JP5591007B2 - 顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡装置に関するものである。

従来、刺激用の光学系により標本に刺激光を照射し、刺激による標本の様々な変化を観察用の光学系により観察する顕微鏡装置が知られている。（例えば、特許文献１、特許文献２および特許文献３参照。）。特許文献１に記載の顕微鏡装置は、対物レンズの瞳面に集光する刺激光の開口数を変更しポイント刺激とエリア刺激の両方を可能にするとともに、走査光学系により刺激光を走査し標本の広い範囲を刺激可能にしている。また、特許文献２に記載の顕微鏡装置は、広範囲にわたり刺激光を照射可能なランプ光源を備え、刺激光を走査することなく標本の広範囲を一括して光刺激することとしている。また、特許文献３に記載の顕微鏡装置は、照明装置にＤＭＤ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ、微小偏向素子アレイ）を採用し、標本の任意の位置に任意の範囲で刺激光を照射することができるようになっている。

特開２００７−３３４３１９号公報 特開２００７−１３９８７０号公報 特許第４０８４３０３号公報

しかしながら、特許文献１に記載の顕微鏡装置は、走査光学系により標本上の広い範囲を走査する場合に走査の開始点と走査の終了点とでタイムラグが生じ、同一のエリア内を同時に刺激することができない場合がある。また、特許文献２に記載の顕微鏡装置は、標本の形状に合わせて刺激する範囲を変えたり複数の位置を同時に刺激したりすることができないという不都合がある。また、特許文献３に記載の顕微鏡装置は、標本を強くスポット的に刺激するアプリケーションの場合に、刺激光のパワーが弱く十分な強さで標本を刺激することができないという不都合がある。

本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、標本の任意の領域全体や複数の領域をタイムラグなく同時に刺激したり、標本の任意の領域に強い刺激を与えたりすることができる顕微鏡装置を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明は以下の手段を採用する。
本発明は、前記標本の画像を取得する観察用光学系と、標本に光刺激を与える第１の刺激光を前記標本上で走査する走査手段を有する第１の刺激用光学系と、前記標本に光刺激を与える第２の刺激光の前記標本上における照射位置を選択的に切り替え可能な空間光変調器を有する第２の刺激用光学系と、前記第１の刺激用光学系の光路と前記第２の刺激用光学系の光路とを合成する刺激用光路合成部と、対物レンズと、を備える顕微鏡装置を提供する。

本発明によれば、第１の刺激光によって標本に光刺激を与える第１の刺激用光学系および第２の刺激光に刺激光によって標本に光刺激を与える第２の刺激用光学系により、異なる刺激パターンで標本を刺激することができる。第１の刺激用光学系においては、走査手段により第１の刺激光を標本上で走査することで、光量損失を抑えつつ標本の広範囲を刺激することができる。また、第２の刺激用光学系においては、空間光変調器により標本に対して第２の刺激光の照射位置を選択的に切り替えて第２の刺激光を照射することで、標本の任意の領域全体を同時に刺激したり複数の領域を同時に刺激したりすることができる。

この場合において、刺激用光路合成部により、第１の刺激用光学系の光路と第２の刺激用光学系の光路とを合成することで、これらの光学系を切り替えることなく同時に使用することができる。したがって、第１の刺激用光学系または第２の刺激用光学系を選択するだけで、標本に強い刺激を与えるアプリケーションや標本の任意の領域全体または複数の領域をタイムラグなく同時に刺激するアプリケーションに迅速に対応させて所望の光刺激を行うことができる。

上記発明においては、前記空間光変調器が、２次元配列された複数の微小素子を有し、各該微小素子の透過率を制御して前記第２の刺激光を選択的に前記標本に向けて透過することとしてもよい。
また、上記発明においては、前記空間光変調器が、２次元配列された複数の微小偏向素子を有し、各該微小偏向素子の角度を切り替えて前記第２の刺激光を選択的に前記標本に向けて偏向することとしてもよい。

また、上記発明においては、前記第１の刺激用光学系による光刺激の強度と前記第１の刺激光の光量との関係および前記第２の刺激用光学系による光刺激の強度と前記第２の刺激光の光量との関係を対応づけて記憶する光量調節用記憶部と、前記第１の刺激光および前記第２の刺激光の一方の光量に応じて他方の前記第２の刺激光または前記第１の刺激光の光量を調節する光量調節手段を備えることとしてもよい。

このように構成することで、光量調節手段により、同一の標本に対する第１の刺激用光学系の光刺激と第２の刺激用光学系の光刺激とを対応づけることができ、例えば、第１の刺激用光学系または第２の刺激用光学系によって標本を刺激したアプリケーションを、他方の第２の刺激用光学系または第１の刺激用光学系に容易に適用することができる。

また、上記発明においては、前記標本の画像を取得する観察用光学系と、該観察用光学系の光路を前記刺激用光路合成部により合成された前記第１の刺激用光学系および前記第２の刺激用光学系の光路に合成する全体光路合成部とを備えることとしてもよい。

このように構成することで、観察用光学系によって取得される標本の画像により、標本の状態を観察することができる。この場合において、全体光路合成部により、観察用光学系と第１の刺激用光学系および第２の刺激用光学系を切り替えることなく同時に使用することができ、刺激による標本の様々な変化を画像上で逃すことなく観察することができる。

また、上記発明においては、前記観察用光学系により取得された画像上で前記第１の刺激用光学系および前記第２の刺激用光学系により刺激する各刺激領域を指定する領域指定手段を備えることとしてもよい。

このように構成することで、領域指定手段により画像上で選択した標本の所望の刺激領域を第１の刺激用光学系および第２の刺激用光学系によって刺激することができ、観察用光学系による観察と各刺激用光学系による光刺激とを効率的に行うことができる。

また、上記発明においては、前記走査手段の走査条件および前記空間光変調器による前記標本上の前記第２の刺激光の照射位置を調整する調整手段を備えることとしてもよい。
このように構成することで、調整手段により、各刺激用光学系における刺激光の照射範囲の位置や大きさを調整し、領域指定手段により指定された各刺激領域と刺激光による実際の各刺激領域とを一致させることができる。これにより、標本の所望の領域を簡易かつ精度よく刺激することができる。

また、上記発明においては、前記調整手段により調整した前記走査手段の走査条件および前記空間光変調器による前記標本上の前記第２の刺激光の照射位置を記憶する調整用記憶部を備えることとしてもよい。
このように構成することで、調整手段により画像上の刺激領域と各刺激用光学系による刺激光の照射範囲とを一致させれば、調整用記憶部に記憶されている走査手段の走査条件および空間光変調器による標本上の第２の刺激光の照射位置に基づいて、その後の位置調節を容易に行うことができる。

また、上記発明においては、前記第１の刺激用光学系および前記第２の刺激用光学系と、前記刺激用光路合成部とが同一の筺体に収容されていることとしてもよい。
このように構成することで、刺激用光路合成部により第１の刺激用光学系および第２の刺激用光学系の光路を筺体内で予め精度よく合成しておくことができる。したがって、全体光路合成部により、これらの刺激用光学系と観察用光学系とを組み合わせる際の光路調節が容易となる。

また、上記発明においては、前記観察用光学系による画像取得と、前記第１の刺激用光学系による前記第１の刺激光の照射タイミングと、前記第２の刺激用光学系による前記第２の刺激光の照射タイミングとを制御する制御手段を備えることとしてもよい。
このように構成することで、制御手段により、同一の標本に対する観察用光学系による観察と各刺激用光学系による光刺激とを容易に同期させることができる。
また、上記発明においては、前記観察用光学系および前記刺激用光路合成部によって合成された刺激用光学系は、前記対物レンズの同一側より前記対物レンズに光を入射させることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記観察用光学系により取得された画像上で前記第２の刺激用光学系により刺激する刺激領域を指定する領域指定手段を備え、該領域指定手段により指定された刺激領域に前記第２の刺激光を照射するように前記空間光変調器を制御することとしてもよい。

本発明によれば、標本の任意の領域全体や複数の領域をタイムラグなく同時に刺激したり、標本の任意の領域に強い刺激を与えたりすることができるという効果を奏する。

本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成を示す図である。 図１の顕微鏡本体、観察ユニット、第１刺激ユニットおよび第２刺激ユニットの概略構成を示す図である。 第２刺激ユニットのＤＭＤにおける可動ミラーの拡大概略図である。 （ａ）はＯＮ状態の角度の可動ミラーを示し、（ｂ）はＯＦＦ状態の角度の可動ミラー示す図である。 図１の観察用レーザコンバイナの概略構成を示す図である。 図１の刺激用レーザコンバイナの概略構成を示す図である。 細胞を観察している様子を示す図である。 （ａ）はＲＯＩと実際の刺激領域とが不一致の状態の画像を示し、（ｂ）はＲＯＩと実際の刺激領域とが一致している状態の画像を示す図である。 タイムラプス観察における観察と刺激のタイミングを示す図である。 （ａ）は第１の刺激用光学系により刺激した細胞の様子を示し、（ｂ）は第２の刺激用光学系により刺激した細胞の様子を示す図である。 本発明の第１の実施形態の変形例に係る顕微鏡装置の概略構成を示す図である。 図１１の顕微鏡本体、観察ユニット、第１刺激ユニットおよび第２刺激ユニットの概略構成を示す図である。 本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡装置の概略構成を示す図である。 図１３の顕微鏡本体、観察ユニット、第１刺激ユニットおよび第２刺激ユニットの概略構成を示す図である。 本発明の第２の実施形態の変形例に係る顕微鏡装置の概略構成を示す図である。 図１５の顕微鏡本体、観察ユニット、第１刺激ユニットおよび第２刺激ユニットの概略構成を示す図である。

〔第１の実施形態〕
以下、本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡装置について、図面を参照して説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置１００は、図１に示すように、顕微鏡本体１０と、細胞等の標本Ｓ（図２参照）を観察する観察ユニット２０と、観察ユニット２０にレーザ光を供給する観察用レーザコンバイナ５０と、標本Ｓを光刺激する第１刺激ユニット３０および第２刺激ユニット４０と、これら刺激ユニット３０，４０にレーザ光を供給する刺激用レーザコンバイナ６０と、顕微鏡本体１０、観察ユニット２０、刺激ユニット３０，４０および各レーザコンバイナ５０，６０を制御するコントロールボックス（制御手段）７０と、コントロールボックス７０を介して装置全体を制御するコンピュータ８０とを備えている。

また、顕微鏡装置１００は、観察用レーザコンバイナ５０から観察ユニット２０にレーザ光を導光する観察用光ファイバ５９と、刺激用レーザコンバイナ６０から第１刺激ユニット３０および第２刺激ユニット４０にそれぞれレーザ光を導光する第１刺激用光ファイバ６９Ａおよび第２刺激用光ファイバ６９Ｂと、観察ユニット２０および刺激ユニット３０，４０とコントロールボックス７０とを電気的に接続する第１制御線７１Ａと、各レーザコンバイナ５０，６０とコントロールボックス７０とを電気的に接続する第２制御線７１Ｂとを備えている。

顕微鏡本体１０は、図２に示すように、観察ユニット２０が接続される接続ポート９Ａと、第１刺激ユニット３０が接続される接続ポート９Ｂと、第２刺激ユニット４０が接続される接続ポート９Ｃとを備えている。

また、顕微鏡本体１０は、標本Ｓを載置するステージ１１と、観察ユニット２０から接続ポート９Ａを介して入射されたレーザ光をリレーするリレー光学系１３Ａと、リレー光学系１３Ａからのレーザ光および標本Ｓから戻る光を反射する一方、各刺激ユニット３０，４０からのレーザ光を透過するダイクロイックミラー（全体光路合成部）１５Ａと、ダイクロイックミラー１５Ａを通過したレーザ光をリレーするリレー光学系１３Ｂ、折り返しミラー１７Ａ、リレー光学系１３Ｃ、折り返しミラー１７Ｂおよびリレー光学系１３Ｄと、リレー光学系１３Ｄからのレーザ光を標本Ｓに照射するとともに、標本Ｓから戻る光を集光する対物レンズ１９とを備えている。

また、顕微鏡本体１０には、第１刺激ユニット３０から接続ポート９Ｂを介して入射されたレーザ光をリレーするリレー光学系１３Ｅと、リレー光学系１３Ｅからのレーザ光を反射する一方、第２刺激ユニット４０からのレーザ光を透過するダイクロイックミラー（刺激用光路合成部）１５Ｂと、ダイクロイックミラー１５Ｂを通過したレーザ光をリレーするリレー光学系１３Ｆ，１３Ｇと、第２刺激ユニット４０から接続ポート９Ｃを介して入射されたレーザ光をリレーするリレー光学系１３Ｈ、ダイクロイックミラー１５Ｃ、リレー光学系１３Ｉ，１３Ｊとを備えている。

ダイクロイックミラー１５Ａは、観察ユニット２０から標本Ｓに照射されるレーザ光の光路と、刺激ユニット３０，４０から標本Ｓに照射されるレーザ光の光路とを合成するようになっている。また、ダイクロイックミラー１５Ｂは、第１刺激ユニット３０から標本Ｓに照射されるレーザ光の光路と第２刺激ユニット４０から標本Ｓに照射されるレーザ光の光路とを合成するようになっている。

観察ユニット２０は、標本Ｓの画像を取得する観察用光学系２２を備えている。
観察用光学系２２は、観察用光ファイバ５９により導光されたレーザ光（以下、「観察用レーザ光」という。）を略平行光にするコリメータレンズ２１と、コリメータレンズ２１により略平行光とされた観察用レーザ光を顕微鏡本体１０の標本Ｓ上で走査するガルバノミラー２４Ａ、２４Ｂを有する走査部２３とを備えている。走査部２３により走査された観察用レーザ光は、接続ポート９Ａを介して顕微鏡本体１０のリレー光学系１３Ａに入射されるようになっている。

また、観察用光学系２２には、コリメータレンズ２１から走査部２３に入射される光を透過する一方、標本Ｓから戻り走査部２３によりディスキャンされた光を反射するダイクロイックミラー２５と、蛍光波長の光のみを選択的に透過し他の波長の光を遮光するエミッションフィルタ２７と、エミッションフィルタ２７を透過した蛍光を集光する集光レンズ２８と、集光レンズ２８により集光された蛍光を撮影するＣＣＤのような光電変換素子２９とを備えている。

第１刺激ユニット３０は、レーザ走査により標本Ｓを刺激可能な第１の刺激用光学系３２を備えている。
第１の刺激用光学系３２は、第１刺激用光ファイバ６９Ａにより導光されたレーザ光（以下、「第１の刺激光」という。）を略平行光にするコリメートレンズ３１と、コリメートレンズ３１により略平行光とされた第１の刺激光を顕微鏡本体１０の標本Ｓ上で走査するガルバノミラー（走査手段）３４Ａ，３４Ｂを有する走査部３３とを備えている。走査部３３により走査された第１の刺激光は、接続ポート９Ｂを介して顕微鏡本体１０のリレー光学系１３Ｅに入射されるようになっている。

第２刺激ユニット４０は、標本Ｓ上における第２の刺激光の照射位置の選択的な切り替えにより、標本Ｓを多点同時刺激や範囲指定刺激可能な第２の刺激用光学系４２を備えている。
第２の刺激用光学系４２は、第２刺激用光ファイバ６９Ｂにより導光されたレーザ光（以下、「第２の刺激光」という。）を略平行光にするコリメートレンズ４１と、コリメートレンズ４１により略平行光とされた第２の刺激光の断面強度分布を均一化する均一化光学系４３と、均一化光学系４３を通過し折り返しミラー４５Ａにより反射された第２の刺激光を標本Ｓに向けて偏向可能なＤＭＤ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｍｉｒｒｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ、空間光変調器）４７と、ＤＭＤ４７により偏向された第２の刺激光をリレーするリレー光学系４９Ａ、折り返しミラー４５Ｂ、リレー光学系４９Ｂ、折り返しミラー４５Ｃ、リレー光学系４９Ｃおよび折り返しミラー４５Ｄとを備えている。折り返しミラー４５Ｄにより反射された第２の刺激光は、接続ポート９Ｃを介して顕微鏡本体１０のリレー光学系１３Ｈに入射されるようになっている。

ＤＭＤ４７は、図３に示すように、一辺が十数μｍの複数（例えば、１０２４×７６８個）の可動ミラー（微小偏向素子）４８が２次元配列されて構成されている。このＤＭＤ４７は、コントロールボックス７０から駆動信号が入力されることにより、各可動ミラー４８の角度をＯＮ／ＯＦＦにより切り替えることができるようになっている。

可動ミラー４８は、例えば、図４（ａ）に示すように、ＯＮ状態の角度の場合に顕微鏡本体１０の標本Ｓに向けて第２の刺激光を反射し、図４（ｂ）に示すように、ＯＦＦ状態の角度の場合に、ＯＮ状態とは異なる方向、すなわち、標本Ｓ以外の方向へ第２の刺激光を反射するようになっている。

観察用レーザコンバイナ５０は、図５に示すように、６３５ｎｍの波長のレーザ光を出力する第１レーザ本体５１Ａと、５５９ｎｍの波長のレーザ光を出力する第２レーザ本体５１Ｂと、４７３ｎｍの波長のレーザ光を出力する第３レーザ本体５１Ｃと、４０５ｎｍの波長のレーザ光を出力する第４レーザ本体５１Ｄとを備えている。

また、観察用レーザコンバイナ５０は、第１レーザ本体５１Ａからのレーザ光を反射する反射ミラー５３と、反射ミラー５３により反射されたレーザ光を透過する一方、第２レーザ本体５１Ｂからのレーザ光を反射するダイクロイックミラー５４Ｂと、ダイクロイックミラー５４Ｂを通過した６３５ｎｍ、５５９ｎｍの波長のレーザ光を透過する一方、第３レーザ本体５１Ｃからのレーザ光を反射するダイクロイックミラー５４Ｃと、ダイクロイックミラー５４Ｃを通過した６３５ｎｍ、５５９ｎｍ、４７３ｎｍの波長のレーザ光を反射する一方、第４レーザ本体５１Ｄからのレーザ光を透過するダイクロイックミラー５４Ｄとを備えている。

さらに、観察用レーザコンバイナ５０には、レーザ光の波長選択および強度調整を制御するＡＯＴＦ（Ａｃｏｕｓｔｏ−Ｏｐｔｉｃ Ｔｕｎａｂｌｅ Ｆｉｌｔｅｒ：音響光学的可変フィルタ）のような音響光学素子５７が備えられている。音響光学素子５７により制御された所定波長のレーザ光（観察用レーザ光）は、観察用光ファイバ５９により観察ユニット２０へ導光される。

刺激用レーザコンバイナ６０は、図６に示すように、レーザ本体５１Ａ，５１Ｂ，５１Ｃ，５１Ｄと同様の性質を有するレーザ本体６１Ａ，６１Ｂ，６１Ｃ，６１Ｄと、レーザ本体６１Ａからのレーザ光を反射する反射ミラー６３と、反射ミラー６３により反射されたレーザ光を透過する一方、第２レーザ本体６１Ｂからのレーザ光を反射するダイクロイックミラー６４Ｂと、ダイクロイックミラー６４Ｂを通過した６３５ｎｍ、５５９ｎｍの波長のレーザ光を透過する一方、第３レーザ本体６１Ｃからのレーザ光を反射するダイクロイックミラー６４Ｃと、ダイクロイックミラー６４Ｃを通過した６３５ｎｍ、５５９ｎｍ、４７３ｎｍの波長のレーザ光を反射する一方、第４レーザ本体６１Ｄからのレーザ光を透過するダイクロイックミラー６４Ｄとを備えている。

また、刺激用レーザコンバイナ６０は、ダイクロイックミラー６４Ｄを通過した所定の波長のレーザ光を透過する一方、他の波長のレーザ光を反射するハーフミラー６５と、ハーフミラー６５により反射されたレーザ光を全反射する全反射ミラー６６と、全反射ミラー６６により反射されたレーザ光およびハーフミラー６５を透過したレーザ光の波長選択および強度調整をそれぞれ制御する音響光学素子６７Ａおよび音響光学素子６７Ｂとを備えている。

音響光学素子６７Ａにより制御された所定波長のレーザ光（第１の刺激光）は、第１刺激用光ファイバ６９Ａにより第１刺激ユニット３０へ導光され、音響光学素子６７Ｂにより制御された所定波長のレーザ光（第２の刺激光）は、第２刺激用光ファイバ６９Ｂにより第２刺激ユニット４０へ導光されるようになっている。

コントロールボックス７０は、各レーザコンバイナ５０，６０から発するレーザ光の光量を調整したり、観察用光学系２２による画像取得と各刺激用光学系３２，４２によるレーザ光の照射タイミングとを制御したりするようになっている。また、コントロールボックス７０は、ＤＭＤ４７の各可動ミラー４８の角度を切り替えたり、走査部２３のガルバノミラー２４Ａ，２４Ｂや走査部３３のガルバノミラー３４Ａ，３４Ｂの各走査条件を調整したりするようになっている。

コンピュータ８０は、観察ユニット２０により取得された画像を表示するモニタ８１と、各ユニット２０，３０，４０の制御条件等を記憶するメモリ（調整用記憶部）８３と、モニタ８１の画面表示に連動してユーザに装置全体の制御内容の設定を行わせるＧＵＩ部（グラフィカルユーザーインターフェース、領域指定手段、調整手段）８５とを備えている。

メモリ８３は、各ユニット２０，３０，４０の制御条件として、例えば、走査部２３におけるガルバノミラー２４Ａ，２４Ｂの走査条件、走査部３３におけるガルバノミラー３４Ａ，３４Ｂの走査条件およびＤＭＤ４７における各可動ミラー４８の角度設定等を記憶するようになっている。

ＧＵＩ部８５は、マウス（図示略）のドラッグ作業により、観察用光学系２２により取得された画像上で第１の刺激用光学系３２および第２の刺激用光学系４２により刺激する各ＲＯＩ（刺激領域）を指定することができるようになっている。また、ＧＵＩ部８５は、コントロールボックス７０を介して、ガルバノミラー３４Ａ，３４Ｂの走査条件やＤＭＤ４７の各可動ミラー４８の角度設定を変更し、各レーザ光の照射範囲の位置や大きさを調整することができるようになっている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡装置１００の作用について以下に説明する。
本実施形態においては、観察ユニット２０により標本Ｓの画像を取得し、取得された画像を観ながら第１刺激ユニット３０および第２刺激ユニット４０により標本Ｓを同時に刺激する場合について説明する。

まず、観察ユニット２０においては、観察用レーザコンバイナ５０のいずれかのレーザ本体５１Ａ，５１Ｂ，５１Ｃ，５１Ｄにより発せられ観察用光ファイバ５９によって導光された観察用レーザ光が、コリメートレンズ２１およびダイクロイックミラー２５を透過して走査部２３に入射される。走査部２３に入射された観察用レーザ光は、観察用ガルバノミラー２４Ａ，２４Ｂにより反射され、接続ポート９Ａを通過して顕微鏡本体１０に入射される。

顕微鏡本体１０に入射された観察用レーザ光は、リレー光学系１３Ａにより集光されてダイクロイックミラー１５Ａでリレー光学系１３Ｂへと反射される。そして、観察用レーザ光はリレー光学系１３Ｂを介して折り返しミラー１７Ａで反射され、リレー光学系１３Ｃを透過して折り返しミラー１７Ｂで反射された後、リレー光学系１３Ｄを介して対物レンズ１９により標本Ｓに照射される。

観察用レーザ光が照射されることにより標本Ｓにおいて蛍光が発生すると、蛍光は対物レンズ１９により集光されて光路を逆方向に戻る。この蛍光は、リレー光学系１３Ｄ、折り返しミラー１７Ｂ，リレー光学系１３Ｃ、折り返しミラー１７Ａおよびリレー光学系１３Ｂを介してダイクロイックミラー１５Ａでリレー光学系１３Ａへと反射され、接続ポート９Ａを通過して観察ユニット２０に入射される。

観察ユニット２０に入射された蛍光は、ガルバノミラー２４Ａ，２４Ｂによりディスキャンされた後、ダイクロイックミラー２５により蛍光波長以外の光と分離されてエミッションフィルタ２７へと反射される。そして、エミッションフィルタ２７を透過した蛍光は、集光レンズ２８により集光されて光電変換素子２９により撮影される。

これにより、例えば、図７に示すような細胞本体３ａ，３ｂ、３ｃ（標本Ｓ）の画像が取得され、モニタ８１に表示される。これにより、モニタ８１の画像上で細胞本体３ａ，３ｂ、３ｃを観察することができる。同図において、符号５ａ，５ｂ，５ｃはそれぞれ細胞本体３ａ，３ｂ、３ｃの細胞質を示し、符号７ａ，７ｂ，７ｃはそれぞれ細胞本体３ａ，３ｂ、３ｃの核を示している。

続いて、第２刺激ユニット４０により細胞本体３ａ，３ｂ、３ｃの各細胞質５ａ，５ｂ，５ｃを同時に刺激するとともに、第１刺激ユニット３０により細胞本体３ｃの核７ｃにおける刺激領域Ｐ１を強いレーザパワーでポイント刺激する。この場合において、ダイクロイックミラー１５Ｂにより第１の刺激用光学系３２と第２の刺激用光学系４２の各レーザ光の光路を合成するとともに、ダイクロイックミラー１５Ａにより観察用光学系２２と各刺激用光学系３２，４２の各レーザ光の光路を合成することで、各光学系２０，３０，４０を切り替えることなく同時に使用することができる。

まず、モニタ８１に表示されている細胞本体３ａ，３ｂ、３ｃの画像を確認しながら、ＧＵＩ部８５により細胞本体３ａ，３ｂ、３ｃを刺激するＲＯＩを決定する。本実施形態においては、細胞本体３ａ，３ｂ、３ｃの細胞質５ａ，５ｂ，５ｃと細胞本体３ｃの核７ｃにおける刺激領域Ｐ１をそれぞれＲＯＩ指定する。

各ＲＯＩが決定したら、ＧＵＩ部８５から刺激開始指示を出力し、細胞本体３ａ，３ｂ、３ｃの光刺激を行う。ここで、コントロールボックス７０の作動により、細胞本体３ａ，３ｂ、３ｃの各細胞質５ａ，５ｂ，５ｃに第２の刺激光を照射するための可動ミラー４８の角度がＯＮ状態に設定され、細胞本体３ｃの刺激領域Ｐ１に第１の刺激光を照射するためのガルバノミラー３４Ａ，３４Ｂの走査条件が設定される。また、刺激用レーザコンバイナ６０におけるレーザ光の光量が調整される。

第２刺激ユニット４０においては、刺激用レーザコンバイナ６０のいずれかのレーザ本体６１Ａ，６１Ｂ，６１Ｃ，６１Ｄにより発せられ第２刺激用光ファイバ６９Ｂによって導光された第２の刺激光が、コリメートレンズ４１により略平行光とされて均一化光学系４３により断面強度分布が均一化された後、折り返しミラー４５Ａを介してＤＭＤ４７上に照射される。

ＤＭＤ４７においてＯＮ状態の可動ミラー４８により顕微鏡本体１０の各細胞本体３ａ，３ｂ、３ｃに向けて反射された第２の刺激光は、リレー光学系４９Ａ、折り返しミラー４５Ｂ、リレー光学系４９Ｂ、折り返しミラー４５Ｃ、リレー光学系４９Ｃおよび折り返しミラー４５Ｄを介して接続ポート９Ｃを通過し、顕微鏡本体１０に入射される。

顕微鏡本体１０に入射された第２の刺激光は、リレー光学系１３Ｈ、ダイクロイックミラー１５Ｃ、リレー光学系１３Ｉ、リレー光学系１３Ｊを介してダイクロイックミラー１５Ｂを透過し、第１の刺激用光学系３２の光路に合成される。そして、リレー光学系１３Ｆ、リレー光学系１３Ｇを介してダイクロイックミラー１５Ａを透過し、観察用光学系２２の光路に合成される。

観察用光学系２２の光路に合成された第２の刺激光は、観察用レーザ光と同様に、リレー光学系１３Ｂ、折り返しミラー１７Ａ、リレー光学系１３Ｃ、折り返しミラー１７Ｂおよびリレー光学系１３Ｄを介して対物レンズ１９により細胞本体３ａ，３ｂ、３ｃの各細胞質５ａ，５ｂ，５ｃにそれぞれ同時に照射される。これにより、各細胞質５ａ，５ｂ，５ｃを同時に刺激することができる。

一方、第１刺激ユニット３０においては、刺激用レーザコンバイナ６０のいずれかのレーザ本体６１Ａ，６１Ｂ，６１Ｃ，６１Ｄにより発せられ第１刺激用光ファイバ６９Ａによって導光された第１の刺激光が、コリメートレンズ３１を透過して走査部３３に入射される。走査部３３に入射された第１の刺激光は、ガルバノミラー３４Ａ，３４Ｂにより反射され、接続ポート９Ｂを通過して顕微鏡本体１０に入射される。

顕微鏡本体１０に入射された第１の刺激光は、リレー光学系１３Ｅを介してダイクロイックミラー１５Ｂで反射され、第２の刺激用光学系４２の光路と合成される。そして、第１の刺激光は、第２の刺激光と同様に、リレー光学系１３Ｆ、リレー光学系１３Ｇを介してダイクロイックミラー１５Ａを透過し、観察用光学系２２の光路に合成される。

観察用光学系２２の光路に合成された第１の刺激光は、観察用レーザ光および第２の刺激光と同様に、リレー光学系１３Ｂ、折り返しミラー１７Ａ、リレー光学系１３Ｃ、折り返しミラー１７Ｂおよびリレー光学系１３Ｄを介して、対物レンズ１９により細胞本体３ｃの核７ｃにおける刺激領域Ｐ１に照射される。これにより、刺激領域Ｐ１を強いレーザパワーで刺激することができる。

ここで、モニタ８１の画像上で指定される各ＲＯＩと、刺激用光学系３２，４２により実際に刺激する領域とがそれぞれ一致している必要がある。ＲＯＩと実際の刺激領域との調整は、例えば、製品出荷調整時や納品時に調整用ソフトウエアを用いて行うこととしてもよい。

この場合、メーカーの技術者等が標本Ｓをステージ１１上に載置して調整用ソフトウエアを起動し、観察ユニット２０により標本Ｓの画像を取得してモニタ８１に表示する。続いて、ＧＵＩ部８５を操作して画像上でＲＯＩを指定し、各刺激用光学系３２，４２によりそれぞれ標本Ｓにレーザ光を照射する。そして、画面上のＲＯＩと実際に照射されているレーザ光の照射範囲の位置および大きさとにずれがないかを確認する。

例えば、図８（ａ）に示すように、ＲＯＩと第１の刺激用光学系３２による実際の刺激領域（レーザー走査による刺激領域）とにずれがある場合は、ＧＵＩ部８５によりガルバノミラー３４Ａ，３４Ｂの走査条件を調整し、第１の刺激光の照射範囲の位置および大きさをＲＯＩに一致させる。同様に、ＲＯＩと第２の刺激用光学系４２による実際の刺激領域（ＤＭＤによる刺激領域）とにずれがある場合は、ＧＵＩ部８５により可動ミラー４８の角度設定を調整し、第２の刺激光の照射範囲の位置および大きさをＲＯＩに一致させる。これにより、図８（ｂ）に示すように、ＲＯＩと実際の各刺激領域とを一致させることができる。

なお、ＧＵＩ部８５により調整したガルバノミラー３４Ａ，３４Ｂの走査条件や可動ミラー４８の角度設定はメモリ８３に記憶される。このようにすることで、ＧＵＩ部８５により画像上のＲＯＩと各刺激用光学系３２，４２の実際の刺激領域とを一致させれば、メモリ８３に記憶されて走査条件や角度設定に基づいて、その後の位置調節を容易に行うことができる。

以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡装置１００によれば、ダイクロイックミラー１５Ａ，１５Ｂにより各光学系２０，３０，４０の光路を合成するので、観察用光学系２２、第１の刺激用光学系３２または第２の刺激用光学系４２を選択するだけで、標本Ｓに強い刺激を与えるアプリケーションや標本Ｓの任意の領域全体または複数の領域をタイムラグなく同時に刺激するアプリケーションに迅速に対応させて、所望の光刺激を行うことができる。

なお、本実施形態に係る顕微鏡装置１００においては、刺激用光学系３２，４２により標本Ｓを同時に刺激することとしたが、例えば、光刺激中に起きる細胞本体３ａ，３ｂ、３ｃの状態変化をタイムラプスで観察して撮影することとしてもよい。この場合、例えば、図９に示すように、ＧＵＩ部８５により第１の刺激用光学系３２（刺激用レーザ走査）および第２の刺激用光学系４２（ＤＭＤによる刺激）による各レーザ光の照射タイムミングを時間単位または撮像のフレーム単位で指定し、光刺激前、光刺激中、光刺激後におけるそれぞれの細胞本体３ａ，３ｂ、３ｃの一連の状態変化を観察用光学系２２（観察用レーザ走査）により撮像することとすればよい。

図９は、横軸がフレーム数を示しており、３００ｍｓごとに１枚ずつ（１フレームずつ）撮像し、これを３５回（３５フレーム）繰り返す場合を表している。ここでは、ＧＵＩ部８５により全撮像フレーム数（あるいは時間。）を設定するとともに、第１の刺激用光学系３２および第２の刺激用光学系４２による刺激のタイミングを設定する。

そして、例えば、１０フレーム目から２０フレーム目までは、図１０（ａ）に示すように第１の刺激用光学系３２により刺激領域Ｐ２にポイント刺激を行い、２０フレーム目から３０フレーム目までは、図１０（ｂ）に示すように第２の刺激用光学系４２により細胞本体３ｃの核７ｃ全体を刺激することができる。

また、本実施形態においては、メモリ８３が第１の刺激用光学系３２による光刺激の強度と第１の刺激光の光量との関係および第２の刺激用光学系４２による光刺激の強度と第２の刺激光の光量との関係を対応づけて記憶する光量調節用記憶部として機能することとしてもよい。この場合、ＧＵＩ部８５を第１の刺激光および第２の刺激光の一方の光量に応じて他方の第２の刺激光または第１の刺激光の光量を調節する光量調節手段として機能させることとすればよい。また、例えば、第１の刺激光の１画素あたりの光量および第２の刺激光の１画素あたりの光量と、ＧＵＩ部８５への刺激光の光量についての指示値との関係を対応づけることとすればよい。

このようにすることで、ＧＵＩ部８５により、標本Ｓに対する第１の刺激用光学系３２の光刺激と第２の刺激用光学系４２の光刺激とを対応づけて行うことができる。例えば、第１の刺激用光学系３２または第２の刺激用光学系４２によって標本Ｓを刺激したアプリケーションを、他方の第２の刺激用光学系４２または第１の刺激用光学系３２に容易に適用することができ、計測の定量性が向上する。

また、本実施形態は以下のように変形することができる。
例えば、本実施形態においては、第２刺激ユニット４０にレーザ光を供給する光源として刺激用レーザコンバイナ６０を例示したが、これに代えて、図１１に示すように、水銀ランプ等のランプ光源９０を採用することとしてもよい。この場合、図１２に示すように、励起フィルタおよび調光機構を備える調光装置９１をランプ光源９０と第２刺激ユニット４０の均一化光学系４３との間に配置することとすればよい。調光装置９１としては、図示しない複数の励起フィルタを配置したディスクと複数のＮＤフィルタを配置したディスクをそれぞれ光軸まわりに回転可能に配列することとすればよい。

〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡装置について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡装置２００は、図１３および図１４に示すように、第１の刺激用光学系２３２と第２の刺激用光学系２４２と、これらの光路を合成するダイクロイックミラー（刺激用合成部）２１５とが同一の筺体２４０に収容されている点で、第１の実施形態と異なる。
以下、第１の実施形態に係る顕微鏡装置１００と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。

筺体２４０は、接続ポート９Ｃに接続されている。
第１の刺激用光学系２３２は、走査部３３により走査された第１の刺激光をリレーするリレー光学系２３５Ａ、折り返しミラー２３７、リレー光学系２３５Ｂ、リレー光学系２３５Ｃを備えている。

ダイクロイックミラー２１５は、第１の刺激用光学系２３２におけるリレー光学系２３５Ｃからの第１の刺激光を透過する一方、第２の刺激用光学系２４２におけるリレー光学系４９Ｂからの第２の刺激光を反射し、第１の刺激光の光路と第２の刺激光の光路とを合成するようになっている。

また、第１の刺激用光学系２３２および第２の刺激用光学系２４２は、ダイクロイックミラー２１５により合成されリレー光学系２４９によりリレーされた第１の刺激光および第２の刺激光を反射して接続ポート９Ｃを通過させる光軸調整ミラー２４５を備えている。

光軸調整ミラー２４５は、第１の刺激光および第２の刺激光の光軸に対する角度を調整することができるようになっている。筺体２４０を顕微鏡装置１０に取り付ける際に光軸調整ミラー２４５の角度を調整することで、観察ユニット２０により取得される標本Ｓの画像上で指定するＲＯＩと実際の刺激領域とを一致させる。この光軸調整ミラー２４５の角度調整は、ＧＵＩ部８５により行うことができることとしてもよい。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡装置２００によれば、ダイクロイックミラー２１５により第１の刺激用光学系２３２および第２の刺激用光学系２４２の光路を筺体２４０内で予め精度よく合成しておくことができ、ダイクロイックミラー１５Ａによりこれらの刺激用光学系２３２，２４２の光路と観察用光学系２２の光路とを合成する際の光路調整が容易となる。なお、本実施形態においては、筺体２４０を接続ポート９Ｃに接続することとしたが、接続ポート９Ｂに接続することとしてもよい。また、顕微鏡本体１０の使用していない接続ポート９Ｂ，９Ｃのいずれかを他の光学系を備えるユニットに使用することとしてもよい。

なお、本実施形態においては、図１５に示すように、第２刺激ユニット２４０にレーザ光を供給する光源として、刺激用レーザコンバイナ６０に代えて水銀ランプ９０を採用することとしてもよい。この場合、図１６に示すように、水銀ランプ９０と均一化光学系４３との間に調光装置９１を配置することとすればよい。

以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記の実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。

また、上記各実施形態においては、空間光変調器としてＤＭＤ４７を例示して説明したが、これに代えて、例えば、２次元配列された複数の微小素子（図示略）を有し、各微小素子の透過率を制御して第２の刺激光を選択的に標本Ｓに向けて透過可能な透過型微小素子アレイ、例えば、ＬＣＤ（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ、図示略）を採用することとしてもよい。ＬＣＤの各画素（微小素子）の透過率を個別に制御することにより、標本Ｓに対して第２の刺激光の照射位置を選択的に切り替えて第２の刺激光を照射することができる。

１５Ａ ダイクロイックミラー（全体光路合成部）
１５Ｂ、２１５ ダイクロイックミラー（刺激用光路合成部）
２２ 観察用光学系
３２，２３２ 第１の刺激用光学系
３４Ａ，３４Ｂ ガルバノミラー（走査手段）
４２，２４２ 第２の刺激用光学系
４７ ＤＭＤ（空間光変調器）
４８ 可動ミラー（微小偏向素子）
７０ コントロールボックス（制御手段）
８３ メモリ（光量調節用記憶部、調整用記憶部）
８５ ＧＵＩ部（領域指定手段、調整手段、光量調節手段）
１００、２００ 顕微鏡装置
Ｓ 標本

Claims (12)

1. 前記標本の画像を取得する観察用光学系と、
   標本に光刺激を与える第１の刺激光を前記標本上で走査する走査手段を有する第１の刺激用光学系と、
   前記標本に光刺激を与える第２の刺激光の前記標本上における照射位置を選択的に切り替え可能な空間光変調器を有する第２の刺激用光学系と、
   前記第１の刺激用光学系の光路と前記第２の刺激用光学系の光路とを合成する刺激用光路合成部と、
   対物レンズと、を備える顕微鏡装置。
2. 前記空間光変調器が、２次元配列された複数の微小素子を有し、各該微小素子の透過率を制御して前記第２の刺激光を選択的に前記標本に向けて透過する請求項１に記載の顕微鏡装置。
3. 前記空間光変調器が、２次元配列された複数の微小偏向素子を有し、各該微小偏向素子の角度を切り替えて前記第２の刺激光を選択的に前記標本に向けて偏向する請求項１に記載の顕微鏡装置。
4. 前記第１の刺激用光学系による光刺激の強度と前記第１の刺激光の光量との関係および前記第２の刺激用光学系による光刺激の強度と前記第２の刺激光の光量との関係を対応づけて記憶する光量調節用記憶部と、前記第１の刺激光および前記第２の刺激光の一方の光量に応じて他方の前記第２の刺激光または前記第１の刺激光の光量を調節する光量調節手段を備える請求項１から請求項３のいずれかに記載の顕微鏡装置。
5. 該観察用光学系の光路を前記刺激用光路合成部により合成された前記第１の刺激用光学系および前記第２の刺激用光学系の光路に合成する全体光路合成部とを備える請求項１から請求項４のいずれかに記載の顕微鏡装置。
6. 前記観察用光学系により取得された画像上で前記第１の刺激用光学系および前記第２の刺激用光学系により刺激する各刺激領域を指定する領域指定手段を備える請求項１から請求項５のいずれかに記載の顕微鏡装置。
7. 前記走査手段の走査条件および前記空間光変調器による前記標本上の前記第２の刺激光の照射位置を調整する調整手段を備える請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡装置。
8. 前記調整手段により調整した前記走査手段の走査条件および前記空間光変調器による前記標本上の前記第２の刺激光の照射位置を記憶する調整用記憶部を備える請求項７に記載の顕微鏡装置。
9. 前記第１の刺激用光学系および前記第２の刺激用光学系と、前記刺激用光路合成部とが同一の筺体に収容されている請求項５から請求項８のいずれかに記載の顕微鏡装置。
10. 前記観察用光学系による画像取得と、前記第１の刺激用光学系による前記第１の刺激光の照射タイミングと、前記第２の刺激用光学系による前記第２の刺激光の照射タイミングとを制御する制御手段を備える請求項５から請求項９のいずれかに記載の顕微鏡装置。
11. 前記観察用光学系および前記刺激用光路合成部によって合成された刺激用光学系は、前記対物レンズの同一側より前記対物レンズに光を入射させることを特徴とする請求項１から請求項１０のいずれかに記載の顕微鏡装置。
12. 前記観察用光学系により取得された画像上で前記第２の刺激用光学系により刺激する刺激領域を指定する領域指定手段を備え、該領域指定手段により指定された刺激領域に前記第２の刺激光を照射するように前記空間光変調器を制御する請求項１から請求項１１のいずれかに記載の顕微鏡装置。

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