JP3517241B2 - 生体高分子の適応度を評価するための方法および装置 - Google Patents

生体高分子の適応度を評価するための方法および装置

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    • Y10T436/11—Automated chemical analysis

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の目的は、レーザー励起蛍光相関分光光度法を
用いた、特に１μＭ以下の希薄溶液中の一つまたは少数
の分子の同定方法、特定の用途における該方法の使用、
並びに本発明の方法を実施するための装置に関する。
近年、生物学的活性分子の分析は特異性および感度の
点で着実に進歩してきており、また、基本的に新しい技
術によって補われてきている。この点に関しては従来の
分析技術に適応しうる量にまで単一の細胞または分子を
増幅するクローニング法または遺伝子物質の酵素的増幅
を挙げることが出来る。しかし、多くの場合、定性的に
も定量的にも単一分子または数分子に直接適応しうる十
分な感度を有する分析法があればより望ましい。
例えば、電子顕微鏡は、単一分子を直接検出しうる技
術である。トンネル型電子顕微鏡を用いた単一のDNA分
子の配列決定が試みられている。しかし、この方法は非
常に煩雑である。
単一分子の単なる分析だけではなく、構造や他の分子
との相互作用または分子構造など、その分子の状態パラ
メータに関する情報も多くの分野で重要である。
最近の進化的生物工学的方法は非常に複雑な分子集合
体に関するものである。その目的は標的構造と特異的相
互作用を起こす分子を同定すること、即ち、望ましい機
能に関する特定の適応度を測定することである。この適
応度は結合定数または速度定数などの熱力学的パラメー
タに帰結させることができる。
例えば、分析する分子が低濃度でのみ存在する場合、
検定法の感度を増加することは問題の解決にとってさし
て重要ではないことがしばしばある。むしろ、多かれ少
なかれ同時に分析すべき大量の試料に対処しなければな
らない。例えば、106個の分析試料を時間のスケールで
分析しなければならないなら、試料を1msから最高で1s
以内で測定および評価しうる分析法しか考えられないの
は明白である。本発明に課せられた問題は、取り分け、
単一分子の単なる分析に止まらず、他の分子との特異的
相互作用または得られた分子構造に関する情報を得られ
る方法を提供する事である。さらに、多量の試料を同時
に分析することである。
本発明の方法は化学発光に基づいており、また蛍光相
関顕微鏡（FCS）の名前で知られている技術を利用して
いる。蛍光性を有する発色分子構造を用いて発色性リガ
ンドの分子環境に関する情報を得ることができる。化学
発色団の回転拡散および並進拡散は、相互作用分子への
エネルギー移動の種々の経路、化学反応速度および励起
状態の寿命と同様に測定しうる。
物理化学的現象に基づき、本発明は単一分子または少
数分子から該分子の性質に関する情報ならびに一つの分
子について特定される一つの化学発色団の種々の状態の
分子種数に関する情報または特定の相互作用機能に関す
る適応度の情報を得るために分光学的測定パラメータを
利用した新しい解答を提供している。
今日まで約20年間、D.マグデ（Magde）のグループ
（エルソン（Elson）,E.L.およびマグデ（Magde）,D.
（1974）蛍光相関顕微鏡、概念および理論;Biopolymer
13,1−27）およびR.リグラー（Rigler）（アーレンバー
グ（Ehernberg）,M.およびリグラー（Rigler）,R.（197
4）回転ブラウン運動および蛍光強度の揺らぎ;Chem.Phy
s.4,390−401）により追跡されてきた蛍光相関顕微鏡法
は技術的な困難さから実際的分析法に組み込まれること
はなかった。測定時間および色素の光誘導性消光（光消
光）に関して上述の要求に答えることは出来なかった。
リグラー（Rigler）等は分子の回転時間を測定できた。
マグデ（Magde）等は揺らぎ時間を通して特定の化学反
応定数を測定しえた。
FCS測定の原理はレーザー光の強力な励起光で溶液内
の比較的限られた小さい容積エレメントを照射すること
により非常に希薄な溶液（10nM以下）中の蛍光性分子を
測定することである。この容積内に存在する対応する励
起スペクトル特性を有する分子のみがこの光で励起され
る。この容積エレメントから発せられる蛍光の像が高感
度のフォトマルチプライヤー上に結ばれる。もし、この
溶液を希釈すれば各照射容積エレメント内に存在する分
子濃度を有意に変化させうる。
特に非常に希薄な溶液は特定の時間内に特定の容積エ
レメント内に同時に存在する分子数の分布はポアソン分
布を示す。一度この容積エレメント内に拡散してきた分
子はその分子型に特徴的な拡散速度（並進）に従う平均
的時間内に再びこの容積エレメントから出ていき、もは
や観測できなくなる。もし、一つの分子が観測エレメン
ト内で平均滞在時間内に何度も励起されるならば、この
分子から多くの発光シグナルが検出できる。別の言葉で
言えば、希薄溶液の場合、一度観測エレメントに拡散し
てきた分子が再びその容積エレメントから離れる前に１
回以上励起されうる確率は、新たに拡散してくる分子が
励起される確率よりもはるかに大きい。この事は対応す
る発光シグナルが新たにそのエレメントに侵入してくる
分子よりも同じ１つの分子から発せられる確率が大きい
ことを意味している。従って、発光シグナルの時間変化
と関連する分子種の相対拡散時間の相関関係を明確にす
ることができる。
もし、励起光と発光の偏向面の回転をパラメータとし
て測定すれば、おおよその分子量、形状パラメーターま
たは周囲のマトリクスに関する情報を引き出しうる分子
の回転拡散係数を決定しうる。
同じ１つの分子を何回も（数千回）励起し、多くの単
一測定に由来する発光シグナルを蓄積することにより希
薄溶液中の単一分子を検出することさえ可能であること
が判明している。
この測定原理の実質的な実現には多くの技術的困難が
ある。最近のレーザー技術を採用しても、この観察領域
が大きすぎて低い並進拡散係数を有する生物学的分子は
約50msも存在することになる。この時間は発色団として
使用する各色素リガンドが消光されてしまうほど十分長
い。頻繁に行われる励起が環境にある分子、特に酸素に
対する発色構造の化学的反応性を増加し、発光は変化を
受けるか、あるいは消光する。もちろん、発光（蛍光）
の損失は分子の測定エレメントからの離脱と混同される
ことから光消光は測定誤差に直接結びつき、また、測定
法を規格化することによる区別が困難であるか、あるい
は異常な技術的経費によって始めて獲得されうることに
なる。
今日まで一般的に使用されている方法における本測定
原理の実質的実現は狭い範囲に限定されてきたが、この
ことは本発明の方法によって克服されうる。
本発明に記載されているようにFCSの作業に関するル
ーチン方法への重大な進展は励起光学系の特定要素、単
一光子検出および試料取扱法の同時使用を要求する試料
総容積がμレンジとなる極小測定容積（望ましくは10
-14−10-17）の導入により達成される。実験レイアウ
トで示される装置の測定容積は２×10-16であり、こ
の容積はこれまで文献で見られる測定容積の約1000倍小
さい。従って、照射領域の大きさは約0.1μm2となる。F
CSが特に測定容積当たり0.1−10個の色素分子濃度に対
する正確なデータを提供するとすると、作業濃度は約10
-7−10-9Mとなる。最高検出効率およびバックグランド
補正を用いた測定は技術的に単一光子検出と組み合わせ
た高開口共焦点光学系で実現されうる。
もし拡散時間と比較して反応時間が遅いならば並進拡
散によって結合定数が測定できる。この事は観察される
リガンドが観測領域に入ってから出るまでにその分子構
造を変えないか、またはほとんど変えないことを示して
いる。また、混合状態を示す相関関係も測定される。も
う一度繰り返すと、分子の滞在時間が従来の観測領域の
場合よりも約1000倍短くなることから、非常に小さい測
定容積を用いた本発明の方法の重要性は明らかであり、
例えばリガンド／レセプター相互作用などに関する、通
常の大きさの平衡定数および速度定数の測定への道が切
り開かれた。
1.本発明の小容積測定領域の重要性 本発明の方法の実施に伴う小容積エレメントの重要性
およびその使用は従来法とは異なる実験的特徴を有して
いる。
小容積エレメントには以下に示す特徴がある。
−バックグランド散乱光、特にラマン散乱光、 −光照射間の蛍光色素の寿命、 −短い測定時間、 −高分子複合体、ウイルス、細胞の拡散時間、 −エレメントに存在しない複合体の統合／保存、および −測定の間の複合体の寿命。
以下の説明から小容積エレメントを実現する上で本発
明に望ましい意味で同時に幾つかのパラメータが正の効
果を有し、累積効果を通して本発明に関する問題に対し
て解答を出した方法論の非線型／指数的改善を行ったこ
とは明白である。
単一分子の測定に必要なSN（シグナル・トゥー・ノイ
ズ）比1000はf1およびサブf1領域における小容積エレメ
ントにより達成される。この比の低下は測定容積の半径
の３乗（r3）に比例する。この挙動は長いカラム容積を
レーザー光が照射し、実質的にビームの２次元内での拡
散を解析していた初期の実験装置では完全に無視されて
いた。
それでも測定技術的理由からより大きい容積を分析す
るならば、本発明に従いマルチアレイ検出により多くの
小容積エレメントを同時に測定すること、および／また
は、異なる空間部位の種々の小空間エレメントを連続し
て測定することが可能となる。測定容積としての各ガウ
ス分布空間エレメントに対してSN比の特徴が維持され
る。本発明に従って、全ての空間エレメントは各々単一
の空間エレメントの単一測定と同様に絞られた励起光で
共焦点的に照射されることが望ましく、また、空間エレ
メントの像はピンホールでスクリーンに形成される。
単一分子の安全な同定および測定、および特定の測定
時間における測定容積内の複合体化または遊離リガンド
の数に基づく平衡定数の測定に必要な単一分子の計数の
可能性に関する本技術の方法論的改善は、測定容積10
-14以下の使用により達成される。このことは、本発
明に従い直径100μｍ以下、望ましくは20−30μｍ以下
のピンホール開口の使用、並びに予め絞られたレーザー
励起光の使用により可能となる。対物板に存在するこの
大きさのピンホール開口を用いると、0.33−0.5μｍの
ガウス測定容積の直径は60倍にも達する。異なる像スケ
ールを有する光学系を使用すると、対応するピンホール
開口を使用しなければならない。このことは遊離したロ
ーダミンに関して測定容積からの拡散平均時間が約40μ
ｓとなることを意味しており、一方従来技術では750μ
ｓとなる。しかし、同時に1000倍以上も減少した測定容
積における分子の滞在確率も1000倍以上小さくなり、そ
の結果不都合に長い測定時間を要することになることか
ら、ガウス分布測定容積の半径の10以上の減少は適当で
はないと言わなければならない。従って、本発明の本方
法の至適測定容積は10-14−10-17となる。とにかく可
視光では減少した寸法の空間エレメントを光の回折性の
ためさらに大きく減少することはできない。しかし、こ
のことは測定シグナルを発生するために核蛍光を励起す
る場合など本発明にしたがってＸ線照射を用いることに
より克服しうる。
−測定時間が実質的に許容されうる範囲（msからｓ）に
あること、 −SN比が１を超え、特に100から1000の範囲にあるこ
と、 −励起のための照射光による破壊が起こらないように小
分子、分子複合体、または分子断片の拡散平均時間（測
定容積を横切る）が大きくならないこと、 以上の特徴を踏まえて、至適ガウス分布測定容積は10
-14以下、特に10-17以下となる。
SN比が高いことは、測定時間が短いことに加えて、適
当なフィルターを使用していることでうまく説明され
る。簡便のため、これらの光学フィルターはラマン散乱
光を抑制する緩衝バンドフィルターおよび／または107
の懸濁因子に対応する10-7の光学密度を有する励起光波
長に近い散乱光をカットするラマンカット・オフ・フィ
ルターを使用する。
本発明の方法および本発明に従った単一分子、分子複
合体、および／または分子断片の蛍光分光光度法用装置
を使用するにあたって、励起用の照射光を鋭く絞り込む
ことに加えて、励起光のビーム経路中に非常に小さなオ
リフィスを有するピンホール開口が共焦点的に存在する
事が重要である。対物板のピンホール開口のオリフィス
サイズは像の大きさおよび対物板上に結像される測定容
積の大きさに依存して選択される。40（100）の像サイ
ズおよび測定容積0.1μｍ以下の半径の場合、最低限４
μｍ（10μｍ）のピンホール開口半径が必要となる。
バックグランド散乱光、特にラマン散乱光 試料を通過する励起光の強度がより強くなり、また単
一光子検出器に結像される容積がより大きくなれば、試
料中に存在する分子および固体によって散乱され検出器
に到達する光の強度はより小さくなる。即ち、自己相関
をとることによりそれらはシグナルと簡単に区別するこ
とができる。
本発明に従って、従来のフィルターで水のラマンバン
ドを抑制すると単一のローダミン分子を0.2flの空間領
域においてSN比1000で測定できる。このような小さい空
間領域を用いずに従来の測定を行うとSN比は僅か10-3と
なる。
光照射中の蛍光色素の寿命 本発明に使用しうる生物学的に有用な蛍光色素は限ら
れた寿命しか持っていない。フルオレセインなどの色素
は明らかに光感受性が高い。しかし、特に大きい複合体
の平均滞在時間の詳細な測定の場合、色素はその分子が
再び測定容積の外に出る前に約10,000−1,000,000回励
起される。早熟の消光は並進係数を大きく見積もらせる
ので（小分子）、早熟の消光は測定結果に誤差を生じさ
せる。
高分子複合体、ウイルス、細胞の拡散時間−短い測定時
間 特に大きい分子複合体、ウイルスまたは細胞は極端に
並進拡散係数が小さい。本発明のように測定容積が小さ
いと、ウイルスおよび細胞は結合した色素の有意な消光
無しに取り扱うことができ、遊離のM13 DNAの場合の拡
散係数は約10-8cm2/sであり、また大腸菌は約５×10-9c
m2/sであった。この測定容積内の細菌の滞在時間は約30
msであった。これまで可能であったより大きい測定容積
ではこれらの大きい複合体が並進拡散により測定容積を
出ていくまでに長い測定時間を要することになるであろ
う。
測定容積領域に存在しない複合体の統合／保存 色素が特定の化学反応により励起状態から反応し、消
光してしまうことが統計的確率で起こる。もし、この事
が測定容積以外から来る光で起こるならば、失活した色
素がシグナルを全く提供せず、その測定に何ら寄与しな
いのでその測定は影響を受けない。しかし、この方法の
質が測定可能な分子および分子複合体の効果的濃度が未
だ測定容積以外に存在する色素標識分子の早熟消光で減
少し感度が影響を受ける事により非常に制限を受ける。
もしもレーザービームが最高までに絞りこまれていなか
ったら、これらの負の要因は煩わしいものになるであろ
うし、また、標識分子が本発明の望ましい態様である幾
つかの色素分子として提供されているならばその分子の
測定不能部分は予備照射で予め消光させておかれる。
測定の間の複合体の寿命 検出される標的分子および標識したテスト試薬の複合
体は、該複合体が測定時間を通して安定に存在する場合
に限り本発明の方法で検出が可能である。このことは、
複合体がそれ自身秒の単位の衰退時間を有する場合の、
大きい測定容積内の平均滞在時間が秒の範囲にある場合
について論じているのではない。この事は例えば結合定
数106・mol-1の金属イオン複合体化等の生物学的反応
に関するものである。しかし、本発明に従う小容積エレ
メントは短い平均滞在時間を意味しているので（＜1m
s）、実際の全ての複合体化反応において複合体は測定
容積内の滞在時間を通して安定に存在する。
マルチアレイ検出 本発明のマルチアレイ検出は、マルチアレイ検出器上
に別々に結像された種々の容積領域を持つ大きい容積領
域を非至適様式で照射し、かつ、入射した光子を記録し
測定の間に別々に評価する事で達成される。この事は市
販のマルチアレイ単一光子検出器を用いることで可能で
ある。この方法の１つの欠点は望ましくない照射が測定
容積外の有意な光失活を起こしてしまうことにある。マ
イチアレイ検出、即ち種々の空間位置での測定容積の並
行FCS分析または種々の空間位置の測定容積の連続的FCS
分析において、比較的大容積エレメントが実験アレイに
おいて照射されるのは今まで述べてきた意味で利点が無
く、一方、小空間エレメントの測定は2Dパターンに整列
させた小さな空間エレメントを同時に結像させ、測定し
評価する事によって達成される。この実験においては
（第24図）、多くの発色団が拡散により測定容積内に到
達するまでに消光してしまうであろう。
低濃度では、比較的容積が大きいエレメントが測定さ
れる。測定時間は必要とされる測定データの精度（SN
比）に依存して10乃至100msの範囲にあるので、10,000
から100,000個の測定容積は1000sで測定される。従っ
て、10-14−10-15Mの極端に低い濃度が測定される。こ
の事は結合定数kass≧106mol/からkass＝1015mol/
までの特異的生物学的相互作用が測定できることを示し
ている。
１つの例では本発明の技術を用いてどの様に結合定数
または反応定数が測定されるかが示される。本発明に従
う反応物の結合平衡の測定は、少なくとも１つの反応物
が化学的に１つの色素分子に結合し、かつ、その反応物
の回転拡散速度および／または並進拡散速度が複合体形
成の間に変化するという事実に基づいている。もし、平
衡定数が非常に希薄な溶液の実験条件と適合しないなら
ば、即ち、低い結合定数が高い反応物濃度を必要とする
ならば、このことは例えば大量の非標識反応物を与える
か、または標識化合物に対して過剰の非標識反応物を添
加することにより達成しうる。
マグネ（Magne）によって示されたようにFCSを用いた
分子揺らぎによる反応速度の測定は、これまで行われて
きた測定装置では拡散経路が長いことにより満足に行う
ことができなかった。本発明の測定技術を用いることに
より、特に生物学的反応に関連する約10-6s-1乃至103s
-1の範囲の複合体の解離速度定数の測定が可能となっ
た。このような測定は例えば、蛍光標識分子の相互交換
により行いうる。
また、本発明の技術は生物学的高分子の構造変化の測
定ならびに関連する熱力学的および速度論的定数の測定
を可能にする。構造の揺らぎは、例えば回転拡散の測定
またはいわゆるエネルギー転移（フェルスター（Ｆrs
ter）理論）により検出できる。
この方法はDNA/RNA分析にも使用しうる（DNA/RNA分析
については以下参照）。遺伝子解析、特に感染性病原の
同定において、診断方法の感度が重要となることが多
い。この事は近年特に遺伝子ターゲット配列の増幅を目
的とした酵素依存的方法の導入に関連して明らかになっ
てきた。本方法を用いることにより予備的な酵素依存的
増幅の必要体を幾つかの診断方法で省略することがで
き、例えばそれによって強く増幅された単一配列の混入
の問題を克服できることが期待される。
また、本方法は既存のRIA、ELISAまたはその他の方法
（以下参照、レセプタースクリーニング）等の診断法の
代わりに使用しうる。本発明の方法の１つの利点はこの
システムが自己校正型であることである。校正曲線また
は内部標準を施す必要はない。各実験で問題となる分子
の測定から内部校正が得られる。例えば、レーザー強度
の変化は測定精度に影響しない。連続測定におけるドリ
フトの問題は発生しない。測定は校正する事無しに何度
でも反復でき、同じ結果を与える。装置の校正も省略す
ることができる。望ましい応用にはテスト試薬として抗
体を使用しない検定法または抗体を使用したELISA、RIA
またはFIAに基づく従来の検定法の代替法が挙げられ
る。特定のターゲット分子（リガンド）を認識する為の
特異的認識分子（レセプター分子、テスト試薬）として
の抗体に加えて、別の分子を使用する全ての検定法が考
えられる。一般に、抗体に加えて可能なレセプター分子
とはその表面に特定の認識部位を有するか（例えば、抗
体、一本鎖抗体、膜レセプター、可溶性レセプター、酵
素、構造タンパク質、多糖類、ペプチド、複合体二次代
謝物等）またはターゲット分子内に特異的認識部位を含
む（例えば、HDL、VLDL、LDL）全ての分子および分子複
合体である。
一般的形のレセプターおよび一つ以上のリガンド間の
特異的複合体の形成が分析的に興味ある物である場合、
および／または少なくとも１つの関連分子が少なくとも
１つの色素標識で提供され、かつ、複合体の形成が色素
標識の回転拡散および／または並進拡散の変化で明確と
なる場合、FCS検定を行うことができる。利点を有する
態様に関する同様の熱力学的規則性はELISA、EIA、RIA
またはFIA型の検定にも同様に適用しうる（図１および
２参照）。
本発明の方法の性能は市場に存在する技術と比較した
ときに特に明確となる。よく採用される方法には関連す
る装置にいわゆるTDXシステムを採用するシカゴのアボ
ット（Abbott）のいわゆるFPIA技術がある。ここでは蛍
光標識した分子の偏光解消を同種の検定法で測定してい
る。
偏光での励起後に発せられる蛍光色素の蛍光の偏光解
消は、基本的にその分子の分子量、形状パラメータに依
存する性質である。大きな分子に比べ比較的小さな分子
は励起と蛍光の発光との間により多く回転し、その結果
蛍光のより大きな偏光解消を起こす。この効果は小さい
蛍光標識分子が例えば、抗体の結合部位に関し非標識タ
ーゲット分子と競合するような場合に利用される。従っ
て、蛍光の偏光解消は複合体に結合した標識分子の相対
的位置に関する情報を提供する。しかし、この方法は望
ましい検出限界に到達していないのは明白である。製造
業者自身、10-9Mという比較的低い検出感度を提供して
いる。本発明の方法は至適条件でない時でも２桁以上も
この方法より感度が高い。この事はFPIAキットを本発明
に従って使用したときにも正しい。より感度の高い色素
を使用することにより、さらに高い感度が達成できる。
この事は例えば薬剤診断などの場合に特に重要である。
本発明の方法は種々の試料条件に依存して定量的およ
び定性的検定に特に優れた性能を示す。蛍光の偏光解消
度は媒体の粘度／温度条件に依存する。粘度が増加する
と、回転拡散定数が低くなるため全ての分子の蛍光偏光
解消度は減少し、直ちに結果に影響する。同様の妨害効
果は励起状態の寿命に影響する媒体の条件により引き起
こされる。寿命の延長は偏光解消の増加と同様の効果を
示す。しかし、本発明に従って並進拡散を測定する方法
では、これらの効果は結果の質に重大な影響をおよぼさ
ない。実際に、この事は試料調製およびスケール決定に
おける経費の節約および顕著に大きいダイナミックレン
ジを意味する。
2.複合体形成における反応速度の重要性 特異的認識反応を伴う核酸の再生の場合のように（以
下参照）、会合速度が遅すぎて認識反応に基づく均一な
検定法は実際的ではない。例えば特異的複合体形成の反
応速度を増加するために標識抗体を使用する場合の不均
一検定法においては反応物を過剰提供し、かつ、複合体
に結合しなかった過剰な反応物は次の段階で除去される
が、このことは均一検定法では容易に行えない。
この問題を以下の例で説明する：本発明の方法に従う
検出により≦10-15Mの濃度の蛍光色素で標識した化合物
を測定しうる。もし、蛍光標識した特異的テスト試薬を
ターゲット分子または分子複合体に使用したなら、少な
くとも３つの必要条件が満足されねばならない。1.複合
体に結合していない蛍光標識した分子と結合した蛍光標
識分子間のサイズの差は、異なる並進拡散を簡単に検出
できるように拡散定数が約２倍異なるくらいに大きくな
くてはならない。2.ターゲット分子と複合体を形成する
結合定数は十分大きくなければならない。3.会合の反応
速度は実験的に許容しうる分から時間の時間スケールで
複合体の形成が行われるように十分大きくなければなら
ない。
もし、複合体に結合していない100個のテスト試薬の
内、１つの複合体化したターゲット分子が検出できれ
ば、本発明に従って10-15Mの生成複合体を検出するのに
10-13Mのテスト試薬を使用することができる。平衡状態
では、対応する２分子会合反応の対応する会合定数kass
が少なくとも1013M-1であるならば複合体形成は十分効
率よく起こる。このような高い結合定数はタンパク質の
ような生体分子では殆どありえない。通常抗体の結合定
数は106から1010M-1の範囲にある。
生体分子の複合体化反応における抗体の反応速度定数
はkass＝107M-1s-1の範囲を越えることはまず無い。基
本的に結合定数の差はしばしば10から10-3s-1の範囲に
くる複合体の解離速度定数kdissの差に寄因する。しか
し、上述の場合、kass＝107M-1s-1の速度定数はテスト
試薬の濃度を10-10Mとしたときに会合の寿命が1000s付
近になることを意味している。
本発明に従って、低い結合定数にもかかわらず認識反
応の均一検定法で10-15Mにも達する光学検出反応の感度
を利用した幾つかの代替法が考えられる。
反応条件を変えることにより会合定数を極端に変化さ
せることができる。核酸について、相補的核酸配列の会
合がどのように10,000から100,000倍も加速されるかを
以下に説明する。長い鎖状DNAの配列モチーフの認識反
応は純粋な拡散支配の反応よりも速く進行する。おそら
く律速段階はDNAへのタンパク質因子の到達であり、そ
の後実際の結合部位への速い一次元拡散段階が続いてい
る。
一般に加速は会合の律速段階の拡散過程を短くするこ
とで達成しうる。このことは単純に反応混合物を濃縮す
ることにより行われる。
本発明では均一検定法において媒体の条件を変化さ
せ、試料容積を減少することなく効果的に反応分子の滞
在空間を減少させている。本発明では、基本的に水和水
被覆の構造に影響を与える例えばポリエチレングリコー
ル類、デキストラン、ポリビニルピロリドン、カオトロ
ピック試薬類、有機溶媒またはこれらの組み合わせ物を
添加することで行っている。本発明では水性２相系を用
いて１相に選択的に反応物を濃縮している。
別の可能性として標識した反応物の過剰量の使用が挙
げられる。もし、共同して１つの分析物を認識し、結合
する２つの色素標識した反応物を使用すると、いわゆる
エネルギー転移複合体が形成される。１つの色素標識は
発光した蛍光が隣接する第２の色素分子（10−100Å）
を励起する励起光受容体として働き、第２の色素から発
した蛍光が本発明の測定シグナルとして検出される。エ
ネルギー転移は色素間距離の６乗に比例して減少するの
で、反応物は過剰に使用しうる。３者複合体の並進拡散
定数を本発明に従って測定する。
本発明では、もし、非複合体化テスト試薬が化学的に
または照射により分光学的に変化を受け、複合体とは異
なる分光特性になるならば、過剰成分としての色素標識
テスト試薬の使用も可能である。この事は例えばインタ
ーカレーション（intercalating）色素の場合に可能で
ある。
本発明の電気的トラップによる濃縮については本明細
書の別の箇所で説明する。
もし、例えば小分子に対する標識化抗体の使用の場合
などのように複合体形成がテスト試薬の分子量および／
または形状をわずかにしか変化させないならば、本発明
の複合体に対する過剰の第２の抗体の使用は本発明で検
出しうる第３の複合体の生成を可能にする。
本発明に従って少なくとも一つのターゲット分子と反
応できる、少なくとも二つの異なる色素で標識された少
なくとも二つの異なるテスト試薬であって、少なくとも
二つの色素の蛍光シグナルを本発明に従って測定しうる
試薬も使用することが出来る。この方法は二つの様式で
使用しうる。
ａ）試料における少なくとも二つの分析物の同時測定 一つの試料中に存在する複数の分析物を検出する上で
実験的問題がしばしば生ずる。二つの独立する検定法と
は異なり、少なくとも二つの異なる分析物の検出は二つ
の独立する異なる色素で標識し、望ましくは異なる波長
の光で励起するか、もしくは異なる発光波長の光を独立
に検出できる二つの独立するテスト試薬の反応により本
発明に従って独立に行うことができる。このことは、た
とえば図16に図示した二つの独立する光学系を用いて行
いうる。
3.相互相関 ｂ）一つの分析物に少なくとも二つの異なるテスト試薬
が同時に結合することによる検出特異性の向上 一つのテスト試薬を結合することにより、不十分な特
異性しか有さない場合でも類似の分析分子から特定の分
析物を区別することができる。このことは自分自身の病
原性またはそれらの生産物の病原性など、その生物学的
活性が極端に異なる相同的核酸配列で例示される。腫瘍
抗原、構造蛋白質または細胞型特異的表面マーカー等の
蛋白質も分析しうるが、唯一のリガンドの結合だけでは
不満足である。
本発明に従い、特定の分子は、少なくとも光学的に異
なる蛍光分子で標識した少なくとも二つのテスト試薬と
同時に複合体を形成しうる。本発明に従い同時の複合体
形成はエネルギー転移複合体の形成（フェルスター転
移、上述）または異なる波長を有する励起および／また
は発光のシグナルの生成を通して特異的に検出しうる。
一つの分析物に対する異なるテスト試薬の結合は異なる
光学シグナルの時間相関で認識される。
二つの異なる標識を付されたテスト試薬による分析物
の二重複合体化は、上述の特異性の向上という利点ばか
りではなく、各試薬をより高い濃度で使用しうるという
実際的利点もある。本発明に従い検出される蛍光シグナ
ルの時間相互相関により、非標識の遊離テスト試薬のシ
グナルは電気的シグナル処理のレベルで効率的に抑制し
うる。この方法は分析物の異なる配列断片に結合する少
なくとも二つの異なる標識テスト試薬を使用することに
よる核酸分析物の場合に特によく使用される。異なる色
素からの蛍光の発光波長は異なる。通常測定される検出
シグナルの単一の自己相関の代わりに、本発明では異な
る波長のシグナルの相互相関が測定される。もし、両プ
ローブがターゲット分析物に同時に結合するならば、相
互相関で分子の数および二重標識核酸断片の拡散時間が
分かる。結合しなかったプローブ分子は自己相関では見
えてくるが、このシグナルは相互相関では抑制される。
4.蛍光相関顕微鏡法を実施するための方法および装置 このように本発明に従い分子または分子複合体に化学
的に結合または物理的に会合した異なる色素の蛍光シグ
ナルの相互相関を用いて感度および特異性を向上するこ
とが出来る。しかし、至適手順で実験するために以下に
示す本発明の方法ならびに関連する装置により特に有効
に実施しうる幾つかの必要条件が満足されなければなら
ない。
本発明の方法は小容積エレメントを用いる蛍光相関分
光法と相互相関法を組み合わせている。この方法はFACS
分析（蛍光活性化細胞分別）で使用されている相関法と
は明らかに異なる。そこでは細胞の様な大きな複合体に
由来するいくつかの光学パラメータ、例えば蛍光シグナ
ルと前方散乱光の組み合わせ、または異なる蛍光シグナ
ルが同時に測定されている。セルソーターの場合、単一
細胞を含む単一液滴のシグナルが測定される。細胞型ま
たはサブタイプを同定するためにとるシグナルの相関は
液滴から検出される種々のシグナルの強度分布のみを問
題にしている。相関は各強度に関する幾つかのパラメー
タの並行した検出と考えてよい。ここで示している方法
は二つのストカスチック過程、小空間エレメント中の種
々の発色団の拡散特性を時間とリンクさせている。実際
に細胞のレベルでは、本発明の方法は発色団を有し測定
領域に存在する種々の分子を区別しうるが、セルソータ
ーでは、発色団が小分子の一部であるか、または複合体
として存在するか、または細胞に結合しているかにかか
わらず、液滴中の発色団の濃度を総合的に検出するにす
ぎない。
FCS分析と組み合わせた相互相関とは以下の方法論を
意味している：容積エレメントは出来るかぎり強く絞っ
たレーザー光またはＸ線で照射される。その電磁波照射
の強度は照射によって励起されうる分子の大部分が励起
状態に励起されるのに十分な大きさを有するように選ば
れる。それから発せられる蛍光を単一光子測定装置のピ
ンホール開口による共焦点像で検出することから、非常
に小容積の細長い円錐形の光を測定することになる。こ
の測定容積エレメントに分子が拡散してくると、励起さ
れ、この測定容積エレメントに留まるかぎり発光によっ
て測定される。その平均滞在時間は分子、分子複合体ま
たは細胞の大きさおよび形に特徴的なものとなる。
このように種々の濃度で存在する分子は相関分光法で
区別でき、また同時に計数しうる。例えば、レセプター
／リガンド相互作用等の複合体形成の結合定数又はこの
ような複合体の衰退速度などの速度定数をこのように測
定しうる。この方法では特に蛍光性を有する分子が単位
時間当たり、容積エレメント内に僅かしか存在しない場
合に良好な結果を示す。この事は10-9以下の濃度範囲の
場合に相当する。しかし、逆に第２の反応物との複合体
形成は107/sよりも速く進行することは無いという問題
が生ずる。２つの反応物が10-9で等モル存在したとする
と反応時間は１分以上かかることを意味する。この反応
時間を短縮するには、例えば過剰量の蛍光標識反応物を
使用することで達成される。反応物の濃度が10-9Mの場
合、10-12Mの濃度のターゲット分子との複合体は分単位
の反応時間の後に検出しうる。より低い濃度の場合、複
合体と遊離のリガンドとのSN（シグナル・トゥー・シグ
ナル）比が大きくなりすぎて信頼できる濃度測定は出来
ない。もし、測定すべき複合体の結合定数がリガンド濃
度≦10-9にするほど高くない場合にも別の実験的問題が
生ずる。しかし、ウイルス抗原、病原体の核酸または特
定のホルモンは有意に10-9M以下の濃度で検出しなけれ
ばならない。典型的な応用分野はしばしば低い結合定数
を有し、各分化した細胞の抗原から脱分化した細胞の腫
瘍抗原を区別する上で特異性がそれほど高くないモノク
ローナル抗体で腫瘍抗原を診断する場合である。２つの
異なる発色団を用いた相互相関法で上述の感度および特
異性の向上が可能となる。
少なくとも３個の発色団を有する分子または分子複合
体が実験的に区別される必要がある：発色団１を有する
遊離リガンド、発色団２を有する遊離リガンド、発色団
１を有する複合体、発色団２を有する複合体並びに発色
団１および発色団２を有する複合体。測定容積内に複合
体が存在する時間内に発色団１および発色団２を有する
複合体のみが、腫瘍抗原またはウイルスまたは関連する
DNAまたはRNA等の病原体として検出すべきターゲット分
子となる。
ここでの相互相関法では発色団１および発色団２が相
関している。分子複合体が測定容積内に存在する１つの
同じ時間枠で励起される場合にのみ、両タイプの発色団
が検出され、これらのシグナルが両発色団を有する複合
体として認識される。
相互相関法を成功させるための重要な必要条件は： −ターゲット分子上の発色団１および２の距離は測定容
積の寸法に比べて十分小さく、その結果分子が測定容積
に侵入し、再び出ていく間に測定の誤差範囲で両色素が
同時に励起光で照射されなければならない（複合体内で
の距離＜0.1μｍ）。
−両色素に対して測定容積が同じ大きさとなり、互いに
結合している両色素は同じ時間枠内で励起光に照射され
なければならない。
−両測定容積は測定の誤差範囲内で同じ空間位置を占め
なければならない。
この問題を解くことは些細な問題ではない。例えば、１
つの問題は、良く知られているように異なる波長の光は
屈折率の違いから異なるサイズの像を結ぶことにある。
しかし、波長の異なる２つのレーザーが不均等な絞りに
より不均等な大きさの測定容積を照射したり、またはフ
ォトマル上での検出が異なる測定容積をカバーしていた
ならば測定にとって障害となる。
本発明ではこの問題を少なくとも２つの発光波長のい
わゆるストーク・シフトによって区別しうる強い重なっ
た励起スペルトルを有する２つの色素と１つの励起波長
を有する１つのレーザーを組み合わせて用いることで解
決している。それとは別に、同一の空間位置を有する容
積エレメントが２つの独立するレーザー光源で照射され
ることもある。簡便性のため、共焦点光学系は両方の場
合で色補正、即ち両発光波長に対して補正されて、両波
長に対して１つで同じ空間エレメントが測定されること
になる。
本発明では異なる波長の蛍光を結像するのに、同じス
ケールで異なる波長の光を結像しうる顕微鏡で馴染みの
深い結像光学系を使用している。しかし、また、本発明
の方法の性能にとっては、同様の大きさの測定容積、同
様の強度特性、および両波長で照射される同様の空間的
位置が重要である。本発明においてこの事は異なる強度
を有する２つの調整された固定光学系を使用し、結果的
に両波長が光線が同じ大きさおよび位置に予め絞られる
励起光学系側の装置、または固定的に調整された予め絞
るための光学系を第２光線経路の可変光線拡大素子と組
み合わせた装置を用いること、または両光線経路で予め
絞るための可変光線拡大素子を採用することにより達成
される。
簡便のためこの装置は２つの対物レンズが照射される
測定部分の２つの反対側に位置するコンパクトな二重顕
微鏡で実現される。入射光および測定部分の分子、分子
複合体、ベシクル（vesicles）または細胞から発せられ
る光線のための光学系は２つの顕微鏡の各「部分」の共
通するガイドまたは支持装置の両側に配置される。各入
射光はダイクロイック・ミラーで対物レンズの方に反射
される。帰ってくる光線はこれらのダイクロイック・ミ
ラーを透過しレンズ、共焦点素子およびフィルター等の
種々の光学素子を通過した後に検出器に到達する。
簡便のため、二色性（dichroic）ミラー上に差し込む
光線の光学軸は２つの対物レンズの移動方向に対して直
角に配している。重なった異なる波長の２つの光線は光
線経路中の最初のものが二色性ミラーである並んだ２つ
の鏡にぶつかる。２つの光線の内の１つはこの二色性ミ
ラーで反射するが、もう一つの光線はこの二色性ミラー
を直線的に透過し、第１光線とは反対の方向に後ろの鏡
で反射される。両光線の反射方向は対物レンズの移動方
向に平行である。さらに、両反射光は反射または二色性
ミラーで反射され、入射光の光学系を通過していく。二
重顕微鏡の光学素子のこのような配置は、測定部分に入
り、そこから進んでいく光線の光学系に沿った２つの対
物レンズはそれらに沿った光源を除去または移動するこ
となしに取り除くことが出来るという利点を有する。特
に、レーザー光源などの光源は二重顕微鏡から離して設
置する事が出来る。光源と２つの光線を重ねて、かつ供
給する二重顕微鏡の間の相対的位置を変える必要がな
い。
また、全４π固定角に渡る測定容積からの蛍光シグナ
ルをカバーする必要がある場合にこの装置を使用するこ
とができる。特に、この事は単一の分子の検出に於いて
全ての発光光子を検出することが重要である場合に起こ
る。この場合、上述した装置１は１つだけの励起波長だ
けが使用され、両方の検出素子は一緒になって全４π固
定角をカバーするように使用される。
第１図はリガンドＬに特異的な結合性を示すレセプタ
ーを有する細胞を用いた関連するエフェクター分子のレ
セプター検定法を示している。リガンドは本発明に従っ
て色素標識したものが提供されている。本発明におい
て、レセプターおよびリガンドのモル比および全濃度は
約50％のレセプターが結合し、約50％のレセプターが未
結合でいるように選択される。本発明に従った分析にお
いて、この事は遅い並進拡散分子から検出されるのと約
同数の発光シグナルが速い並進拡散分子から検出される
ことで見て取れる（右上の模式図；左のステップは遊離
リガンドに対応し、右のステップはレセプターに結合し
たリガンドに対応する）。
活性物質が添加されたとき、平衡の移動は特異的レセ
プター結合を有する活性物質候補の相互作用を示す。レ
セプター機能のアンタゴニスト活性化因子または阻害因
子の場合、標識リガンドの置換が観察される（シグナル
は遊離リガンドのみのシグナルに対応する）。同様のシ
グナルは、レセプターまたはリガンドとの活性物質のア
ロステリック相互作用が標識リガンドの結合を妨害する
場合に見られる。
同様に、活性物質はレセプターへのリガンドの結合を
促進し、結合したリガンドの測定値を増加する（右
下）。
また、この検定法は細胞が観察される特異的反応を妨
害しないレセプターをより多く有している場合にも行い
うる。
もし、レセプター認識反応が迅速に平衡に達しないな
らば、標識リガンドおよび活性物質をレセプターに対し
て同時に競争させうる利点がある。
第２図は同じ特異性および結合強度を有する天然のリ
ガンドを認識するが異なるシグナルを伝達する異なる細
胞上の異なるレセプターの使用について説明している。
活性物質はこれらのレセプターを選択的に活性化または
妨害することで興味深い。この事は天然の活性物質の変
異体と同様に構造的に関連しない活性物質でも行いう
る。
例えば、先ず各ターゲット・レセプターに対する検定
を別々に行う。第１図の脚注に示した規則を適用する。
基本的に、活性物質を効果的におよび特異的にレセプタ
ー結合の１つと相互作用することについて、従って種々
のレセプター機能の区別が可能であるかどうかを検定す
る（左下に可能な場合を示した）。同様の方向に作用す
る効果で、右下に示したような測定結果が見て取れる。
特異的実施例により、以下に詳しく示すように、本発
明のFCS検定法は抗体に依存する特異性に限定されず、
均一または固相検定における分子、細胞、組織系に対し
て等しく有用であり、熱力学的パラメータ（結合定数）
および速度パラメータ（速度定数）の測定が可能であ
り、生体系（細胞培養物、組織）の非破壊研究が可能で
あり、および溶液中で分析する場合に表面との非特異的
相互作用が妨害しない点で優れている。
5.細胞または天然または人工的ベシクル構造に存在する
未知のレセプターに対する既知の蛍光標識リガンドの結
合による医薬活性物質のスクリーニング 天然物と同様に化学的に合成された医薬活性物質は未
だ知られていない標的分子として存在する。これらの標
的分子には細胞外分子（例えばプロテアーゼ・インヒビ
ター）、表面積レセプター（例えばインシュリン）、可
溶性メディエーターレセプター（ステロイドホルモン・
レセプター）または細胞構造タンパク質または酵素とし
て存在する。
従って、本発明により既知の活性物質の医薬的に重要
な標的分子を発見し、特徴付け、場合によってはこれら
を単離する非常に重要な問題が解決される： −オルファン（orphan）・レセプターの探索 −医薬作用のメカニズムの解明 −活性物質類似体の探索 −望ましくは区別しうる生物学的標的における（種々の
細胞分化、腫瘍／非腫瘍、病原／非病原等）種々のレセ
プター分子の差異の探索。
医薬速度論 本発明にしたがって医薬速度論に関する研究もなしう
る： −特定の活性物質の投与後種々の時間間隔で新たに添加
される色素標識比較物質を用いた競争実験で組織試料ま
たは体液を分析しうる。
複合体の解離速度定数による活性物質の標的分子の区別 もし、過剰の色素標識活性物質をレセプターと活性物
質の種々の複合体混合物に添加したなら、活性物質の解
離分子は色素標識活性物質と置換するであろう。場合に
よってはこの実験は逆標識でも行いうる。例えば、典型
的な問題は異なるレセプターを検出する為の種々の細胞
系列の分析にある（例えば：腫瘍表面抗原、タンパク質
Ｐ結合型レセプターＩ、II、III）。一般に、多くの試
料を同時に分析する場合、第19図に示したような図がで
きる。本発明に従って、解離速度定数が小さい場合、固
定時間間隔であらゆる位置で反復して結合および解離活
性物質の比を測定する事により同時に、および／または
反復して長い期間に渡る実験で非常に多くの分析物を分
析しうる。第19図にこの結果を図示してある。
このように、例えば１つで同じ試料中、または解離速
度（kD）は非常に異なるが反応速度定数（kR）は同等で
ある種々の細胞型または分化段階を含む種々の試料中の
特異的標的分子と種々の熱力学的安定性の複合体を形成
する種々のレセプターまたは抗原決定基を検定しうる。
従って所謂オルファン試薬またはオルファンレセプター
または多機能分子群のメンバーに関する生物学的構造も
機能検定法で検出しうる。
実際に取り扱う上での利点は均一溶液での作業が、nM
レンジのルーチン分析において実際には無視できる程の
（秒または分のレンジ）短いインキュベーション時間に
由来しており、かつ激しい洗浄ステップまたは二次イン
キュベーションの必要もない。
試料キャリヤーとしては本発明にしたがって対物レン
ズに液体試料を接触することなく、従って汚染されるこ
となく近づけうるシート状キャリヤーを使用することが
望ましい（第３図）。
第３図は例えば特許出願PCT/ET 89/01320、PCT/ET 89
/01387、PCT/DE 91/00082、PCT/DE 91/00081、PCT/DE 9
1/00083、PCT/DE 91/00704に説明され、使用されている
様なウェルを有するキャリヤーシートの使用が示されて
いる。マルチ・ウェル・シートと呼ばれるこの反応キャ
リヤーは本発明のFCS分析のための試料を受容しうるウ
ェルを有している。これらは二次元的に移動可能なシー
ト挿入装置で制御され、試料を含むウェルの底が対物レ
ンズに接近し、その結果液体試料部分は対物レンズから
約100−1000μｍよりも離れることはない。シートと対
物レンズの間の媒体は水が望ましく、これには対物レン
ズの補正が関係している（上述参照）。そのシートはレ
ーザー励起光および発光の両方に関して光学的に透明で
化学的に不活性である。シートはカバーシートでシール
されていることが望ましい。市場に出回っている自動ピ
ペットシステムが使用できる点で、市販のマイクロプレ
ートシステムまたはオカサキフォーマットに対応するウ
ェル間距離を有するシートが望ましい。さらに、反応キ
ャリヤーとしてのシートは汚染が低く、簡単に廃棄で
き、かつシール状態でコンパクトに納めうるものであ
る。
6.イオン性分子の分析 「電気的トラップ」を採用することにより本発明の方
法の測定領域内で荷電分子（カチオンおよびアニオン）
を特異的に分析しうる。この事は、例えば機械的誘導流
による誘導の有無に係わらず特定のイオン性分子を観測
部分に電場で濃縮するか、または単一の分子を測定領域
に直接輸送してくるような、測定領域に分子流を誘導す
る事により行いうる。このことは静電場、例えば約1V/1
μｍの範囲の電場強度を有する２つのキャピラリーの末
端間で行いうる。本発明に従って、１つ以上のトラップ
分子が観測部分に入るやいなや観測領域内の電場内で該
分子を振動させることもできる（以下参照）。
本発明の装置の技術的な説明 7.光学系 本発明の方法は技術的には焦点の結像特性に関して高
い性能を有する顕微鏡光学系を用いて行いうる。特に、
励起光の発生前のレンズ系は色的にも構造的にも補正し
たものでなければならない。高い開口数1.2N.A.以上を
有するドイツ、オーベルコッケン、ツァイス社のNeoflu
arシステムが望ましく、カバーグラスまたは分離コート
無しでも使用しうる。作用距離は0.17−0.9mmである。
対物レンズは水に対して補正してあり、最高作用距離で
最高の開口数を提供する。油浸対物レンズは適していな
い。本発明に従い、光量は顕微鏡対物レンズの後ろにあ
る対物板にある共焦点ピンホール開口で制限される。
8.レーザー光源 ＞200−1000nmの波長のレーザー光源として、特にア
ルゴン、クリプトン、ヘリウム−ネオン、ヘリウム−カ
ドミウム並びに可変ダイオード・レーザー（赤から赤外
線）など周波数ダブリングの可能性を有する連続レーザ
ーを使用するのが望ましい。本発明に従って≧10MHzの
高周波数パルスレーザーも使用しうる。
9.レーザー強度 0.5mWのレーザー強度で観察容積内の色素分子の数パ
ーセントを励起するのに十分である。5mWのレーザー強
度では励起分子の割合は50％となる。さらにそれ以上レ
ーザー強度を上げるのは光効率から見て適当ではない。
10.化学発光団 結合するのに適した化学発光団または蛍光色素には、
蛍光分光学的検出法において長時間使用しうるような多
くの基本的色素構造物並びにそれらの色素のオリゴマー
がある。色素としては標的分子との特異的な妨害相互作
用に寄与せず、またはP 42 34 086.1（ヘンコ（Henco）
等）に提唱されているように、核酸二本鎖にインターカ
レートしうるような特異的結合性を利用して特異的に使
用しうる色素が望ましい。
使用する色素は量子収率0.1−１で吸光係数が約30,00
0から100,000のものが望ましい。
例えば疎水相互作用を防ぐように親水性残基を多く含
むクマリン類またはローダミンＢ誘導体由来の色素、ま
たは二本鎖中にインターカレートしうるチアゾール・オ
レンジ基本構造に基づく色素が適していることが分かっ
た。
本発明の測定法に関して、光消光（光安定性）に対す
る色素の耐性は重要なことである。しかし、先に述べた
ように、本発明に従って非常に小さい容積が使用される
場合、測定時間は約1000倍大きい領域を測定する場合に
比べて数桁短くなることから、測定性能に関して傑出し
た重要性を有するとは言えない。
11.三重項状態の意義 本発明では、色素は三重項状態を生成しないほうが望
ましい。
色素を選択する場合、三重項状態を生成しにくい色素
を選択することが重要である。三重項状態は化学反応の
確率を増加し、シグナルを提供しないか、または不都合
な波長のシグナルを提供し、かつ、分子が再び励起され
る状態の一重項状態に戻るまでの時間を長くする。
もし、標識するのに色素多量体、特に特定のクマリン
誘導体のような親水性色素に基づく色素を使用するな
ら、測定時間を有意に短くする事ができる。各測定容積
の数が多くなれば、少ない分子の測定領域の通過で十分
な測定精度を得なければならないことになる。
12.測定部分 第４図にみられるように、測定部分はレーザー絞り光
学系の対物レンズから100−1000μｍまで接近していな
ければならない。最も単純な場合、この事は対物レンズ
自体へ垂らし、分析する分子を含む液滴で行われる。こ
のような測定システムは種々の試料間の汚染の可能性が
高くなることから分析物が少ないときに限られる。カバ
ーガラスおよび油浸を用いる従来の顕微鏡に相当する技
術も使用しうる。本発明の方法は光学系から水性試料を
離すのに水浸および非常に薄いガラスまたはプラスチッ
クシートを使用している。このシートは同時に平たいキ
ャリヤーまたはキャピラリーの形で測定部分の下をシー
ルするのに役立っている。
多くの生体高分子の進化的至適化の実験で起こるよう
な大量の試料をスクリーニングする目的では試料に向い
た側を化学的に修飾したメンブレンも使用される。望ま
しい修飾とは例えば核酸を固定ためのイオン交換性など
の特異的結合性、および／または抗体コーティングおよ
びキレート試薬特にNTA（ニトリロ三酢酸）またはIDA
（イミノ二酢酸）によるコーティングなどのタンパク質
に関する特異的結合性を有し、標的構造に対する相互作
用でこれらを分析するために高い結合定数（kass≧1
010）で金属キレートを介して表面に結合しうる（His）
６などの結合オリゴペプチドを含むペプチドまたは組み
換えタンパク質を選択的に固定するための表面構造であ
る。
13.分子トラップ 小容積エレメント内の単一分子の検出の可能性には、
本発明に従い後に示される電場を用いた分子トラップの
使用がある。この種の分析は荷電分子などの電場と相互
作用する分子に対してのみ使用しうる。
14.検出 測定シグナルの検出はなだれ（avalanche）・ダイオ
ード検出器の使用が望ましい単一フォトン計数器を含む
蛍光顕微鏡の光学系で行うことが望ましい。例えば、EG
＆ G社のSPC−100およびSPC−200を使用することが適
当であることが分かった。シグナル分析はデジタル・コ
リレーターまたはマルチチャンネルカウンターMCSを用
いて行う。
方法および応用 15.分子の特性 相関法は直接３個の分子的特性：数（Ｎ）、並進拡散
定数Dtおよび回転拡散定数Drを明らかにする。後者の２
つは分子の大きさと形（例えば半径、形および容積）の
関数であり、例えば酵素的切断または他のリガンドとの
複合体の形成による分子の変化に関する情報を提供す
る。拡散に相関する拡散時間の測定も本発明に従って迅
速かつ高感度に実施されるので、分子サイズの分析およ
び溶液中の分子集団の分布の分析はクロマトグラフィー
による分離なしに本方法で行いうる。
16.結合定数の測定 R.リグラー（Rigler）が示したように、互いに反応す
る分子の相関関数の分析により、その相互作用が分子数
Ｎおよび特徴的拡散時間の重み付け因子を測定すること
で決定しうる。特異的反応の場合は常にそうなるが、反
応速度定数の値が拡散時間よりも小さい場合、相関関数
は重み付けした拡散時間の総計で与えられる： Ｇ（ｔ）＝１＋1/N（Ｘ（１＋t/τｘ）-1＋ｙ（１＋t/τｙ）-1） ここでｘ、ｙおよびτｘ、τｙは分子ＸおよびＹの割合
および拡散時間である。τ＝ω2D。ωは試料容積の半径
であり、Ｄは拡散定数である。
反応速度定数が拡散時間よりも大きい場合、相関関数は Ｇ（Ｔ）＝１＋1/N（１＋４＜Ｄ＞t/ω２）-1 ここで＜Ｄ＞＝xDx＋yDy。
もし、DxおよびDyが異なり、レセプターとしての大き
い分子（タンパク質、核酸、抗体）に対する小さいリガ
ンドの結合は通常所謂不均一検定法で行われる分子分離
過程無しに簡単に行いうる。また、相当する関係も回転
拡散係数又は回転拡散時間も誘導しうる。高い測定感度
はラジオイムノアッセイ技術（RIA）として知られてい
るラジオアイソトープ法の感度を越える。これらは高い
比活性で標識したときのみ同様の効果を示す。本発明に
従って遂行したときは、分子分離過程および煩雑な校正
を省くことができる。従って相関法は今日使用されてい
るラジオイムノアッセイの代替物となりうる。以上に示
した技術に従い、均一相または不均一相（固相に結合し
て）において測定すべき抗体と拮抗させて抗体への結合
を分析する蛍光標識抗原を放射能標識した抗原試薬の代
わりに使用することができる。本発明の方法の利点の１
つは測定法の感度を同時に増加できる一方で望ましくな
い放射能を排除しうることに基づく。
17.酵素反応の生成物 酵素触媒が分子構造および分子量を変化させる場合、
反応生成物の形成は分子数および拡散時間の変化をもた
らしうる。典型的な例には核酸の複製および切断、タン
パク質およびペプチドの切断があるが、触媒抗体の選択
も挙げられる。
18.メンブレンおよび細胞における分子動力学 FCS法を用いた粘性環境下での大きな分子の回転拡散
を測定できるということは細胞表面ばかりでなく、細胞
内部での特異的レセプターの動力学の解析にとって特に
重要である。同時に、標識したリガンドの結合はレセプ
ターなどの細胞構造物のところでの回転拡散および並進
拡散を測定することで決定しうる。例としてはニューロ
トランスミッターや成長ホルモンなどの組織因子ばかり
ではなくCa+2等のカチオンリガンドも挙げられる。
また、本発明の方法は揺らがないか、または非常にゆ
っくりと揺らぐ分子に対しても使用しうる。このこと
は、例えば非常に粘性の高い媒体中、ゲルマトリクスま
たは組織中、固相を使用して、または非常に大きな分子
複合体または細胞を用いて測定する場合に対応する。
意外なことに、質量が大きいにも係わらず細胞でさえ
水性懸濁液中で測定しうる。ブラウン運動および攪拌
は、例えば測定容積内にそのレセプターを有するメンブ
レンを導入し、かつ色素標識の消光現象を介在すること
なしに再びそこから出ていくのに十分な効果を有してい
る。図式で示した第５図は、本発明にしたがったほぼ定
常状態の分子測定を示している。例えば、長方形で示さ
れているように、それらは固定化細胞上のメンブレン・
レセプターとして存在しうる。座標軸は本発明に従った
定常状態の測定容積の強制的相対運動による非揺らぎ分
子の分析を示している。これはレーザーの座標、測定容
積の座標、または試料の座標の相対的変化、またはこれ
らを組み合わせることにより行いうる。
揺らぎが強く制限されるか、または色素標識が定常的
に結合している場合、本発明では測定容積に対する揺ら
ぎを強制しなければならない。この事は試料容積および
そこに含まれる測定容積の強制運動（例えば振動、流
れ）および／または試料内の測定容積の位置座標の連続
的または非連続的変化によって行う。この事は焦点を変
えること、および／または照射される容積エレメントの
位置を変化することにより行うことが望ましい。固定化
標識分子の場合、このように強制された測定容積の位置
座標に対する相対運動は、結合色素の「見かけの」並進
拡散を決定する。非固定化分子に結合する色素分子を区
別するために、強制相対運動は非固定化分子の運動より
もゆっくりしていなければならない。
本発明で示した操作はゆっくり拡散する複合体の並進
拡散の時間が分析には関係せず、むしろそれに結合した
色素標識の絶対数または相対数が重要である場合に可能
となる。このことは、例えば細胞培養物または組織のレ
セプター結合定数を測定する場合に相当する。
本発明の方法で特に利点を示すのは分子および／また
は細胞運動の測定である。このような測定は技術的、生
物学的および医学的に興味深く、また、まだ広まってい
ないような特殊な技術を使用することによってのみ可能
となる。本発明に従った実施例を以下に示す：受精能力
測定に関する精子の運動の測定、マクロファージの運
動、収縮要素の活性、天然または人工膜中の膜タンパク
質の運動、活性または能動輸送分子の運動。このことは
細胞、分子複合体または問題の分子を標識抗体または抗
体誘導体などの特異的色素標識リガンドで標識するこ
と、または色素標識で直接標識することによって行うこ
とが望ましい。
本発明の１つの重要な利点は、とりわけ細胞または天
然または人工ベシクル構造体上に存在する既知のレセプ
ターへの既知の蛍光標識リガンドの結合による活性物質
の薬学的スクリーニングの可能性にある。現在、レセプ
ター結合活性物質の探索における研究の望ましい方向に
は、第１にプロテイン・キナーゼ・レセプター群などの
特定のレセプターのクローニングおよびそれらを個々に
発現する事が含まれる。ついでこれらの標的構造を例え
ばELISAプレート等に個々に固定化し、ELISA検定法を用
いて分析する。これを行うためにはかなりの量の研究能
力および人員が必要とされ、かつ、クローニングされ、
個々に発現されたレセプターがその機能または特異性を
変化または喪失する危険が伴う。
第１図および第２図に見られるように、本発明ではレ
セプターのクローニングを完全に省くことができる。レ
セプターは特異的リガンド相互作用に関する相互の結合
定数の範囲内の濃度で使用しなければならないので、細
胞または天然またはクローニングした細胞の断片を使用
することができる。また、このことは高い反応物濃度で
起こりうる他のリガンドまたはレセプターとの非特異的
相互作用の危険を抑制しうる。従って、他のレセプター
の存在はこの検定を妨害しない。
単一の標識リガンドを使用する検定で種々の細胞／細
胞系列を使用する場合、レセプターの機能的挙動の差も
結合リガンドの変異体との競争を通して区別しうる。異
なる組織における１つで同じエフェクターに関して区別
されたレセプター機能は稀に起こる調節メカニズム（例
えば,TNF、キニン）ではないように考えられる（第２図
参照）。この効果は１つのレセプター型を認識する選択
的リガンド変異体を使用することにより薬学的に用いる
ことができる。
第26−28図は、 （ｉ）細胞外膜のレセプターとの会合に関する蛍光標識
したリガンドの挙動の測定、 （ii）結合および遊離リガンドの区別、および／または （iii）細胞質ゾル中を通過する場合のリガンド運動の
測定、 に関する本発明に従ったFCS法の応用を示している。
また、（ｉ）乃至（iii）のテーマは、とりわけ標識分
子種の運動の三次元的イメージ化を行いうるダイナミッ
ク・レーザー・スキャンニング顕微鏡法において本発明
を応用する例となる。得られる特定の分子濃度の分布か
ら、この分子の局在化に関する結論が引き出される。ま
た、この方法は例えば区画化された標的分子との会合
（例えばウイルス核酸とのセンス／アンチセンス相互作
用）等の各細胞または組織区画中の分子状態の評価を可
能にする。
（ｉ）乃至（iii）はラット由来の細胞結合レセプター
（EGFレセプター）とヒトの上皮成長因子（EGF）で例示
される。EGFレセプターを有する細胞は各腫瘍組織に由
来するラット膀胱細胞NBD2である。この細胞をPBS（リ
ン酸緩衝液）中シャーレ上に表面固定化する。これらを
集密化単層に到達するまで標準培地で増殖させる。培地
にはテトラメチルローダミンで標識したEGFが含まれて
いる。励起用には500nmのアルゴンレーザー（0.5mW）が
選ばれた。遊離のEGF因子の回転拡散定数（τDfree）は
0.145msである。その濃度は6nMであった。第26a図は遊
離EGFの自己相関関数を示している。
細胞単層との30分間のインキュベーションの後、測定
容積が細胞外膜を含む場合第26b図に見られる自己相関
関数が見られた（第５図参照）。測定で検出されたリガ
ンドの88％は関連する拡散時間τDcomplex＝14.54msを
持つレセプター結合複合体中に存在する。この時間は細
胞膜中のレセプターの拡散に関係する量である。拡散時
間τDfree＝0.145msにはリガンドの12％が含まれてい
る。１つの空間要素中には約１つのEGFレセプターが存
在する。関連する膜表面は0.5×10-8cm2である。30分間
の洗浄後、第26c図に示される自己相関関数が見られ、
そこから以下のことが見て取れる：測定容積当たり約0.
5個のEGFレセプターが高い親和性で結合しているリガン
ドを保持している。
もし、FCS測定容積が少なくとも大部分が細胞の細胞
質ゾル内に有るなら、第27図が得られる（細胞質ゾル中
のEGF）。進入したEGFの38％は移動中に妨害を受け（レ
セプターへの結合または粘性の高い媒体の影響による）
（拡散時間τ＝3.3ms）、またはEGFの62％が遊離因子と
同様の移動度を有している。
第28a図はM13/pUC（−21）プライマー（5'−TGACCGGC
AGCAAAATGT−3'）の配列を有するDNAオリゴヌクレオチ
ドと対応する相補的配列を含むバクテリオファージM13
のウイルス一本鎖DNAとの相互作用を示している。この
オリゴヌクレオチドは5'−C6位置にボディパイ（モレキ
ュラー・プローブ社）で標識してある。会合反応の時間
経過は40℃の溶液中、本発明に従って測定された。この
溶液には10nMトリス緩衝液（pH7.5）および0.18M塩化ナ
トリウム中の50nMのオリゴヌクレオチドおよび50nMのM1
3mp18（＋）DNAが含まれている。連続的自己相関関数の
変化は会合の速度論を明らかにする。自己相関は、０、
0.5、１、２、４、８、16、32、64、128、192および256
分後に測定した。遊離プライマーの拡散時間は0.17msで
あり、複合体形成後には2.9msであった。第29図は会合
した複合体中のプライマーの割合を実験的に明らかにす
る会合経過を示している。再会合速度は0.07min-1であ
る。
第28b図は標識したプライマーDNAの自己相関の例であ
る。第28c図は遊離およびM13 DNA結合プライマーの混合
物の自己相関関数を示している。
測定領域の細胞は、インサイチュウ（in situ）およ
び基本的に非破壊的に分析できる。特にこの事は薬学速
度論的研究に関連する。
19.反応速度パラメータ 秒の単位の拡散時間を測定できることは、高い会合定
数の２分子の速度論的相互作用の解析および再結合およ
び解離速度定数の測定を可能にする。この事は抗原／抗
体、リガンド／レセプターおよび同様の相互作用などの
高い生物学的特異性を有する相互作用の特性に対して特
に興味深い。10-6s-1迄の定数を有する特に遅い過程の
解析は本発明に本質的な自己校正の利点により簡単に行
われる（第19図）。
20.単一分子の検出 高感度の本測定法により少なくとも１つの検出レーザ
ー光を通過する単一の分子が観測される。≦１μｍの出
口を有する特別なガラスピペットの形をしたいわゆる
「分子ロート」を用いることにより、単一の分子を直径
１−５μｍのレーザー光中に流れにより導入しうる。電
場の作用により、ブラウン運動が制限され、各分子はレ
ーザー光の最高強度の部位に通される。反対側の検出器
および液浸光学系を伴う光学ユニットの配置が良好な光
子流並びに全ての空間方向に発せられる発光の検出精度
および効率を保証する（第６図）。例えば、この配置は
エクソヌクレアーゼ的分解による単一のDNAまたはRNA分
子の配列分析（J.H.ジェット（Jett）等、US 4,962,03
7）ばかりでなく、標識および荷電を提供された単一分
子の検出にも有用である。
21.定常または振動場における電気的分子トラップを用
いた単一分子の検出 また、イオン化した単一分子を電場内の強制並進によ
り観察域に導入しうる。別に、測定容積内で単一または
反復並進を強制することもできる。これは第６図に図示
した配置で行うことが望ましい。分子流は中央に観察域
が存在する大きな試料容積を通過する。定常的または振
動的な電場により観察域内を荷電分子を移動させること
ができる。このようにして分子を表面的に絞ることがで
きる。この「分子フォーカシング」は定量的に検出すべ
き分子が全測定容積内に１つまたは数分子しか存在しな
い場合に重要となる。
これを行うために、試料はB.サクマン（Sakmann）お
よびE.ネハー（Neher）が示したように２つのマイクロ
キャピラリーの出口の間にマイクロドロップとして固定
するのが望ましい。このキャピラリーはキャピラリーの
出口で水性バッファシステムと接触するように導電性の
金属層で、望ましくはクロムで下塗りした上に金で蒸気
コートすることが望ましい。測定エレメントは試料液滴
内にあり、顕微鏡の対物レンズは液滴と直接接している
か、または液滴がシートで対物レンズから離されてい
る。
一度、キャピラリーの末端を離れた後、単一分子また
は分子複合体が検出されれば、速度論的データが得られ
る。小さい容積中での場または温度ジャンプを技術的に
実現するのは難しいことではない。もし、反応複合体が
ウェン（Wien）効果を示すかまたは十分高い反応エンタ
ルピーを有するなら、これらのパラメータは、例えば反
応速度定数を測定するための緩和法に使用することがで
きる。
測定容積内での核酸などの荷電分子のキャリヤー・フ
リーな電気的濃縮を伴う単一分子の検出の原理は、非常
に希薄な溶液中の単一分子の分析に非常に重要である。
特に以下に示す２つの特徴が重要である：本発明に従う
10−1000μもの大量の試料容積から10-9μの測定領
域への１つまたは数分子の能動輸送は1010から1012倍の
濃縮を意味する（第20図、第21図）。
1ml当たり１つの分子とは約10-21Mの濃度に相当す
る。先に述べた濃度は測定領域中で最終濃度10-9Mとな
る。DNA分析のセクションで示したように、同時に濃縮
される色素標識プローブとのハイブリダイゼーションを
速い反応速度で行うことができる。
このことは診断において傑出した進歩を意味する。こ
のように、これまで実現できなかった感度の診断が、特
に酵素依存の増幅操作やそれに伴う増幅産物による汚染
の危険などの問題を避けて行うことができる。このこと
は細菌およびウイルス診断において特に重要である。
もし、ウイルスまたは細菌が希薄溶液中に存在し、こ
れも負に荷電している過剰の共存核酸で汚染していない
ならば、分析は汚染核酸の予備的分離無しに行いうる。
このことは、例えば非常に少量の生物物質を遺伝的に分
析する法廷化学分析の場合にあたる。臨床分析では精
液、尿または血漿などの体液の無細胞上清に関する分析
となる。
大量の共存核酸は濃縮過程およびハイブリダイゼーシ
ョンを妨害する。しかし、核酸は特異的ハイブリダイゼ
ーション法などにより予め濃縮する事ができる。この事
を行うためには特定の核酸を大容量の試料から、例えば
望ましくはプローブと相同的でない逆鎖プローブを結合
したモル過剰量の固相を添加することにより抽出し共存
する汚染核酸から分離する。続いて核酸を溶出し、本発
明に従って測定容積内でこれらを濃縮する。
基本的にその他の分子も本発明の電気的トラップによ
り測定領域内で濃縮しうる。核酸の場合の様な分子の本
質的性質としての荷電、または培地条件による荷電、ま
たは特定のリガンドとの反応による荷電のいずれかのタ
ーゲット分子の荷電性が必要となる。
本発明の望ましい操作において核酸以外の検出反応に
おける標識リガンドまたは特異的色素標識がプローブを
解析でき、テスト分子は特異的複合体形成が既に起こっ
た後にのみ電場による測定領域への輸送が起こる。本発
明に従い、この事は荷電していないか、またはターゲッ
ト分子およびレセプター・ターゲット複合体および測定
領域で濃縮されるリガンドと異なる荷電を有する場合で
さえ非複合体化プローブで行うことができる。
第30図は双極子トラップ中の荷電分子の動きを示して
いる。レーザー照射容積エレメント内の水中の負に荷電
したローダミン標識したdUTP分子の濃度および振動の変
化を電場強度10kV/cmおよび周波数4Hzの振動電場で示さ
れている。観察の光学軸は電場勾配に対して直角である
（第６図参照）。測定領域内の分子を濃縮する効果は明
白である。この濃縮効果は電場が解消され、分子が拡散
で観察領域から離れるときに解除される。第６図に示し
たマイクロキャピラリーを逆にすることでも同様の結果
が得られる。
第31図は水中の単一のローダミン6G分子の光子シャワ
ーを示している。光子シャワーとは分子がガウス分布測
定領域内に存在する間に受ける検出される光子の総量を
意味する。従って、単一の発色団を有する単一分子の信
頼しうる検出の可能性が証明された。第31a図:2.5×10
-11M;第31b図:4×10-10M。チャンネル時間は拡散時間と
同じ４×10-5secならびにガウス分布測定領域0.24flで
あった。
22.PNA（タンパク質様核酸） 本発明に従う特に適当な分子とは、荷電していない
か、またはそのリン酸バックボーンの荷電と反対の荷電
を通して複合体の静電的安定化に寄与していることから
核酸に結合する挙動が特にしっかりしている分子であ
る。ハイブリダイズしうる分子が必ずしも核酸の化学的
特徴を有している必要はない。いわゆるPNA分子が特に
本発明に有利に利用しうることが示されてきた。
比較的長鎖の核酸ターゲットの場合、このことは電荷
および電気泳動の分離挙動を決定し、例えばプローブ分
子の反対電荷を過剰解消してしまう過剰負電荷のターゲ
ット分子によって成し遂げられる。このように複合体化
したターゲット分子をハイブリダイゼーションの完結後
測定領域内で選択的に濃縮しうるが、過剰の標識プロー
ブ分子は測定領域から除去される。
また、例えば、本発明の方法は酵素的核酸増幅操作無
しに、血清約100μ−10ml（10-20〜10-22Mに相当す
る）中の単一ウイルス粒子の直接検出を可能にする。
実施例として血清試料中の核酸による検出では、以下の
必要事項が満足されなければならない： −上述した量の血清にはハイブリダイゼーションしうる
核酸（DNAまたはRNA）を含む単一のウイルスが含まれな
ければならない。
−その溶液には蛍光標識したテスト試薬として本発明の
特異的核酸プローブを含まなくてはならない。プローブ
の長さは、血清中には高モル過剰量のRNA分子が存在す
ることからターゲット配列に対して高い特異性が保証さ
れるように選択されなければならない。
−プローブの長さを選択する場合、相補的RNAまたはDNA
に対する結合の安定性を考慮しなければならない。可能
なら解離速度は10-5sec-1以下であるべきである。この
ことは遊離のプローブ分子が除去され、即ち推定濃度10
-20Mでの平衡が解離分子側に完全に偏った場合でさえも
１日はハイブリッドが安定に保持されることを意味す
る。本発明に従うと、このことは後に電気泳動で遊離プ
ローブが望ましくは10-20Mに希釈される場合に起こる。
−ハイブリダイズしたとき、プローブは会合およびハイ
ブリダイゼーションが秒から分の範囲で起こるような高
い濃度で存在しなければならない。本発明の場合、以下
に議論する物質が会合を促進するためにハイブリダイゼ
ーション媒体が添加されるならば低い濃度でも使用しう
る。
−プローブは少なくとも本発明に従う１つ、望ましくは
それ以上の蛍光色素に化学的に結合される。遊離のプロ
ーブの電気泳動移動度は複合体を形成したプローブの移
動度とは異なる。この事は単にサイズの差または構造の
差または本発明に従って修飾した中性または陽性に荷電
したプローブ誘導体を使用する事で行いうる。
本発明の分析は望ましい態様で示す特定の電気泳動ユ
ニットと組み合わせた本発明で請求している装置で行わ
れる。
それにはキャピラリーの出口（直径約10-3mm）を有す
る電気泳動セルが含まれ、本発明に従う単分子蛍光装置
（FCS）と組み合わされる。
第12図は電気泳動セルの望ましい態様を模式図で示し
てある。それには（１）分析する試料および／または洗
浄溶液の添加／収集を目的とした少なくとも１つの出
口；（２）壁電極；（３）リング電極；（４）ネハー・
キャピラリー；（５）電極としての金メッキチップ；
（６）液滴出口；（７）レーザー光線が含まれる。
電気泳動セルはプライマー溶液が出来るかぎり正確な
量で添加される測定試料で満たされている。壁電極とリ
ング電極の間の電圧は例えば分の範囲内でリング電極中
のプローブおよびハイブリッドの濃縮が起こる時間に渡
って供給される。その後、壁電極とキャピラリー・チッ
プの間に高電圧がかけられることが望ましい。この時点
から遊離プローブおよびハイブリッドの分離は電気泳動
で出来るかぎり適正に行えるようにキャピラリーの長さ
が選ばれる。遊離プローブはハイブリッドが測定にかか
る時間とは明らかに異なる時間に電極の出口に出現する
ので、この時点で未結合のプライマーの濃度は十分に希
釈されている。この溶液は液滴として出てくることが望
ましく、その結果逆拡散が起こりえなくなる。もし可能
なら２つの時間:Ts、遊離プローブが出現してからの時
間、およびTz、ハイブリッドが出現してからの時間は固
定しておく。ハイブリッドは所定の時間にマイクロドロ
ップとして出現し単一の分子蛍光として検出しうる。ま
た、キャピラリーから出口までの光学的測定もできる。
もし、遊離プローブからのシグナルが大きく揺らいで
いるなら、単一分子の測定は困難である。1ml当たり１
個の分子は10-20から10-22Mに相当する。しかし反応時
間のために、会合のためのプローブ濃度は約10-10Mでな
ければならない。この場合、本発明の電気泳動との組み
合わせが未分離の混合物の種々の測定よりもシャープな
分離を可能にする。さらに、生成されるハイブリッドは
正確に計算できる時間に、≦10-12の容積内に出現
し、これは本発明の方法で検出可能である。適当な蛍光
標識を選択する事で蛍光を至適化する事ができる。
23.分子トラップとの組み合わせが有る場合、又は無い
場合に単一分子ソーティング法に関して目的の標識複合
体を大量に選択するための装置。
分子、分子複合体、ウイルスまたは細胞が目的分子と
してFCSで認識される場合、直接的大量濃縮できる可能
性がある。これは、電気泳動により各分子が測定直後の
限定された時間、限定された場所に存在し、そこで電気
泳動的に分離しうることが前提となる。
電場での移動度の測定、キャピラリー電気泳動での実時
間測定、相関の実時間測定、シーケンシング 例えば、キャピラリー電気泳動法を用いた電場での分
子、または分子複合体の移動度の測定により、その分子
の性質に関する情報が得られる。従って、例えば蛍光標
識を用いたエドマン分解産物としてのタンパク質または
ペプチドのアミノ酸はこの電気泳動の移動度により測定
しうる。近年、ペプチドおよびタンパク質の配列分析は
非常に重要になってきた。現在市販されている気相分析
器における分析量のタンパク質の使用は重要な進歩であ
る。このようにして、二次元ゲル（オファーレル・ゲ
ル）の単一スポット由来のタンパク質はシーケンシング
しうる。
この方法の効率は引き続き行われるキャピラリー電気
泳動の評価における分解産物の分析的測定の感度が増加
できれば、さらに向上することができる。従来の検出法
と比較して、実時間測定（実時間相関）と組み合わせた
FCSによるピーク測定で驚くべき感度の高さが達成でき
る。このように、キャピラリー電気泳動で得られる分析
量のペプチドおよびタンパク質で配列決定するのに十分
である。当初の量として、単一細胞はそこに含まれてい
るタンパク質の配列を分析するのに十分な量である。一
方、この方法の感度は測定すべき2Dゲル電気泳動で分離
したタンパク質、ペプチドまたは分解産物の実質的に長
い配列の構造に対しても有効である。
PCRなどの酵素依存の増幅反応ではかなりの付加的ス
テップ無しにはこのような感度は達成しえない。高い増
幅を受けた生産物による汚染に関する酵素依存の増幅に
関する問題は本発明の方法では発生しない。
電気泳動法と組み合わせた本発明の方法は、核酸への
応用に限定されない。タンパク質およびタンパク質の複
合体または低分子化学リガンドも荷電キャリヤーが提供
され、本発明の分析が可能となる。例えば、負または正
に荷電したポリペプチドはそれらを非変性の条件で電気
泳動にかけるため組み換え法で調製した抗体に結合しう
る。例えば、ウイルス当たりに大量に生成されるか、血
清中に単独で分泌される表面タンパク質の抗原分析が可
能な場合、低いウイルス濃度でも検出が可能である。
単一分子を検出するための電気的トラップの変化には
双極子の代わりに四極子を組み込むことがあげられる。
四極子面の振動場を適用することにより、適当な電場強
度での荷電分子の四極子領域からの熱的拡散を防ぐこと
ができる。もし、本発明に従って更に２つの電極を四極
子の上下に配置すれば（六極子）、適当な電圧を外の六
極子電極と四極子の平均電圧の間にかけた後に荷電分子
は四極子の振動場に動き、そこで濃縮される。
六極子電極は２つの顕微鏡対物レンズの金属被覆ガラ
ス表面で形成しうる。もし、単一分子が約40μの六極
子容積内に存在するなら、これは４×10-20Mの濃度に相
当する。六極子電極と四極子面の間（距離約1mm）に100
Vの電圧をかけると、核酸分子は約１秒以内に四極子面
に移動する。四極子面に捕まった分子は約6flの容積内
に存在し、これは約2.5×10-10Mの濃度に相当し、濃度
は6.4×109濃縮したことになる。その存在は分子数（Ｎ
＝１）およびこの分子に特徴的に拡散時間を測定するこ
とにより証明される。
四極子および／または六極子に実際にかけられる電圧
および電位差は分析溶液のイオン強度に依存する。
種々の要素が四極子面の異なる空間位置を示す、位置
感受性検出器を使用する場合（なだれ型フォトダイオー
ド検出器）、検出器と四極子の電極間のフィードバック
配置により、電場勾配は分子が常に四極子内の固定した
位置に留まるように調整される。この位置は各検出器に
よって規定される。
24.電気的トラップ 簡便のため、上述の「電気的トラップ」は測定部分を
通る共通軸上に有る２つの正（負）に荷電した極（電
極）の間の中央に測定部分を配置することより実現され
る。この軸と直角の面に、少なくとも２つ、望ましくは
４つの電極があり、その間に振動電場が生成される。電
極はそれらが、もしくはそのペアが互いに向き合うよう
に配置される。これらの電極に回転振動電場をかけ、そ
の中に正（負）に荷電した分子を置く。振動電場に垂直
な２つの電極の荷電のために分子はこの振動電場からの
動きを制限される。先に紹介し、後により詳しく説明す
る二重顕微鏡を使用する場合、電極は２つの相対する対
物レンズのサポートとなることが望ましく、その共通の
焦点中に測定部分が設定される。
ルーチン分析に「電気的トラップ」を使用する時、タ
ーゲット分子複合体は観察するために比較的大容積の試
料から（10−100μ）非常に小容積の測定領域にもっ
てくることが重要である。これを行うために、簡便性の
ため本発明では荷電ターゲット分子は大きなポテンシャ
ル勾配を越えてゼロポテンシャルの容積エレメントに運
ばれ、その内外では例えば固定および／または測定領域
の運動制御のため、例えば四極子等の多極電場で制御さ
れる。このことは試料を受け取る数ミリメートルまたは
数センチメートルの長さのキャピラリーで行われること
が望ましく（第20図、第21図）、その一端には例えば＋
100（または−100）Ｖの電圧がかけられ、もう一端は0V
にアースされている。アースされている電極はピンホー
ルを有し、その後ろには例えば低電圧の四極子振動電場
がかけられている（第20図参照）。電気泳動移動度μ＝
ca.10-4から10-6cm2/Vsに従い、ターゲット分子はピン
ホールに迅速に移動し、幾何学的に隣接する四極子電場
へと動きつづける。もしキャピラリー電気泳動で見られ
るような電気的移動に関して電気浸透効果が重なること
が望まれるなら、キャピラリーは例えばガラスまたは石
英で作成する。別に非荷電の表面を有するテフロンで作
られたキャピラリーは電気浸透効果が実質的に排除され
る場合に使用しうる。
25.大量の試料集合体における変異体スペルトルの適応
度の測定 進化論的スクリーニング検定法において、本発明の方
法は選択する分子（タンパク質、ペプチド、核酸、抗
体）へのリガンドの結合を測定するのに有用である。本
方法で達成される高い測定感度は、特に、特定の生理学
的または生物学的に興味のある非常に特異的な相互作用
の分析を可能にする。その相互作用はリガンドまたは標
識したリガンドの結合または未標識のリガンドと標識し
たインヒビターとの競争を通して測定される。このよう
に変異体スペルトルの適応度測定は大容量の試料集合体
から行うことができる。
適応度パラメータには、テストの特定の媒体条件下での −アフィニティー・パラメータ −速度パラメータ −酵素的パラメータ がある。
26.遺伝子型／表現型結合のための試料キャリヤーシス
テム 本発明の分析および表現型変異体の大容量試料集合体
の評価において、対応する遺伝子型、例えばコードして
いるプラスミドまたはコードしているmRNAは、選抜され
て進化過程を続けることが重要である。この問題は決し
て些細なことではない。この過程はより選択的に選抜が
行われることにより、より詳細にいうと、対応する遺伝
子型が不要な表現型をコードする配列の混入無しに単離
できれば、成功する確率が高くなる。
27.テスト・セル 中程度の試料数（＜10,000）には固定して空間的に分
離した容積エレメントが採用され、これを以後テスト・
セルと呼ぶ。これらはPCT/EP 89/01320、PCT/EP 89/013
87、PCT/DE 91/00082、PCT/DE 91/00081、PCT/DE 91/00
083、PCT/DE 91/00704に示されているシステムと同等の
シート・システムの一部とすることができ、各容積エレ
メントにはシールされたシート・エレメント内に試料が
含まれている。シールされたエレメントから同定された
表現型はコードする遺伝子またはmRNA転写物に従って直
接的なメカニカルな方法で単離しうる。
28.マイクロコンパートメンタリゼーション また、超微量試料容積の光学的測定および評価を含む
本発明の方法は、非常に少量の試料を通常では取り扱え
ないマイクロコンパートメンタリゼーション（微小区分
化）することを可能にする。このことは正と同定される
遺伝子型を得るために各コンパートメントを充填および
選択的に空にすることに関して達成される。
マイクロコンパートメントは特許出願DE 42 37 383.1
に示されている平行に配置されたキャピラリー・エレメ
ントのような規則的および非規則的多孔性キャリヤー、
またはコントロールド・ポア・ガラスなどの多孔性物質
または容積エレメントがキャピラリー内で一次元的に分
離しているが、そのペアは直接接触しているキャピラリ
ーからなる板状キャリヤーから構築しうる。
特に望ましい形のマイクロコンパートメンタリゼーシ
ョンを第４図に示した。光学的に透明な平板キャリヤー
の下の、各々の表現型および遺伝子型を含む組み換えま
たは天然の細胞または人工ベシクルの形で分析される試
料中に存在する容積エレメントが使用される。別の態様
では、容積エレメントはキャリヤーに適用している間ま
たはそれ以後に設定される。ゲルまたはベシクル形成ポ
リマー、特にカプロラクタム誘導体ポリマー等の熱可塑
性構造に基づくポリマーが望ましい。
この応用は、先ず、分離した水性容積エレメントを生
成するポリマーの分離またはピエゾ制御のマイクロディ
スペンサーを用いた微分散液滴の適用による均一溶液か
ら行なわれる。
これまで述べてきたように、細胞の内容物も分析する
ことができる。例えば、細胞を先に説明したベシクル構
造で包み、後に高温で分解することができる。この場
合、ベシクル中に含まれ、分解した細胞の内容物を伴う
反応分子又は分子複合体を含む溶液の、少なくとも部分
的混合が起こる。反応分子は本発明のFCS法で検出およ
び定量しうる細胞成分との特異的相互作用または反応を
行う、例えば核酸プローブ、酵素またはタンパク質であ
る。この技術はインサイチュウ・ハイブリダイゼーショ
ンまたは細胞特異的タンパク質染色と同様の技術であ
る。
また、K.ヘンコ（Henco）等、DE 42 37 381.6の出願
に示されているような核酸および分析する表現型分子構
造の同時固定のためのキャリヤーも遺伝子型／表現型の
結合を行うための反応キャリヤーとして有用である。
もちろん、遺伝子型をキャリヤーのX/Y位置に限定す
る、いわゆるAFFYMAX技術の範囲にあるS.フォダー（Fod
er）等に採用されたキャリヤーも使用しうる。
29.選択された表現型フォトマーキング 各容積エレメント内で本発明にしたがって選択された
変異体の指定およびマーキングは示された分析光学系を
用いることによる位置の光学的マーキングが望ましい
（第７図）。このことはキャリヤー表面の光学性化可能
なコーティングが励起され、例えば選択的脱色により簡
単に認識される反応産物を生成しうる波長の光を反射す
ることで行いうる。もし、相関分析が分析される各容積
エレメントの所定の値を示すならば光信号が活性化され
る。
ここでは従来の光反応性コーティングを使用しうる。
これもレーザー光源が望ましいが別の光源が使用される
か、また分析に使用しているレーザーを使用することも
できる。測定と光活性化による位置のマーキングの分離
は、例えばマーキング反応には二倍周波数を使用するこ
とで行いうる。また、望ましいエレメントのX/Y位置は
電子データ蓄積により収集しうる。
キャリヤー上の位置のマーキング後、望ましい核酸が
対応する容積エレメントから、例えば機械的方法で得ら
れる。
30.選択された表現型および遺伝子型の光活性化 選択された容積エレメントをマーキングする代わり
に、第７図に従う対応する遺伝子型をマーキングする事
が本発明では特に有用である。
本発明に従う以下に示す幾つかの代替法が望ましい： （１）容積エレメントの表面構造体への核酸の光活性化
結合、 （２）核酸特異的リガンドの光化学的活性化、 （３）選択されたもの以外の全ての容積エレメントの光
化学的不活性化。
代替法（１）では、二本鎖インターカレート試薬とし
て360nmの光照射で核酸両鎖を互いに化学的に結合させ
るソラレン（psoralen）誘導体を使用しうる。このよう
なリガンドは例えばキャリヤー表面に化学的に結合する
ことができる（第８図）。
このように十分な数の表現型コードプラスミドをスク
リーニングの間にポジティブに選択された表面セグメン
トに結合しうる。続いて、固定されなかった核酸を全て
洗い流す。選択された核酸は直接表面上での酵素依存増
幅反応に供される。
別に、その核酸はソラレン結合の可逆性を利用して回
収しうる。このことは、例えば260nmの光で行いうる。
代替法（２）では、核酸結合リガンドは、次に生成が可
能で、かつ、望ましくない核酸を分離しうる別の分子に
結合しうる。この事は、DNAまたはRNA認識リガンド、特
にビオチン、アビジン、スカレプトアビジン、免疫グロ
ブリン、オリゴペプチドまたはオリゴヌクレオチド等の
アフィニティー・リガンドに結合した光活性化可能なソ
ラレン誘導体またはインターカレーティング色素を結合
することにより例示される。
第８図に見られるように、これらの化合物をポジティ
ブに選択された容積エレメント由来のDNAまたはRNAと光
誘導的に化学結合した後、全ての容積エレメント由来の
DNAおよび／またはRNAを一緒に精製し、また、選択基準
を満足しなかった核酸からそれらを同時に分離すること
が可能となる。分取は疎水クロマトグラフィー、アフィ
ニティー・クロマトグラフィーまたは表面がアダプター
分子のリガンドに結合する適当な性質を有する磁性粒子
で行うことが望ましい。このような特異的結合の望まし
い例には、オリゴ−dT/オリゴ−dA、アビジン−ストレ
プトアビジン／ビオチン、NTA−IDA/（His）６および同
様の既知複合体形性試薬がある。
次のステップでは、このようにプールされた精製核酸
を直接酵素依存増幅反応またはcDNA合成に使用すること
ができ、または先ず光化学的に誘導した結合の逆反応で
リガンドから脱離することもできる。
本発明では、分析の選択基準に満たない核酸を選択的
に不活性化することも考えうる（代替法（３））。この
ことはソラレン等のクロスリンク物質を用い、クロスリ
ンクした構造ではもはや連続的酵素反応で増幅されない
ようになることで行いうる。しかし、この方法の欠点は
ポジティブに選択された容積ユニットに対する濃縮因子
が逆に影響を受けることから、不活性化は完全に行われ
なければならないということである。代替法（１、２）
において、濃縮の収率はたいして重要ではない。酵素依
存増幅法により、非常に少数のコピーも本発明をカバー
する程度に濃縮することができる。しかし、ほとんどの
応用に対しては、ポジティブに選択された容積エレメン
ト由来の核酸の割合が出来るかぎり大きいほうが有利で
ある。このことは、例えば分析で考えられている容積エ
レメントよりも大きい容積エレメントを光学系が照射す
ることで達成される。
31.フラクション分析／フロー・インジェクション分析/
GC/MSカップリング 分析／調製分離法とカップリングしたフロー・インジ
ェクション分析は、活性物質を発見し、または化学的ま
たは酵素的に生ずる擬種を至適化する（DE 43 22 147お
よびWO 92/18645）緩慢な化学的または生化学的反応の
方法に本発明の方法をカップリングする上で特に重要で
ある。
先に示したように、本方法は数に関して複雑であり、
また進化過程で予備的に発生する分子集合体の解析およ
び評価に特に有用である。しかし、この事は別にしても
分子多様性を有する複雑なシステムの機能的解析はかな
り重要である。多様性は複製メカニズムを通して進化シ
ステムだけで発生するのではないのと同様に、サブポピ
ュレーションのコンパートメンタリゼーションは細胞ま
たはベシクル構造でのみ生ずるのではない。
合成化学において種々の分子型の非常に複雑なシステ
ムが故意に、または無作為に生成しており、所定の種類
の複雑性を選択的に生成しうる。微生物または植物は種
々の二次代謝物を合成し、そこから多量の医学的活性物
質が誘導された。周知のようにHPLC、FPLC、ガス・クロ
マトグラフィー等のクロマトグラフィー法を使用して、
このような化合物を効率的に分離および単離することが
できる。
本発明の方法は核酸またはタンパク質等いわゆる複製
系由来の変異体の平行分析を行うばかりではなく、化学
的または代謝的に複雑な混合物由来の変異体も分析す
る。従来、この操作は、先ず複雑な混合物を個々のフラ
クションに精製し、これらを化学的に分析、および／ま
たはその構造を解析し、可能ならば純粋な形で個々に生
物学的検定することであった。
現在、本発明の方法を用いることにより、例えば薬学
的検定を行うために当初分析的に少量しか存在しなかっ
たフラクションまたは個々の物質を分取して使用するこ
とが可能である。本発明の方法の望ましい態様では、得
られたフラクションを直接FCS検定に連結することがで
きる。FCS検定において各問題にポジティブに応答する
以前に、個々の物質を生産することは省略される。現在
行われている活性物質に対するブラインド・スクリーニ
ングは活性物質を含むフラクションを選択的に調査する
ことで置き換えることができる。
材料の複雑な混合物中の機能性化合物の分析は薬学に
おいて厄介な作業である。第１に、すでに述べてきた微
生物および植物由来の天然物の複雑な混合物が知られて
いる。日本の研究所および企業は、最初の抗生物質を導
入したことから各々の新しい検定法においてスクリーニ
ングに導入しうる新しい構造の精製物質の拡張バンクを
持続的に確立していくことによっては追いつくことが困
難である他の国に対して、天然物質をスクリーニングす
る上でリードしている。この事は、これまで知られてい
る活性構造の二重開発を意味する反復検出が回避される
ことから、生物を培養するよりも単純である。
その利点のため、本発明の方法は本操作を断念するこ
とができるが、個々の分子が実質的に純粋物質として回
収されることから非常に拡張されかつ、複雑な混合物の
分析も可能である。単一の微生物は千個以上の複雑な構
造の二次代謝物を合成しうるが、そのいくつかは少量と
して存在するのみで抽出物の全混合物の分析においてそ
の機能で同定する事は出来ないことを知っておかなけれ
ばならない。本発明では微生物由来の物質の混合物また
は幾つかの微生物または植物抽出物の混合物を先ず、例
えばクロマトグラフィーで分離し個々のフラクションに
ついて分離マトリクスの終わりにあるキャピラリー中、
望ましくは「オン・ライン」で機能化合物の存在を検定
する（第９図参照）。
以後第９図を説明する。本発明によりクロマトグラフ
ィーによる分離を組み合わせて複雑な物質混合物を分析
しうる。クロマトグラフィーによる分離後、標識した参
照分子を連続的に、かつ一定濃度でフラクションに添加
し、さらに、これに特異的結合ターゲット分子を一定濃
度で添加する。第１図に示したように、各濃度で約分子
の50％が複合体を形成し、その結果分離された混合物由
来の妨害物質を最高感度で検出しうるように各濃度を選
択する。
その後、合わせた試料はキャピラリー・フロー管を通
して検出ユニットに入る。このフラクションは、目的の
結合平衡を特異的にシフトするかどうかを分析される。
例えば、複雑なシンソン（synthon）混合物を使用し
たとき、アルキル反応における多様な置換または非置換
アルキル残基の混合物も上述のように分析的にカバーし
うる。従って、各反応ステップ後、反応混合物から形成
される化合物を分離してその特性を調べる必要はもはや
無い。
望ましい態様（第９図）では、混合物をレセプターを
含む溶液に添加する前に、先ず各フラクションに妨害を
分析する物質の部分標本を添加し、競争反応を測定する
ことができる。別に、若しレセプターが既に占有されて
いるならば、遅い解離速度定数は置換反応の検出を複雑
にする。遅いレセプター置換反応は、時間変化、即ちk
dissの測定を可能にする。
32.ターゲット分子との物理的相互作用に関するパラメ
ータの大まかな評価を伴う生物機能的相互作用に関する
複合体混合物のスクリーニング もし、本発明に従い例えばLC/FCSカップリングによ
り、ターゲット分子との相互作用に関して種々の物資混
合物を分析するなら、対応する各ガイド構造の質的評価
を可能にする結合定数の上限または下限を直接評価する
ことができる。このことは以下の実施例で説明する。
各探索される物質が0.1％量しか含まれない1000個の
物質を含む10μｇの物質混合物をLC分離装置にかける。
このことは絶対量が1ngであることに対応する。フラク
ションの分離後、この量の物質が５μの容積に存在す
る。分子量を200ダルトンと仮定すると、これは10-6Mの
濃度に対応する。ターゲット分子、例えばレセプターを
同程度の濃度で添加すると、複合体の形成は、反応速度
が所定の最高値を越え、かつ、結合定数が＞106あるな
らば、所定の時間内に完了することができる。
この検出反応は活性であると同定される化合物の構造
データを直接得るために、HPLC/MSまたはGC/MSとカップ
リングする事ができる。
また、本発明の分析法の物質の微量化はオンライン分
析に使用する場合のシグナルのドリフトの問題をこおむ
るバイオセンサー技術を用いた種々の代替法に対抗して
本発明の分析法の使用を可能にしている。上述のクロマ
トグラフィーのかわりに試料ディスペンサーを使用でき
る。
DNA/RNAプローブ検定法 本発明の技術の強力な検出感度をフルに利用したと
き、DNAまたはRNAプローブ技術に特異的な問題が生ず
る。分子レベルでの本発明の検出反応は少なくとも互い
に相補的な一本鎖構造からなる二本鎖構造の形成を必要
とし、該一本鎖は化学的な修飾を含みうるDNAまたはRNA
基本構造物、またはDNAおよびRNAの混合物を含み、か
つ、該修飾は特に基本構造、特に塩基の化学発光性を修
正する構造または特異的分子または分子複合体への特異
的結合性を有する、および／または化学発光置換基であ
る置換基を保持する構造に適するものである。
しかし、二本鎖構造の形成は比較的ゆっくりとした反
応である（ハイブリダイゼーション、cot速度論）。実
験的には、このことは細胞由来のゲノムDNAの再生が実
験条件に依存して週または月の単位で継続する過程であ
り、その結果、この実験は事実上完全には行うことがで
きない。例えば真核生物ゲノムあたり＞100,000個の割
合で生成する反復ゲノムセグメントだけは再ハイブリダ
イゼーションしうる（デビッドソン（Davidson）および
ウェットマー（Wetmur））。
実際によく使用されている近似式で変性二本鎖の再生
が表されている。
ｔ1/2＝Ｎ×ln2/（3.5×105×Ｌ×C0） ｔ1/2はＴ＝Tm−20、イオン強度1Mにおける秒の単位で
示された再生の時間を示している。Ｌはプローブ断片の
長さ、Ｎはユニット配列の長さ、C0はヌクレオチドの濃
度および3.5×105は再生の本質的速度定数の近似値であ
る。
反応速度が２つの反応物（＋および−鎖）の濃度の総
計に依存するので、一般に再生速度を促進するには２つ
の可能性がある。従来のブロット検定法では過剰量の成
分が速度を決定するので、通常プローブは過剰量で使用
され、後に洗浄ステップで過剰のプローブが分離され
る。PCR（ポリメレース・チェーン・リアクション）な
どの酵素依存増幅反応の導入で、その反応速度を測定す
る程度までに検出すべきターゲット核酸を増幅すること
ができる。しかし、もし増幅反応が本発明の方法で免ぜ
られるならば、またはその検出がワンポット操作におけ
るプローブ成分の厄介な分離無しに行われるならば、本
発明に１つ以上のプロセスおよび操作が組み合わされ
る。
本発明の検出に十分であるガス相（空気細菌）または
溶液または懸濁液の小容量試料中のウイルスまたは細菌
病原体の検出感度は、簡単な濾過ステップを用いること
で増加することができる。これらは大量の容積からフィ
ルターまたはフィルターシステムを用いて抽出し、小容
積に含めることができる。別法には例えば被覆磁性粒子
による濃縮がある。
DNA/RNA分析ではインターカレーティング置換基を有
するプローブを使用することができる。インターカレー
ションで蛍光挙動が変化するか、または増加するこれら
の発色リガンドの使用は特に望ましい。チアゾール・オ
レンジ類の置換基は特に有用である。インターカレーシ
ョン状態ではこれらの蛍光収率は遊離状態に比べて約10
00倍大きい。従って、1000倍過剰量の非色素インターカ
レーティングプローブ存在下でのインターカレーション
により特異的複合体の形成を測定することができる。
プローブに結合したオリゴマーまたはマルチマー色素
を使用することにより、より少ない個々の事象が必要と
されるシグナルを生成して検出されなければならないこ
とから感度はさらに10−100倍増加しうる。
過剰濃度の二本鎖分析物は反応を促進するのに必ずし
も望ましくない。もしも過剰に存在する分析物のカウン
ター鎖が複合体とさらにハイブリダイゼーションするな
らば、複合体由来の既に会合したプローブの不都合な置
換が起こる。
本発明ではこの問題は例えばPCR反応における非対称
な開始により、または細胞内で天然に生成するRNAポリ
メラーゼによる、または3SRなどの相同的増幅反応で生
成することによる特異的RNA配列の決勝戦（run−off）
生成によるようなカウンター鎖無しに特定の極性のみで
存在する過剰量の分析物に注意することで解決してい
る。
また、置換反応は複合体を熱力学的に安定化するイン
ターカレーティング置換基（例えばアクリジン色素）に
より、または不可逆的クロスリンクを開始することによ
り（ソラレン誘導体）で防ぐことができる（特許出願P
42 34 086.1参照）。
本発明の上述のパラメータの至適化を通して10-12Mの
範囲の標識プローブの使用が可能であり、かつ10-14M範
囲の分析物（カウンター鎖）が検出できるならば、再生
の反応速度（複合体形成）は受け入れがたいほど遅くな
る。上述の近似式を用いて200ヌクレオチドの長さのフ
ラグメントは、本発明の方法による光学的測定前に寿命
の10倍待たなくてはならないなら、会合するのに約23,0
00分（16日）かかるであろう。
フェノールに基づく有機性溶剤およびチオシアネート
またはパークロレート類のようなカオトロピック塩の組
み合わせを用いることにより、反応速度を約100,000倍
も促進することができる（キュンケル（Kunkel）等）。
実際にはこの方法はフィルター検定法ではうまく行かな
かった。しかし、この方法は溶液でうまく行うことがで
きる本発明の方法と組み合わせることができる。このよ
うに、上述の例の反応速度が秒の範囲でシフトするばか
りでなく、同時にその溶液がRNA分析物に対する例えば
リボヌクレアーゼの作用による分解プロセスを防ぐ。
また、この方法は種々の輸送ベシクル、LDL、VLDL、
およびHDL間の鎖を探すならば脂質代謝における種々の
診断に必要とされる大きなベシクル複合体の検出を可能
とする。従って、今日まで比較的複雑な電気泳動法を困
難な定量に使用しなければならなかった。本発明に従っ
て、色素標識ベシクルは移動度および／または回転拡散
測定により区別しうる。このベシクルを蛍光標識した特
異的抗体で染色しうる。別に蛍光ラベル分子は特異的
に、かつ永久にベシクル構造中に取り込まれうる。
インビトロ・トランスレーション生産物の機能検定法 本発明のスクリーニング技術の使用は、インビトロタ
ンパク質生合成と組み合わせたタンパク質またはペクチ
ドの形をした複製分子の分析に特に重要である。インビ
トロタンパク質生合成は組み換え細胞システムを回避し
ている。しかし、インビトロタンパク質合成の効率が小
さすぎて合成産物の機能の検出を出費をかけることなく
行うことは不可能である。平均して１つのmRNA分子から
１つ以上のペプチドまたタンパク質分子が生産される。
この結果はより悪くなりうる。しかし、本発明の方法の
感度はmRNAがμＭの濃度範囲でのみ合成混合物中で使用
しなければならず、また分析には小容量の試料で十分な
ことから機能の測定が可能となる。
分子サイズの分布の測定 高分子化学の分析において、ポリマーの分布を測定す
ることは重要である。この事は超遠心法および物理的フ
ロー法の代替法となる本発明の方法を用いて容易に行い
うる。オリゴマーに本質的な蛍光を用いることもできる
し、また発光性リガンドとの会合または結合を観測する
こともできる。
イン・サイチュウ・ハイブリダイゼーションとは標識
した核酸プローブと相補的ターゲット核酸との特異的二
本鎖形成を分析する目的物の幾何学的配置を固定して行
う方法である。分析される目的物は分子または分子複合
体の表面固定調製物である。例には染色体、転写複合体
または翻訳複合体の調製物が含まれる。ルーチン分析で
は、表面固定した組織スライスまたは細胞培養物由来の
細胞が重要となる。
ダイナミック・レーザー相関分光光度法 その感度のために本発明の方法は、核酸以外のリガン
ドの場合、ハイブリダイズした、または複合体を形成し
た蛍光標識結合リガンドの位置を決定することができ
る。本発明の利点は単一分子の検出感度が高いことに基
づいている。このことは酵素依存増幅反応が必要な場
合、または多糸染色体の場合のようなターゲット分子が
局所的に高濃度になることを必要とされる場合の直接分
析を可能にする。目的構造の相対的位置を決定しうる本
発明の方法における二重または多重標識の使用も請求の
範囲に含まれる。
ダイナミック・プロセスの分析に関してピンホールを
使用することによる最小容積エレメントの共焦点イメー
ジングを含む本発明の方法は、本発明に従い構造の空間
高分解能を得るためにレーザー・スキャンニング顕微鏡
で使用される従来法と組み合わせて使用しうる。レーザ
ー・スキャンニング顕微鏡を用いる場合は蛍光強度のみ
が測定量として使用されるが、本発明の「レーザー相関
顕微鏡」は二次または三次元的に結像される空間座標
（x,y,z）で規定される測定エレメントにおける相関関
数およびその動的内容を使用している（第10図）。この
ように、例えば細胞または他の生物学的対象物における
標識分子の二次元的（断面）または三次元的な動的像を
描くことができる。
以下に第10図を説明する。本発明の光学系の原理機構
が示されている。試料は試料ホルダーに納められ、それ
は二次または三次元的にコントロール可能なピエゾ素子
で所定のスクリーン内に移すことができる。各関連容積
エレメントを動的プロセスに関して分析し、全体として
コンピュータにより二次（断面）または三次元像に組み
立てられる。
33.流行病的に保存されている遺伝子セグメントの測定 ハイブリッド二本鎖の解離定数の測定を通して、上述
の解離定数の測定と同様にホモロジー評価を行うことが
できる。このことはHIウイルスのような発散病原体の流
行病学的解析に非常に重要である。診断プローブを開発
し、その信頼性を評価するために、種々の生物由来のい
くつかの遺伝子セグメントをそれらのパラメータについ
て検定しなければならない（第22図）。
ターゲットゲノムに関する多数の突然変異の同時検定法 遺伝病の分析において、多数の変異体の存在を同時に
検定するという問題がしばしば発生する。このことは特
に優性遺伝子病またはＸ染色体コード型の病気の場合で
ある。劣性病の場合、１つの対立遺伝子上に特定の点突
然変異が発生したか、または両方に発生したかを評価す
ることは重要である（今日までに30以上の変異体が示さ
れてきた嚢胞性繊維症参照）。本発明の操作は１つの試
料中の種々の突然変異を同時に分析することを可能にす
る（第23図）。
表現発現細菌の結合特異性による単一細菌の検出 最近のバイオテクノロジー的研究の重要な多くの応用
に関して、もし所定の試料中の機能性生体分子の検出の
代わりに、単一の細胞またはウイルスの検出法ができた
ならば非常に便利で効率的である。非常に興味深い重要
な利点は、表現型発現産物、例えば天然または組み換え
表面タンパク質のその遺伝子テンプレートへの結合であ
る。
微生物のゲノムには約107個のヌクレオチドを含まれ
る。ショットガン発現により平均長100アミノ酸残基の
フラグメントが従来法により発現できる。読み枠の変化
（因子３）および仮定される非コード相補鎖を考慮する
と、108個の組み換え細菌クローンは約100倍の各セグメ
ントを含んでいる。10Dの1mlの懸濁液に含まれる108個
の組み換え細菌クローンを、例えばアレルギー患者由来
のIgEに対する結合性に関し、本発明の方法を用いて約2
4時間で個々に試験することが可能である。対応する特
徴の細菌を単離するか、または少なくとも非常に濃縮
し、かつ生物的に増殖しなければならないか、または対
応するゲノムセグメントを酵素依存増幅法で増幅し、か
つ特徴付けなければならない。
このような問題は例えば、WO92/18645に示されている
突然変異誘発法および淘汰法を用いることによるペプチ
ドおよび／またはタンパク質の進化的至適化の方法に関
連している。24時間以内に約109個の細菌を、所定の濃
度のターゲット分子と相互作用する能力を有する表面タ
ンパク質／ペプチドを発現する細菌の存在に関して特異
的色素標識した物質への結合性によりスクリーニングす
ることができる。対応する細菌は従来法で反応混合物か
らクローニングしうる。
別の重要な応用は、cDNAライブラリーまたはサブジェ
ニックな構造要素のライブラリー（形空間）由来の遺伝
子セグメントの機能的マッピングに関するゲノム・プロ
ジェクトに由来する。このように、例えば、ターゲット
分子への結合挙動など、広い集合体由来のゲノムおよび
／またはサブジェニックなセグメントの機能を測定しう
る。
遺伝子的にコードされているペプチドセグメントの機
能指定を示す方法論の使用は、アレルギー研究において
非常に重要である。アレルギー原に関する免疫優性エピ
トープの同定は（例えばアスペルギラス、ミルクタンパ
ク質、α−アミラーゼ）非常に重要であり、今日まで解
決しにくかった問題である。実際に発生した典型的問題
を以下に示す。
通常、病気に関連する物質の混合物中のIgE結合分子
の決定。例えば、大豆のレシチンのどの部分が免疫原
か、純粋な物質だけか、調製物の不純物と相互作用する
純粋物質か、または宿主生物の構造物との相互作用か、
この問題に答えることは非常に重要である。本発明では
混合物中の種々の物質を患者由来の標識化IgEで分類す
る事ができる。
サブジェニック遺伝子セグメントの発現により、上述
の方法により免疫優性エピトープを決定し特徴を明らか
にすることができる。これらの結果を用いて、 −対応する免疫優性領域を欠く進化的に類似する機能分
子、例えば少ない免疫原性α−アミラーゼをWO92/18645
に示されている方法を用いて生成できる。また、 −特異的エピトープを遺伝子工学の標準的方法により調
製でき、または純粋なテスト試薬としてまたは感度減少
に使用しうる。
装置 この測定配置は以下に示す配置のレーザー光の回折制
限フォーカシングにより本発明の方法を行うのに特に有
効な装置である。第14図に示したように、この装置はプ
レ・フォーカスしたレーザー光に特徴がある。フォーカ
シングレンズと一定の結像距離を保つ交換可能な顕微鏡
光学系を組み合わせることにより、プレ・フォーカスし
たレーザー光の径を変えることができる。二色性ミラー
により反射後、プレ・フォーカスしたレーザー光はカバ
ーガラスがある場合も無い場合も空気または水浸漬光学
系により例えばキャリヤー上、または吊り下がった１滴
中に存在する試料容積に結像される。通常蛍光の発光が
励起光の方向に対して180゜の角度にある浸漬光学系に
より集められ、結像される。対物板25には、適当なカッ
ト・オフまたは干渉フィルターの通過後、半導体検出器
エレメント（なだれ型フォトダイオード）上に適当なス
ケールの像をつくるピンホールがある。この適当なスケ
ールはフォトダイオードの大きさに試料の像を調節する
ことから決まる。フォトダイオードは100μｍの範囲で
比較的小さく作り、それらが共焦点検出器に対しピンホ
ールを置換できるようにすることが望ましい。本発明の
装置の特別な態様では、このダイオードも検出器に組み
合わされて配置することもできる。
ピンホール開口50の結像は種々の発光波長に対して至
適化した、例えば２つの検出エレメント53、54上のビー
ム・スプリッター60を用いて行いうる。ピンホール開口
の代わりに、例えば１つ以上の半導体検出エレメント
（アレイ）を結像板に置くことができる。
望ましい態様では、レーザー光の回折制限フォーカシ
ング生成用のユニットおよび観察ユニットに相互に分割
しうる本発明の装置は、以下のような構築エレメントを
有している。レーザー光21をプレ・フォーカスするため
の器具20にはレーザー光21を屈折させるためのレーザー
光路中の二色性ミラー30が含まれる。回折制限フォーカ
シングで生成されたレーザー光は、例えばキャリヤー上
に位置するか、または吊り下がった液滴１に存在する試
料に二色性ミラー30で屈折された後別のレンズ40により
結像される。
場合によっては、観測ユニットはフィルター器具51、
光子計数器具52、相関器具71および／またはマルチチャ
ンネル・スケーラー器具72を有している。測定シグナル
は場合によってはコンピュータで処理され、および／ま
たは評価される。
第15図はレーザー光21をプレ・フォーカスするための
プレ・フォーカシング器具20を図で示している。顕微鏡
光学系に相当するレンズL22およびアレイ23により、レ
ーザー光21はレンズ22を通して結像板B1上に結像され
る。アレイ23は最初の像として結像板B2にレーザー光を
結像する。アレイ23は例えば顕微鏡のノーズ・ピースの
形をしたレンズの交換可能な配置を提供されることが望
ましい。プレ・フォーカシングしたレーザー光21の径は
それで変えることができる。
本発明の装置の望ましい態様では、検出ユニットは２
つの検出器52および54を含み、試料から検出器53および
54へ発せられる光55を分割するビーム・スプリッター60
を有している。この配置は第16図に示した。試料１から
発した光55が検出器53または54に入る前に結像レンズ5
6、57およびフィルター・エレメント58、59を通ること
には利点がある。特に、各検出器53および54が異なる波
長の光を検出できることは有利である。この事は適当な
フィルターを選択することで達成される。
もし、検出器エレメントが検出器アレイ状に結像板に
設置されるならばピンホール開口50の使用は不要であ
る。検出器エレメントは＜100μｍの大きさを持つこと
が望ましい。本発明の装置の別の態様はビーム経路55に
ピンホール50を配置している。
第25図では、測定領域（62に示した）を調べるのに使
用する二重顕微鏡の側面が図示してある。この顕微鏡は
単独プレート64を有する垂直サポート63（長方形チュー
ブ）を有している。サポート63の上側には、中央支持ア
ーム65が水平軸の回りに回転するように取り付けられて
いる。中央支持アーム65は凹むように工夫され、ビーム
・スプリッター66および45゜反射鏡67のような光学エレ
メントと共に内側に提供されている。支持アーム65のベ
アリング軸68も凹むように工夫され、２つの重なるレー
ザー光は理想的な回転軸に沿って支持アーム56に照射さ
れ、光路中のビーム・スプリッター66およびミラー67
（広いルーフ・プリズム）に衝突する。ビーム・スプリ
ッター66およびミラー67を通して、２つの重なるレーザ
ー光が２つの反対側にある支持アーム65からガイドされ
てくる。すなわち、この部分で支持アームは開口69が提
供されている（ガラスカバープレート）。
支持アーム65を離れた２つのレーザー光70、71はこれ
らの光を偏向させるビーム・スプリッター72、73にぶつ
かり、その結果、光の方向は支持アーム65の軸方向と平
行になる。
支持アーム65のフリーの端には支持アーム74が結合し
ており、両方のアームでＴ型構造を採るように配置して
いる。サポート63から逸れた支持アーム74の前面には、
対物レンズ78を含む対物ノーズ・ピース77を伴うボディ
ー・パーツ76の縦の動きをガイドするガイド器具75があ
る。２つのノーズ・ピース77の相対的配置は、対物レン
ズ78が互いに向かい合い、共通の光学軸上にある一方、
２つの対物レンズ78間に支持アーム74によって支えられ
ている標本台79がある。支持アーム74の内側には、反対
のネジ山を持つ２つのスピンドル81を有する二重スピン
ドル・ドライブ80がある。このスピンドル81は支持アー
ム74に投影されるアーム82とスレッド結合状態にあり、
かつ、ボディー・パーツ76に連結している。従って、二
重スピンドルドライブ88が運転されるとき、２つのボデ
ィー・パーツ76は運転方向に依存して互いに方向に、ま
たは互いから遠ざかるように移動し、その結果２つの対
物レンズの焦点が結合しうる。
二重ガイド・システムは２つの置換可能なボディー・
パーツ76の各々と連結している。これらの二重ガイド・
システムの各々は２つのフィッシュ・テール・スライド
・レール83、84の形で具現される。これらのスライド・
レール83、84は支持アーム74の２つの末端が向き合うよ
うに配置されており、ボディー・パーツ76に沿って移動
する。２つのスライド・レール83、84は支持アーム74越
しに両側（ガラス・スライド側と支持アーム65との連結
側）に突き出す一方、支持アーム65に対しては平行であ
る。互いに向き合っている内側には半透鏡またはビーム
・スプリッター72、73から来るレーザー光をプレ・フォ
ーカスするための光学エレメント85、86が提供されてい
る。互いに向き合っていな２つのスライド・レール83、
84側では測定領域からくる光を処理するための光学系
（レンズ、開口、フィルター等）がある。88はピンホー
ルであり、89は蛍光を検出する検出器にピンホール開口
を結像するためのバイコンベックス・レンズと呼ばれ
る。さらに、互いに向き合っていないスライド・レール
83、84の外側には、45゜の角度に合わし、測定領域62か
ら来る光を光学エレメント87、88に反射する鏡89があ
る。さらに、相互相関をとるために必要なレーザー光か
らの情報を電気シグナルに変換する検出器90、91がスラ
イド・レール83、84側に存在する。
第25図に示した二重顕微鏡の作動モードを以下に示
す。ベアリング軸68を通して、種々の波長の２つの重な
ったレーザー光（70、71）が支持アーム65に入り込み、
ビーム・スプリッター66に進入した後１つのレーザー光
71はビーム・スプリッター・エレメント66によって一方
に90゜反射され、また、もう一つのレーザー光70はミラ
ー67により反対方向に90゜反射される。支持アーム65の
隙間69から出たレーザー光70、71はビーム・スプリッタ
ーまたは半透鏡72、73にぶつかり、そこから光学エレメ
ント86を通過する。その後、レーザー光は、その端でサ
ポート63および検体ステージ79に面する側に長い穴92が
提供されている（第25図ではサポート63に面する長い穴
92だけが描かれている）支持アーム74に進入する。さら
に、レーザー光70、71はボディー・パーツ76を通り、そ
こで半透鏡93にぶつかってから、ノーズ・ピース77およ
び対物レンズ78を通過して測定領域62に到達する。測定
部分62から反射された光は偏向無しに半透鏡93を通過
し、反射鏡89によりスライド・レール83、84の外側の光
学エレメント87、88に送られる。その後、検出器90、91
に衝突する。
同様に用いられる対物レンズ78に依存して調整可能な
ように、測定部分62へのレンズ焦点、ボディー・パーツ
76およびスライド・レール83、84は先に示したように移
動可能である。半透鏡72、73は光学エレメント86のよう
に互いに向き合うスライド・レール83、84側に存在する
ので、反射鏡67および半透鏡（ビーム・スプリッター6
6）からの半透鏡72、73の距離はボディー・パーツ76お
よびスライド・レール83、84が移動したときに変化す
る。レーザー光70、71が支持アーム65に平行に走ってい
る半透鏡72、73の後の領域では、該鏡からの光の距離は
変化する。これにより長い穴92内の支持アーム74の相対
的位置は変化する。このことから、中央支持アーム65の
外側にある全ての光学系は変化するし、２つの移動方向
は中央支持アーム65を離れたレーザー光70、71の方向と
一致する。
全体の二重顕微鏡は非常にコンパクトな構造をしてい
る。全てのエレメントは重さが「実質的に均一に」分布
するように配置されている。検体ステージ79に向かった
二重顕微鏡のオペレーターは作業領域の顕微鏡の装備お
よび光学系に邪魔されることはない。二重顕微鏡の中央
支持アーム65および全ての光学装置は回転しうる（矢印
94参照）。中央支持アームは同軸の２つのベアリングに
よりサポート63に固定してあり、曲がることはない。２
つの対物レンズ78の内の１つは測定部分62が検体ステー
ジ79に位置する部位から２つの対物レンズ78の共通焦点
のオフセットのバランスをとるためにピエゾ素子または
別の調整エレメント（示さず）で正確に位置決めされ
る。
レンズ、フィルター、反射鏡、半透鏡等、ここで示さ
れた光学エレメントに加えて、行われる測定に必要とさ
れるならば別の光学エレメントもレーザー光70、71の光
路に置くことができる。
第17図はローダミンで標識したデオキシリボ核酸を示
している。縦軸は規格化した強度相関関数を示してい
る。横軸は対数時間軸である。濃度は容積エレメント当
たり（２×10-16）の標識分子で与えられる。代17a図
は拡散時間0.067msの容積ユニット当たり２分子のモノ
ヌクレオチド・ウラシルを示している。第17b図は拡散
時間1.8msを有する容積ユニット当たり0.3分子に相当す
る500塩基対のDNAを示している。
第18図はヒトのリンパ球における細胞結合レセプター
（β−アドレナリン・レセプター）と蛍光標識レセプタ
ーリガンドとの相互作用を示している。このシステムの
座標軸は第17図と同様である。第18a図は拡散時間1.1ms
の容積ユニット当たり10.7分子に相当するBSS中の標識
リガンドを示している。
第18b図は拡散時間13sの容積ユニット当たり72分子に
相当するBSS中のリガンドで標識したリンパ球レセプタ
ーを示している。
第18c図は遊離のリガンド76％およびリンパ球レセプ
ターに結合したリガンド24％の状態を示している。
10−100ms以内の蛍光相関関数を得ることができるの
で、10乃至100s以内に1000ピクチャー・エレメントをコ
ードしうる。特に、本発明の方法の各ピクチャー・エレ
メントは、一般的に半径0.1−１μｍおよび長さ１−３
μｍを有するポアソン分布空間エレメントに相当する。
この相関関数は所定の時間以内に各ピクチャー・エレメ
ント内で計算され、各軸ｘ、ｙ、ｚについて蓄積され
る。その後、この調製物は新しい座標点にピエゾ素子で
移動されることが望ましい。この調製物を移動させる代
わりに、例えばレーザー光を所定の限度内に適当な鏡装
置で動かすこともできる（第９図参照）。ダイナミック
・ピクチャー・エレメントはコンピュータで１つの像に
組み立てることができる。
第６図は試料容積および測定容積に関する電気的分子
トラップを用いた光学検出ユニットの望ましい配置を示
している。１つまたは２つの検出器（検出器1/2）はテ
キストに示したように１つまたは２つの光学ユニットに
より共焦点的に結像された測定容積エレメントからの蛍
光シグナルを検出する。水性試料はエマージェンス・レ
ンズの表面に直接接するか、または第３図に示したよう
に薄いシートで対物レンズから分離されている。
試料は約１μｍのキャピラリー末端の内径を有する少
なくとも２つのキャピラリーの間に提供される。イオン
性分子に対して分子トラップとして機能する場合、この
キャピラリーは導電性表面層、望ましくはクロム・プラ
イマー上の金でコーティングされており、そこに静電場
または振動電場をかけることができる。電場の制御は光
学検出ユニットと対応するコンピュータで行うことが望
ましく、また、問題の分子が進入してきたとき、限定さ
れた方法で調節しうることが望ましい。
第３図は特定の適応度パラメータで大量の変異体をス
クリーニングするための本発明に従った配置の望ましい
態様を示している。試料は第６図に従った光学検出ユニ
ットを用いて検定しうる。試料は水浸した対物レンズに
接することが望ましいシート状表面下で液滴として存在
する。このシートは特定のコーティングを施してあり、
各試料由来の分子を表面に選択的に結合させうる。試料
は、例えばマイクロディスペンシング・システムを用い
て決まった位置に規則正しく置くこともできるし、ラン
ダム分布として置くこともできる。試料からの溶媒の蒸
発を防ぐために、液滴は保護マトリクス、例えばポリマ
ーまたはオイルで囲むことができる。
第７図は選択された遺伝子型のFCSタギングを模式的
に示している。特定の試料が第３図に従って予備選択し
た適応度パラメータに対応するなら、各容積セグメント
への接近は、例えば光学的にその位置をマークするか、
または続いて試料への接近を可能にする光活性化可能な
コーティングが提供されている表面により容易に行いう
る。
選択された容積セグメント、または第８図に示したよ
うにコードしている核酸等、中、に含まれる分子への接
近も、例えば核酸と反応するようにエレメント中の可溶
性反応物を光活性化することで行いうる。このように標
識された核酸は、さらに例えばPCR反応を行うための単
離を比較的簡単に行うことができる。
第11図は本発明の検定法の選択を示している。「Ag」
は抗原を示しているが、例えば二本鎖構造で検出される
核酸のような一般的な意味での分析物を示している。
「Ak」は抗体を示しているが、一般的には例えば抗体
フラグメント、結合ドメイン、または分析物に相補的な
核酸等、分析物に対する特異的テスト試薬を示してい
る。
「Ｆ」は発光色素、特に蛍光色素を示している。
（Ａ）蛍光標識されたテスト試薬による分析物"Ag"の本
発明に従う特異的複合体形成であって、複合体型の蛍光
標識テスト試薬は本発明により遊離型のものと区別され
る。この一群は分析物の1000倍過剰まで許容される。
（Ｂ）しかし、（Ａ）と同様に、非標識型の過剰に添加
された第２のテスト試薬の結合は、小さすぎる複合体と
非複合体型標識テスト試薬とのサイズの差を増加するの
に使用される。
（Ｃ）少量のテスト試薬および蛍光標識競合分析物の添
加を用いた競合RIA類似検定法。
（Ｄ）過剰量のテスト試薬を用いた検定法であって、エ
ネルギー転移により色素標識が特異的複合体形成を示す
少なくとも２つの異なるテスト試薬が使用される。
（Ｅ）（Ｄ）と同様に、異なる色素を本発明に従って独
立に検出し、共通の複合体の形成は異なる光学的シグナ
ルの時間相関で測定される検定法。
第19図は、ｎ個の反応混合物中のｎ個のレセプター分
子に由来し、かつ、色素標識リガンドを含む複合体が平
行した実験においてどの様な解離挙動を示しうるかを表
している。限定した時間間隔でいくつかの反応混合物を
反復して分析する。最初は、過剰量の非標識リガンドを
混合物に添加し、解離したどの複合体も非標識リガンド
との複合体を再び形成するようにする。曲線１、３およ
びｎから各解離速度定数が見積もられ、曲線２およびｎ
−１は２つの区別可能な解離過程を明らかにし、かつ区
別可能なレセプターを示している。
第20図は本発明の電気的トラップの種々の態様を示し
ている。（ａ）a,b,c,dは四極子電極を示している（金
属被覆ネハーキャピラリーまたは平坦試料キャリヤー
（シリコン、硝子およびその他の基剤）上の微細構造に
金属蒸着した電極）;e、ｆは六極子電極の場合（例えば
１つまたは２つの対物レンズの金属蒸着したエマージェ
ンス・レンズ）。調整はx,y,z方向で行う。（ｂ）エッ
チングした電極チャンネルを有する平坦キャリヤー、ま
たは電場内で荷電分子の運動をコントロールしうるLIGA
技術で調製したキャリヤーの使用。ｅおよびｆの底板は
六極子電極同様に被覆した、または金属蒸着カバーで被
覆した対物レンズでありうる。（ｃ）キャピラリー末端
の電極（約±０−100V）および接地電圧（0V）の電極を
含む大容量受容のための鉱物（例えば、硝子、シリコ
ン、または電気浸透キャピラリー効果を防ぐテフロン等
のプラスチック）からできたキャピラリー。
第21図は電気的トラップによる荷電分子の検出の可能
性を説明している。（ａ）もしターゲット分子が四極子
または六極子電場内に存在するなら、その分子は電極a,
b,c,d上のランダム振動電場で強制運動を起こさせられ
る。これらは本発明にしたがって計数しうる。（ｂ）ト
ラップ内の分子の位置はマルチエレメント検出器で認識
しうる。正のフィードバックで四極子／六極子電場を調
整し、分子ジェット（gets）は決まった領域／容積エレ
メント内の位置に固定される。
第22図はウイルスゲノムに流行病学的に保存されてい
る遺伝子セグメントの分析を示している。種々のウイル
ス種のDNA/RNA混合物はセグメント毎、各々標識化した
カウンター鎖プローブで標識し、過剰の非標識プローブ
による置換実験に使用する。融解温度以下での遊離した
標識プローブの迅速な出現は、多くのウイルス種が多く
のミスマッチを含んでプローブと複合体を形成している
ことを示している。これらの領域では、ウイルス種は明
らかに非常に不均一である。
第23図では、相互相関によって同時にゲノムセグメン
ト上のいくつかの突然変異の少なくとも１つの存在を示
すための本発明の方法を説明している。非標識フラグメ
ントの混合物を分析するDNAまたはRNA混合物に添加す
る。色素F2を含むプローブｐのハイブリダイゼーション
は、もし検索している突然変異の１つが存在するなら
ば、色素F1で標識した少なくとも１つのプローブm1−m6
の同時のハイブリダイゼーションと相関していなければ
ならない。プローブm1−m6は変異した配列に各々相補的
であり、ストリンジェント条件下野生型配列の二本鎖構
造は効率的に形成できない。分析する核酸の望ましい濃
度は10-10−10-14Mであり、一方プローブは望ましくは1
0-8−10-11Mの濃度で提供される。
第24図は本発明の小さい励起容積（ａ）、小さい測定
容積（ｂ）および平行測定の小さい容積（ｃ）を示して
いる。（ａ）プレ・フォーカス無しの励起光の断面図が
本発明の小さい測定容積の像と共に示されている。色素
標識の光不活性化が実際の測定容積に入る前に起こり、
測定容積内の有効濃度が実際の濃度よりも低くなる領域
が形成される。このことはプレ・フォーカスした励起光
を照射し、かつ対物板中のピンホール開口で結像するこ
とにより大部分防止された。光強度がガウス分布してい
るガウス容積が形成される（ｂ）。（ｃ）は小さい測定
容積の望ましい像と共にプレ・フォーカスを伴う平行照
射励起光の断片、または試料容積内の種々の空間座標を
持つ種々の容積エレメントの連続照射および測定を示し
ている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５９５ Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ 33/58 27/26 ３２５Ａ (31)優先権主張番号 Ｐ４３４２７０３．０ (32)優先日 平成５年12月15日(1993．12．15) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） 前置審査 (72)発明者 ヘンコ・カルステン ドイツ連邦共和国、エルクラス Ｄ― 40699、キルヒベルク ４ (72)発明者 ウロ・メッツ エストニア、タリン ＥＥ―0013、テド レ 24 (72)発明者 イェルカー・ビデングレン スウェーデン、ソルナ Ｓ―17132、ス ヨベゲン ２ (72)発明者 ミハエル・シュトゥケ ドイツ連邦共和国、ゲッチンゲン Ｄ― 37077、アウフ・デル・リース 36 (72)発明者 ミハエル・ブリンクマイヤー ドイツ連邦共和国、ゲッチンゲン Ｄ― 37077、ハノーファーシェ・シュトラー セ 134 (72)発明者 ウォルフガング・ジム ドイツ連邦共和国、ロスドルフ Ｄ― 37124、シュタイン・フルルベーク ２ ベー (72)発明者 オラフ・レーマン ドイツ連邦共和国、ゲッチンゲン Ｄ― 37077、シーエ・シュトラーセ 19 (56)参考文献 特開 昭52−96089（ＪＰ，Ａ) Ｒｕｄｏｌｆ Ｒｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎ ｄ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｓｉｎｇ ｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｓ Ｏｂ ｓｅｒｖｅｄ ｂｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃ ｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｓ ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，ＦＬＵＯＲＥ ＳＣＥＮＣＥ ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰ Ｙ，1992年，Ｐａｇｅ．13−24 Ｐ．Ｋａｓｋ ｅｔ ａｌ．，Ｆｌｕ ｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｏｒｒｅｌａｔ ｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｉ ｎ ｔｈｅ ｎａｎｏｓｅｃｏｎｄ ｔ ｉｍｅ ｒａｎｇｅ：Ｐｈｏｔｏｎ ａ ｎｔｉｂｕｎｃｈｉｎｇ ｉｎ ｄｙｅ ｆｌｕｏｒｅ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂ ｉｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｊｏｕｒｎａｌ, 1985年，Ｖｏｌ．12，Ｎｏ．３，Ｐａｇ ｅ．809−815 Ｎ．Ｏ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａ ｌ．，Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｅ ｓｃｅｎｃｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｂｉｏｐ ｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，1986 年，Ｖｏｌ．49，Ｎｏ．４，Ｐａｇｅ. 809−815 Ａｒｔｈｕｒ Ｇ．Ｐａｌｍｅｒ Ｉ ＩＩ ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｔｉｃａｌ ｓｐａｔｉａｌ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｏｒｄｅｒ ａｕｔｏｃｏｒｒｅｌａｔ ｉｏｎ ｉｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃ ｅ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ａｐｐ ｌｉｅｄ Ｏｐｔｉｃｓ，1989年，Ｖｏ ｌ．26，Ｎｏ．６，Ｐａｇｅ．1214− 1220 Ｒｕｄｏｌｆ Ｒｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｏｆ Ｓ ｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ Ｔｈ ｒｏｏｕｇｈ ａ Ｇａｕｓｓｉａｎ Ｌａｓｅｒ Ｂｅａｍ，Ｌａｓｅｒ Ｓ ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ Ｂｉｏ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，1992年，Ｐａｇ ｅ．239−247 Ｊ．Ｒｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉ ｒｅｃｔ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏ ｆ ａ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｃｏｒｒｅ ｌａｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｃｒｏｓ ｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ，Ｐｈｙｓ ｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ａ，1989年, Ｖｏｌ．39，Ｎｏ．５，Ｐａｇｅ．2646 −2652 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 21/62 - 21/74 G01N 33/48 - 33/98 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (82)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】分析する分子−リガンド複合体の拡散経路
    が短いレーザー励起蛍光相関分光光度法（以下FCS）を
    用いて、試料容積に含まれる少なくとも１つの10-14リ
    ットル以下の測定容積または多数の該測定容積におい
    て、発光性リガンドと測定されるべき分子との直接相互
    作用によって形成される分子−リガンド複合体の発光を
    測定し、 前記測定から、前記分子−リガンド複合体の１つ以上の
    物質特異的パラメータを決定し、 前記物質特異的パラメータから、１つまたは複数の前記
    分子を同定する方法であって、 前記分子は、１μＭ以下の濃度に希釈されており、 前記物質特異的パラメータは、並進拡散係数、回転拡散
    係数、励起および発光波長、発光置換基の各励起状態の
    寿命、またはこれらの測定量の組み合わせであり、 前記発光性リガンドは、量子収率0.1以上で30,000以上
    の吸光係数を有することを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】前記測定されるべき分子と発光性リガンド
    との直接相互作用によって形成された、定常的または非
    常にゆっくり拡散する発光複合体を分析するために、測
    定容積に対し試料容積を動かすことにより、または経時
    的にレーザービーム光の位置を変化させることにより、
    または検出光学系の焦点の位置を変化させることによ
    り、又はそれらの組み合わせにより、測定容積の空間座
    標を分析中に試料容積の空間座標に対して変化させる、
    但し、測定した並進拡散係数が実質的な並進拡散係数と
    測定容積の座標の上に載せた相対的位置の変化との組み
    合わせに対応していることを特徴とする請求項１に記載
    の方法。
  3. 【請求項３】前記測定容積の座標の経時変化が、定常的
    または非常にゆっくり拡散する発光分子複合体の見かけ
    の拡散時間を規定することを特徴とする請求項２に記載
    の方法。
  4. 【請求項４】前記レーザー励起FCSを用いた測定が、並
    進拡散、又は回転拡散、又は並進及び回転拡散の測定を
    用いて、存在する分子の絶対数の測定により、又は前記
    分子数の経時変化の測定により、又はそれらの組み合わ
    せによって行われる請求項１乃至３のいずれか１項に記
    載の方法。
  5. 【請求項５】前記複合体がイオン性または非イオン性で
    ある請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】前記測定が時間に対して一定または変化す
    るスーパーインポーズされた（superimposed）電場また
    は磁場中で行われることを特徴とする請求項１乃至５の
    いずれか１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】試料容積のイオン性複合体が測定容積を通
    過すること、または短時間、測定容積中に留まることを
    直流電場または交流電場で強制する請求項５又は６に記
    載の方法。
  8. 【請求項８】電気的分子トラップを使用する場合、発光
    性リガンドが複合体を作るターゲット分子よりも小さい
    荷電を有するか、またはターゲット分子の荷電と反対荷
    電を有することを特徴とする請求項６または７に記載の
    方法。
  9. 【請求項９】前記測定が、遊離した発光性リガンドを特
    に複合体化した発光性リガンドから分離するための電気
    泳動分離法と組み合わされることを特徴とする請求項１
    乃至８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】検出すべき発光性リガンドと分子との複
    合体を第１の電気泳動ステップで予備濃縮し、かつ検出
    すべき複合体を第２の電気泳動ステップで測定容積に輸
    送することを特徴とする請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記測定容積が、エマージェンス対物レ
    ンズから1000μｍ以下の作動距離に配置され、該対物レ
    ンズは直接試料容積に接しているか、または試料容積が
    透明シートでエマージェンス対物レンズから分離されて
    いることを特徴とする請求項１乃至10のいずれか１項に
    記載の方法。
  12. 【請求項１２】前記測定されるべき分子、又は測定され
    るべき分子の平衡混合物、又は測定されるべき分子と発
    光性リガンドとの複合体形成の反応速度過程は、少なく
    とも１つの試料容積で分析されることを特徴とする請求
    項１乃至11のいずれか１項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】複数の試料容積の場合、該試料容積が二
    次元配列の二次元キャリアー上、又は線状に配列する請
    求項１乃至12のいずれか１項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】前記試料容積は、天然若しくは試験管内
    で修正した細胞内若しくは細胞上、又は人工的に調製し
    たベシクル構造中に存在する請求項１乃至13のいずれか
    １項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記各試料容積がマイクロディスペンシ
    ング・システムを用いて生成されることを特徴とする請
    求項１乃至14のいずれか１項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記測定されるべき分子は、スクリーニ
    ング操作において調べられるレセプターであり、該スク
    リーニング操作において、薬学的に活性のある物質を、
    レセプターに対する発光標識リガンドの結合で該相互作
    用を検定する事による特異的レセプターとの相互作用に
    より分析し、そのキャリヤー細胞上の天然のレセプタ
    ー、ならびにレセプターを過剰発現するキャリヤー細胞
    上のレセプター、または発現された分子または分子複合
    体の形のレセプターを使用することを特徴とする請求項
    １乃至15のいずれか１項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】前記測定されるべき分子が、特異的レセ
    プターまたは生細胞の細胞内物質のいずれかであり、試
    料容積内で特異的レセプターまたは生細胞の細胞内物質
    と潜在的活性物質との相互作用の分析において、細胞の
    主要な部分が分裂可能か、または代謝的に活性を維持し
    ていることを特徴とする請求項１乃至16のいずれか１項
    に記載の方法。
  18. 【請求項１８】潜在的活性物質と前記測定されるべき分
    子との特異的認識反応の検出のために、発光性リガンド
    が添加され、次いで前記分子と発光性リガンドとの間の
    相互作用が調べられる請求項１乃至17のいずれか１項に
    記載の方法。
  19. 【請求項１９】潜在的活性物質が複雑な天然、合成また
    は半合成混合物中に存在し、かつ、該混合物が、分析前
    にクロマトグラフィーで分離されることを特徴とする請
    求項18に記載の方法。
  20. 【請求項２０】前記発光性リガンドが、クロマトグラフ
    ィーでの分離の後に、分離された混合物画分に添加され
    る請求項18または19に記載の方法。
  21. 【請求項２１】前記クロマトグラフィーの代わりに、試
    料ディスペンサーを使用することを特徴とする請求項19
    または20に記載の方法。
  22. 【請求項２２】前記測定されるべき分子が、相同的な相
    補的核酸分子であり、かつ前記発光性リガンドが、標識
    した核酸プローブであり、試料容積中の相同的な相補的
    核酸分子のタイプまたは数をハイブリダイゼーションに
    より、少なくとも１つの標識した核酸プローブを用いて
    分析することを特徴とする請求項１至21のいずれか１項
    に記載の方法。
  23. 【請求項２３】核酸検出を目的とした標識プローブとし
    ては、合成または細胞性RNAまたはDNA型の特定の極性を
    有する（＋または−鎖）過剰成分としての一本鎖核酸を
    使用することを特徴とする請求項22に記載の方法。
  24. 【請求項２４】ハイブリダイゼーションにおける複合体
    形成の反応速度がカオトロピック塩、または有機溶媒、
    またはそのいずれをも含む媒体中で検定を行うことで促
    進されることを特徴とする請求項22または23に記載の方
    法。
  25. 【請求項２５】ハイブリダイズした核酸の相補性の程度
    を複合体の熱力学的安定性を介して分析することを特徴
    とする請求項22乃至24のいずれか１項に記載の方法。
  26. 【請求項２６】相補的核酸の検出が内部標準を用いて定
    量され、該内部標準が少なくとも１つの点突然変異で定
    量される核酸の配列と区別され、かつ該分析が内部標準
    とプローブの複合体および分析する核酸分子とプローブ
    の複合体の種々の構造が、色素分子で標識された核酸プ
    ローブの並進拡散、または回転拡散、又はその両方に関
    して区別される温度で行われることを特徴とする請求項
    22乃至24のいずれか１項に記載の方法。
  27. 【請求項２７】前記複合体を、発光性リガンドおよび測
    定されるべき分子との複合体の間のサイズ、または形、
    またはその両方の差を増加する目的で添加される少なく
    とも１つの付加的リガンドと反応させることを特徴とす
    る請求項１〜26のいずれか１項に記載の方法。
  28. 【請求項２８】前記測定されるべき分子と第一の発光性
    リガンドとの直接相互作用の特異性を、少なくとも第二
    の発光性リガンドを用いて二重複合体化することにより
    増加し、前記第二の発光性リガンドの蛍光色素の励起に
    適合する発光波長を有するように、少なくとも１つの第
    一の発光性リガンドが標識されており、かつ前記第二の
    発光性リガンドの蛍光が検出されることを特徴とする請
    求項１乃至27のいずれか１項に記載の方法。
  29. 【請求項２９】少なくとも２つの測定されるべき分子
    が、少なくとも２つの独立した異なる色素で標識され、
    かつ、異なる波長の光で励起されるか、または異なる発
    光波長の光で独立して検出される２つの異なる発光性リ
    ガンドとの反応により、１回の検定の１つの試料で一緒
    に分析されることを特徴とする請求項１乃至28のいずれ
    か１項に記載の方法。
  30. 【請求項３０】特定の測定されるべき分子が、少なくと
    も１つの光学的に異なる蛍光分子で各々標識された少な
    くとも２つの発光性リガンドと同時に複合体を形成し、
    該同時複合体形成がエネルギー転移複合体の形成、また
    は異なる励起若しくは発光波長を有するシグナルの時間
    相関によって検出されることを特徴とする請求項１乃至
    29のいずれか１項に記載の方法。
  31. 【請求項３１】ベシクル構造の混合物中の測定されるべ
    き分子を、該ベシクルを蛍光標識抗体で染色すること、
    または蛍光標識された発光性リガンドを特異的および持
    続的にベシクル構造に取り込むことにより分析すること
    を特徴とする請求項１乃至30のいずれか１項に記載の方
    法。
  32. 【請求項３２】前記測定されるべき分子が試験管内タン
    パク質生合成の産物であり、該産物を、特異的結合性ま
    たは酵素特性に関して分析することを特徴とする請求項
    １乃至31のいずれか１項に記載の方法。
  33. 【請求項３３】前記測定されるべき分子がオリゴマーま
    たはポリマー分布物であり、該オリゴマーまたはポリマ
    ー分布物が平均並進拡散係数、または平均回転拡散係
    数、又はそれらの両方、およびそれぞれの分布の半値幅
    に関して分析されることを特徴とする請求項１乃至32の
    いずれか１項に記載の方法。
  34. 【請求項３４】前記測定が、蛍光の偏向解消の検出を目
    的とした検定法として開発されたキット・システムを使
    用して行われる請求項１乃至33のいずれか１項に記載の
    方法。
  35. 【請求項３５】固定化細胞、組織、オルガネラ、ゲル構
    造体のような三次元的構造を有する試料容積中における
    ダイナミック・プロセスまたは反応速度プロセスの二次
    元的または三次元的結像を目的として使用される請求項
    １〜34のいずれか１項に記載の方法。
  36. 【請求項３６】評価すべき測定容積を反応条件に同時に
    または連続的にさらし、かつ、限定した反応時間後、反
    応産物の分析を行うことによる特異的物質の転換または
    発光性リガンドの結合反応の反応効率の測定を目的とし
    て使用される請求項１乃至34のいずれか１項に記載の方
    法。
  37. 【請求項３７】特異的分子、又は分子複合体、又は分子
    若しくは分子複合体の分子環境を、定性的又は定量的に
    見出すことを目的として使用される請求項１〜34のいず
    れか１項に記載の方法。
  38. 【請求項３８】生理学的に活性なレセプターの測定若し
    くは評価、又はレセプター結合リガンド若しくはリガン
    ド複合体の評価を目的として使用される請求項１〜34の
    いずれか１項に記載の方法。
  39. 【請求項３９】発光団保有リガンドと検索分子のレセプ
    ター分子への競合的結合を測定することによるラジオイ
    ムノアッセイまたは酵素結合イムノアッセイの代替法と
    して使用される請求項１乃至34のいずれか１項に記載の
    方法。
  40. 【請求項４０】複雑な分子集合体、複雑な化学反応生産
    物、化学反応で合成された生産物の複雑なシステム、又
    は細胞合成産物としての二次代謝物の複雑な混合物を分
    析することを目的として使用される請求項１乃至34のい
    ずれか１項に記載の方法。
  41. 【請求項４１】複雑な物質混合物の分析を分析的分画を
    含めてオンラインで行うために使用される請求項１乃至
    34のいずれか１項に記載の方法。
  42. 【請求項４２】分子、分子複合体、または細胞の移動度
    の測定を目的として使用される請求項１乃至34のいずれ
    か１項に記載の方法。
  43. 【請求項４３】非常に希釈した溶液の小さな測定容積に
    おける蛍光の励起のためのレーザーフォーカシング用、
    および次の測定のための発生した蛍光の共焦点的結像用
    として知られている顕微鏡光学系を含み、高開口数の光
    学システムを少なくとも１つ使用し、光量は顕微鏡の対
    物レンズの後ろにある結像板にある共焦点的に配置した
    ピンホール開口で制限されている装置を使用する請求項
    １乃至34のいずれか１項に記載の方法。
  44. 【請求項４４】前記開口数が1.2以上であることを特徴
    とする請求項43に記載の方法。
  45. 【請求項４５】前記装置は、測定シグナルの生成側に、
    レーザー光（21）をプレ・フォーカシングするための装
    置（20）、該レーザー光（21）を屈折させるための二色
    性ミラー（30）、および測定容積にレーザー光をフォー
    カスするための付加的レンズ（40）が提供され、かつ、
    観察ユニットが光子計数装置（52）、相関装置（71）、
    およびマルチチャンネル・スケーラー装置（72）を有す
    る、測定シグナルを生成するユニットおよび観察ユニッ
    トを含むレーザー光の回折制限フォーカシングを行うた
    めの装置である請求項43又は44に記載の方法。
  46. 【請求項４６】測定シグナルが、コンピューターで処理
    及び／又は評価される請求項45に記載の方法。
  47. 【請求項４７】前記装置は、プレ・フォーカシングのた
    めの装置（20）に顕微鏡光学系に相当するレンズ（22）
    およびアレイ（23）が提供され、光軸を合わせたレーザ
    ー光（21）がレンズＬにより結像板B1上におよび前記ア
    レイ（23）により結像板B2（第１像）上にフォーカスさ
    れる装置である請求項43又は44に記載の方法。
  48. 【請求項４８】前記アレイ（23）にプレ・フォーカスし
    たレーザー光（21）の径を変化させるための交換可能な
    レンズが提供される請求項47に記載の方法。
  49. 【請求項４９】前記装置において、検出ユニットが、試
    料から検出器（53,54）に発せられる光（55）を分離す
    るビーム・スプリッター（60）を有する２つの検出器
    （53,54）によって構成される請求項45乃至48のいずれ
    か１項に記載の方法。
  50. 【請求項５０】前記装置において、発生した光（55）が
    各検出器（53,54）の前に結像レンズ（56,57）およびフ
    ィルター・エレメント（58,59）を通過する請求項49に
    記載の方法。
  51. 【請求項５１】前記装置において、検出器（53,54）が
    異なる波長の光を検出する請求項45乃至50のいずれか１
    項に記載の方法。
  52. 【請求項５２】前記装置において、１つ以上の検出器エ
    レメント又は検出器アレイが結像板に設置される43乃至
    51のいずれか１項に記載の方法。
  53. 【請求項５３】前記装置において、ピンホール開口（5
    0）が光路（55）に配置される請求項45乃至52のいずれ
    か１項に記載の方法。
  54. 【請求項５４】前記装置において、90゜を超える角度を
    とるような２つの対物レンズを使用することを特徴とす
    る請求項43乃至53のいずれか１項に記載の方法。
  55. 【請求項５５】前記装置において、発光波長＞200nmの
    波長を有する連続レーザー、または出力0.5mW以上で20M
    Hz以上の高周波数を有するパルスレーザーを光源として
    使用することを特徴とする請求項43乃至54のいずれか１
    項に記載の方法。
  56. 【請求項５６】前記装置において、発光を検出するため
    に単一光子計数を目的とした装置が発光経路中に配置さ
    れ、かつ、シグナル分析をデジタル相関器またはマルチ
    チャンネルカウンターで行う請求項43乃至55のいずれか
    １項に記載の方法。
  57. 【請求項５７】前記装置において、測定容積が２つのキ
    ャピラリー間の試料容積内に固定され、該キャピラリー
    は外側に化学的に不活性な導電性コーティングが施さ
    れ、前記導電性コーティングはコンピュータ・コントロ
    ールされる直流電場または交流電場に連結され、さらに
    測定容積を通して互いに電気的に連結されている請求項
    43乃至56のいずれか１項に記載の方法。
  58. 【請求項５８】前記装置において、互いに向き合う２つ
    の顕微鏡光学系が測定部分を囲んでいる請求項43乃至57
    のいずれか１項に記載の方法。
  59. 【請求項５９】前記装置に、分析する試料または洗浄液
    のチャージ／ディスチャージを目的とした少なくとも１
    つの口を有する少なくとも１つの電気泳動セル、壁電
    極、リング電極、ネハー（Neher）キャピラリー、キャ
    ピラリー末端の電極および液滴出口を有する電気泳動の
    付加的な装置が提供される請求項43乃至58のいずれか１
    項に記載の方法。
  60. 【請求項６０】前記装置において、四個の電極を有する
    電気トラップ、又は六極子配置の前記四個の電極と少な
    くとも２つの付加的電極との組み合わせを使用する請求
    項59に記載の方法。
  61. 【請求項６１】前記装置において、試料を受け取ること
    を目的としたシートは、分子誘導体化による分子に対す
    る特異的結合性を有している請求項59又は60に記載の方
    法。
  62. 【請求項６２】前記装置において、試料容積が二次元ま
    たは三次元的にコントロール可能な試料受容装置に固定
    されている請求項59乃至61のいずれか１項に記載の方
    法。
  63. 【請求項６３】前記装置が、限定された座標においてレ
    ーザー光を屈折するか、または焦点位置を明確に決定し
    うる装置を装着する請求項59乃至62のいずれか１項に記
    載の方法。
  64. 【請求項６４】いくつかの小さい測定容積を共通するよ
    り大きい、若しくはいくつかの小さい励起容積の内から
    測定容積として分析するか、または試料内の１若しくは
    複数の測定容積の空間座標の変化を伴うか、若しくは伴
    わないで連続的に分析するか、またはそのいずれをも行
    う、いくつかの小さい測定容積中の１つ以上の分子を同
    定することを目的とした請求項１に記載の方法。
  65. 【請求項６５】全てまたはいくつかの測定容積を含む励
    起容積を照射する光学系を有する、またはいくつかの励
    起容積の平行照射を行う光学システムを有するマルチア
    レイ検出器を使用する装置を使用する、請求項１乃至34
    のいずれか１項に記載の方法。
  66. 【請求項６６】蛍光光度法を用いて測定容積中の、１μ
    Ｍ以下の濃度に希釈した１つ以上の分子、分子複合体、
    または分子フラグメント、またはそれらの組み合わせを
    検出することを目的とした装置であって、 （ａ）第１の波長のレーザー光を発生するためのレーザ
    ー光発生装置、 （ｂ）測定容積内にレーザー光を高度にフォーカスし、
    レーザー光が基本的に測定域のみをカバーするような測
    定容積にレーザー光をフォーカスすることを目的とした
    フォーカシング装置、 （ｃ）一つ以上の分子、分子複合体および／または分子
    フラグメントのレーザー光励起によって発生した蛍光を
    検出することを目的とした検出装置、および （ｄ）検出装置によって検出される蛍光量を制限するた
    めの測定容積に対して共焦点的に蛍光の光路内の板に配
    置されたピンホール開口、 以上（ａ）乃至（ｄ）の装置を含む装置 を使用する、請求項１乃至34のいずれか１項に記載の方
    法。
  67. 【請求項６７】前記装置において、測定容積および対物
    板間のイメージ・スケールが1:100、1:60または1:40で
    あり、かつ、測定容積は各方向に0.1μｍ以下の大きさ
    を有する場合、前記ピンホール開口が各々直径約10μ
    ｍ、６μｍまたは４μｍである、請求項66に記載の方
    法。
  68. 【請求項６８】前記装置において、レーザー光に関する
    光学系、または蛍光、またはその両方に関する光学系が
    高開口数を有することを特徴とする請求項66又は67に記
    載の方法。
  69. 【請求項６９】前記開口数が1.2以上であることを特徴
    とする請求項68に記載の方法。
  70. 【請求項７０】前記装置において、測定容積がフォーカ
    シング装置から最大1,000μｍまで離れていることを特
    徴とする請求項66乃至69のいずれか１項に記載の方法。
  71. 【請求項７１】前記装置において、フォーカシング装置
    がレーザー光をプレ・フォーカスするためのプレ・フォ
    ーカシング装置および測定容積上にプレ・フォーカスさ
    れたレーザー光をフォーカスするためのフォーカシング
    対物レンズを有することを特徴とする請求項66乃至70の
    いずれか１項に記載の方法。
  72. 【請求項７２】前記装置において、フォーカシング対物
    レンズと測定容積の間の距離が1,000μｍ以下であるこ
    とを特徴とする請求項70または71に記載の方法。
  73. 【請求項７３】前記装置において、プレフォーカシング
    装置とフォーカシング対物レンズの間に半透明の鏡を置
    き、フォーカシング対物レンズにプレ・フォーカスした
    レーザー光を屈折させることを特徴とする請求項71に記
    載の方法。
  74. 【請求項７４】前記装置において、フォーカシング対物
    レンズに面さない半透鏡側にピンホール開口を配置する
    ことを特徴とする請求項73に記載の方法。
  75. 【請求項７５】前記装置において、検出装置が蛍光を検
    出するための少なくとも一つの検出器を有することを特
    徴とする請求項66乃至74のいずれか１項に記載の方法。
  76. 【請求項７６】前記装置において、ピンホール開口と検
    出装置の間に少なくとも一つの光学フィルター、または
    少なくとも一つ以上の結像レンズ、または少なくとも一
    つの半透鏡、または少なくとも一つの反射鏡、またはそ
    れらの組み合わせを配置することを特徴とする請求項66
    乃至74のいずれか１項に記載の方法。
  77. 【請求項７７】前記装置は、第一の波長と異なる波長の
    付加的レーザー光を発生するための付加的レーザー光発
    生装置、基本的に付加的レーザー光が測定容積を独占的
    にカバーするように高度に測定容積に前記付加的レーザ
    ー光をフォーカスするための付加的フォーカシング装
    置、一つ以上の分子、分子複合体、または分子フラグメ
    ント、またはその両方の励起によって生成する蛍光の検
    出を目的とした付加的検出装置、および二つの検出装置
    を連結する相関ユニットを特徴とする請求項66乃至76の
    いずれか１項に記載の方法。
  78. 【請求項７８】前記装置は、 （ａ）第一の支持アーム（65）と第一の支持アーム（6
    5）に直行して連結された第二の支持アーム（74）を含
    むＴ型支持体、 （ｂ）二つのレーザー光および二つの蛍光に対する光学
    エレメント（レンズ、フィルター、ミラー、検出器）の
    光軸を合わせ、これらを支持する第二の支持アーム（7
    4）に面して末端に配置された支持装置（83,84）であっ
    て、フォーカスされたレーザー光が、測定容積を有し、
    かつ、第二の支持アーム（74）に面するように支持さ
    れ、その両端間で望ましくは中間に分離可能なように配
    置されているガラススライド上に入射される装置、 （ｃ）二つの支持装置（83,84）が長さ方向に第二の支
    持アーム（74）に面して各末端と同期して動くことがで
    き、二つの支持装置（83,84）が第一の支持アーム（6
    5）の伸長方向に張り出し、二つのレーザー光が支持装
    置（83,84）で支持されているレーザー光の光学エレメ
    ント上に第一の支持アーム（65）の内側から光学的開口
    （69）を通して屈折鏡、または半透鏡（66,67,72,7
    3）、またはその両方によって屈折されうる、 以上（ａ）乃至（ｃ）の事項を特徴とする請求項77に記
    載の方法。
  79. 【請求項７９】前記装置は、レーザー光用の光学エレメ
    ントが二つの支持装置（83,84）の内側に互いに向き合
    うように配置されており、かつ、蛍光用の光学エレメン
    トが二つの支持装置（83,84）の外側に互いに向き合わ
    ないように配置されていることを特徴とする請求項78に
    記載の方法。
  80. 【請求項８０】前記装置において、フォーカシング対物
    レンズの一つが、ピエゾ素子で動かされる調節エレメン
    トで位置決めされうることを特徴とする請求項78または
    79に記載の方法。
  81. 【請求項８１】蛍光相関分光光度法（FCS）が、検出さ
    れるシグナルの自己相関によって行われる請求項１乃至
    80のいずれか１項に記載の方法。
  82. 【請求項８２】蛍光相関分光光度法（FCS）が、異なる
    波長のシグナルの相互相関によって行われる請求項１乃
    至80のいずれか１項に記載の方法
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