JP4425098B2 - 蛍光顕微鏡および蛍光相関分光解析装置 - Google Patents
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Description
本発明は、被測定試料中の蛍光物質から発せられる蛍光の強度の時間的な揺らぎに基づいて該蛍光物質の並進拡散定数等を測定する蛍光相関分光解析装置、および、この蛍光相関分光解析装置において好適に用いられる蛍光顕微鏡に関するものである。
蛍光相関分光法（ＦＣＳ: Fluorescence Correlation Spectroscopy）は、極低濃度の蛍光物質が存在する溶液の被測定試料中の微小領域に励起光を照射するととともに、その微小な励起光照射領域で発生した蛍光の強度を検出して、その蛍光強度の経時変化の自己相関関数を求め、この自己相関関数を解析することで、被測定試料中の蛍光物質の並進拡散運動等を測定するものである（例えば特許文献１を参照）。
このような蛍光相関分光法を用いて被測定試料中の蛍光物質を解析する蛍光相関分光解析装置は、励起光照射および蛍光検出の為の共焦点型の蛍光顕微鏡と、蛍光顕微鏡により検出された蛍光の強度に基づいて自己相関関数を求めて解析をする解析部と、を備えて構成される。
特許文献１では、蛍光相関分光法を用いたマルチアレイ検出について言及されている。この文献で言うマルチアレイ検出は、複数の励起光照射領域それぞれに励起光を照射し、複数の励起光照射領域それぞれで発生する蛍光を検出して、各々の励起光照射領域について自己相関関数を求めて解析をするものである、と考えられる。
仮に、この文献に記載されているように複数の励起光照射領域それぞれについて同時に又は順次に蛍光相関分光法により測定が可能であれば、例えば被測定試料としての細胞の内部における蛋白質等の分子の間の相互作用を観測することが可能となると考えられる。
特許第３５１７２４１号公報
ところで、例えば被測定試料としての細胞の内部における複数の励起光照射領域それぞれを測定する場合には、これら測定すべき複数の励起光照射領域は、励起光入射方向に垂直な所定平面上に存在するとは限らず、励起光入射方向について異なる位置に存在することもあり、更には、細胞内を３次元的に測定したい場合もある。また、細胞の内部における透過率や屈折率は必ずしも均一でなく、励起光照射強度の不均一や収差が問題となる場合がある。
しかしながら、特許文献１記載のものを含め従来の装置における励起光照射光学系は、複数の励起光照射領域が励起光照射方向について異なる位置に存在する場合や、透過率や屈折率が均一でない場合には、適用することができない。特許文献１には、複数の励起光照射領域それぞれに励起光を照射する為の励起光照射光学系の構成や、複数の励起光照射領域それぞれで発生した蛍光を検出する為の蛍光検出光学系の構成について、何ら開示も示唆もない。
本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、複数の励起光照射領域それぞれについて同時に又は順次に蛍光相関分光法により測定するのに好適に用いられ得る励起光照射光学系を備える蛍光顕微鏡および蛍光相関分光解析装置を提供することを目的とする。
本発明に係る蛍光顕微鏡は、被測定試料中の励起光照射領域で発生した蛍光を検出する蛍光顕微鏡であって、(1) 互いに波長が異なる第１励起光および第２励起光を出力する励起光源部と、(2) 励起光源部から出力された第１励起光に対して空間的な変調を与える第１空間光変調素子と、励起光源部から出力された第２励起光に対して空間的な変調を与える第２空間光変調素子とを有し、第１空間光変調素子により空間的に変調された第１励起光と第２空間光変調素子により空間的に変調された第２励起光とを同一光路として被測定試料に照射する励起光照射光学系と、(3) 第１励起光が照射された励起光照射領域で発生した第１蛍光と、第２励起光が照射された励起光照射領域で発生した第２蛍光とを互いに分離して、第１蛍光を入力して結像するとともに当該結像面のうち特定領域に入力した第１蛍光を選択的に出力する第１選択出力手段と、第２蛍光を入力して結像するとともに当該結像面のうち特定領域に入力した第２蛍光を選択的に出力する第２選択出力手段と、を有する蛍光検出光学系と、(4) 第１選択出力手段から出力された第１蛍光の強度を検出するとともに、第２選択出力手段から出力された第２蛍光の強度を検出する検出部と、を備えることを特徴とする
また、本発明に係る蛍光相関分光解析装置は、上記の本発明に係る蛍光顕微鏡と、蛍光顕微鏡の検出部により検出された第１蛍光および第２蛍光それぞれの強度の経時変化の相互相関関数を求める解析部と、を備えることを特徴とする。
ここで、励起光照射光学系に含まれる第１空間光変調素子および第２空間光変調素子それぞれは位相変調型のものであるのが好適である。蛍光検出光学系に含まれる第１選択出力手段および第２選択出力手段それぞれは、空間光変調素子であるのが好適であり、更に、強度変調型の空間光変調素子であるのが好適である。また、本発明に係る蛍光顕微鏡は、被測定試料を撮像する撮像手段を更に備えるのが好適である。
本発明では、励起光源部から出力された第１励起光および第２励起光それぞれは、励起光照射光学系に含まれる空間光変調素子により空間的な変調が与えられ、同一光路とされて被測定試料に照射される。第１励起光が照射された励起光照射領域で発生した第１蛍光と、第２励起光が照射された励起光照射領域で発生した第２蛍光とは、蛍光検出光学系により分離されて結像され、当該結像面のうち特定領域に入力した各々の蛍光は選択出力手段により選択的に出力される。選択出力手段から出力された第１蛍光および第２蛍光それぞれの強度は検出部により検出される。そして、解析部により、検出部により検出された第１蛍光および第２蛍光それぞれの強度の経時変化の相互相関関数が求められる。
本発明に係る蛍光顕微鏡および蛍光相関分光解析装置は、複数の励起光照射領域それぞれについて同時に又は順次に蛍光相関分光法により測定し得る。
以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための最良の形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
（第１実施形態）
先ず、本発明に係る蛍光顕微鏡および蛍光相関分光解析装置の第１実施形態について説明する。図１は、第１実施形態に係る蛍光相関分光解析装置１０の構成図である。この図に示される蛍光相関分光解析装置１０は、蛍光顕微鏡１１、解析部１２および表示部１３を備え、透明平板２上に置かれた被測定試料１に励起光を照射して該被測定試料１で発生した蛍光を検出するものである。
先ず、本発明に係る蛍光顕微鏡および蛍光相関分光解析装置の第１実施形態について説明する。図１は、第１実施形態に係る蛍光相関分光解析装置１０の構成図である。この図に示される蛍光相関分光解析装置１０は、蛍光顕微鏡１１、解析部１２および表示部１３を備え、透明平板２上に置かれた被測定試料１に励起光を照射して該被測定試料１で発生した蛍光を検出するものである。
蛍光顕微鏡１１は、対物レンズ１０１、ダイクロイックミラー１０２、ハーフミラー１０５、ミラー１０６、レーザ光源１１１、ＮＤフィルタ１１２、ビームエクスパンダ１１３、ミラー１１４、空間光変調素子１１５、レンズ１３１、バンドパスフィルタ１３２、空間光変調素子１３３、検出部１３４、レンズ１５１、バンドパスフィルタ１５２およびＣＣＤ（Charged Coupled Device）１５３を備える。
レーザ光源１１１から被測定試料１に到るまでの光学系は、レーザ光源１１１から出力された励起光を被測定試料１に照射するための励起光照射光学系を構成している。被測定試料１から検出部１３４に到るまでの光学系は、被測定試料１で発生した蛍光を検出部１３４へ導く蛍光検出光学系を構成している。また、被測定試料１からＣＣＤ１５３へ到るまでの光学系は、被測定試料１を撮像するための撮像光学系および撮像手段を構成している。
レーザ光源（励起光源部）１１１は、被測定試料１に含まれる蛍光物質を励起し得る波長の励起光を出力する。ＮＤフィルタ１１２は、レーザ光源１１１から出力された励起光の強度を調整して出力する。ビームエクスパンダ１１３は、ＮＤフィルタ１１２から出力された励起光を入力し、その励起光の光束径を適当な大きさまで拡大するとともにコリメートして出力する。
空間光変調素子１１５は、ビームエクスパンダ１１３から出力されてミラー１１４により反射された励起光を入力し、その励起光に対して空間的な変調を与えて、その空間変調した励起光を出力する。空間光変調素子１１５は、空間的な変調が可変であり、以降の光学系を介して空間的に変調した励起光を被測定試料１に照射させることで、被測定試料１中において励起光が照射される領域の個数・位置・形状を設定することができ、また、励起光照射強度の不均一や収差の問題を解消することができる。
空間光変調素子１１５は、透過型のものであってもよいし、反射型のものであってもよい。また、空間光変調素子１１５は、振幅変調型のものであってもよいし、位相変調型のものであってもよいし、振幅および位相の双方を変調し得るものであってもよい。ただし、励起光の利用効率の観点からは、空間光変調素子１１５は位相変調型のものであるのが好ましい。例えば、空間光変調素子１１５として、液晶を含む微小な画素が平面上に２次元配列されたものが用いられる。
ダイクロイックミラー１０２は、空間光変調素子１１５から出力された励起光を反射させて対物レンズ１０１に入射させるとともに、対物レンズ１０１から出力された蛍光を透過させる。対物レンズ１０１は、ダイクロイックミラー１０２により反射された励起光を入力して、その励起光を被測定試料１中の所定領域（励起光照射領域）に照射する。また、対物レンズ１０１は、励起光照射領域で発生した蛍光を入力して、その蛍光をダイクロイックミラー１０２へ出力する。
ハーフミラー１０５は、対物レンズ１０１から出力されダイクロイックミラー１０２を透過した光を入力し、その光の一部を反射させ残部を透過させることで光を２分岐し、反射させた光をレンズ１３１へ出力し、透過させた光をミラー１０６へ出力する。なお、ハーフミラー１０５に替えて着脱自在のミラーが用いられてもよい。レンズ１３１は、ハーフミラー１０５により反射された蛍光を入力して、対物レンズ１０１とともに、被測定試料１中の励起光照射領域で発生した蛍光の像を空間光変調素子１３３上に形成する。バンドパスフィルタ１３２は、レンズ１３１と空間光変調素子１３３との間の光路上に設けられ、蛍光を選択的に透過させる一方、励起光の散乱成分を遮断する。
空間光変調素子１３３は、対物レンズ１０１およびレンズ１３１による蛍光の結像面のうち特定領域に入力した蛍光を選択的に出力する選択出力手段として作用する。空間光変調素子１３３に替えて、開口を有するマスクが用いられて、その開口に蛍光像が位置するようにしてもよい。しかし、開口に相当する上記特定領域が可変であるのが好ましいことから、空間光変調素子１３３は、蛍光結像面のうち選択的に蛍光を出力すべき特定領域の個数・位置・形状が可変であるのが好適である。このようにすることにより、等価的な共焦点光学系を実現することができる。
空間光変調素子１３３は、透過型のものであってもよいし、反射型のものであってもよい。また、空間光変調素子１３３は、振幅変調型のものであってもよいし、位相変調型のものであってもよいし、振幅および位相の双方を変調し得るものであってもよい。ただし、検出光学系中の空間光変調素子１３３は、励起光照射光学系中の空間光変調素子１１５と比べて各種条件制御が不要であるので、コストの観点からは強度変調型のものであるのが好適である。例えば、空間光変調素子１３３として、テキサス・インストルメンツ社（Texas Instruments Inc.）のデジタル・マイクロミラー・デバイス（ＤＭＤ: Digital Micromirror Device）が好適に用いられる。
検出部１３４は、空間光変調素子１３３から出力されて到達した蛍光の強度を検出する。この検出部１３４として、光電子増倍管やアバランシュフォトダイオードが好適に用いられる。解析部１２は、検出部１３４により検出された蛍光の強度の経時変化Ｉ(ｔ)を記憶し、このＩ(ｔ)から自己相関関数Ｇ(τ)を求める（下記(1)式）。そして、この自己相関関数Ｇ(τ)に基づいて、被測定試料１中の励起光照射領域における蛍光物質の並進拡散定数等を求めることができる。ここで、ｔは時間変数であり、τは相関時間を表す変数である。
図２は、対物レンズ１０１および被測定試料１の拡大図である。対物レンズ１０１として水浸のものが用いられ、対物レンズ１０１と透明平板２との間の光路には水３が充填されている。透明平板２は、励起光および蛍光の双方に対して透過率が高く無蛍光性の材料からなる平板であって、例えば石英ガラスからなるカバーガラスが好適に用いられる。被測定試料１は透明平板２の上に置かれる。
被測定試料１中の励起光照射領域は、励起光照射光学系中の空間光変調素子１１５における励起光の空間的変調に応じて、個数・位置・形状が設定される。これは、空間光変調素子１１５による空間的変調により波面が調整された励起光が、空間光変調素子１１５から被測定試料１に到るまでの光学系の光学的伝達関数の影響を受けて、被測定試料１に照射されるからである。すなわち、空間光変調素子１１５における励起光の空間的変調は、空間光変調素子１１５から被測定試料１に到るまでの光学系の光学的伝達関数、および、被測定試料１における所望の励起光照射領域の位置等に基づいて、決定される。各励起光照射領域の位置は、対物レンズ１０１の光軸に垂直な方向（ｘ方向，ｙ方向）についてだけでなく、対物レンズ１０１の光軸に平行な方向（ｚ方向）についても、設定が可能である。複数の励起光照射領域それぞれ対して励起光は同時に又は順次に照射され得る。
図２では、被測定試料１は、観測領域１Ａと観測領域１Ｂとからなるものとしている。観測領域１Ａと観測領域１Ｂとは、屈折率が互いに異なり、或いは、透過率が互いに異なる。また、３つの励起光照射領域Ｐ１〜Ｐ３が示されている。励起光照射領域Ｐ１，Ｐ２は観測領域１Ａ内に位置し、励起光照射領域Ｐ３は観測領域１Ｂ内に位置している。
図３は、被測定試料１中の励起光照射領域の拡大図である。一般に、或る有限の光束径を有する光を集光レンズで集光すれば、その集光位置における光ビームは、径方向の強度分布がガウス形状であって、半径ｗのビームウェストを有する。蛍光相関分光法では、励起光照射領域として半径ｗで長さＬの円柱状の領域を考え、この励起光照射領域に存在する蛍光物質の個数が数個程度となるようにする。そして、蛍光物質が励起光照射領域に出入りすることで、励起光照射領域に存在する蛍光物質の個数が時間的に揺らいで、励起光照射領域から発生する蛍光の強度も時間的に揺らぐことから、この蛍光強度の時間的揺らぎを表す自己相関関数Ｇ(τ)に基づいて、励起光照射領域における蛍光物質の並進拡散定数等を求めることができる。
図４〜図９は、空間光変調素子１１５における励起光の空間的位相変調の例を示す図である。図４（ａ），図５（ａ），図６（ａ），図７，図８および図９それぞれは、空間光変調素子１１５における画素毎の励起光の位相変調を濃淡として示しており、例えば、０から２πまでの間を等分割した２５６通りの位相値に対して２５６階調の濃淡として表示される。また、図４（ｂ），図５（ｂ）および図６（ｂ）それぞれは、対物レンズ１０１の視野における被測定試料１内の励起光照射領域の位置を黒点で示している。
図４に示された第１の例では、同図（ａ）に示されたような２次元位相グレーティングが空間光変調素子１１５に形成され、これに応じて、同図（ｂ）に示されたような２つの励起光照射領域が被測定試料１に形成される。同図（ｂ）では、左にある励起光照射領域における励起光強度は、右にある励起光照射領域における励起光強度の２倍となっている。
図５に示された第２の例では、同図（ａ）に示されたような１次元位相グレーティングが空間光変調素子１１５に形成され、これに応じて、同図（ｂ）に示されたような１つの励起光照射領域が被測定試料１に形成される。被測定試料１に形成される励起光照射領域の位置は、空間光変調素子１１５に形成される１次元位相グレーティングの周期および方位に応じたものとなり、対物レンズ１０１の光軸に垂直な方向（ｘ方向，ｙ方向）について調整され得る。
図６に示された第３の例では、同図（ａ）に示されたような２次元位相グレーティングが空間光変調素子１１５に形成され、これに応じて、同図（ｂ）に示されたような２つの励起光照射領域が被測定試料１に形成される。被測定試料１に形成される各々励起光照射領域の位置は、空間光変調素子１１５に形成される２次元位相グレーティングの各々の方位および周期に応じたものとなる。同図（ｂ）では、左にある励起光照射領域における励起光強度と、右にある励起光照射領域における励起光強度とは、互いに同じとなっている。
図７に示された第４の例では、主光線入射位置を中心点として径方向に位相が次第に変化するような空間的位相変調パターンが空間光変調素子１１５に形成される。この場合、空間光変調素子１１５は、屈折率分布型レンズと同様の作用を奏する。被測定試料１に形成される励起光照射領域の位置は、空間光変調素子１１５における径方向の位相変化率に応じたものとなり、対物レンズ１０１の光軸に平行な方向（ｚ方向）について調整され得る。
図８に示された第５の例では、空間光変調素子１１５に形成される空間的位相変調パターンは、図５（ａ）に示された空間的位相変調パターンと、図７に示された空間的位相変調パターンとが、足し合わされたものとなっている。この場合、被測定試料１に形成される励起光照射領域の位置は、対物レンズ１０１の光軸に垂直な方向（ｘ方向，ｙ方向）について調整され得るとともに、対物レンズ１０１の光軸に平行な方向（ｚ方向）についても調整され得る。
図９に示された第６の例では、空間光変調素子１１５に形成される空間的位相変調パターンは、空間光変調素子１１５から被測定試料１に到るまでの光学系の非点収差を補正することでできるものとなっている。
これら図４〜図９から判るように、空間光変調素子１１５における励起光の空間的位相変調のパターンに応じて、被測定試料１に形成される励起光照射領域の個数・位置・励起光強度が調整され得、また、励起光照射光学系の収差（非点収差だけでなく色収差および球面収差などをも含む。）が補正され得る。なお、図９に示される空間的位相変調パターンに他の空間的位相変調パターンを足し合わせたものを空間光変調素子１１５に形成することで、被測定試料１に形成される励起光照射領域の個数・位置・励起光強度の調整、および、励起光照射光学系の収差の補正が、同時に可能となる。
次に、第１実施形態に係る蛍光相関分光解析装置１０を用いた蛍光相関分光測定の一例について説明する。図１０は、第１実施形態に係る蛍光相関分光解析装置１０を用いた蛍光相関分光測定の手順を示すフローチャートである。
初めに、ステップＳ１では、被測定試料１に替えて標準試料が透明平板２の上に置かれて、蛍光検出が行われる。ここで、標準試料は、粘性が既知の媒質（バッファ液）中に、分子量が既知の蛍光物質が存在するものである。バッファ液としては例えば水が用いられる。蛍光物質としては、例えば、蛍光蛋白質（ＧＦＰ: Green Fluorescence Protein）がそのまま用いられ、或いは、ローダミン（Rhodamin）やアレクサ（Alexa）等の蛍光色素でラベル化されたアンジオテンシン（Angiotensin）またはビオチン（Biotin）が用いられる。
このような標準試料が透明平板２上に置かれた状態で、レーザ光源１１１から励起光（例えば波長４８８ｎｍ）が出力されると、その励起光は、ＮＤフィルタ１１２より強度が調整され、ビームエクスパンダ１１３により光束径が調整され、ミラー１１４により反射されて、空間光変調素子１１５に入射する。空間光変調素子１１５に入射して空間的に変調された励起光は、ダイクロイックミラー１０２により反射され、対物レンズ１０１を経て透明平板２上の標準試料に照射される。
標準試料内の励起光照射領域で発生した蛍光は、対物レンズ１０１，ダイクロイックミラー１０２，ハーフミラー１０５，レンズ１３１およびバンドパスフィルタ１３２を経て、空間光変調素子１３３に入射する。空間光変調素子１３３に入射した蛍光のうち特定領域に入射した蛍光は、検出部１３４により受光されて強度が検出され、その検出された蛍光の強度の経時変化Ｉ(ｔ)が解析部１２により記憶される。このとき、標準試料内の励起光照射領域から空間光変調素子１３３に到るまでの光学系は、等価的な共焦点光学系を構成している。
続くステップＳ２では、解析部１２により、ステップＳ１で検出された蛍光強度の経時変化Ｉ(ｔ)が解析される。すなわち、このＩ(ｔ)から自己相関関数が求められ（上記(1)式）、その求められた自己相関関数は、理想分子運動モデルを想定した場合の下記(2)式の自己相関関数Ｇ(τ)によりフィッティング処理される。この(2)式中で、Ｆはトリプレット状態の割合であり、τtripはトリプレット状態の減衰時間であり、Ｎは励起光照射領域内の蛍光物質の平均個数であり、Ｍは成分識別番号（Ｍ＝１or２or３）であり、ｙｉは第ｉ番目の成分の寄与率であり、τＤｉは第ｉ番目の成分の並進拡散時間である。また、Ｓは、励起光照射領域の半径ｗおよび長さＬから定まる構造パラメータである（図３を参照）。
続くステップＳ３では、測定の対象である被測定試料１が透明平板２の上に置かれて、その被測定試料１が撮像される。ここで、被測定試料１は、例えば、細胞であり、屈折率または透過率が互いに異なる観測領域１Ａと観測領域１Ｂとからなる（図２を参照）。また、この被測定試料１には、ステップＳ１，Ｓ２で標準試料にドープされたものと同じ蛍光物質がドープされている。
このような被測定試料１が透明平板２上に置かれた状態で、レーザ光源１１１から励起光が出力されると、その励起光は、ＮＤフィルタ１１２より強度が調整され、ビームエクスパンダ１１３により光束径が調整され、ミラー１１４により反射されて、空間光変調素子１１５に入射する。空間光変調素子１１５に入射して空間的に変調された励起光は、ダイクロイックミラー１０２により反射され、対物レンズ１０１を経て透明平板２上の被測定試料１に照射される。このとき、空間光変調素子１１５における励起光の空間的変調が経時的に変化して、被測定試料１においては、スポット状の励起光が２次元走査され、或いは、ライン状の励起光が１次元走査される。
被測定試料１内の励起光照射領域で発生した蛍光は、対物レンズ１０１，ダイクロイックミラー１０２，ハーフミラー１０５，ミラー１０６，レンズ１５１およびバンドパスフィルタ１５２を経て、ＣＣＤ１５３の撮像面上に結像される。上述のように、被測定試料１への励起光の照射が走査されることにより、ＣＣＤ１５３により被測定試料１が撮像される。そして、その撮像された被測定試料１の像は表示部１３により表示され、これにより、被測定試料１内の観測領域１Ａと観測領域１Ｂとを峻別することができる。なお、この被測定試料１の撮像に際しては、被測定試料１を照明する為の専用の照明用光源や照明光学系が用いられてもよい。
続くステップＳ４では、上記の被測定試料１が透明平板２の上に置かれて、ステップＳ１と同様にして蛍光検出が行われる。ここでは、被測定試料１内の観測領域１Ａおよび観測領域１Ｂそれぞれに励起光照射領域が形成される。例えば、観測領域１Ａ内に励起光照射領域Ｐ１，Ｐ２が形成され、観測領域１Ｂ内に励起光照射領域Ｐ３が形成される（図２を参照）。そして、励起光照射領域Ｐ１〜Ｐ３それぞれについて、検出された蛍光の強度の経時変化Ｉ(ｔ)が解析部１２により記憶される。
続くステップＳ５では、ステップＳ２と同様にして、解析部１２により、ステップＳ４で検出された励起光照射領域Ｐ１〜Ｐ３それぞれについての蛍光強度の経時変化Ｉ(ｔ)が解析される。これにより、励起光照射領域Ｐ１〜Ｐ３それぞれについて、蛍光物質の並進拡散時間または平均個数が求められる。
続くステップＳ６では、観測領域１Ａ内にある励起光照射領域Ｐ１，Ｐ２についてステップＳ５において得られた結果が同等であるか否かが判定される。もし、両者の結果が異なれば、励起光照射領域Ｐ１，Ｐ２それぞれに照射される励起光の強度を調整すべく、空間光変調素子１１５による励起光の空間的変調パターンを変更して、再びステップＳ４，Ｓ５を行う。一方、両者の結果が同等であれば、次のステップＳ７へ進む。
ステップＳ７では、透明平板２上の被測定試料１に対して、既にドープされている蛍光物質と特異的に結合し得る他の分子がドープされて、ステップＳ４と同様にして蛍光検出が行われる。ここで、例えば、既にドープされている蛍光物質がＧＦＰである場合には、新たにドープされるべき他の分子は抗ＧＦＰである。既にドープされている蛍光物質が蛍光色素でラベル化されたアンジオテンシンである場合には、新たにドープされるべき他の分子は抗アンジオテンシンである。また、既にドープされている蛍光物質が蛍光色素でラベル化されたビオチンである場合には、新たにドープされるべき他の分子は抗ビオチンである。そして、励起光照射領域Ｐ１〜Ｐ３それぞれについて、検出された蛍光の強度の経時変化Ｉ(ｔ)が解析部１２により記憶される。
続くステップＳ８では、ステップＳ５と同様にして、解析部１２により、ステップＳ７で検出された励起光照射領域Ｐ１〜Ｐ３それぞれについての蛍光強度の経時変化Ｉ(ｔ)が解析される。これにより、励起光照射領域Ｐ１〜Ｐ３それぞれについて、蛍光物質の並進拡散時間または平均個数が求められる。既にドープされていた蛍光物質（分子Ａ）と新たにドープされた他の分子（分子Ｂ）とが結合されてなる分子ＡＢは、分子Ａと比べて、分子量が大きく、ブラウン運動が遅くなるので、並進拡散定数が大きい。
したがって、励起光照射領域Ｐ１〜Ｐ３それぞれについて得られた蛍光物質の並進拡散時間を比較することにより、観測領域１Ａおよび観測領域１Ｂそれぞれにおける分子Ａと分子Ｂとの結合の程度が求められる。また、観測領域１Ａおよび観測領域１Ｂそれぞれにおいて、分子Ａと結合分子ＡＢとの検出比率や解離定数（Ｋｄ値）も求められ、また、分子Ａおよび結合分子ＡＢそれぞれの並進拡散時間も求められる（特開平１１−３２６２０８号公報を参照）。
なお、ステップＳ７，Ｓ８において、透明平板２上の被測定試料１に対して新たに他の分子をドープしなくても、被測定試料１内に既にドープされている蛍光物質が、被測定試料１内に既に存在する又は生成される他の分子と特異的に結合する場合にも、同様にして、これら蛍光物質と他の分子との相互作用を解析することができる。例えば、既にドープされている蛍光物質が、特定配列化された核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）が蛍光色素でラベル化されたものである場合には、被測定試料１内の他の分子は、被測定試料１としての細胞の内部で生成される分子（ドープされた核酸と特異的に結合し得る核酸または蛋白質）である。また、分子結合を外部刺激により促進または抑制する場合にも、同様にして、分子間の相互作用を測定することができる。ここで言う外部刺激は、例えば、電気的刺激、磁気的刺激、化学的刺激、熱的刺激、光学的刺激、放射線照射による刺激、等である。
続くステップＳ９では、ステップＳ３で撮像された被測定試料１の像と、ステップＳ８で得られた被測定試料１の蛍光検出結果と、が対比される。図１１は、ステップＳ３で撮像された被測定試料１の像と、ステップＳ８で得られた被測定試料１の蛍光検出結果と、を示す図である。同図（ａ）は、ステップＳ３で撮像された被測定試料１の像のみを示し、同図（ｂ）は、ステップＳ３で撮像された被測定試料１の像と、ステップＳ８で得られた被測定試料１の蛍光検出結果（蛍光物質の並進拡散時間または平均個数）と、を重ねて示す。例えば、この図に示されるように、並進拡散時間は、観測領域１Ａ中であって観測領域１Ｂに近い領域１Ａ１、観測領域１Ａ中であって領域１Ａ１を囲む領域１Ａ２、観測領域１Ａ中であって領域１Ａ２を囲む領域１Ａ３、観測領域１Ａ中の他の領域１Ａ４、の順に大きい。このような表示から、被測定試料１としての細胞の内部における蛋白質の作用等を解析することができる。
このように、空間光変調素子１１５における励起光の空間的変調パターンを順次に変更することで、対物レンズ１０１の視野内の被測定試料１の蛍光検出結果の分布が得られる。このとき、対物レンズ１０１の光軸に垂直な方向（ｘ方向，ｙ方向）についてだけでなく、対物レンズ１０１の光軸に平行な方向（ｚ方向）についても、被測定試料１の蛍光検出結果の分布が得られるので、対物レンズ１０１の視野内の被測定試料１の蛍光検出結果の３次元分布が得られる。
（第２実施形態）
次に、本発明に係る蛍光顕微鏡および蛍光相関分光解析装置の第２実施形態について説明する。図１２は、第２実施形態に係る蛍光相関分光解析装置２０の構成図である。この図に示される蛍光相関分光解析装置２０は、蛍光顕微鏡２１および解析部２２を備え、透明平板２上に置かれた被測定試料１に励起光を照射して該被測定試料１で発生した蛍光を検出するものである。特に、この蛍光相関分光解析装置２０は、蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ: Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy）を用いて被測定試料１を測定するのに好適に用いられる。
次に、本発明に係る蛍光顕微鏡および蛍光相関分光解析装置の第２実施形態について説明する。図１２は、第２実施形態に係る蛍光相関分光解析装置２０の構成図である。この図に示される蛍光相関分光解析装置２０は、蛍光顕微鏡２１および解析部２２を備え、透明平板２上に置かれた被測定試料１に励起光を照射して該被測定試料１で発生した蛍光を検出するものである。特に、この蛍光相関分光解析装置２０は、蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ: Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy）を用いて被測定試料１を測定するのに好適に用いられる。
蛍光顕微鏡２１は、対物レンズ１０１、ダイクロイックミラー１０２、ダイクロイックミラー１０３、ダイクロイックミラー１０４、ミラー１０６、ミラー１０７、レーザ光源１１１、ＮＤフィルタ１１２、ビームエクスパンダ１１３、ミラー１１４、空間光変調素子１１５、レーザ光源１２１、ＮＤフィルタ１２２、ビームエクスパンダ１２３、ミラー１２４、空間光変調素子１２５、レンズ１３１、バンドパスフィルタ１３２、空間光変調素子１３３、検出部１３４、レンズ１４１、バンドパスフィルタ１４２、空間光変調素子１４３および検出部１４４を備える。
レーザ光源１１１およびレーザ光源１２１それぞれから被測定試料１に到るまでの光学系は、レーザ光源１１１，１２１から出力された励起光を被測定試料１に照射するための励起光照射光学系を構成している。被測定試料１から検出部１３４および検出部１４４それぞれに到るまでの光学系は、被測定試料１で発生した蛍光を検出部１３４，１４４へ導く蛍光検出光学系を構成している。なお、本実施形態においても、被測定試料１を撮像するための撮像光学系および撮像手段を備えるのが好適であるが、説明を省略する。
本実施形態では、励起光を出力する励起光源部として、互いに波長が異なる励起光を出力するレーザ光源１１１およびレーザ光源１２１が設けられている。レーザ光源１１１から出力される第１励起光、および、レーザ光源１２１から出力される第２励起光それぞれは、被測定試料１に含まれる蛍光物質を励起し得る波長のものである。
ＮＤフィルタ１１２は、レーザ光源１１１から出力された第１励起光の強度を調整して出力する。ビームエクスパンダ１１３は、ＮＤフィルタ１１２から出力された第１励起光を入力し、その第１励起光の光束径を適当な大きさまで拡大するとともにコリメートして出力する。空間光変調素子１１５は、ビームエクスパンダ１１３から出力されてミラー１１４により反射された第１励起光を入力し、その第１励起光に対して空間的な変調を与えて、その空間変調した第１励起光を出力する。
ＮＤフィルタ１２２は、レーザ光源１２１から出力された第２励起光の強度を調整して出力する。ビームエクスパンダ１２３は、ＮＤフィルタ１２２から出力された第２励起光を入力し、その第２励起光の光束径を適当な大きさまで拡大するとともにコリメートして出力する。空間光変調素子１２５は、ビームエクスパンダ１２３から出力されてミラー１２４により反射された第２励起光を入力し、その第１励起光に対して空間的な変調を与えて、その空間変調した第２励起光を出力する。
空間光変調素子１１５，１２５は、空間的な変調が可変であり、以降の光学系を介して空間的に変調した励起光を被測定試料１に照射させることで、被測定試料１中において励起光が照射される領域の個数・位置・形状を設定することができ、また、励起光照射強度の不均一や収差の問題を解消することができる。
空間光変調素子１１５，１２５は、透過型のものであってもよいし、反射型のものであってもよい。また、空間光変調素子１１５，１２５は、振幅変調型のものであってもよいし、位相変調型のものであってもよいし、振幅および位相の双方を変調し得るものであってもよい。ただし、励起光の利用効率の観点からは、空間光変調素子１１５，１２５は位相変調型のものであるのが好ましい。例えば、空間光変調素子１１５，１２５として、液晶を含む微小な画素が平面上に２次元配列されたものが用いられる。
ダイクロイックミラー１０３は、空間光変調素子１１５から出力された第１励起光を透過させるとともに、空間光変調素子１２５から出力されてミラー１０７により反射された第２励起光を反射させて、これら第１励起光と第２励起光とを同一光路としてダイクロイックミラー１０２へ出力する。
ダイクロイックミラー１０２は、ダイクロイックミラー１０３から到達した第１励起光および第２励起光を反射させて対物レンズ１０１に入射させるとともに、対物レンズ１０１から出力された蛍光を透過させる。対物レンズ１０１は、ダイクロイックミラー１０２により反射された第１励起光および第２励起光を入力して、それらの励起光を被測定試料１中の所定領域（励起光照射領域）に照射する。また、対物レンズ１０１は、励起光照射領域で発生した蛍光を入力して、その蛍光をダイクロイックミラー１０２へ出力する。
ダイクロイックミラー１０４は、第１励起光が照射された被測定試料１中の励起光照射領域で発生した第１蛍光と、第２励起光が照射された被測定試料１中の励起光照射領域で発生した第２蛍光とを互いに分離する。第１蛍光と第２蛍光とは互いに波長が異なる。すなわち、ダイクロイックミラー１０４は、対物レンズ１０１から出力されダイクロイックミラー１０２を透過した光を入力し、そのうちの第１蛍光を選択的に反射させ、第２蛍光（および励起光の散乱成分）を透過させる。ミラー１０６は、ダイクロイックミラー１０４を透過した光を入力して、そのうちの第２蛍光を反射させ、励起光の散乱成分を吸収する。
レンズ１３１は、ダイクロイックミラー１０４により反射された第１蛍光を入力して、対物レンズ１０１とともに、被測定試料１中の励起光照射領域で発生した第１蛍光の像を空間光変調素子１３３上に形成する。バンドパスフィルタ１３２は、レンズ１３１と空間光変調素子１３３との間の光路上に設けられ、第１蛍光を選択的に透過させる一方、励起光の散乱成分を遮断する。空間光変調素子１３３は、対物レンズ１０１およびレンズ１３１による第１蛍光の結像面のうち特定領域に入力した第１蛍光を選択的に出力する選択出力手段として作用する。検出部１３４は、空間光変調素子１３３から出力されて到達した第１蛍光の強度を検出する。
レンズ１４１は、ミラー１０６により反射された第２蛍光を入力して、対物レンズ１０１とともに、被測定試料１中の励起光照射領域で発生した第２蛍光の像を空間光変調素子１４３上に形成する。バンドパスフィルタ１４２は、レンズ１４１と空間光変調素子１４３との間の光路上に設けられ、第２蛍光を選択的に透過させる一方、励起光の散乱成分を遮断する。空間光変調素子１４３は、対物レンズ１０１およびレンズ１４１による第２蛍光の結像面のうち特定領域に入力した第２蛍光を選択的に出力する選択出力手段として作用する。検出部１４４は、空間光変調素子１４３から出力されて到達した第２蛍光の強度を検出する。
空間光変調素子１３３，１４３に替えて、開口を有するマスクが用いられて、その開口に蛍光像が位置するようにしてもよい。しかし、開口に相当する上記特定領域が可変であるのが好ましいことから、空間光変調素子１３３，１４３は、蛍光結像面のうち選択的に蛍光を出力すべき特定領域の個数・位置・形状が可変であるのが好適である。このようにすることにより、等価的な共焦点光学系を実現することができる。
空間光変調素子１３３，１４３は、透過型のものであってもよいし、反射型のものであってもよい。また、空間光変調素子１３３，１４３は、振幅変調型のものであってもよいし、位相変調型のものであってもよいし、振幅および位相の双方を変調し得るものであってもよい。ただし、検出光学系中の空間光変調素子１３３，１４３は、励起光照射光学系中の空間光変調素子１１５，１２５と比べて各種条件制御が不要であるので、コストの観点からは強度変調型のものであるのが好適である。
解析部２２は、検出部１３４により検出された第１蛍光の強度の経時変化Ｉ１(ｔ)を記憶するとともに、検出部１４４により検出された第２蛍光の強度の経時変化Ｉ２(ｔ)を記憶し、これらのＩ１(ｔ)およびＩ２(ｔ)から相互相関関数Ｇ(τ)を求める（下記(3)式）。そして、この相互相関関数Ｇ(τ)に基づいて、被測定試料１中の励起光照射領域における蛍光物質の相互作用を解析することができる。
空間光変調素子１１５により空間的に変調された第１励起光、および、空間光変調素子１２５により空間的に変調された第２励起光は、ダイクロイックミラー１０３により同一光路とされた後、ダイクロイックミラー１０２により反射され、対物レンズ１０１を経て透明平板２上の被測定試料１に照射される。被測定試料１には、第１励起光により励起され得る蛍光色素（例えばAlexa488）でラベル化された第１蛍光物質、および、第２励起光により励起され得る蛍光色素（例えばAlexa633）でラベル化された第２蛍光物質がドープされている。
被測定試料１内の励起光照射領域で第１励起光の照射により発生した第１蛍光（波長５３０ｎｍ）は、対物レンズ１０１，ダイクロイックミラー１０２，ダイクロイックミラー１０４，レンズ１３１およびバンドパスフィルタ１３２を経て、空間光変調素子１３３に入射する。空間光変調素子１３３に入射した第１蛍光のうち特定領域に入射した第１蛍光は、検出部１３４により受光されて強度が検出され、その検出された第１蛍光の強度の経時変化Ｉ１(ｔ)が解析部２２により記憶される。このとき、被測定試料１内の励起光照射領域から空間光変調素子１３３に到るまでの光学系は、等価的な共焦点光学系を構成している。
被測定試料１内の励起光照射領域で第２励起光の照射により発生した第２蛍光（波長６８０ｎｍ）は、対物レンズ１０１，ダイクロイックミラー１０２，ダイクロイックミラー１０４，ミラー１０６，レンズ１４１およびバンドパスフィルタ１４２を経て、空間光変調素子１４３に入射する。空間光変調素子１４３に入射した第２蛍光のうち特定領域に入射した第２蛍光は、検出部１４４により受光されて強度が検出され、その検出された第２蛍光の強度の経時変化Ｉ２(ｔ)が解析部２２により記憶される。このとき、被測定試料１内の励起光照射領域から空間光変調素子１４３に到るまでの光学系は、等価的な共焦点光学系を構成している。
そして、解析部２２により、これらのＩ１(ｔ)およびＩ２(ｔ)から相互相関関数Ｇ(τ)が求められて、その求められた相互相関関数Ｇ(τ)は、理想分子運動モデルの場合の相互相関関数によりフィッティング処理される。これにより、被測定試料１内の励起光照射領域における第１蛍光物質と第２蛍光物質との間の相互作用が解析され得る。
以上のように、本実施形態に係る蛍光相関分光解析装置２０においても、前述の第１実施形態に係る蛍光相関分光解析装置１０と同様に、空間光変調素子１１５，１２５における励起光の空間的位相変調のパターンに応じて、被測定試料１に形成される励起光照射領域の個数・位置・励起光強度が調整され得、また、励起光照射光学系の収差が補正され得る。
加えて、この蛍光相関分光解析装置２０では、被測定試料１内の励起光照射領域に互いに波長が異なる第１励起光および第２励起光が照射され、励起光照射領域に存在する第１蛍光物質が第１励起光により励起ざれて該第１蛍光物質から第１蛍光が発生するとともに、励起光照射領域に存在する第２蛍光物質が第２励起光により励起ざれて該第２蛍光物質から第２蛍光が発生する。そして、蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ）により、第１蛍光強度Ｉ１(ｔ)および第２蛍光強度Ｉ２(ｔ)それぞれが各々共焦点光学系により検出され、励起光照射領域における第１蛍光物質と第２蛍光物質との間の相互作用が解析され得る。
また、この蛍光相関分光解析装置２０では、被測定試料１内の第１励起光照射領域に第１励起光を照射して第１蛍光を検出する一方で、この第１励起光照射領域とは異なる第２励起光照射領域に第２励起光を照射して第２蛍光を検出することもできる。そして、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）により、互いに位置が異なる第１励起光照射領域および第２励起光照射領域それぞれにおいて、別個に蛍光物質の挙動を測定することができる。
１…被測定試料、２…透明平板、１０…蛍光相関分光解析装置、１１…蛍光顕微鏡、１２…解析部、１３…表示部、２０…蛍光相関分光解析装置、２１…蛍光顕微鏡、２２…解析部、１０１…対物レンズ、１０２〜１０４…ダイクロイックミラー、１０５…ハーフミラー、１０６，１０７…ミラー、１１１…レーザ光源、１１２…ＮＤフィルタ、１１３…ビームエクスパンダ、１１４…ミラー、１１５…空間光変調素子、１２１…レーザ光源、１２２…ＮＤフィルタ、１２３…ビームエクスパンダ、１２４…ミラー、１２５…空間光変調素子、１３１…レンズ、１３２…バンドパスフィルタ、１３３…空間光変調素子、１３４…検出部、１４１…レンズ、１４２…バンドパスフィルタ、１４３…空間光変調素子、１４４…検出部、１５１…レンズ、１５２…バンドパスフィルタ、１５３…ＣＣＤ。
Claims (6)
- 被測定試料中の励起光照射領域で発生した蛍光を検出する蛍光顕微鏡であって、
互いに波長が異なる第１励起光および第２励起光を出力する励起光源部と、
前記励起光源部から出力された第１励起光に対して空間的な変調を与える第１空間光変調素子と、前記励起光源部から出力された第２励起光に対して空間的な変調を与える第２空間光変調素子とを有し、前記第１空間光変調素子により空間的に変調された第１励起光と前記第２空間光変調素子により空間的に変調された第２励起光とを同一光路として前記被測定試料に照射する励起光照射光学系と、
前記第１励起光が照射された励起光照射領域で発生した第１蛍光と、前記第２励起光が照射された励起光照射領域で発生した第２蛍光とを互いに分離して、前記第１蛍光を入力して結像するとともに当該結像面のうち特定領域に入力した前記第１蛍光を選択的に出力する第１選択出力手段と、前記第２蛍光を入力して結像するとともに当該結像面のうち特定領域に入力した前記第２蛍光を選択的に出力する第２選択出力手段と、を有する蛍光検出光学系と、
前記第１選択出力手段から出力された第１蛍光の強度を検出するとともに、前記第２選択出力手段から出力された第２蛍光の強度を検出する検出部と、
を備えることを特徴とする蛍光顕微鏡。 - 前記励起光照射光学系に含まれる前記第１空間光変調素子および前記第２空間光変調素子それぞれが位相変調型のものであることを特徴とする請求項１記載の蛍光顕微鏡。
- 前記蛍光検出光学系に含まれる前記第１選択出力手段および前記第２選択出力手段それぞれが空間光変調素子であることを特徴とする請求項１記載の蛍光顕微鏡。
- 前記蛍光検出光学系に含まれる前記第１選択出力手段および前記第２選択出力手段それぞれが強度変調型の空間光変調素子であることを特徴とする請求項１記載の蛍光顕微鏡。
- 前記被測定試料を撮像する撮像手段を更に備えることを特徴とする請求項１記載の蛍光顕微鏡。
- 請求項１〜５の何れか１項に記載の蛍光顕微鏡と、
前記蛍光顕微鏡の前記検出部により検出された第１蛍光および第２蛍光それぞれの強度の経時変化の相互相関関数を求める解析部と、
を備えることを特徴とする蛍光相関分光解析装置。
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