅を決定しており、そのために多大な手間と時間がかかるという問題があった。

本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、観察対象に対する最適な検出波長範囲（開始波長と取り込み波長幅）を簡単に設定できる走査型レーザ顕微鏡および検出波長範囲設定方法を提供することを目的とする。

請求項１記載の発明は、レーザ光を発生するレーザ光源と、前記レーザ光源のレーザ光が照射される標本からの検出光を結像する共焦点レンズ、該共焦点レンズの焦点位置に配置される共焦点絞りを有する検出光学系と、前記共焦点絞りを通った検出光を取り込みスペクトル分散させるスペクトル分散手段と、前記スペクトル分散手段で分散されたスペクトルから測定すべきスペクトル領域を選択するスペクトル領域選択手段を有し、該スペクトル領域選択手段で選択されたスペクトルのデータを検出する検出手段と、前記スペクトル分散手段とスペクトル領域選択手段を制御し、前記標本の観察対象に予め設定された標準検出波長範囲についてデータを取得するとともに、前記標準検出波長範囲の短波長側と長波長側の少なくとも一方について、所定の波長範囲を波長幅単位として数ステップずらし走査してデータを取得し、これら取得されたデータにより前記標準検出波長範囲で検出したデータに対し加減算を行い、前記標準検出波長範囲に対する検出開始波長と波長幅の少なくとも一方をずらしながら複数の補完データを生成し、これらデータにより前記標準検出波長範囲に最適な検出波長範囲（開始波長と取込み波長幅）を設定可能とした制御手段とを具備したことを特徴としている。

請求項２記載の発明は、請求項１記載の発明において、さらに表示手段を有し、前記制御手段により生成された補完データを各別に表示するようにしたことを特徴としている。

請求項３記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記制御手段は、前記標準検出波長範囲に対する検出開始波長と波長幅の少なくとも一方をずらしながら生成された補完データのダイナミックレンジの差分からコントラストを評価し最適な検出波長範囲（開始波長と取込み波長幅）を自動選択可能にしたことを特徴としている。

請求項４記載の発明は、請求項１記載の発明において、前記制御手段は、前記標準検出波長範囲に対する検出開始波長と取込み波長幅の少なくとも一方をずらす際に、前記レーザ光源のレーザ光の波長を含まないように制御することを特徴としている。

請求項５記載の発明は、レーザ光を発生するレーザ光源と、前記レーザ光源のレーザ光が照射される標本からの検出光を結像する共焦点レンズ、該共焦点レンズの焦点位置に配置される共焦点絞りを有する検出光学系と、前記共焦点絞りを通った検出光を取り込みスペクトル分散させるスペクトル分散手段と、前記スペクトル分散手段で分散されたスペクトルから測定すべきスペクトル領域を選択するスペクトル領域選択手段を有し、該スペクトル領域選択手段で選択されたスペクトルのデータを検出する検出手段と、前記スペクトル分散手段とスペクトル領域選択手段を制御し、前記標本の観察対象に予め設定された標準検出波長範囲に対する検出開始波長と取込み波長幅の少なくとも一方をずらしながら前記標準検出波長範囲に関するデータを取得し、これらデータにより前記標準検出波長範囲に最適な検出波長範囲（開始波長と取込み波長幅）を設定可能とした制御手段とを具備したことを特徴としている。

請求項６記載の発明は、レーザ光を発生するレーザ光源と、前記レーザ光源のレーザ光が照射される標本からの検出光を波長ごとに分光し複数チャンネルの光路に分割する光路分割手段と、前記複数チャンネルのうち一つのチャンネルに設けられ、前記検出光をスペクトル分散させるスペクトル分散手段と、該スペクトル分散手段で分散されたスペクトルから測定すべきスペクトル領域を選択するスペクトル領域選択手段を有し、該スペクトル領域選択手段で選択されたスペクトルを検出する第１のチャンネル検出手段と、前記複数チャンネルのうち他の一つのチャンネルに設けられ、前記検出光をスペクトル分散させるスペクトル分散手段と、該スペクトル分散手段で分散されたスペクトルから測定すべきスペクトル領域を選択するスペクトル領域選択手段を有し、該スペクトル領域選択手段で選択されたスペクトルを検出する第２のチャンネル検出手段と、前記第１および第２のチャンネル検出手段の前記スペクトル分散手段とスペクトル領域選択手段を制御し、前記標本の観察対象に予め設定された標準検出波長範囲についてデータを取得するとともに、前記標準検出波長範囲の短波長側と長波長側の少なくとも一方について、所定の波長範囲を波長幅単位として数ステップずらし走査してデータを取得し、これら取得されたデータにより前記標準検出波長範囲で検出したデータに対し加減算を行い、前記標準検出波長範囲に対する検出開始波長と波長幅の少なくとも一方をずらしながら複数の補完データを生成し、これらデータにより前記標準検出波長範囲に最適な検出波長範囲（開始波長と取込み波長幅）を設定可能とした制御手段とを具備したことを特徴としている。

請求項７記載の発明は、レーザ光を発生するレーザ光源と、前記レーザ光源のレーザ光が照射される標本からの検出光を結像する共焦点レンズ、該共焦点レンズの焦点位置に配置される共焦点絞りを有する検出光学系と、前記共焦点絞りを通った検出光を取り込みスペクトル分散させるスペクトル分散手段と、前記スペクトル分散手段で分散されたスペクトルから測定すべきスペクトル領域を選択するスペクトル領域選択手段を有し、該スペクトル領域選択手段で選択されたスペクトルのデータを検出する検出手段とを具備する走査型レーザ顕微鏡の検出波長範囲設定方法であって、前記スペクトル分散手段とスペクトル領域選択手段を制御し、前記標本の観察対象に予め設定された標準検出波長範囲についてデータを取得するとともに、前記標準検出波長範囲の短波長側と長波長側の少なくとも一方について、所定の波長範囲を波長幅単位として数ステップずらし走査してデータを取得し、これら取得されたデータにより前記標準検出波長範囲で検出したデータに対し加減算を行い、前記標準検出波長範囲に対する検出開始波長と波長幅の少なくとも一方をずらしながら複数の補完データを生成し、これらデータにより前記標準検出波長範囲に最適な検出波長範囲（開始波長と取込み波長幅）を設定可能としたことを特徴としている。

本発明によれば、観察対象に対する最適な検出波長範囲（開始波長と取り込み波長幅）を簡単に設定できる走査型レーザ顕微鏡および検出波長範囲設定方法を提供できる。

以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。

（第１の実施の形態）
図１は、本発明の第１の実施の形態にかかる走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示している。

図において、１は観察用励起レーザ光源として観察用励起レーザ光を発振するレーザ光源ユニットで、このレーザ光源ユニット１は、レーザ光源として４８８ｎｍの波長のレーザ光を発振するアルゴンレーザ２と、５４３ｎｍの波長のレーザ光を発振するヘリウムネオンレーザ３を有している。アルゴンレーザ２からのレーザ光の光路上には、反射ミラー４が配置されている。また、ヘリウムネオンレーザ３からのレーザ光の光路上には、反射ミラー４で反射されるレーザ光との交点上にダイクロイックミラー５が配置されている。ダイクロイックミラー５は、これら２つのレーザ光路を合成するもので、ヘリウムネオンレーザ３からのレーザ光を透過し、反射ミラー４で反射されるレーザ光を反射するようになっている。ここでのダイクロイックミラー５は、４８８ｎｍのレーザ光を反射し、５４３ｎｍのレーザ光を透過するような特性を有している。

ダイクロイックミラー５により合成されたレーザ光の光路上には、音響光学可変フィルタ（以下、ＡＯＴＦとする）６が配置されている。ここでのＡＯＴＦ６は、４８８ｎｍと５４３ｎｍの波長のレーザ光の選択を行うことが可能になっている。

ＡＯＴＦ６の出射端には、シングルモードファイバ７の入射端が接続されている。シングルモードファイバ７の出射端には、スキャナユニット８が接続されている。スキャナユニット８は、シングルモードファイバ７のの出射側に、ＡＯＴＦ６からのレーザ光を平行光にするコリメートレンズ９が配置されている。

コリメートレンズ９の平行光の光路上には、光路分割手段としてビームスプリッタユニット１０が配置されている。ビームスプリッタユニット１０は、例えば回転ターレットからなるもので、光学素子として特性の異なるビームスプリッタ１０ａ、１０ｂ、１０ｃが同心円状に配置されている。また、ビームスプリッタユニット１０は、モータ１０ｄによる回転駆動により、ビームスプリッタ１０ａ、１０ｂ、１０ｃを選択的に光路上に位置決め可能な構成となっている。すなわち、ビームスプリッタ１０ａと１０ｂと１０ｃのいずれか一つが光路上に配置され得る。

ここで、ビームスプリッタ１０ａは、全ての波長域にわたり反射率２０％、透過率８０％の特性を有し、ビームスプリッタ１０ｂは、４８８ｎｍの波長を反射し、それ以外の波長を透過するような特性を有し、ビームスプリッタ１０ｃは、４１８８ｎｍと５４３ｎｍの波長を反射し、それ以外の波長を透過するような特性を有している。

なお、図示例では、ビームスプリッタ１０ａが光路上に位置決めされている。

ビームスプリッタユニット１０の反射光路には、走査手段としてＸＹスキャナミラー１１が配置されている。このＸＹスキャナミラー１１は、直交する２方向に光を偏向するための２枚のミラー１１ａ、１１ｂを有し、これらのミラー１１ａ、１１ｂにより後述する標本１５上の観察用励起レーザ光を２次元方向に走査するようになっている。

ＸＹスキャナミラー１１により２次元走査されたレーザ光の光路上には、観察用励起レーザ光の走査光学系を構成する瞳投影レンズ１２、結像レンズ１３、対物レンズ１４が配置されている。この場合、ＸＹスキャナミラー１１で２次元走査された観察用励起レーザ光は、瞳投影レンズ１２、結像レンズ１３、対物レンズ１４を介して標本１５の焦点位置に結像され、また、標本１５から発生された蛍光（検出光）は、観察用励起レーザ光と逆の光路をたどって対物レンズ１４、結像レンズ１３、瞳投影レンズ１２、ＸＹスキャナミラー１１を介してビームスプリッタユニット１０まで戻るようになっている。

ビームスプリッタユニット１０の透過光路上には、反射ミラー１６が配置されている。この反射ミラー１６の反射光路上には、検出光学系として共焦点レンズ１７と共焦点絞り（ピンホール）２２が配置されている。この場合、共焦点レンズ１７の集光位置に共焦点絞り２２が配置されている。共焦点絞り２２には、駆動装置２２ａが設けられている。この駆動装置２２ａは、共焦点絞り２２の共焦点絞り径を、対物レンズ１４の瞳径により決まるスポット径に適したものにするためのものである。

共焦点絞り２２を通過した光路上には、コリメートレンズ２３が配置されている。コリメートレンズ２３は、共焦点絞り２２を通過して拡散される光を平行光に変換するものである。

コリメートレンズ２３からの平行光は、スキャナユニット８内の分光ユニット２４に入射される。分光ユニット２４は、コリメートレンズ２３からの平行光の光路上にスペクトル分散手段としてミラー面が回折格子であるガルバノミラー（以下、回折格子ガルバノミラーと称する）２５が配置されている。回折格子ガルバノミラー２５は、不図示のステッピンングモータを使用して回折格子面を図示の回転方向２５ａに回転可能になっていて、回折格子により分散されたスペクトルの反射方向を変えることができるようになっている。

回折格子ガルバノミラー２５より反射される光路上には、集光レンズ２６が配置されている。集光レンズ２６は、回折格子ガルバノミラー２５の分散面の回転中心に前側焦点位置がくるように配置されている。集光レンズ２６を透過した光路には、検出手段としてスペクトル領域選択手段としてのスリット２７とサイドオン型のフォトマルチプライヤー２８が配置されている。スリット２７は、集光レンズ２６の結像位置に配置されている。このスリット２７は駆動装置２７ａによりスリット幅をスペクトルの分散方向に変更できるようになっている。また、フォトマルチプライヤー２８は、スリット２７の後方に配置されている。この場合、フォトマルチプライヤー２８は、蛍光の分散されたスペクトルの列方向と受光面の長手方向が一致するように配置されている。

ビームスプリッタユニット１０のモータ１０ｄ、焦点絞り２２の駆動装置２２ａ、スリット２７の駆動装置２７ａおよび回折格子ガルバノミラー２５には、制御ユニット２９が接続されている。この制御ユニット２９は、ビームスプリッタユニット１０のモータ１０ｄ、焦点絞り２２の駆動装置２２ａ、スリット２７の駆動装置２７ａおよび回折格子ガルバノミラー２５に対し各種の制御信号を出力するもので、このうち、駆動装置２７ａに対しスリット２７のスペクトル列方向のスリット幅を指示するとともに、回折格子ガルバノミラー２５に対し分散されたスペクトルの反射角度を指示するような制御を行なうようにしている。

制御ユニット２９には、フォトマルチプライヤー２８、モニタ３０が接続されている。このモニタ３０は、制御ユニット２９の指示によりフォトマルチプライヤー２８で取得されたデータを表示するようにしている。

次に、このように構成された実施の形態の作用を説明する。

この場合、制御ユニット２９によりビームスプリッタユニット１０のビームスプリッタ１０ａを光路上に切り換え、レーザ光源ユニット１の４８８ｎｍの波長の光を発振するアルゴンレーザ２と５４３ｎｍの波長の光を発振するヘリウムネオンレーザ３からのレーザ光により標本１５より発生する蛍光の分光データを取得する場合を説明する。

レーザ光源ユニット１のＡＯＴＦ６により４８８ｎｍの波長と５４３ｎｍの波長のレーザ光が選択されると、これら波長のレーザ光は、シングルモードファイバ７を介してスキャナユニット８に導かれる。

スキャナユニット８に導かれたレーザ光は、コリメートレンズ９で平行光になって、ビームスプリッタ１０ａで反射され、ＸＹスキャナミラー１１で２次元走査され、瞳投影レンズ１２、結像レンズ１３、対物レンズ１４を介して標本１５に結像される。

標本１５から発生された蛍光は、レーザ光と逆の経路をたどって対物レンズ１４、結像レンズ１３、瞳投影レンズ１２、ＸＹスキャナミラー１１を介してビームスプリッタ１０ａまで戻る。ビームスプリッタ１０ａまで戻った蛍光は、このビームスプリッタ１０ａを透過し、反射ミラー１６で反射され、共焦点レンズ１７を介して共焦点絞り２２上に結像される。共焦点絞り２２を通過した蛍光は拡散光となってコリメートレンズ２３に入射し、平行光に変換される。平行光となった蛍光は分光ユニット２４に導入され、回折格子ガルバノミラー２５に入射して回折格子の分散作用により、スペクトル成分へ分解される。

スペクトル分解された蛍光は、集光レンズ２６によりスリット２７上に結像する。

このとき、制御ユニット２９により駆動装置２７ａが駆動され、スリット２７のスペクトル列方向のスリット幅が設定され、フォトマルチプライヤー２８で受光されるスペクトル幅、つまり検出波長範囲が決定される。同時に、制御ユニット２９により回折格子ガルバノミラー２５の反射角度が制御され、スリット２７で決定された検出波長範囲がスペクトルがフォトマルチプライヤー２８上で走査される。つまり、スリット２７のスリット幅の設定と回折格子ガルバノミラー２５の走査を行うことで、所望する検出波長範囲の分光データの取得が可能になる。

ところで、このように顕微鏡についても、図９で述べたように他の試薬で多重染色されていたり、試料自体に自家蛍光などが発生しているような場合、観察対象の試薬の標準検出波長範囲では、コントラストのよい観察像が得られないことががある。

このような場合、制御ユニット２９は、以下のプログラム化された手順による制御を実行する。

いま、標本１５に染色された観察対象の試薬の蛍光波長特性を図２（ａ）に示すものとし、多重染色された他の試薬や試料自体の自家蛍光などによる蛍光波長特性を同図（ｂ）に示し、その波長域Ｂが観察対象の試薬の推奨の標準検出波長範囲Ａに一部重なっているものとする。

この状態で、最初、スリット２７のスペクトル列方向のスリット幅を観察対象の試薬の標準検出波長範囲Ａに設定し、この標準検出波長範囲Ａについてフォトマルチプライヤー２８によりデータ取りを行なう。次に、スリット２７のスペクトル列方向のスリット幅を標準検出波長範囲Ａより十分に小さい所定の波長範囲Ｘに設定するとともに、回折格子ガルバノミラー２５の反射角度を制御し、波長範囲Ｘを波長幅単位として数ステップずらし走査しながらデータ取りを行なう。この場合のずらし走査は、例えば図２（ｃ）に示すように標準検出波長範囲Ａの短波長側ＡＳを中心として前後の６ステップ（１）〜（６）と、同図（ｄ）に示すように標準検出波長範囲Ａの長波長側ＡＬを中心として前後の６ステップ（７）〜（１２）としている。

次に、図２と同様な蛍光波長特性（ａ）（ｂ）を示した図３において、同図（ｃ）のように、先程の波長範囲Ｘのずらし走査により得られたデータを用いて、標準検出波長範囲Ａに対し加算、減算を実行し、検出開始波長をα、取込み波長幅をβだけずらしながら、標準検出波長範囲Ａの周辺をまんべんなくデータ補完し、複数の補完データ（１）’〜（１５）’を生成する。ここでは、α＝β／２＝Ｘとなっている。

この場合、データ（１）’〜（５）’は、図３（ｃ１）に示すように標準検出波長範囲Ａに対して波長幅を−βだけ狭めた検出波長範囲としたもので、データ（１）’を得るには、標準検出波長範囲Ａで得られたデータに対して図２に示すステップ（３）のデータを加算し、ステップ（７）（８）（９）のデータを減算すればよく、同様に、データ（２）’を得るには、標準検出波長範囲Ａで得られたデータに対して図２に示すステップ（８）（９）のデータを減算すればよい。以下、同じ要領で、データ（３）’〜（５）’についても、標準検出波長範囲Ａで得られたデータに、図２に示すステップ（１）〜（１２）のデータを適宜加減算することにより取得する。

また、データ（６）’〜（１０）’は、図３（ｃ２）に示すように標準検出波長範囲Ａをそのまま検出波長範囲としたもので、データ（６）’を得るには、標準検出波長範囲Ａで得られたデータに対して図２に示すステップ（２）（３）のデータを加算し、ステップ（８）（９）のデータを減算すればよく、同様に、データ（７）’を得るには、標準検出波長範囲Ａで得られたデータに対して図２に示すステップ（３）のデータを加算し、ステップ（９）のデータを減算すればよい。以下、同じ要領で、データ（８）’〜（１０）’についても、標準検出波長範囲Ａで得られたデータに、図２に示すステップ（１）〜（１２）のデータを適宜加減算することにより取得する。

さらに、データ（１１）’〜（１５）’は、図３（ｃ３）に示すように標準検出波長範囲Ａに対して波長幅をβだけ広げた検出波長範囲としたもので、データ（１１）’を得るには、標準検出波長範囲Ａで得られたデータに対して図２に示すステップ（１）（２）（３）のデータを加算し、ステップ（９）のデータを減算すればよく、同様に、データ（１２）’を得るには、標準検出波長範囲Ａで得られたデータに対して図２に示すステップ（２）（３）のデータを加算すればよい。以下、同じ要領で、データ（１３）’〜（１５）’についても、標準検出波長範囲Ａで得られたデータに、図２に示すステップ（１）〜（１２）のデータを適宜加減算することにより取得する。

このようにして得られた補完データは、モニタ３０に送られて表示される。この場合、モニタ３０は、第４図に示すように複数（図示例では１６）の分割画面３０ａ〜３０ｐを有するもので、これらのうち分割画面３０ｂ〜３０ｐに上述した要領で補完されたデータ（１）’〜（１５）’を各別に表示する。

検鏡者は、モニタ３０の分割画面３０ａ〜３０ｐの中から明るさやコントラストが最も良好と思われるものを選択する。この実施の形態では、対象試薬の標準検出波長範囲Ａに対し多重染色された他の試薬や試料自体の自家蛍光などによる蛍光波長特性の波長域Ｂが重ならない波長領域のデータ（２）’または（６）’が表示される分割画面３０ｃ、３０ｇに最適なコントラストが得られる。

そして、このような最適なコントラストの分割画面３０ｃ又は３０ｇが選択されると、これら分割画面３０ｃ又は３０ｇに対して設定された検出波長範囲（開始波長と取込み波長幅）が読み出され、スリット２７のスペクトル列方向のスリット幅と回折格子ガルバノミラー２５の反射角度が設定される。この状態でタイムラプスやＺスタックなどの取得に移行すれば、所望の分光データを簡単に取得することができる。

なお、モニタ３０は、補完データの表示に使用しない分割画面３０ａに上述した検出開始波長と波長幅のそれぞれのずらし量α、βを表示させてもよい。また、各分割画面３０ｂ〜３０ｐに検出波長幅などのリファレンスデータを、おのおのの画像に重ねて表示すれば、検出波長領域と取り込み画像の質の関連をより分かり易くすることができる。

従って、このようにすれば、検鏡者は、プログラム化された負担の少ない作業により、観察対象の試薬の標準検出波長範囲Ａに基づいて最適条件の検出波長範囲（開始波長と取込み波長幅）を設定できるので、従来の試料の種類や試薬の染まり具合に合わせて検出開始波長や取込み波長幅を決定したり、他の試薬との重なり具合をチェックするなど試行錯誤を繰り返すものと比べ、短時間のうちに最適な条件を決定することができ、しかも、波長選択のフレキシビリティーさも高次元で活かすことができる。

（変形例）
上述した検出開始波長と波長幅のずらし量α、βのレベルを種々変更することで、例えば、粗モードでおおよその目安をつけて、微モードで微調整するようなことが可能となる。また、上述の実施の形態では、タイムラプスやＺスタック取得時の前処理として検出波長範囲（開始波長と取込み波長幅）を設定する場合を説明したが、勿論、直接ある画面の最良条件のデータを取得する際に適用しても効果的である。また、検出開始波長と波長幅のずらしをする際にレーザ光の波長（図２に示す４８８ｎｍと５４３ｎｍの部分）にかぶらないようにすれば、よりコントラストの高い蛍光データのみを取り扱うことができ、さらにデータ精度を高めることができる。また、波長範囲Ｘを波長幅単位として数ステップ実行される、ずらし走査は、標準検出波長範囲の短波長側と長波長側の少なくとも一方について行なうようにしてもよく、また、標準検出波長範囲に対する検出開始波長と波長幅のずらしについても、検出開始波長と波長幅の少なくとも一方を行なうようにしてもよい。 また、最適条件の評価については、検鏡者がモニタ３０の分割画面３０ａ〜３０ｐの中から明るさやコントラストが最も良好と思われるものを選択するようにしたが、標準検出波長範囲に対する検出開始波長と波長幅をずらしながら生成された補完データのダイナミックレンジの差分を読み取って、コントラストを評価し、この評価結果から最適な検出波長範囲（開始波長と取込み波長幅）を自動選択するようにすれば、さらに簡単に最適条件を取得することができる。

（第２の実施の形態）
次に、本発明の第２の実施の形態を説明する。

図５は、本発明の第２の実施の形態にかかる走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示すもので、図１と同一部分には同符号を付している。

この場合、上述したビームスプリッタユニット１０は、第１のビームスプリッタユニット１０とする。

第１のビームスプリッタユニット１０による標本１５からの検出光の透過光路上には、光路分割手段として第２のビームスプリッタユニット４０が配置されている。第２のビームスプリッタユニット４０も、例えば回転ターレットからなるもので、光学素子として特性の異なるビームスプリッタ４０ａ、４０ｂ、４０ｃが同心円状に配置されている。また、第２のビームスプリッタユニット４０は、モータ４０ｄによる回転駆動により、ビームスプリッタ４０ａ、４０ｂ、４０ｃを選択的に光路上に位置決め可能な構成となっている。すなわち、ビームスプリッタ４０ａと４０ｂと４０ｃのいずれか一つが光路上に配置され得る。

ここで、ビームスプリッタ４０ａは、全ての波長域の光線を全反射する特性を有し、ビームスプリッタ４０ｂは、５６０ｎｍ以下の波長を反射し、それ以上の波長を透過するような特性を有し、ビームスプリッタ４０ｃは、全ての波長域の光線を透過するような特性を有している。

第２のビームスプリッタユニット４０の反射光路を１チャンネル目と称する。この１チャンネル目の光路上には、第１のチャンネル検出手段が設けられている。この第１のチャンネル検出手段は、第１の実施の形態で述べた共焦点レンズ１７以降の共焦点絞り２２、コリメートレンズ２３および分光ユニット２４と全く同様な構成になっており、したがって、ここでは、同一部分には同符号を付して説明を省略する。

第２のビームスプリッタユニット４０の透過光路上には、さらに光路分割手段として第３のビームスプリッタユニット１４０が配置されている。第３のビームスプリッタユニット１４０は、例えば回転ターレットからなるもので、光学素子として特性の異なるビームスプリッタ１４０ａ、１４０ｂ、１４０ｃが同心円状に配置されている。また、第３のビームスプリッタユニット１４０は、モータ１４０ｄによる回転駆動により、ビームスプリッタ１４０ａ、１４０ｂ、１４０ｃを選択的に光路上に位置決め可能な構成となっている。すなわち、ビームスプリッタ１４０ａと１４０ｂと１４０ｃのいずれか一つが光路上に配置され得る。

ここで、ビームスプリッタ１４０ａは、全ての波長域の光線を全反射ずる特性を有し、ビームスプリッタ１４０ｂは、６３０ｎｍ以下の波長を反射し、それ以上の波長を透過するような特性を有し、ビームスプリッタ１４０ｃは、全ての波長域の光線を透過するような特性を有している。

第３のビームスプリッタユニット１４０の反射光路を２チャンネル目と称する。この２チャンネル目の光路上には、第２のチャンネル検出手段が設けられている。この第２のチャンネル検出手段は、第１の実施の形態で述べた共焦点レンズ１７以降の共焦点絞り２２、コリメートレンズ２３および分光ユニット２４と全く同様な構成になっており、したがって、ここでは、同一部分には同符号に添え字１を付して説明を省略する。

なお、第３のビームスプリッタユニット１４０の透過光路は、３チャンネル目の光路となっていて、不図示のオプションの検出装置などが取り付けられ、透過してきた光を検出できるようにしている。

その他は、図１と同様である。

次に、このように構成された実施の形態の作用を説明する。

この場合、標本１５は、５２０ｎｍと５８０ｎｍでそれぞれ蛍光波長のピークを有するＦＩＴＣとＲｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎの色素で２重染色がなされているものとする。

この状態から、制御ユニット２９により第１のビームスプリッタユニット１０のビームスプリッタ１０ａを光路上に切り換え、レーザ光源ユニット１の４８８ｎｍの波長の光を発振するアルゴンレーザ２と５４３ｎｍの波長の光を発振するヘリウムネオンレーザ３からのレーザ光により標本１５より発生する蛍光の分光データを取得する。

この場合、第２のビームスプリッタユニット４０ではビームスプリッタ４０ｂ、第３のビームスプリッタユニット１４０では、ビームスプリッタ１４０ｂを設定して、１チャンネル目により５２０ｎｍにピークのあるＦＩＴＣの蛍光を、２チャンネル目により５８０ｎｍにピークのあるＲｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎの蛍光をそれぞれ取得する。

いま、観察対象のＦＩＴＣとＲｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎの蛍光波長特性を図６（ａ）（ｂ）に示し、それぞれの推奨の標準検出波長範囲をＡ１、Ａ２に示すものとする。

この状態で、１チャンネル目のＦＩＴＣについて、スリット２７のスペクトル列方向のスリット幅を観察対象のＦＩＴＣの標準検出波長範囲Ａ１に設定し、この標準検出波長範囲Ａ１についてフォトマルチプライヤー２８によりデータ取りを行なう。同時に、２チャンネル目のＲｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎについても、スリット１２７のスペクトル列方向のスリット幅を観察対象のＲｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎの標準検出波長範囲Ａ２に設定し、この標準検出波長範囲Ａ２についてフォトマルチプライヤー１２８によりデータ取りを行う。

次に、１チャンネル目のスリット２７のスペクトル列方向のスリット幅を標準検出波長範囲Ａ１より十分に小さい所定の波長範囲Ｘに設定するとともに、回折格子ガルバノミラー２５の反射角度を、波長範囲Ｘの波長幅単位で数ステップずらし走査しながらデータ取りを行なう。この場合、波長範囲Ｘのずらし走査は、例えば図６（ｃ）に示すように標準検出波長範囲Ａ１の短波長側ＡＳ１を中心として前後の６ステップ（１）〜（６）と、標準検出波長範囲Ａ１の長波長側ＡＬ１を中心として前後の６ステップ（７）〜（１２）としている。

同様にして、２チャンネル目についても、スリット１２７のスペクトル列方向のスリット幅を標準検出波長範囲Ａ２より十分に小さい所定の波長範囲Ｘに設定するとともに、回折格子ガルバノミラー１２５の反射角度を、波長範囲Ｘの波長幅単位で数ステップずらし走査しながらデータ取りを行なう。この場合、波長範囲Ｘのずらし走査は、例えば図６（ｄ）に示すように標準検出波長範囲Ａ２の短波長側ＡＳ２を中心として前後の６ステップ（１）〜（６）と、標準検出波長範囲Ａ１の長波長側ＡＬ２を中心として前後の６ステップ（７）〜（１２）としている。

次に、図６と同様な蛍光波長特性（ａ）（ｂ）を示した図７において、まず、１チャンネル目について、同図（ｃ）に示すように、先程の波長範囲Ｘのずらし走査により得られたデータを用いて、対象試薬の標準検出波長範囲Ａ１に対し加算、減算を実行し、検出開始波長をα、波長幅をβだけずらしながら、標準検出波長範囲Ａの周辺をまんべんなくデータ補完し、複数のデータ（１）’〜（１５）’を生成する。２チャンネル目についても同様で、同図（ｄ）に示すように、先程の波長範囲Ｘのずらし走査により得られたデータを用いて、対象試薬の標準検出波長範囲Ａ２に対し加算、減算を実行し、検出開始波長をα、波長幅をβだけずらしながら、標準検出波長範囲Ａ２の周辺をまんべんなくデータ補完し、複数のデータ（１）’’〜（１５）’’を生成する。

なお、ここでの具体的なデータの生成方法は、第１の実施の形態で述べたのと同様である。

そして、このようにして得られた１チャンネル目と２チャンネル目の補完データは、モニタ３０に送られ、分割画面３０ａ〜３０ｐに各別に表示される。この場合、モニタ３０の分割画面３０ａ〜３０ｐに１回で表示しきれないときは、複数ページに分けて表示する。

検鏡者は、モニタ３０の分割画面３０ａ〜３０ｐの中から明るさやコントラストが最も良好と思われるものを選択する。この実施の形態では、１チャンネル目のＦＩＴＣについては、輝度ピークを中心値にしているデータ（１５）’、２チャンネル目のＲｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎについては、ＦＩＴＣのかぶりのほとんどない（１０）’’が表示される分割画面に最適なコントラストが得られる。

そして、このような最適なコントラストの分割画面が選択されると、これら分割画面に対して設定された検出波長範囲（開始波長と取込み波長幅）が読み出され、この読み出しデータにより１チャンネル目のスリット２７のスペクトル列方向のスリット幅と回折格子ガルバノミラー２５の反射角度が設定され、同時に、２チャンネル目のスリット１２７のスペクトル列方向のスリット幅と回折格子ガルバノミラー１２５の反射角度が設定される。

従って、このようにすれば、多重染色の標本についても、それぞれの対象試薬の標準検出波長範囲に基づいて、最適条件の検出波長範囲（開始波長と取込み波長幅）を試行錯誤することなく簡単に取得することができ、波長選択のフレキシビリティーさも高次元で活かすことができる。

なお、第２の実施の形態についても、標準検出波長範囲Ａ１、Ａ２およびα、βの値は１チャンネル目と２チャンネル目で必ずしも同じでなくてはならないというものではなく、試薬に応じて適宜変更することが可能である。

（変形例）
図８は、第２の実施の形態の変形例を説明するもので、ここでは、１つの蛍光色素の検出において２チャンネル検出を用いるようにしている。この例では、観察対象の試薬の蛍光波長特性を図８（ａ）に示すものとし、多重染色された他の試薬や試料自体の自家蛍光などによる蛍光波長特性を同図（ｂ）に示し、その波長域Ｂが観察対象の試薬の推奨の標準検出波長範囲Ａ０に一部重なっているものとする。

この状態で、図５に示した第２のビームスプリッタユニット４０に、全ての波長域の光線を全反射する反射ミラーの特性を有するビームスプリッタを設定して、１チャンネル目で対象試薬の標準検出波長範囲Ａ０のデータ取りを行う。次に、第２のビームスプリッタユニット４０に、標準検出波長範囲Ａ０の短波長側を反射して、長波長側を透過するようなビームスプリッタを設定して、第３のビームスプリッタユニット１４０に標準検出波長範囲Ａの長波長側を反射するミラーまたはビームスプリッタを設定する。

そして、図８（ｃ）に示すように１チャンネル目で標準検出波長範囲Ａ０の短波長側ＡＳ０の前後を波長範囲Ｘの波長幅単位で数ステップずらし走査しながらデータ取りを行ない、同時に、同図（ｄ）に示すように２チャンネル目で標準検出波長範囲Ａ０の長波長側ＡＬ０の前後を波長範囲Ｘの波長幅単位で数ステップずらし走査しながらデータ取りを行なう。

このような方法であれば、第１の実施の形態で述べた標準検出波長範囲Ａの短波長側ＡＳのデータ取りを終えた後、長波長側ＡＬのデータ取りを行なうようにするよりも、走査回数が少なくてすむので、標本１５に与えるダメージを最小限にすることができるという利点がある。

なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。例えば、上述した実施の形態では、標準検出波長範囲の短波長側側と長波長側側を所定の波長幅単位で数ステップずらし走査しながらデータ取りを行なうようにしているが、この方法に限るものではなく、各ステップごとの差を検出できるのであれば、この他の方法でもかまわない。

また、上述した実施の形態では、所定の波長幅単位のずらし走査により得られたデータを用いて標準検出波長範囲に対し加減算を実行し、検出開始波長と波長幅をずらしながら、標準検出波長範囲Ａの周辺をまんべんなくデータ補完し、複数のデータを生成するようにしたが、これらのデータは、加減算で求めるのでなく、制御ユニット２９により検出波長範囲（開始波長と取込み波長幅）を設定するスリット２７のスリット幅と回折格子ガルバノミラー２５の反射角度を制御して、標準検出波長範囲Ａに対する検出開始波長と取込み波長幅の少なくとも一方をずらしながら、標準検出波長範囲Ａに関するデータを取得し、これらデータにより標準検出波長範囲Ａに最適な検出波長範囲（開始波長と取込み波長幅）を取得するようにしてもよい。このようにすれば、実際にスリット２７と回折格子ガルバノミラー２５の制御に応じた標準検出波長範囲Ａに関するデータが直接を得られるので、より信頼性の高い結果が得られるという利点がある。

さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。

本発明の第１の実施の形態にかかる走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す図。 第１の実施の形態の補完データの取得方法を説明するための図。 第１の実施の形態の補完データの取得方法を説明するための図。 第１の実施の形態に用いられるモニタの表示例を示す図。 本発明の第２の実施の形態にかかる走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示す図。 第２の実施の形態の補完データの取得方法を説明するための図。 第２の実施の形態の補完データの取得方法を説明するための図。 第２の実施の形態の変形例の補完データの取得方法を説明するための図。 観察対象の試薬の蛍光波長特性を示す図。

符号の説明

１…レーザ光源ユニット、２…アルゴンレーザ
３…ヘリウムネオンレーザ、４…反射ミラー
５…ダイクロイックミラー、６…ＡＯＴＦ
７…シングルモードファイバ、８…スキャナユニット
９…コリメートレンズ、１０…ビームスプリッタユニット
１０ａ．１０ｂ、１０ｃ…ビームスプリッタ、１０ｄ…モータ
１１…ＸＹスキャナミラー、１１ａ．１１ｂ…ミラー
１２…瞳投影レンズ、１３…結像レンズ
１４…対物レンズ、１５…標本、１６…反射ミラー
１７…共焦点レンズ、２２…共焦点絞り、２２ａ…駆動装置
２３…コリメートレンズ、２４…分光ユニット
２５…回折格子ガルバノミラー、２５ａ…回転方向
２６…集光レンズ、２７…スリット、２７ａ…駆動装置
２８…フォトマルチプライヤー、２９…制御ユニット
３０…モニタ、３０ａ〜３０ｐ…分割画面、４０…第２のビームスプリッタユニット
４０ａ．４０ｂ、４０ｃ…ビームスプリッタ、４０ｄ…モータ
１４０…第３のビームスプリッタユニット、
１４０ａ．１４０ｂ、１４ｃ…ビームスプリッタ、１４０ｄ…モータ
１１７…共焦点レンズ、１２２…共焦点絞り
１２２ａ…駆動装置、１２３…コリメートレンズ
１２４…分光ユニット、１２５…回折格子ガルバノミラー
１２５ａ…回転方向、１２６…集光レンズ
１２７…スリット、１２７ａ…駆動装置、１２８…フォトマルチプライヤー

Claims (7)

1. レーザ光を発生するレーザ光源と、
   前記レーザ光源のレーザ光が照射される標本からの検出光を結像する共焦点レンズ、該共焦点レンズの焦点位置に配置される共焦点絞りを有する検出光学系と、
   前記共焦点絞りを通った検出光を取り込みスペクトル分散させるスペクトル分散手段と、
   前記スペクトル分散手段で分散されたスペクトルから測定すべきスペクトル領域を選択するスペクトル領域選択手段を有し、該スペクトル領域選択手段で選択されたスペクトルのデータを検出する検出手段と、
   前記スペクトル分散手段とスペクトル領域選択手段を制御し、前記標本の観察対象に予め設定された標準検出波長範囲についてデータを取得するとともに、前記標準検出波長範囲の短波長側と長波長側の少なくとも一方について、所定の波長範囲を波長幅単位として数ステップずらし走査してデータを取得し、これら取得されたデータにより前記標準検出波長範囲で検出したデータに対し加減算を行い、前記標準検出波長範囲に対する検出開始波長と波長幅の少なくとも一方をずらしながら複数の補完データを生成し、これらデータにより前記標準検出波長範囲に最適な検出波長範囲（開始波長と取込み波長幅）を設定可能とした制御手段と
   を具備したことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
2. さらに表示手段を有し、前記制御手段により生成された補完データを各別に表示するようにしたことを特徴とする請求項１記載の走査型レーザ顕微鏡。
3. 前記制御手段は、前記標準検出波長範囲に対する検出開始波長と波長幅の少なくとも一方をずらしながら生成された補完データのダイナミックレンジの差分からコントラストを評価し最適な検出波長範囲（開始波長と取込み波長幅）を自動選択可能にしたことを特徴とする請求項１記載の走査型レーザ顕微鏡。
4. 前記制御手段は、前記標準検出波長範囲に対する検出開始波長と取込み波長幅の少なくとも一方をずらす際に、前記レーザ光源のレーザ光の波長を含まないように制御することを特徴とする請求項１記載の走査型レーザ顕微鏡。
5. レーザ光を発生するレーザ光源と、
   前記レーザ光源のレーザ光が照射される標本からの検出光を結像する共焦点レンズ、該共焦点レンズの焦点位置に配置される共焦点絞りを有する検出光学系と、
   前記共焦点絞りを通った検出光を取り込みスペクトル分散させるスペクトル分散手段と、
   前記スペクトル分散手段で分散されたスペクトルから測定すべきスペクトル領域を選択するスペクトル領域選択手段を有し、該スペクトル領域選択手段で選択されたスペクトルのデータを検出する検出手段と、
   前記スペクトル分散手段とスペクトル領域選択手段を制御し、前記標本の観察対象に予め設定された標準検出波長範囲に対する検出開始波長と取込み波長幅の少なくとも一方をずらしながら前記標準検出波長範囲に関するデータを取得し、これらデータにより前記標準検出波長範囲に最適な検出波長範囲（開始波長と取込み波長幅）を設定可能とした制御手段と
   を具備したことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
6. レーザ光を発生するレーザ光源と、
   前記レーザ光源のレーザ光が照射される標本からの検出光を波長ごとに分光し複数チャンネルの光路に分割する光路分割手段と、
   前記複数チャンネルのうち一つのチャンネルに設けられ、前記検出光をスペクトル分散させるスペクトル分散手段と、該スペクトル分散手段で分散されたスペクトルから測定すべきスペクトル領域を選択するスペクトル領域選択手段を有し、該スペクトル領域選択手段で選択されたスペクトルを検出する第１のチャンネル検出手段と、
   前記複数チャンネルのうち他の一つのチャンネルに設けられ、前記検出光をスペクトル分散させるスペクトル分散手段と、該スペクトル分散手段で分散されたスペクトルから測定すべきスペクトル領域を選択するスペクトル領域選択手段を有し、該スペクトル領域選択手段で選択されたスペクトルを検出する第２のチャンネル検出手段と
   前記第１および第２のチャンネル検出手段の前記スペクトル分散手段とスペクトル領域選択手段を制御し、前記標本の観察対象に予め設定された標準検出波長範囲についてデータを取得するとともに、前記標準検出波長範囲の短波長側と長波長側の少なくとも一方について、所定の波長範囲を波長幅単位として数ステップずらし走査してデータを取得し、これら取得されたデータにより前記標準検出波長範囲で検出したデータに対し加減算を行い、前記標準検出波長範囲に対する検出開始波長と波長幅の少なくとも一方をずらしながら複数の補完データを生成し、これらデータにより前記標準検出波長範囲に最適な検出波長範囲（開始波長と取込み波長幅）を設定可能とした制御手段と
   を具備したことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
7. レーザ光を発生するレーザ光源と、前記レーザ光源のレーザ光が照射される標本からの検出光を結像する共焦点レンズ、該共焦点レンズの焦点位置に配置される共焦点絞りを有する検出光学系と、前記共焦点絞りを通った検出光を取り込みスペクトル分散させるスペクトル分散手段と、前記スペクトル分散手段で分散されたスペクトルから測定すべきスペクトル領域を選択するスペクトル領域選択手段を有し、該スペクトル領域選択手段で選択されたスペクトルのデータを検出する検出手段とを具備する走査型レーザ顕微鏡の検出波長範囲設定方法であって、
   前記スペクトル分散手段とスペクトル領域選択手段を制御し、前記標本の観察対象に予め設定された標準検出波長範囲についてデータを取得するとともに、前記標準検出波長範囲の短波長側と長波長側の少なくとも一方について、所定の波長範囲を波長幅単位として数ステップずらし走査してデータを取得し、これら取得されたデータにより前記標準検出波長範囲で検出したデータに対し加減算を行い、前記標準検出波長範囲に対する検出開始波長と波長幅の少なくとも一方をずらしながら複数の補完データを生成し、これらデータにより前記標準検出波長範囲に最適な検出波長範囲（開始波長と取込み波長幅）を設定可能としたことを特徴とする走査型レーザ顕微鏡の検出波長範囲設定方法。

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