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In der Mikroskopie, insbesondere der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS), wie diese beispielsweise vom ConfoCor der Anmelderin bekannt ist, werden die von einzelnen Fluoreszenzereignissen erzeugten und über sogenanntes Single Photon Counting detektierten zeitlichen Signalfolgen zur Auswertung entweder mit sich selbst zeitlich korreliert (Autokorrelation) oder mit der zeitlichen Signalfolge eines zweiten Eingangskanals zeitlich korreliert (Kreuzkorrelation). Die Korrelationsauswertung erfolgt mittels spezieller hardwaremäßiger Korrelatoren, wie diese beispielsweise von der Firma ALV-Laser Vertriebsgesellschaft, Langen, Deutschland unter der Bezeichnung „5000 Multiple Tau Correlator” angeboten werden. Derartiger Korrelatoren arbeiten nach dem sogenannten Multiple-Tau-Verfahren, bei dem die Eingangssignale jeweils über eine Korrelationsstufenzeit miteinander multipliziert und die dabei entstehenden Produkte addiert werden, wobei stufenweise die Korrelationsstufenzeit logarithmisch verlängert wird. Vorteil dieses Verfahrens ist, daß auch bei längeren Korrelationszeiten der Rechenaufwand relativ gering bleibt. Nachteilig ist jedoch, daß durch die Zusammenfassung der Eingangssignale in den höheren Korrelationsstufen eine Tiefpaßfilterung erfolgt. Außerdem gehen die Originaldaten verloren, so daß eine Bearbeitung und nachfolgende erneute oder anderweitige Auswertung nicht möglich ist.
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Für die Korrelationsauswertung eines einzigen Kanals mit einzelnen Impulssignalen, also einer Signalfolge, die binäre Daten 0 und 1 liefert, wobei die 1 nur gelegentlich auftritt, ist es bekannt, den Eingangskanal mit einer festen Frequenz abzutasten und lediglich die Zeitabstände zwischen den einzelnen Impulsen aufzuzeichnen und zu speichern. Die Korrelationsberechnung erfolgt dann einfach durch die Bestimmung aller aufgetretenen zeitlichen Impulsabstände in der Impulsfolge. Eine Anwendung dieses Verfahrens auf die Signale mehrerer Eingangskanäle ist jedoch nicht bekannt.
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Aus der
US 5,909,278 A ist ein Verfahren zur zeitaufgelösten Fluoreszenzanalyse bekannt. Dabei wird eine Integration angewendet, bei der die innerhalb eines vordefinierten Zeitfensters nach einem Anregungsimpuls detektierten Signale aufintegriert werden.
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Aus der
US 5,754,449 A ist die Datenaufzeichnung von mehreren Kanälen bekannt. Bei den detektierten Ereignissen handelt es sich jedoch nicht um Impulssignale. Gemäß dem hier beschriebenen Verfahren wird der Aufzeichnungszeitraum in eine Anzahl diskreter Zeitfenster aufgeteilt und jedem Zeitfenster wird ein bestimmter Speicherbereich in einem Speicher zugeordnet. Auftretende Ereignisse werden dann jeweils in dem Speicherbereich abgespeichert, der dem Zeitfenster, in dem das Ereignis eingetreten ist, zugeordnet ist. Wenn ein Speicher überläuft, werden neu eintretende Ereignisse nur dann abgespeichert, und der Speicher entsprechend überschrieben, wenn die nachfolgenden Ereignisse einen höheren Rang als die abgespeicherten Ereignisse aufweisen. Dazu wird jedem Ereignis ein entsprechender Rang zugeordnet.
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In der
US 5,226,153 A ist eine Verfahren und eine Vorrichtung beschrieben, um die Arbeit und die Leistungsfähigkeit eines Computers während dessen Betrieb zu beobachten. Dazu hat das System einen Triggercontrol, der dann, wenn bestimmte Ereignisse eintreten, ein Triggersignal erzeugt. Dieses Triggersignal löst dann die Datenaufzeichnung für eine vorbestimmte Zeit aus. Weiterhin kann der Triggercontrol so ausgebildet sein, dass er in bestimmten Zeitintervallen ein Triggersignal erzeugt, um dadurch die Datenaufzeichnung zu starten. Bei dem in dieser Schrift beschriebenen System wird vom Triggercontrol auch ein Zeitsignal erzeugt, das ebenfalls mit den aufgezeichneten Daten abgespeichert wird. Dieses Zeitsignal ist jedoch nicht von der Zeitdauer seit der letzten Speicherung abhängig.
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In der
US 4,811,249 A ist ein weiterer Datalogger beschrieben. Bei diesem Datalogger werden zunächst die eingehenden Daten mit hoher Zeitauflösung abgespeichert. Wenn der Datenspeicher voll ist, werden die Daten zu einer relativ groben Zeitauflösung zusammengefasst. Danach aufgezeichnete Daten werden dann nur noch bei der großen Zeitauflösung erfasst.
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Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Aufzeichnung von Impulssignalen mehrerer Eingangskanäle, das eine möglichst kompakte Speicherung der Information ohne Informationsverlust ermöglicht.
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Dieses Ziel wird durch Verfahren mit den Merkmalen der Ansprüche 1 und 2 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der abhängigen Ansprüche.
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Bei einer ersten Ausführungsform der Erfindung werden die mehreren Eingangskanäle mit einer vorgegebenen festen Frequenz auf auftretende Ereignisse abgetastet und nach Detektion eines Ereignisses in einem der Eingangskanäle oder nach Überlauf eines Zählers – je nach dem welches Ereignis von beiden zuerst eintritt – wird der aktuelle Zustand aller Eingangskanäle in einem Speicherregister zusammen mit einer den Zeitabstand zur letzten Abspeicherung charakterisierenden Größe gespeichert.
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Bei einer zweiten Ausführungsform der Erfindung werden ebenfalls die mehreren Eingangskanäle mit einer vorgegebenen festen Frequenz auf auftretende Ereignisse abgetastet. Und auch bei dieser zweiten Ausführungsform erfolgt die Abspeicherung nach der Detektion eines Ereignisses in einem der Eingangskanäle oder nach Überlauf eines Zählers – je nachdem welches der beiden Ereignisse zuerst auftritt. Jedoch werden bei dieser Ausführungsform die Zustande der Eingangskanäle in dem Abtastzyklus, in dem das Ereignis eintritt und zusätzlich für eine vorgegebene Anzahl an Abtastzyklen nach Eintritt des Ereignisses zusammen mit einer den Zeitabstand zur letzten Abspeicherung charakterisierenden Größe abgespeichert.
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Bei beiden Ausführungsformen ist in den abgespeicherten Daten die Information über die Signalfolgen in allen Eingangskanälen vollständig erhalten; durch die vorgenommene Zeit-Abstandskodierung liegen die Rohdaten in einer Form vor, die eine spätere Autokorrelations- und/oder Kreuzkorrelationsauswertung durch Auswertung der Histogramme der zeitlichen Impulsabstände der Eingangskanäle ermöglicht. Der Speicherbedarf ist in beiden Fällen primär von der Häufigkeit der in den Eingangskanälen auftretenden Ereignisse und nur sekundär von der Abtastfrequenz abhängig.
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Bei der ersten Ausführungsform wird in den jeweils abgespeicherten Wörtern für jeden Eingangskanal nur ein einziges Bit benötigt; die verbleibenden Bits jedes Wortes stehen für die Darstellung des Zeitabstands zur letzten Abspeicherung zur Verfügung. Bei zwei Eingangskanälen und Abspeicherung als 16-Bit Wörter ergeben sich damit 14 Bit für die Darstellung des Zeitabstandes. Diese Ausführungsform ermöglicht eine optimal effiziente Ausnutzung des Speicherplatzes bei Signalfolgen, die gemessen an der Dauer eines einzelnen Abtastzyklus nur sehr wenige Ereignisse aufweisen, so daß in den meisten Fällen eine Abspeicherung aufgrund eines Überlaufs des Zählers erfolgt. Bei Ereignisreichen Signalfolgen, bei denen in jedem Abtastzyklus ein Ereignis auftritt, wird jedoch die abzuspeichernde Datenrate sehr hoch.
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Bei der zweiten Ausführungsform wird in jedem abgespeicherten Wort für jeden Eingangskanal eine Anzahl an Bits benötigt, die der Anzahl der vorgegeben Abtastzyklen entspricht, über die die Kanalzustände mit abgespeichert werden, zuzüglich einem weiteren Bit für den Zustand in dem die Abspeicherung auslösenden Abtastzyklus. Bei zwei Eingangskanälen, einer Abspeicherung über jeweils drei dem ersten eintretenden Ereignis oder dem Zählerüberlauf nachfolgende Abtastzyklen und einer Abspeicherung als 16-Bit Wörter werden demzufolge 8 Bit für die Speicherung der Zustande der Eingangskanäle benötigt, so daß nur noch 8 Bit für die Speicherung des Zeitabstands zur letzten vorhergehenden Abspeicherung zur Verfügung stehen. Bei Signalfolgen, die nur sehr selten Ereignisse aufweisen und demzufolge in den meisten Fällen die Abspeicherung durch einen Überlauf des Zählers ausgelöst wird, ist die Abspeicherung gegenüber der ersten Ausführungsform ineffizienter, da für den Zähler nur eine geringere Anzahl an Bits zur Verfügung steht und es entsprechend häufiger zu einem Zählerüberlauf kommt. Dieser Nachteil ist jedoch nicht sehr störend, da bei Signalfolgen mit selten auftretenden Ereignissen der insgesamt benötigte Speicherbedarf gering und deshalb unkritisch ist. Gegenüber der ersten Ausführungsform ist hingegen bei der zweiten Ausführungsform der bei Signalfolgen mit häufig auftretenden Ereignissen benötigte Speicherplatz, und damit auch der maximal benötigte Speicherplatz, deutlich reduziert. So ergibt sich bei dem obigen Zahlenbeispiel und einer Abtastrate von 20 MHz bei der zweiten Ausführungsform eine maximale Speicherrate – wenn in jedem Abtastzyklus ein Ereignis auftritt – von 10 Mbyte/s und ein minimaler Speicherbedarf – wenn kein Ereignis auftritt und die Abspeicherung demzufolge stets durch den Zählerüberlauf ausgelöst wird – von 155 kbyte/s. Im Gegensatz dazu beträgt die maximale Datenrate bei der ersten Ausführungsform bei gleicher Abtastfrequenz 20 Mbyte/s.
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Die entsprechend der Erfindung aufgezeichneten Daten können nachfolgend ausgelesen und/oder bearbeitet werden. Außerdem können die aufgezeichneten Daten auch einer Korrelationsauswertung unterzogen werden, wobei entweder die Daten jedes einzelnen Eingangskanals mit sich selbst korreliert werden (Autokorrelation) oder die Daten zweier Eingangskanäle miteinander korreliert werden (Kreuzkorrelation). Die abgespeicherten Daten liegen dabei bereits in einer für einen linearen Korrelationsalgorithmus, bei dem die Korrelationsfunktion aus dem Histogramm der zeitlichen Impulsabstände verlustfrei, d. h. ohne jeglichen Informationsverlust, berechnet wird, geeigneten Form vor.
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Besonders vorteilhaft ist jedoch die kombinierte Anwendung zweier verschiedener Korrelationsalgorithmen von denen der eine, der lineare Algorithmus, für kurze Korrelationszeiten und der zweite, das Multiple-Tau-Verfahren für längere Korrelationszeiten angewendet wird. Die Grenze zwischen beiden Verfahren, d. h. die Korrelationszeit, die die Grenze zwischen den beiden Algorithmen darstellt, ist dabei bei softwaremäßiger Implementierung vom Benutzer wählbar. Der lineare Algorithmus arbeitet verlustfrei und benötigt bei kurzen Korrelationszeiten geringere Rechenkapazitäten als das Multiple-Tau-Verfahren; dabei steigt die erforderliche Rechenkapazität linear mit der Korrelationszeit an. Die für das Multiple-Tau-Verfahren benötigte Rechenkapazitäten sind dem hingegen begrenzt und nahezu unabhängig von der Korrelationszeit. Die Grenze zwischen den beiden Verfahren wird deshalb sinnvoll bei solchen Korrelationszeiten angesetzt, bei denen die erforderlichen Rechenkapazitäten beider Algorithmen einander entsprechen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere zur Datenaufzeichnung in der Fluoreszenz-Korrelation-Spektroskopie, in der Fluoreszenzsignale aus mikroskopisch kleinen Volumina aufgezeichnet und durch Korrelationsberechnungen ausgewertet werden, bestens geeignet. Entsprechend findet die Erfindung auch vorzugsweise in Verbindung mit konfokalen Mikroskopen Anwendung.
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Nachfolgend werden Einzelheiten der Erfindung anhand der Zeichnungen näher erläutert. Im einzelnen Zeigen:
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1: ein Blockschaltbild für eine Datentaufzeichnungseinrichtung für das erfindungsgemäße Verfahren;
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2: eine Prinzipskizze eines konfokalen Mikroskopes mit Zweikanal-Fluoreszenzdetektion.
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In der 1 sind die mehreren Eingangskanäle mit Kanal 1, Kanal 2 ... Kanal n bezeichnet. Die eingehenden Signale sind binäre Impulssignale, die jeweils aus einer Folge von „0” und „1” bestehen, wobei eine „1” ein aufgetretenes Ereignis darstellt. Soweit die Eingangssignale analog sind, sind sie vor der Datenaufzeichnung in binäre Signale zu transformieren.
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Ein Takt-Oszillator (1) gibt die Abtastfrequenz für die Datenaufzeichnung in einer Einheit (2) vor. Die Abtastfrequenz ist dabei so gewählt, daß in einem Abtastzyklus, also innerhalb der Zeitdauer eines Taktes des Oszillators (1) höchstens ein einziges Ereignis in jedem der Eingangskanäle zu erwarten ist. Die Anzahl der vom Takt-Oszillator vorgegebenen Takte wird von einem Zähler (3) mit M-Bit Datenbreite gezählt. Wenn die Abtastung der Eingangssignale in der Einheit (2) ein Ereignis – also eine binäre „1” – in einem der n Kanäle feststellt bevor ein Überlauf des Zählers (3) stattfindet, wird eine Speicherung der Kanalzustände und des Zählerstandes des Zählers (3) in einem Speicher (4) ausgelöst. Gleichzeitig wird der Zähler wieder auf Null zurückgesetzt. Wird hingegen bis zum Erreichen des Überlaufs des Zählers (3) kein Ereignis in einem der Eingangskanäle festgestellt, so werden ebenfalls die Zustande der Eingangskanäle und der Zählerstand abgespeichert und nachfolgend der Zähler (3) auf Null zurückgesetzt. Die Speicherung eines Datensatzes wird also jeweils ausgelöst, wenn entweder ein Ereignis in einem der Eingangskanäle eintritt oder ein Zählerüberlauf stattfindet, je nachdem welches dieser Ereignisse zuerst auftritt.
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Der Speicher (4) bzw. jedes im Speicher (4) gespeicherte Wort besteht aus zwei Teilbereichen (4a) und (4b). In einem Teilbereich (4b) von M Bit wird der Stand des Zählers (3) und damit ein Maß für die seit der letzten Speicherung vergangene Zeit gespeichert. Im anderen Teilbereich (4a) werden die Zustande der Eingangskanäle binär abgespeichert. Beide Teilbereiche gemeinsam ergeben jeweils im Hexadezimalssystem ein abgespeichertes Wort, das die Information über die Zustände aller Eingangskanäle und der seit der letzten Speicherung vergangenen Zeit enthält. In der Folge der abgespeicherten Wörter ist demzufolge die vollständige Information über die zeitlichen Signalfolgen aller Eingangskanäle mit der durch die Taktfrequenz gegebenen Zeitauflösung enthalten.
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Im ersten Ausführungsbeispiel ist L = 1, d. h. für die Kennzeichnung jedes Eingangskanals wird 1 Bit benötigt. Die verbleibenden Bits stehen demzufolge für die Charakterisierung des Zeitabstandes seit der letzten Speicherung, also für den Stand des Zählers (3) bei Auslösung der Speicherung zur Verfügung.
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Beim zweiten Ausführungsbeispiel ist L ungleich und größer als Eins. In diesem Fall werden für die Kennzeichnung der Zustände jedes Eingangskanals L Bit benötigt. Entsprechend werden bei jeder Abspeicherung die Zustände jedes der Eingangskanäle über L Abtastzyklen aufgezeichnet und gespeichert. Bei L = 4 werden beispielsweise die Zustände der Eingangskanäle in dem Abtastzyklus bt1, in dem das erste detektierte Ereignis auftritt, und in den drei unmittelbar darauf folgenden Abtastzyklen bt2, bt3 und bt4 gespeichert. Für jeden Eingangskanal geben dann die L Bits an, ob und in welchem Abtastzyklus ein Ereignis stattgefunden hat. Die Zuordnung in einem 16-Bit-Wort bei zwei Eingangskanälen kann beispielsweise folgendermaßen aussehen:
| Bits 1–7: | Abtastzyklen, die seit der letzten Speicherung vergangen sind |
| Bit 8: | = 1, wenn Ereignis im Kanal 1 im Zyklus bt1 stattgefunden hat, sonst = 0 |
| Bit 9: | = 1, wenn Ereignis im Kanal 2 im Zyklus bt1 stattgefunden hat, sonst = 0 |
| Bit 10: | = 1, wenn Ereignis im Kanal 1 im Zyklus bt2 stattgefunden hat, sonst = 0 |
| Bit 11: | = 1, wenn Ereignis im Kanal 2 im Zyklus bt2 stattgefunden hat, sonst = 0 |
| Bit 12: | = 1, wenn Ereignis im Kanal 1 im Zyklus bt3 stattgefunden hat, sonst = 0 |
| Bit 13: | = 1, wenn Ereignis im Kanal 2 im Zyklus bt3 stattgefunden hat, sonst = 0 |
| Bit 14: | = 1, wenn Ereignis im Kanal 1 im Zyklus bt4 stattgefunden hat, sonst = 0 |
| Bit 15: | = 1, wenn Ereignis im Kanal 2 im Zyklus bt4 stattgefunden hat, sonst = 0 |
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Die Speicherung eines Wortes erfolgt dann jeweils L-1 Abtastzyklen nachdem das erste Ereignis in einem der Eingangskanäle stattgefunden hat oder nachdem der Zähler seinen Überlauf erreicht hat. Bei Speicherung in 16-Bit Wörtern ergibt sich damit folgende beispielhafte Kodierung, wobei die Low-Bytes die seit der Abspeicherung vergangene Zeit und die High-Bytes die Kanalzustände angeben:
| Wort (hex): | Signalfolge: |
| 197B | Low Byte: 7B (hex) = 123 (dec); high Byte 19 (hex) = 00011001 (bin) In den Abtastzyklen 124 (bt1) und 126 (bt3) wurde ein Ereignis im Kanal 1 und im Abtastzyklus 125 (bt2) ein Ereignis im Kanal 2 detektiert. |
| 00FF | Low Byte: FF (hex) = 255 (dec); high Byte 00 (hex) = 00000000 (bin) Die Datenspeicherung erfolgte nach Zählerüberlauf, also nachdem der Zähler seine Maximalzahl von 255 erreicht hatte, in den nachfolgenden vier Abtastzyklen 256 bis 259 (bt1–bt4) ist in keinem Eingangskanal ein Ereignis aufgetreten. |
| 18FF | Low Byte: FF (hex) = 255 (dec); high Byte 18 (hex) = 00011000 (bin) Die Datenspeicherung erfolgte nach Zählerüberlauf, also nachdem der Zähler seine Maximalzahl von 255 erreicht hatte, im Abtastzyklus 2 (bt2) ist im Kanal 1 und im Abtastzyklus 258 (bt3) im Kanal 2 ein Ereignis aufgetreten. |
| 117B | Low Byte: 7B (hex) = 123 (dec); high Byte 11 (hex) = 00010001 (bin) In den Abtastzyklen 124 (bt1) und 126 (bt3) ist im Kanal 1 ein Ereignis aufgetreten, im Kanal 2 sind keine Ereignisse aufgetreten. |
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Die beispielhaft angegebenen Kodierungen veranschaulichen, daß bei der zweiten Ausführungsform im Fall, daß bis zum Zählerüberlauf kein Ereignis in einem der Kanäle auftritt, die Speicherung erst L Abtastzyklen nach Zählerüberlauf erfolgt, ohne daß die vollständige Signalaufzeichnung verloren geht. Dieses wird dadurch erreicht, daß die für die Charakterisierung der Kanalzustände vorgesehenen Bits auch Information über den Abtastzyklus enthalten, in dem ein Ereignis auftritt.
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Die kodierten und abgespeicherten Wörter werden in einem Massenspeicher (5) abgelegt und können anschließend über ein PCI-Interface (6) gelesen und in einem Schritt (7) aufbereitet werden. Bei der Datenaufbereitung können charakteristische Fehlstellen oder durch Ausbleichen der Farbstoffe aufgetretene Störungen, die bei der nachfolgenden Auswertung zu fehlerhaften Ergebnissen führen würden, eliminiert werden. Außerdem kann bei der Datenaufbereitung eine Grenz-Korrelationszeit für die anzuwendenden Korrelationsalgorithmen angegeben werden.
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Die nachfolgende Berechnung der zeitlichen Korrelationsfunktionen der Eingangskanäle erfolgt nach zwei verschiedenen Algorithmen. Für Korrelationszeiten, die kürzer als die gewählte Grenz-Korrelationszeit sind, wird ein linearer Algorithmus angewendet, der die Korrelationsfunktion aus den Histogrammen der zeitlichen Impulsabstände der aufgezeichneten Signalfolgen bestimmt.
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Bei der Autokorrelation, also der getrennte Auswertung der Kanäle, werden sämtliche möglichen Impulsabstände ermittelt. Dabei kann wie folgt vorgegangen werden:
Ist tk der zeitliche Abstand zwischen dem k-ten Impuls und dem k + 1-ten Impuls (für k = 1, 2, ... N). Das Histogramm H(t) der zeitlichen Impulsabstände ergibt sich dann aus der Definition:
H(t) = 0
H(t) = H++, wenn t = = t1
H(t) = H++, wenn t = = t1 + t2
H(t) = H++, wenn t = = t1 + t2 + t3
H(t) = H++, wenn t = = t1 + t2 + t3 + ...
H(t) = H++, wenn t = = t2
H(t) = H++, wenn t = = t2 + t3
H(t) = H++, wenn t = = t2 + t3 + ...
H(t) = H++, wenn t = = tk
H(t) = H++, wenn t = = tk + t(k + 1)
H(t) = H++, wenn t = = tk + t(k + 1) + t(k + 2)
H(t) = H++, wenn t = = tk + t(k + 1) + t(k + 2) + ...
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Für binäre Impulsfolgen und unter der Vorraussetzung, daß nach einem bestimmten Impuls keine weiteren Impulse nachfolgen und in jedem Abtastzyklus maximal ein Impuls auftritt, ist die Autokorrelationsfunktion A (t) = H(t) gleich dem Histogramm der Impulsabstände.
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Im Falle der Kreuzkorrelation werden zwei Impulsfolgen n, m miteinander korreliert. Ist k1 die Nummer des ersten Impulses der Impulsfolge m, der dem 1-ten Impuls der Impulsfolge n nachfolgt, und ist di1 der zeitliche Impulsabstand zwischen dem 1-ten Impuls und dem 1 + 1-sten Impuls der Impulsfolge m sowie dj1 der zeitliche Impulsabstand zwischen dem 1-ten Impuls und dem 1 + 1-sten Impuls der Impulsfolge n, wobei i, j = 1, 2, ... N das betreffende Zeitintervall kennzeichnen, wird analog zur Definition eines Histogrammes für die zeitlichen Impulsabstände einer einzelnen Impulsfolge ein Histogramm K für die Zeitabstände zwischen den Impulsen der beiden Impulsfolgen n, m definiert:
K(t) = 0
K(t) = K++, wenn t = = k1 – i1
K(t) = K++, wenn t = = k1 – i1 + djk1
K(t) = K++, wenn t = = k1 – i1 + djk1 + djk2
K(t) = K++, wenn t= = k1 – i1 + djk1 + djk2 + ...
...
K(t) = K++, wenn t = = k2 – i2
K(t) = K++, wenn t = = k2 – i2 + djk2
K(t) = K++, wenn t = = k2 – i2 + djk2 + djk3
K(t) = K++, wenn t = = k2 – i2 + djk2 + djk3 + ...
...
K(t) = K++, wenn t = = k1 – i1
K(t) = K++, wenn t = = k1 – i1 + djk1
K(t) = K++, wenn t = = k1 – i1 + djk(1 + 1)
K(t) = K++, wenn t = = k1 – i1 + djk1 + djk(1 + 1) + ...
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Es läßt sich zeigen, daß für binäre Impulsfolgen die Kreuzkorrelation der beiden Impulsfolgen n, m dem oben definierten Histogramm entspricht.
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Der beschriebene lineare Algorithmus, bei dem die Autokorrelation und die Kreuzkorrelation anhand der Histogramme der Impulsabstände ermittelt wird und demzufolge bei kleinen Korrelationszeiten nur geringen Rechenaufwand erfordert, wird nur für Korrelationszeiten unterhalb des eingegebenen Grenzwertes angewendet. Für größere Korrelationszeiten wird in einem Schritt 8 in 1 die Autokorrelation und/oder die Kreuzkorrelation nach dem Multiple-Tau-Verfahren durchgeführt. Hinsichtlich der hierbei angewendeten Algorithmen sei auf die Produktinformationen der Firma ALV-Laser Vertriebsgesellschaft m. b. H. Langen, FRG, zum ALV-5000 Digital Multiple Tau Correlator, insbesondere auf die Schrift „Introduction to the Multiple Tau Correlation Technique” von Rainer Perters, verwiesen. Die Ergebnisse beider Algorithmen werden nachfolgend in einem Schritt 10 zu einem Zusammengesetzten Diagramm vereinigt und dargestellt.
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Die erfindungsgemäßen Verfahren finden bevorzugt Anwendung in der konfokalen Mikroskopie, bei dem der von einem oder mehreren Lasern (11) emittierte Laserstrahl durch ein Mikroskopobjektiv (13) hoher numerischer Apertur in eine Probe (12) fokussiert wird. Das Anregungsvolumen in der Probe (12) beträgt dabei nur wenige Ferntoliter. Die in der Probe (12) erzeugte Fluoreszenzstrahlung wird vom Objektiv (13) wieder aufgesammelt, mittels eine Farbteilers (15) vom Anregungslicht getrennt und nachfolgend mittels eines zweiten Farbteilers (14) zwei separaten Detektionkanälen zugeführt. In jedem der beiden Detektionskanäle ist eine konfokale Blende (16, 17) vorgesehen, die beide in einer zur Fokusebene des Objektivs (13) konjugierten Ebene angeordnet sind. Nach Transmission durch die konfokalen Blenden wird das in jedem Detektionskanal enthaltene Lichtsignal von hochempfindlichen Detektoren, die zum Nachweis einzelner Photonen ausgelegt sind, detektiert. Die konfokalen Blenden stellen dabei sicher, daß auch das Volumen in der Probe, aus dem Fluoreszenzstrahlung detektiert wird, die geringe Größe des Anregungsvolumens aufweist. Aufgrund des sehr keinen Anregungs- und Detektionsvolumens treten in beiden Detektionskanälen Impulssignale auf, die im wesentlichen aus einzelnen Impulsen mit längeren Impulsabständen bestehen.
