DE19951188B4

DE19951188B4 - Method and device for recording pulse signals

Info

Publication number: DE19951188B4
Application number: DE1999151188
Authority: DE
Inventors: Albrecht Geist; Manfred Loth; Frank Klemm
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 1999-10-22
Filing date: 1999-10-22
Publication date: 2013-04-25
Anticipated expiration: 2019-10-23
Also published as: US6591223B1; JP4656715B2; CH695072A5; DE19951188A1; JP2001194236A

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Einrichtung zur Aufzeichnung von Impulssignalen mehrerer, mindestens zweier Eingangskanäle, wobei die mehreren Eingangskanäle mit vorgegebener Abtastfrequenz auf aufgetretene Ereignisse abgetastet werden und nach Detektion eines Ereignisses in mindestens einem der Eingangskanäle oder nach Überlauf eines Zählers der aktuelle Zustand aller Eingangskanäle in einem Speicherregister zusammen mit einer den Zeitabstand zur letzten Abspeicherung charakterisierenden Größe abgespeichert werden. Bei einem alternativen Ausführungsbeispiel wird bei jeder Speicherung sowohl der Zustand in dem Abtastzyklus, in dem das die Speicherung auslösende Ereignis stattfindet, aufgezeichnet als auch in einer vorbestimmten Anzahl nachfolgender Abtastzyklen. Das aufgezeichnete Datenformat zeichnet sich bei Impulssignalen mit gegenüber der Abtastfrequenz seltenen Ereignissen durch einen geringen Speicherbedarf aus, wobei dennoch die Information über die gesamten zeitlichen Verläufe der Eingangssignale ohne Informationsverlust in den abgespeicherten Daten enthalten ist. Das Datenformat ist weiterhin für eine nachfolgende Korrelationsauswertung auf der Basis von Impulsabstandssignalen geeignet.The invention relates to a method and a device for recording pulse signals of several, at least two input channels, wherein the plurality of input channels are sampled at predetermined sampling frequency on occurred events and after detection of an event in at least one of the input channels or after overflow of a counter, the current state of all input channels stored in a memory register together with a variable characterizing the time interval to the last storage. In an alternative embodiment, each state stores both the state in the scan cycle in which the memory trigger event occurs and in a predetermined number of subsequent scan cycles. The recorded data format is characterized in pulse signals with respect to the sampling frequency rare events by a small memory requirement, yet the information is contained over the entire temporal course of the input signals without loss of information in the stored data. The data format is also suitable for a subsequent correlation evaluation on the basis of pulse spacing signals.

Description

In der Mikroskopie, insbesondere der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS), wie diese beispielsweise vom ConfoCor der Anmelderin bekannt ist, werden die von einzelnen Fluoreszenzereignissen erzeugten und über sogenanntes Single Photon Counting detektierten zeitlichen Signalfolgen zur Auswertung entweder mit sich selbst zeitlich korreliert (Autokorrelation) oder mit der zeitlichen Signalfolge eines zweiten Eingangskanals zeitlich korreliert (Kreuzkorrelation). Die Korrelationsauswertung erfolgt mittels spezieller hardwaremäßiger Korrelatoren, wie diese beispielsweise von der Firma ALV-Laser Vertriebsgesellschaft, Langen, Deutschland unter der Bezeichnung „5000 Multiple Tau Correlator” angeboten werden. Derartiger Korrelatoren arbeiten nach dem sogenannten Multiple-Tau-Verfahren, bei dem die Eingangssignale jeweils über eine Korrelationsstufenzeit miteinander multipliziert und die dabei entstehenden Produkte addiert werden, wobei stufenweise die Korrelationsstufenzeit logarithmisch verlängert wird. Vorteil dieses Verfahrens ist, daß auch bei längeren Korrelationszeiten der Rechenaufwand relativ gering bleibt. Nachteilig ist jedoch, daß durch die Zusammenfassung der Eingangssignale in den höheren Korrelationsstufen eine Tiefpaßfilterung erfolgt. Außerdem gehen die Originaldaten verloren, so daß eine Bearbeitung und nachfolgende erneute oder anderweitige Auswertung nicht möglich ist.In microscopy, in particular fluorescence correlation spectroscopy (FCS), as known, for example, from Applicant's ConfoCor, the temporal signal sequences produced by individual fluorescence events and detected by so-called single photon counting are either time correlated with themselves (autocorrelation) or correlated in time with the temporal signal sequence of a second input channel (cross-correlation). The correlation evaluation takes place by means of special hardware correlators, as offered, for example, by the company ALV-Laser Vertriebsgesellschaft, Langen, Germany under the name "5000 Multiple Tau Correlator". Such correlators work according to the so-called multiple-tau method, in which the input signals are multiplied by a correlation step time each time and the resulting products are added, whereby the correlation step time is extended logarithmically in stages. The advantage of this method is that even with longer correlation times the computational effort remains relatively low. The disadvantage, however, is that a low-pass filtering takes place through the combination of the input signals in the higher correlation stages. In addition, the original data is lost, so that a processing and subsequent re-evaluation or otherwise is not possible.

Für die Korrelationsauswertung eines einzigen Kanals mit einzelnen Impulssignalen, also einer Signalfolge, die binäre Daten 0 und 1 liefert, wobei die 1 nur gelegentlich auftritt, ist es bekannt, den Eingangskanal mit einer festen Frequenz abzutasten und lediglich die Zeitabstände zwischen den einzelnen Impulsen aufzuzeichnen und zu speichern. Die Korrelationsberechnung erfolgt dann einfach durch die Bestimmung aller aufgetretenen zeitlichen Impulsabstände in der Impulsfolge. Eine Anwendung dieses Verfahrens auf die Signale mehrerer Eingangskanäle ist jedoch nicht bekannt.For the correlation evaluation of a single channel with individual pulse signals, that is, a signal sequence that provides binary data 0 and 1, the 1 occurs only occasionally, it is known to sample the input channel at a fixed frequency and record only the time intervals between the individual pulses and save. The correlation calculation then takes place simply by determining all occurred time intervals in the pulse train. However, an application of this method to the signals of multiple input channels is not known.

Aus der US 5,909,278 A ist ein Verfahren zur zeitaufgelösten Fluoreszenzanalyse bekannt. Dabei wird eine Integration angewendet, bei der die innerhalb eines vordefinierten Zeitfensters nach einem Anregungsimpuls detektierten Signale aufintegriert werden.From the US 5,909,278 A a method for time-resolved fluorescence analysis is known. In this case, an integration is used in which the signals detected within a predefined time window after an excitation pulse are integrated.

Aus der US 5,754,449 A ist die Datenaufzeichnung von mehreren Kanälen bekannt. Bei den detektierten Ereignissen handelt es sich jedoch nicht um Impulssignale. Gemäß dem hier beschriebenen Verfahren wird der Aufzeichnungszeitraum in eine Anzahl diskreter Zeitfenster aufgeteilt und jedem Zeitfenster wird ein bestimmter Speicherbereich in einem Speicher zugeordnet. Auftretende Ereignisse werden dann jeweils in dem Speicherbereich abgespeichert, der dem Zeitfenster, in dem das Ereignis eingetreten ist, zugeordnet ist. Wenn ein Speicher überläuft, werden neu eintretende Ereignisse nur dann abgespeichert, und der Speicher entsprechend überschrieben, wenn die nachfolgenden Ereignisse einen höheren Rang als die abgespeicherten Ereignisse aufweisen. Dazu wird jedem Ereignis ein entsprechender Rang zugeordnet.From the US 5,754,449 A is the data recording of multiple channels known. However, the detected events are not pulse signals. According to the method described herein, the recording period is divided into a number of discrete time windows and each time slot is allocated a particular memory area in a memory. Occurring events are then respectively stored in the memory area which is assigned to the time window in which the event occurred. When a memory overflows, new events will only be saved and the memory will be overwritten accordingly if the subsequent events have a higher rank than the events stored. For this purpose, each event is assigned a corresponding rank.

In der US 5,226,153 A ist eine Verfahren und eine Vorrichtung beschrieben, um die Arbeit und die Leistungsfähigkeit eines Computers während dessen Betrieb zu beobachten. Dazu hat das System einen Triggercontrol, der dann, wenn bestimmte Ereignisse eintreten, ein Triggersignal erzeugt. Dieses Triggersignal löst dann die Datenaufzeichnung für eine vorbestimmte Zeit aus. Weiterhin kann der Triggercontrol so ausgebildet sein, dass er in bestimmten Zeitintervallen ein Triggersignal erzeugt, um dadurch die Datenaufzeichnung zu starten. Bei dem in dieser Schrift beschriebenen System wird vom Triggercontrol auch ein Zeitsignal erzeugt, das ebenfalls mit den aufgezeichneten Daten abgespeichert wird. Dieses Zeitsignal ist jedoch nicht von der Zeitdauer seit der letzten Speicherung abhängig.In the US 5,226,153 A For example, a method and apparatus for monitoring the work and performance of a computer during its operation is described. The system has a trigger control that generates a trigger signal when certain events occur. This trigger signal then triggers the data recording for a predetermined time. Furthermore, the trigger control can be designed such that it generates a trigger signal at specific time intervals in order thereby to start the data recording. In the system described in this document, the trigger control also generates a time signal, which is also stored with the recorded data. However, this time signal does not depend on the time since the last storage.

In der US 4,811,249 A ist ein weiterer Datalogger beschrieben. Bei diesem Datalogger werden zunächst die eingehenden Daten mit hoher Zeitauflösung abgespeichert. Wenn der Datenspeicher voll ist, werden die Daten zu einer relativ groben Zeitauflösung zusammengefasst. Danach aufgezeichnete Daten werden dann nur noch bei der großen Zeitauflösung erfasst.In the US 4,811,249 A is another datalogger described. With this datalogger, the incoming data is first stored with high time resolution. When the data store is full, the data is aggregated to a relatively coarse time resolution. After that recorded data are then only recorded at the large time resolution.

Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur Aufzeichnung von Impulssignalen mehrerer Eingangskanäle, das eine möglichst kompakte Speicherung der Information ohne Informationsverlust ermöglicht.The aim of the invention is a method for recording pulse signals of multiple input channels, which allows the most compact storage of information without loss of information.

Dieses Ziel wird durch Verfahren mit den Merkmalen der Ansprüche 1 und 2 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der abhängigen Ansprüche.This object is solved by methods having the features of claims 1 and 2. Advantageous embodiments of the invention will become apparent from the features of the dependent claims.

Bei einer ersten Ausführungsform der Erfindung werden die mehreren Eingangskanäle mit einer vorgegebenen festen Frequenz auf auftretende Ereignisse abgetastet und nach Detektion eines Ereignisses in einem der Eingangskanäle oder nach Überlauf eines Zählers – je nach dem welches Ereignis von beiden zuerst eintritt – wird der aktuelle Zustand aller Eingangskanäle in einem Speicherregister zusammen mit einer den Zeitabstand zur letzten Abspeicherung charakterisierenden Größe gespeichert.In a first embodiment of the invention, the plurality of input channels are sampled at a predetermined fixed frequency for occurring events and after detection of an event in one of the input channels or after overflow of a counter - depending on which event of both first occurs - the current state of all input channels is stored in a memory register together with a variable characterizing the time interval for the last storage.

Bei einer zweiten Ausführungsform der Erfindung werden ebenfalls die mehreren Eingangskanäle mit einer vorgegebenen festen Frequenz auf auftretende Ereignisse abgetastet. Und auch bei dieser zweiten Ausführungsform erfolgt die Abspeicherung nach der Detektion eines Ereignisses in einem der Eingangskanäle oder nach Überlauf eines Zählers – je nachdem welches der beiden Ereignisse zuerst auftritt. Jedoch werden bei dieser Ausführungsform die Zustande der Eingangskanäle in dem Abtastzyklus, in dem das Ereignis eintritt und zusätzlich für eine vorgegebene Anzahl an Abtastzyklen nach Eintritt des Ereignisses zusammen mit einer den Zeitabstand zur letzten Abspeicherung charakterisierenden Größe abgespeichert.In a second embodiment of the invention, the plurality of input channels are also sampled at a predetermined fixed frequency for occurring events. And also in this second embodiment, the storage occurs after the detection of an event in one of the input channels or after overflow of a counter - depending on which of the two events occurs first. However, in this embodiment, the states of the input channels are stored in the sampling cycle in which the event occurs and additionally for a predetermined number of sampling cycles after the occurrence of the event together with a variable characterizing the time interval to the last storage.

Bei beiden Ausführungsformen ist in den abgespeicherten Daten die Information über die Signalfolgen in allen Eingangskanälen vollständig erhalten; durch die vorgenommene Zeit-Abstandskodierung liegen die Rohdaten in einer Form vor, die eine spätere Autokorrelations- und/oder Kreuzkorrelationsauswertung durch Auswertung der Histogramme der zeitlichen Impulsabstände der Eingangskanäle ermöglicht. Der Speicherbedarf ist in beiden Fällen primär von der Häufigkeit der in den Eingangskanälen auftretenden Ereignisse und nur sekundär von der Abtastfrequenz abhängig.In both embodiments, the information about the signal sequences in all input channels is completely preserved in the stored data; by the time-distance coding made, the raw data are in a form that allows a later autocorrelation and / or cross-correlation evaluation by evaluating the histograms of the time intervals of the input channels. The memory requirement in both cases depends primarily on the frequency of the events occurring in the input channels and only secondarily on the sampling frequency.

Bei der ersten Ausführungsform wird in den jeweils abgespeicherten Wörtern für jeden Eingangskanal nur ein einziges Bit benötigt; die verbleibenden Bits jedes Wortes stehen für die Darstellung des Zeitabstands zur letzten Abspeicherung zur Verfügung. Bei zwei Eingangskanälen und Abspeicherung als 16-Bit Wörter ergeben sich damit 14 Bit für die Darstellung des Zeitabstandes. Diese Ausführungsform ermöglicht eine optimal effiziente Ausnutzung des Speicherplatzes bei Signalfolgen, die gemessen an der Dauer eines einzelnen Abtastzyklus nur sehr wenige Ereignisse aufweisen, so daß in den meisten Fällen eine Abspeicherung aufgrund eines Überlaufs des Zählers erfolgt. Bei Ereignisreichen Signalfolgen, bei denen in jedem Abtastzyklus ein Ereignis auftritt, wird jedoch die abzuspeichernde Datenrate sehr hoch.In the first embodiment, only one bit is needed in each stored word for each input channel; the remaining bits of each word are available to represent the time interval for the last save. With two input channels and storage as 16-bit words, this results in 14 bits for representing the time interval. This embodiment allows optimally efficient utilization of the memory space in signal sequences which, measured in terms of the duration of a single sampling cycle, have only very few events, so that in most cases storage takes place due to an overflow of the counter. However, in event-rich bursts, where an event occurs in each sampling cycle, the data rate to be stored becomes very high.

Bei der zweiten Ausführungsform wird in jedem abgespeicherten Wort für jeden Eingangskanal eine Anzahl an Bits benötigt, die der Anzahl der vorgegeben Abtastzyklen entspricht, über die die Kanalzustände mit abgespeichert werden, zuzüglich einem weiteren Bit für den Zustand in dem die Abspeicherung auslösenden Abtastzyklus. Bei zwei Eingangskanälen, einer Abspeicherung über jeweils drei dem ersten eintretenden Ereignis oder dem Zählerüberlauf nachfolgende Abtastzyklen und einer Abspeicherung als 16-Bit Wörter werden demzufolge 8 Bit für die Speicherung der Zustande der Eingangskanäle benötigt, so daß nur noch 8 Bit für die Speicherung des Zeitabstands zur letzten vorhergehenden Abspeicherung zur Verfügung stehen. Bei Signalfolgen, die nur sehr selten Ereignisse aufweisen und demzufolge in den meisten Fällen die Abspeicherung durch einen Überlauf des Zählers ausgelöst wird, ist die Abspeicherung gegenüber der ersten Ausführungsform ineffizienter, da für den Zähler nur eine geringere Anzahl an Bits zur Verfügung steht und es entsprechend häufiger zu einem Zählerüberlauf kommt. Dieser Nachteil ist jedoch nicht sehr störend, da bei Signalfolgen mit selten auftretenden Ereignissen der insgesamt benötigte Speicherbedarf gering und deshalb unkritisch ist. Gegenüber der ersten Ausführungsform ist hingegen bei der zweiten Ausführungsform der bei Signalfolgen mit häufig auftretenden Ereignissen benötigte Speicherplatz, und damit auch der maximal benötigte Speicherplatz, deutlich reduziert. So ergibt sich bei dem obigen Zahlenbeispiel und einer Abtastrate von 20 MHz bei der zweiten Ausführungsform eine maximale Speicherrate – wenn in jedem Abtastzyklus ein Ereignis auftritt – von 10 Mbyte/s und ein minimaler Speicherbedarf – wenn kein Ereignis auftritt und die Abspeicherung demzufolge stets durch den Zählerüberlauf ausgelöst wird – von 155 kbyte/s. Im Gegensatz dazu beträgt die maximale Datenrate bei der ersten Ausführungsform bei gleicher Abtastfrequenz 20 Mbyte/s.In the second embodiment, each stored word requires, in each stored word, a number of bits corresponding to the number of predetermined sampling cycles over which the channel states are stored plus one more bit for the state in the sample-triggering cycle. Thus, with two input channels, one store each of three first-occurrence events or counter-overflow of subsequent sample cycles and one 16-bit words of storage, 8 bits are required to store the state of the input channels, leaving only 8 bits to store the time interval available for the last previous storage. In the case of signal sequences which have only very few events and consequently in most cases the storage is triggered by an overflow of the counter, the storage is inefficient compared with the first embodiment, since only a smaller number of bits are available for the counter and it accordingly more often comes to a counter overflow. However, this disadvantage is not very disturbing, because with signal sequences with rarely occurring events, the overall required memory requirement is low and therefore uncritical. Compared to the first embodiment, however, in the second embodiment, the storage space required for signal sequences with frequently occurring events, and thus also the maximum storage space required, is significantly reduced. Thus, in the above numerical example and a sampling rate of 20 MHz in the second embodiment, a maximum memory rate - when an event occurs in each sampling cycle - of 10 Mbytes / s and a minimum memory requirement - if no event occurs and the storage therefore always by the Counter overflow is triggered - from 155 kbytes / s. In contrast, the maximum data rate in the first embodiment at the same sampling frequency is 20 Mbytes / s.

Die entsprechend der Erfindung aufgezeichneten Daten können nachfolgend ausgelesen und/oder bearbeitet werden. Außerdem können die aufgezeichneten Daten auch einer Korrelationsauswertung unterzogen werden, wobei entweder die Daten jedes einzelnen Eingangskanals mit sich selbst korreliert werden (Autokorrelation) oder die Daten zweier Eingangskanäle miteinander korreliert werden (Kreuzkorrelation). Die abgespeicherten Daten liegen dabei bereits in einer für einen linearen Korrelationsalgorithmus, bei dem die Korrelationsfunktion aus dem Histogramm der zeitlichen Impulsabstände verlustfrei, d. h. ohne jeglichen Informationsverlust, berechnet wird, geeigneten Form vor.The data recorded according to the invention can subsequently be read out and / or edited. In addition, the recorded data can also be subjected to a correlation evaluation, wherein either the data of each individual input channel are correlated with itself (autocorrelation) or the data of two input channels are correlated with each other (cross-correlation). The stored data are already in one for a linear correlation algorithm in which the correlation function from the histogram of the time intervals pulse loss, d. H. without any loss of information, calculated, appropriate form.

Besonders vorteilhaft ist jedoch die kombinierte Anwendung zweier verschiedener Korrelationsalgorithmen von denen der eine, der lineare Algorithmus, für kurze Korrelationszeiten und der zweite, das Multiple-Tau-Verfahren für längere Korrelationszeiten angewendet wird. Die Grenze zwischen beiden Verfahren, d. h. die Korrelationszeit, die die Grenze zwischen den beiden Algorithmen darstellt, ist dabei bei softwaremäßiger Implementierung vom Benutzer wählbar. Der lineare Algorithmus arbeitet verlustfrei und benötigt bei kurzen Korrelationszeiten geringere Rechenkapazitäten als das Multiple-Tau-Verfahren; dabei steigt die erforderliche Rechenkapazität linear mit der Korrelationszeit an. Die für das Multiple-Tau-Verfahren benötigte Rechenkapazitäten sind dem hingegen begrenzt und nahezu unabhängig von der Korrelationszeit. Die Grenze zwischen den beiden Verfahren wird deshalb sinnvoll bei solchen Korrelationszeiten angesetzt, bei denen die erforderlichen Rechenkapazitäten beider Algorithmen einander entsprechen.However, the combined application of two different correlation algorithms is particularly advantageous, of which one, the linear algorithm, is used for short correlation times and the second, the multiple-tau method is used for longer correlation times. The boundary between the two methods, ie the correlation time, which represents the boundary between the two algorithms, can be selected by the user in the case of software implementation. The linear algorithm works lossless and requires short Correlation times lower computational capacities than the multiple-tau method; The required computing capacity increases linearly with the correlation time. On the other hand, the computing capacities required for the multiple-tau method are limited and almost independent of the correlation time. The boundary between the two methods is therefore expediently used for such correlation times in which the required computing capacities of both algorithms correspond to one another.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere zur Datenaufzeichnung in der Fluoreszenz-Korrelation-Spektroskopie, in der Fluoreszenzsignale aus mikroskopisch kleinen Volumina aufgezeichnet und durch Korrelationsberechnungen ausgewertet werden, bestens geeignet. Entsprechend findet die Erfindung auch vorzugsweise in Verbindung mit konfokalen Mikroskopen Anwendung.The inventive method is particularly well suited for data recording in fluorescence correlation spectroscopy in which fluorescence signals are recorded from microscopically small volumes and evaluated by correlation calculations. Accordingly, the invention is also preferably used in conjunction with confocal microscopes.

Nachfolgend werden Einzelheiten der Erfindung anhand der Zeichnungen näher erläutert. Im einzelnen Zeigen: Details of the invention will be explained in more detail with reference to the drawings. In detail Show:

1: ein Blockschaltbild für eine Datentaufzeichnungseinrichtung für das erfindungsgemäße Verfahren; 1 : a block diagram for a data recording device for the method according to the invention;

2: eine Prinzipskizze eines konfokalen Mikroskopes mit Zweikanal-Fluoreszenzdetektion. 2 : A schematic diagram of a confocal microscope with two-channel fluorescence detection.

In der 1 sind die mehreren Eingangskanäle mit Kanal 1, Kanal 2 ... Kanal n bezeichnet. Die eingehenden Signale sind binäre Impulssignale, die jeweils aus einer Folge von „0” und „1” bestehen, wobei eine „1” ein aufgetretenes Ereignis darstellt. Soweit die Eingangssignale analog sind, sind sie vor der Datenaufzeichnung in binäre Signale zu transformieren.In the 1 the several input channels are labeled channel 1, channel 2 ... channel n. The incoming signals are binary pulse signals, each consisting of a sequence of "0" and "1", where a "1" represents an event that has occurred. As far as the input signals are analog, they have to be transformed into binary signals before the data recording.

Ein Takt-Oszillator (1) gibt die Abtastfrequenz für die Datenaufzeichnung in einer Einheit (2) vor. Die Abtastfrequenz ist dabei so gewählt, daß in einem Abtastzyklus, also innerhalb der Zeitdauer eines Taktes des Oszillators (1) höchstens ein einziges Ereignis in jedem der Eingangskanäle zu erwarten ist. Die Anzahl der vom Takt-Oszillator vorgegebenen Takte wird von einem Zähler (3) mit M-Bit Datenbreite gezählt. Wenn die Abtastung der Eingangssignale in der Einheit (2) ein Ereignis – also eine binäre „1” – in einem der n Kanäle feststellt bevor ein Überlauf des Zählers (3) stattfindet, wird eine Speicherung der Kanalzustände und des Zählerstandes des Zählers (3) in einem Speicher (4) ausgelöst. Gleichzeitig wird der Zähler wieder auf Null zurückgesetzt. Wird hingegen bis zum Erreichen des Überlaufs des Zählers (3) kein Ereignis in einem der Eingangskanäle festgestellt, so werden ebenfalls die Zustande der Eingangskanäle und der Zählerstand abgespeichert und nachfolgend der Zähler (3) auf Null zurückgesetzt. Die Speicherung eines Datensatzes wird also jeweils ausgelöst, wenn entweder ein Ereignis in einem der Eingangskanäle eintritt oder ein Zählerüberlauf stattfindet, je nachdem welches dieser Ereignisse zuerst auftritt.A clock oscillator ( 1 ) returns the sampling frequency for data recording in one unit ( 2 ) in front. The sampling frequency is chosen so that in a sampling cycle, ie within the duration of a clock of the oscillator ( 1 ) at most a single event is expected in each of the input channels. The number of clocks given by the clock oscillator is determined by a counter ( 3 ) counted with M-bit data width. When the sampling of the input signals in the unit ( 2 ) detects an event - ie a binary "1" - in one of the n channels before an overflow of the counter ( 3 ), a storage of the channel states and the count of the counter ( 3 ) in a memory ( 4 ). At the same time the counter is reset to zero. However, until reaching the overflow of the counter ( 3 ) no event is detected in one of the input channels, so also the states of the input channels and the count are stored and subsequently the counter ( 3 ) reset to zero. The storage of a data record is therefore triggered in each case when either an event occurs in one of the input channels or a counter overflow takes place, depending on which of these events occurs first.

Der Speicher (4) bzw. jedes im Speicher (4) gespeicherte Wort besteht aus zwei Teilbereichen (4a) und (4b). In einem Teilbereich (4b) von M Bit wird der Stand des Zählers (3) und damit ein Maß für die seit der letzten Speicherung vergangene Zeit gespeichert. Im anderen Teilbereich (4a) werden die Zustande der Eingangskanäle binär abgespeichert. Beide Teilbereiche gemeinsam ergeben jeweils im Hexadezimalssystem ein abgespeichertes Wort, das die Information über die Zustände aller Eingangskanäle und der seit der letzten Speicherung vergangenen Zeit enthält. In der Folge der abgespeicherten Wörter ist demzufolge die vollständige Information über die zeitlichen Signalfolgen aller Eingangskanäle mit der durch die Taktfrequenz gegebenen Zeitauflösung enthalten.The memory ( 4 ) or each in memory ( 4 stored word consists of two parts ( 4a ) and ( 4b ). In a subarea ( 4b ) of M bits, the state of the counter ( 3 ) and thus a measure of the time that has passed since the last storage. In the other subarea ( 4a ), the states of the input channels are stored in binary form. Both subsections together result in the hexadecimal system a stored word which contains the information about the states of all input channels and the time since the last storage. As a result of the stored words, the complete information about the temporal signal sequences of all input channels is therefore included at the time resolution given by the clock frequency.

Im ersten Ausführungsbeispiel ist L = 1, d. h. für die Kennzeichnung jedes Eingangskanals wird 1 Bit benötigt. Die verbleibenden Bits stehen demzufolge für die Charakterisierung des Zeitabstandes seit der letzten Speicherung, also für den Stand des Zählers (3) bei Auslösung der Speicherung zur Verfügung.In the first embodiment, L = 1, ie 1 bit is required for the tag of each input channel. The remaining bits are therefore for the characterization of the time interval since the last storage, ie for the state of the counter ( 3 ) when the storage is triggered.

Beim zweiten Ausführungsbeispiel ist L ungleich und größer als Eins. In diesem Fall werden für die Kennzeichnung der Zustände jedes Eingangskanals L Bit benötigt. Entsprechend werden bei jeder Abspeicherung die Zustände jedes der Eingangskanäle über L Abtastzyklen aufgezeichnet und gespeichert. Bei L = 4 werden beispielsweise die Zustände der Eingangskanäle in dem Abtastzyklus bt1, in dem das erste detektierte Ereignis auftritt, und in den drei unmittelbar darauf folgenden Abtastzyklen bt2, bt3 und bt4 gespeichert. Für jeden Eingangskanal geben dann die L Bits an, ob und in welchem Abtastzyklus ein Ereignis stattgefunden hat. Die Zuordnung in einem 16-Bit-Wort bei zwei Eingangskanälen kann beispielsweise folgendermaßen aussehen: Bits 1–7: Abtastzyklen, die seit der letzten Speicherung vergangen sind Bit 8: = 1, wenn Ereignis im Kanal 1 im Zyklus bt1 stattgefunden hat, sonst = 0 Bit 9: = 1, wenn Ereignis im Kanal 2 im Zyklus bt1 stattgefunden hat, sonst = 0 Bit 10: = 1, wenn Ereignis im Kanal 1 im Zyklus bt2 stattgefunden hat, sonst = 0 Bit 11: = 1, wenn Ereignis im Kanal 2 im Zyklus bt2 stattgefunden hat, sonst = 0 Bit 12: = 1, wenn Ereignis im Kanal 1 im Zyklus bt3 stattgefunden hat, sonst = 0 Bit 13: = 1, wenn Ereignis im Kanal 2 im Zyklus bt3 stattgefunden hat, sonst = 0 Bit 14: = 1, wenn Ereignis im Kanal 1 im Zyklus bt4 stattgefunden hat, sonst = 0 Bit 15: = 1, wenn Ereignis im Kanal 2 im Zyklus bt4 stattgefunden hat, sonst = 0 In the second embodiment, L is unequal and greater than one. In this case, L bits are required to identify the states of each input channel. Accordingly, at each storage, the states of each of the input channels are recorded and stored over L sampling cycles. For example, at L = 4, the states of the input channels are stored in the sampling cycle bt1 in which the first detected event occurs and in the three immediately subsequent sampling cycles bt2, bt3 and bt4. For each input channel, then the L bits indicate whether and in which sampling cycle an event has occurred. For example, mapping into a 16-bit word on two input channels might look like this: Bits 1-7: Scanning cycles that have passed since the last save Bit 8: = 1, if event occurred in channel 1 in cycle bt1, otherwise = 0 Bit 9: = 1, if event occurred in channel 2 in cycle bt1, otherwise = 0 Bit 10: = 1, if event occurred in channel 1 in cycle bt2, otherwise = 0 Bit 11: = 1, if event occurred in channel 2 in cycle bt2, otherwise = 0 Bit 12: = 1, if event occurred in channel 1 in cycle bt3, otherwise = 0 Bit 13: = 1, if event occurred in channel 2 in cycle bt3, otherwise = 0 Bit 14: = 1, if event occurred in channel 1 in cycle bt4, otherwise = 0 Bit 15: = 1, if event occurred in channel 2 in cycle bt4, otherwise = 0

Die Speicherung eines Wortes erfolgt dann jeweils L-1 Abtastzyklen nachdem das erste Ereignis in einem der Eingangskanäle stattgefunden hat oder nachdem der Zähler seinen Überlauf erreicht hat. Bei Speicherung in 16-Bit Wörtern ergibt sich damit folgende beispielhafte Kodierung, wobei die Low-Bytes die seit der Abspeicherung vergangene Zeit und die High-Bytes die Kanalzustände angeben: Wort (hex): Signalfolge: 197B Low Byte: 7B (hex) = 123 (dec); high Byte 19 (hex) = 00011001 (bin) In den Abtastzyklen 124 (bt1) und 126 (bt3) wurde ein Ereignis im Kanal 1 und im Abtastzyklus 125 (bt2) ein Ereignis im Kanal 2 detektiert. 00FF Low Byte: FF (hex) = 255 (dec); high Byte 00 (hex) = 00000000 (bin) Die Datenspeicherung erfolgte nach Zählerüberlauf, also nachdem der Zähler seine Maximalzahl von 255 erreicht hatte, in den nachfolgenden vier Abtastzyklen 256 bis 259 (bt1–bt4) ist in keinem Eingangskanal ein Ereignis aufgetreten. 18FF Low Byte: FF (hex) = 255 (dec); high Byte 18 (hex) = 00011000 (bin) Die Datenspeicherung erfolgte nach Zählerüberlauf, also nachdem der Zähler seine Maximalzahl von 255 erreicht hatte, im Abtastzyklus 2 (bt2) ist im Kanal 1 und im Abtastzyklus 258 (bt3) im Kanal 2 ein Ereignis aufgetreten. 117B Low Byte: 7B (hex) = 123 (dec); high Byte 11 (hex) = 00010001 (bin) In den Abtastzyklen 124 (bt1) und 126 (bt3) ist im Kanal 1 ein Ereignis aufgetreten, im Kanal 2 sind keine Ereignisse aufgetreten. The storage of a word then occurs every L-1 sampling cycles after the first event has occurred in one of the input channels or after the counter has reached its overflow. When stored in 16-bit words, this results in the following exemplary coding, the low bytes indicating the time since the storage and the high bytes indicating the channel states: Word (hex): Light sequence: 197B Low byte: 7B (hex) = 123 (dec); high byte 19 (hex) = 00011001 (bin) In the scan cycles 124 (bt1) and 126 (bt3) an event was detected in channel 1 and in scan cycle 125 (bt2) an event in channel 2 was detected. 00FF Low byte: FF (hex) = 255 (dec); high byte 00 (hex) = 00000000 (bin) The data was stored after counter overflow, ie after the counter had reached its maximum number of 255, in the following four sampling cycles 256 to 259 (bt1-bt4) no event has occurred in any input channel. 18ff Low byte: FF (hex) = 255 (dec); high byte 18 (hex) = 00011000 (bin) The data was stored after counter overflow, ie after the counter has reached its maximum number of 255, in the sampling cycle 2 (bt2) in channel 1 and in the sampling cycle 258 (bt3) in channel 2 an event occurred. 117B Low byte: 7B (hex) = 123 (dec); high byte 11 (hex) = 00010001 (bin) In the scan cycles 124 (bt1) and 126 (bt3), an event has occurred in channel 1 and no events have occurred in channel 2.

Die beispielhaft angegebenen Kodierungen veranschaulichen, daß bei der zweiten Ausführungsform im Fall, daß bis zum Zählerüberlauf kein Ereignis in einem der Kanäle auftritt, die Speicherung erst L Abtastzyklen nach Zählerüberlauf erfolgt, ohne daß die vollständige Signalaufzeichnung verloren geht. Dieses wird dadurch erreicht, daß die für die Charakterisierung der Kanalzustände vorgesehenen Bits auch Information über den Abtastzyklus enthalten, in dem ein Ereignis auftritt.The encodings exemplified illustrate that in the second embodiment, in the event that no event occurs in one of the channels until the counter overflow, the storage is only L scanning cycles after counter overflow, without the complete signal recording is lost. This is accomplished by having the bits provided to characterize the channel states also contain information about the sampling cycle in which an event occurs.

Die kodierten und abgespeicherten Wörter werden in einem Massenspeicher (5) abgelegt und können anschließend über ein PCI-Interface (6) gelesen und in einem Schritt (7) aufbereitet werden. Bei der Datenaufbereitung können charakteristische Fehlstellen oder durch Ausbleichen der Farbstoffe aufgetretene Störungen, die bei der nachfolgenden Auswertung zu fehlerhaften Ergebnissen führen würden, eliminiert werden. Außerdem kann bei der Datenaufbereitung eine Grenz-Korrelationszeit für die anzuwendenden Korrelationsalgorithmen angegeben werden.The coded and stored words are stored in a mass memory ( 5 ) and can then be accessed via a PCI interface ( 6 ) and in one step ( 7 ). In data processing, characteristic defects or disturbances due to fading of the dyes, which would lead to erroneous results in the subsequent evaluation, can be eliminated. In addition, during data preparation, a limit correlation time can be specified for the correlation algorithms to be used.

Die nachfolgende Berechnung der zeitlichen Korrelationsfunktionen der Eingangskanäle erfolgt nach zwei verschiedenen Algorithmen. Für Korrelationszeiten, die kürzer als die gewählte Grenz-Korrelationszeit sind, wird ein linearer Algorithmus angewendet, der die Korrelationsfunktion aus den Histogrammen der zeitlichen Impulsabstände der aufgezeichneten Signalfolgen bestimmt.The subsequent calculation of the temporal correlation functions of the input channels is carried out according to two different algorithms. For correlation times that are shorter than the selected limit correlation time, a linear algorithm is used which determines the correlation function from the histograms of the temporal pulse intervals of the recorded signal sequences.

Bei der Autokorrelation, also der getrennte Auswertung der Kanäle, werden sämtliche möglichen Impulsabstände ermittelt. Dabei kann wie folgt vorgegangen werden:
Ist tk der zeitliche Abstand zwischen dem k-ten Impuls und dem k + 1-ten Impuls (für k = 1, 2, ... N). Das Histogramm H(t) der zeitlichen Impulsabstände ergibt sich dann aus der Definition:
H(t) = 0
H(t) = H++, wenn t = = t1
H(t) = H++, wenn t = = t1 + t2
H(t) = H++, wenn t = = t1 + t2 + t3
H(t) = H++, wenn t = = t1 + t2 + t3 + ...
H(t) = H++, wenn t = = t2
H(t) = H++, wenn t = = t2 + t3
H(t) = H++, wenn t = = t2 + t3 + ...
H(t) = H++, wenn t = = tk
H(t) = H++, wenn t = = tk + t(k + 1)
H(t) = H++, wenn t = = tk + t(k + 1) + t(k + 2)
H(t) = H++, wenn t = = tk + t(k + 1) + t(k + 2) + ...In autocorrelation, ie the separate evaluation of the channels, all possible pulse intervals are determined. This can be done as follows:
Tk is the time interval between the kth pulse and the k + 1th pulse (for k = 1, 2, ... N). The histogram H (t) of the temporal pulse intervals then results from the definition:
H (t) = 0
H (t) = H ++, if t = = t1
H (t) = H ++, if t = = t1 + t2
H (t) = H ++, if t = = t1 + t2 + t3
H (t) = H ++, if t = = t1 + t2 + t3 + ...
H (t) = H ++, if t = = t2
H (t) = H ++, if t = = t2 + t3
H (t) = H ++, if t = = t2 + t3 + ...
H (t) = H ++, if t = = tk
H (t) = H ++, if t = = tk + t (k + 1)
H (t) = H ++, when t = = tk + t (k + 1) + t (k + 2)
H (t) = H ++, if t = = tk + t (k + 1) + t (k + 2) + ...

Für binäre Impulsfolgen und unter der Vorraussetzung, daß nach einem bestimmten Impuls keine weiteren Impulse nachfolgen und in jedem Abtastzyklus maximal ein Impuls auftritt, ist die Autokorrelationsfunktion A (t) = H(t) gleich dem Histogramm der Impulsabstände.For binary pulse trains, and provided that no further pulses follow a given pulse and a maximum of one pulse occurs in each sampling cycle, the autocorrelation function A (t) = H (t) is equal to the histogram of the pulse intervals.

Im Falle der Kreuzkorrelation werden zwei Impulsfolgen n, m miteinander korreliert. Ist k1 die Nummer des ersten Impulses der Impulsfolge m, der dem 1-ten Impuls der Impulsfolge n nachfolgt, und ist di1 der zeitliche Impulsabstand zwischen dem 1-ten Impuls und dem 1 + 1-sten Impuls der Impulsfolge m sowie dj1 der zeitliche Impulsabstand zwischen dem 1-ten Impuls und dem 1 + 1-sten Impuls der Impulsfolge n, wobei i, j = 1, 2, ... N das betreffende Zeitintervall kennzeichnen, wird analog zur Definition eines Histogrammes für die zeitlichen Impulsabstände einer einzelnen Impulsfolge ein Histogramm K für die Zeitabstände zwischen den Impulsen der beiden Impulsfolgen n, m definiert:
K(t) = 0
K(t) = K++, wenn t = = k1 – i1
K(t) = K++, wenn t = = k1 – i1 + djk1
K(t) = K++, wenn t = = k1 – i1 + djk1 + djk2
K(t) = K++, wenn t= = k1 – i1 + djk1 + djk2 + ...
...
K(t) = K++, wenn t = = k2 – i2
K(t) = K++, wenn t = = k2 – i2 + djk2
K(t) = K++, wenn t = = k2 – i2 + djk2 + djk3
K(t) = K++, wenn t = = k2 – i2 + djk2 + djk3 + ...
...
K(t) = K++, wenn t = = k1 – i1
K(t) = K++, wenn t = = k1 – i1 + djk1
K(t) = K++, wenn t = = k1 – i1 + djk(1 + 1)
K(t) = K++, wenn t = = k1 – i1 + djk1 + djk(1 + 1) + ...In the case of cross-correlation, two pulse trains n, m are correlated with each other. If k1 is the number of the first pulse of the pulse sequence m following the 1-th pulse of the pulse sequence n, and di1 is the time interval between the 1-th pulse and the 1 + 1-th pulse of the pulse sequence m and dj1 is the time pulse interval between the 1-th pulse and the 1 + 1-th pulse of the pulse train n, where i, j = 1, 2, ... N denote the relevant time interval, analogous to the definition of a histogram for the temporal pulse intervals of a single pulse sequence Histogram K for the time intervals between the pulses of the two pulse sequences n, m defines:
K (t) = 0
K (t) = K ++, if t = = k1 - i1
K (t) = K ++, if t = = k1 - i1 + djk1
K (t) = K ++, if t = = k1 - i1 + djk1 + djk2
K (t) = K ++, if t = = k1 - i1 + djk1 + djk2 + ...
...
K (t) = K ++, if t = = k2 - i2
K (t) = K ++, if t = = k2 - i2 + djk2
K (t) = K ++, if t = = k2 - i2 + djk2 + djk3
K (t) = K ++, if t = = k2 - i2 + djk2 + djk3 + ...
...
K (t) = K ++, if t = = k1 - i1
K (t) = K ++, if t = = k1 - i1 + djk1
K (t) = K ++, if t = = k1 - i1 + djk (1 + 1)
K (t) = K ++, if t = = k1 - i1 + djk1 + djk (1 + 1) + ...

Es läßt sich zeigen, daß für binäre Impulsfolgen die Kreuzkorrelation der beiden Impulsfolgen n, m dem oben definierten Histogramm entspricht.It can be shown that for binary pulse trains, the cross-correlation of the two pulse trains n, m corresponds to the histogram defined above.

Der beschriebene lineare Algorithmus, bei dem die Autokorrelation und die Kreuzkorrelation anhand der Histogramme der Impulsabstände ermittelt wird und demzufolge bei kleinen Korrelationszeiten nur geringen Rechenaufwand erfordert, wird nur für Korrelationszeiten unterhalb des eingegebenen Grenzwertes angewendet. Für größere Korrelationszeiten wird in einem Schritt 8 in 1 die Autokorrelation und/oder die Kreuzkorrelation nach dem Multiple-Tau-Verfahren durchgeführt. Hinsichtlich der hierbei angewendeten Algorithmen sei auf die Produktinformationen der Firma ALV-Laser Vertriebsgesellschaft m. b. H. Langen, FRG, zum ALV-5000 Digital Multiple Tau Correlator, insbesondere auf die Schrift „Introduction to the Multiple Tau Correlation Technique” von Rainer Perters, verwiesen. Die Ergebnisse beider Algorithmen werden nachfolgend in einem Schritt 10 zu einem Zusammengesetzten Diagramm vereinigt und dargestellt.The described linear algorithm, in which the autocorrelation and the cross-correlation is determined on the basis of the histograms of the pulse intervals and consequently requires only little computational effort for small correlation times, is only used for correlation times below the entered limit value. For larger correlation times is in one step 8th in 1 the autocorrelation and / or the cross-correlation performed according to the multiple-tau method. With regard to the algorithms used here, reference is made to the product information of ALV-Laser Vertriebsgesellschaft mb. H. Langen, FRG, on the ALV-5000 Digital Multiple Tau Correlator, in particular the text "Introduction to the Multiple Tau Correlation Technique" by Rainer Perters. The results of both algorithms are subsequently in one step 10 combined and presented to a composite diagram.

Die erfindungsgemäßen Verfahren finden bevorzugt Anwendung in der konfokalen Mikroskopie, bei dem der von einem oder mehreren Lasern (11) emittierte Laserstrahl durch ein Mikroskopobjektiv (13) hoher numerischer Apertur in eine Probe (12) fokussiert wird. Das Anregungsvolumen in der Probe (12) beträgt dabei nur wenige Ferntoliter. Die in der Probe (12) erzeugte Fluoreszenzstrahlung wird vom Objektiv (13) wieder aufgesammelt, mittels eine Farbteilers (15) vom Anregungslicht getrennt und nachfolgend mittels eines zweiten Farbteilers (14) zwei separaten Detektionkanälen zugeführt. In jedem der beiden Detektionskanäle ist eine konfokale Blende (16, 17) vorgesehen, die beide in einer zur Fokusebene des Objektivs (13) konjugierten Ebene angeordnet sind. Nach Transmission durch die konfokalen Blenden wird das in jedem Detektionskanal enthaltene Lichtsignal von hochempfindlichen Detektoren, die zum Nachweis einzelner Photonen ausgelegt sind, detektiert. Die konfokalen Blenden stellen dabei sicher, daß auch das Volumen in der Probe, aus dem Fluoreszenzstrahlung detektiert wird, die geringe Größe des Anregungsvolumens aufweist. Aufgrund des sehr keinen Anregungs- und Detektionsvolumens treten in beiden Detektionskanälen Impulssignale auf, die im wesentlichen aus einzelnen Impulsen mit längeren Impulsabständen bestehen.The methods according to the invention are preferably used in confocal microscopy, in which the one or more lasers ( 11 ) emitted laser beam through a microscope objective ( 13 ) high numerical aperture into a sample ( 12 ) is focused. The excitation volume in the sample ( 12 ) is only a few Ferntoliter. The in the sample ( 12 ) generated by the lens ( 13 ) picked up again, by means of a color divider ( 15 ) separated from the excitation light and subsequently by means of a second color divider ( 14 ) are supplied to two separate detection channels. In each of the two detection channels is a confocal aperture ( 16 . 17 ) are provided, both in a focal plane of the lens ( 13 ) are arranged on the conjugate plane. After transmission through the confocal apertures, the light signal contained in each detection channel is detected by highly sensitive detectors designed to detect individual photons. The confocal diaphragms thereby ensure that the volume in the sample from which fluorescence radiation is detected also has the small size of the excitation volume. Due to the very low excitation and detection volume, pulse signals occur in both detection channels, which essentially consist of individual pulses with longer pulse intervals.

Claims

A method of recording pulse signals of a plurality of at least two input channels, wherein the plurality of input channels are sampled at occurred sampling frequencies and after detection of an event in at least one of the input channels or after overflow of a counter, the current state of all input channels in a memory register together with the Time interval to the last storage characterizing size are stored.

A method of recording pulse signals of a plurality of at least two input channels, wherein the plurality of input channels are sampled for events at a predetermined sampling frequency and, upon detection of an event in at least one of the input channels or after overflow of a counter, the states of all input channels in the sampling cycle in which the event occurred and stored for a predetermined number of sampling cycles after the occurrence of the first event together with a quantity characterizing the time interval to the last preceding storage.

The method of claim 1 or 2, wherein the data of the input channels is binary.

The method of claim 2, wherein said storing is as at least 16-bit words, and wherein said predetermined number of sampling cycles for at least two input channels is at least two, preferably three.

The method of claim 1 or 2, wherein the stored data are subjected to a correlation evaluation.

The method of claim 5, wherein the cross-correlation of the data of two input channels is calculated.

The method of claim 5 or 6, wherein a correlation limit is selectable and wherein for correlation times that are smaller than the correlation limit, the calculation of the correlation is lossless using the histograms of the pulse intervals.

Device for recording pulse signals of several input channels according to a method according to one of claims 1 to 7, wherein a clock oscillator ( 1 ), An institution ( 2 ) for sampling the multiple input channels, a counter ( 3 ) and a memory ( 4 ) and wherein the detection of a first event in one of the input channels or the overflow of the counter ( 3 ), depending on which event occurs first, a storage of the states of all input channels and the last count on the occurrence of the event triggers.

Confocal microscope with at least two confocal detection channels for the separate detection of light at two different wavelengths and with a device for recording pulse signals according to claim 8.