WO2012032955A1 - 複数の波長帯域の光計測を用いた光分析方法 - Google Patents

複数の波長帯域の光計測を用いた光分析方法 Download PDF

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WO2012032955A1
WO2012032955A1 PCT/JP2011/069440 JP2011069440W WO2012032955A1 WO 2012032955 A1 WO2012032955 A1 WO 2012032955A1 JP 2011069440 W JP2011069440 W JP 2011069440W WO 2012032955 A1 WO2012032955 A1 WO 2012032955A1
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light
signal
particles
time
light intensity
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PCT/JP2011/069440
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拓哉 葉梨
田邊　哲也
山口光城
秀孝 中田
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オリンパス株式会社
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    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
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    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy

Definitions

  • the present invention uses an optical system capable of detecting light from a minute region in a solution, such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope, and uses atoms, molecules or aggregates thereof dispersed or dissolved in a solution ( These are hereinafter referred to as “particles”), for example, biomolecules such as proteins, peptides, nucleic acids, lipids, sugar chains, amino acids or aggregates thereof, particulate objects such as viruses and cells, or non-
  • the present invention relates to an optical analysis method capable of detecting light from biological particles and obtaining useful information in analysis or analysis of their states (interactions, binding / dissociation states, etc.).
  • a particle that emits light is either a particle that emits light itself, or a particle to which an arbitrary luminescent label or luminescent probe is added.
  • the light emitted from the luminescent particles may be fluorescence, phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, scattered light, or the like.
  • the average residence time (translational diffusion time) of the fluorescent molecules and the like in the minute region determined from the value of the autocorrelation function of the measured fluorescence intensity, and the average number of staying molecules Based on this, acquisition of information such as the speed or size of movement of fluorescent molecules, concentration, concentration, molecular structure or size change, molecular binding / dissociation reaction, dispersion / aggregation, etc.
  • FCCS fluorescence cross-correlation spectroscopy
  • Non-Patent Document 4 and Patent Document 5 an apparatus similar to FCS is used for a sample solution containing two fluorescent molecules having different emission wavelengths.
  • the light intensity of the two emission wavelengths is measured, and based on the value of the cross-correlation function of the measured light intensity of the two emission wavelengths, there is a correlation between the movements of the particles emitting fluorescence of the two emission wavelengths. Whether the particles are bound or interacting with each other, or the number or percentage of interacting substances.
  • Patent Documents 6 and 7 propose a method for detecting a fluorescent substance based on the passage of time of a fluorescence signal of a sample solution measured using an optical system of a confocal microscope.
  • Patent Document 8 describes the presence of fluorescent fine particles in a flow or on a substrate by measuring weak light from fluorescent fine particles distributed in a flow cytometer or fluorescent fine particles fixed on a substrate using a photon counting technique. A signal arithmetic processing technique for detecting the signal is proposed.
  • the sample required for the measurement is much larger than before.
  • Low concentration and minute amount are acceptable (the amount used in one measurement is at most several tens of ⁇ L), and the measurement time is greatly shortened (second measurement is repeated several times in one measurement) .) Therefore, these technologies are particularly useful for analyzing rare or expensive samples often used in the field of medical and biological research and development, for clinical diagnosis of diseases, screening for physiologically active substances, etc.
  • the number is large, it is expected to be a powerful tool capable of performing experiments or inspections at a lower cost or faster than conventional biochemical methods.
  • the light to be measured is light emitted from one molecule or several molecules of fluorescence.
  • Statistical processing to calculate fluctuations in fluorescence intensity such as calculation of autocorrelation function or cross-correlation function of fluorescence intensity data measured in time series or fitting to a histogram is performed in the analysis of It does not refer to or analyze the light signal individually. That is, in these photoanalysis techniques, light signals from a plurality of fluorescent molecules and the like are statistically processed, and statistical average characteristics of the fluorescent molecules and the like are detected.
  • the concentration or number density of the fluorescent molecules or the like to be observed in the sample solution is equal to one second in the equilibrium state.
  • there is always about one fluorescent molecule in the micro area so that the number of fluorescent molecules that can be statistically processed in and out of the micro area within the measurement time of the order length. It needs to be at a certain level.
  • the concentration of fluorescent molecules or the like in the sample solution used in the above optical analysis technique is typically about 1 nM or more.
  • the applicant of the present application disclosed in Japanese Patent Application No. 2010-044714 and PCT / JP2011 / 53481 that the concentration or number density of the luminescent particles to be observed includes statistical processing such as FCS, FCCS, FIDA, etc.
  • An optical analysis technique based on a novel principle that makes it possible to quantitatively observe the state or characteristics of luminescent particles in a sample solution lower than the level handled in the paper is proposed.
  • optical that can detect light from a minute region in a solution such as an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope as in FCS, FCCS, FIDA, etc.
  • the position of the micro area which is the light detection area
  • the sample solution is scanned by the micro area and dispersed in the sample solution and randomly moved.
  • the luminescent particles cross the microscopic area, the light emitted from the luminescent particles is detected, thereby detecting each of the luminescent particles in the sample solution individually, and counting of the luminescent particles and the sample solution Allows acquisition of information on the concentration or number density of the luminescent particles therein.
  • the sample required for measurement is a very small amount (for example, about several tens of ⁇ L, as in the optical analysis techniques such as FCS, FCCS, FIDA)
  • the measurement time is short, and the presence of luminescent particles having a lower concentration or number density is detected as compared with the case of optical analysis techniques such as FCS, FCCS, FIDA, etc.
  • the light emitted from the luminescent particle is a mountain-shaped or substantially bell-shaped peak in time-series light intensity data.
  • the intensity change of the profile that is, it appears as a pulse-like signal, and the pulse-like signal is represented on the time-series light intensity data under the assumption that each of the pulse-like signals corresponds to each of the luminescent particles.
  • the number of detected pulse signals is counted as the number of luminescent particles that have passed through the light detection region.
  • a light signal from one kind of luminescent particles and another kind of luminescent particles having a common emission wavelength are used.
  • the light signal can be discriminated, or the light signal from the observation target particle and the light signal from the light emitting particle other than the observation target particle can be distinguished, and the light signal from the light emitting particle other than the observation target particle can be distinguished. It is preferable that the light signal can be selectively removed.
  • the optical measurement technology that combines the optical system of the current confocal microscope or multiphoton microscope and the ultrasensitive photodetection technology.
  • a method for detecting the signal of each luminescent particle individually can be used for discrimination from light signals from other luminescent particles or selective removal of light signals from luminescent particles other than the observation target particles. That's right.
  • one object of the present invention is to have a common emission wavelength in a method of measuring light by combining the optical system of the confocal microscope or the multiphoton microscope as described above and an ultrasensitive photodetection technique. Proposing a novel method that allows individual detection and identification of light intensity changes or signals corresponding to light from one type of luminescent particles in a sample solution in which there are multiple types of luminescent particles. .
  • another object of the present invention is to provide light intensity data measured in a method of measuring light by combining the optical system of the confocal microscope or multiphoton microscope as described above and an ultrasensitive photodetection technique. It is to propose a novel technique that makes it possible to determine which of the plurality of types of luminescent particles is the signal that appears above.
  • the above problem is a method for detecting and analyzing light from a sample solution containing a plurality of types of luminescent particles that randomly move using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope. And measuring the intensity of light in a plurality of wavelength bands from the light detection region of the optical system in the sample solution for each wavelength band simultaneously and generating time-series light intensity data separately for each of the wavelength bands And detecting a signal generated simultaneously in time-series light intensity data of at least two wavelength bands of the time-series light intensity data as a signal representing light from the luminescent particles, It is achieved by a method characterized in that a simultaneously generated signal is identified as a signal of at least one specific type of luminescent particles among the plurality of types of luminescent particles.
  • “randomly moving luminescent particles” are particles that emit light, such as atoms, molecules, or aggregates thereof dispersed or dissolved in a sample solution, and are not fixed to a substrate or the like. Any particles may be used as long as they are freely Brownian moving in the solution. Such luminescent particles are typically fluorescent particles, but may be particles that emit light by phosphorescence, chemiluminescence, bioluminescence, light scattering, or the like.
  • the “light detection area” of the optical system of a confocal microscope or multiphoton microscope is a minute area in which light is detected in those microscopes.
  • the illumination light is Corresponds to the focused region (in the confocal microscope, it is determined in particular by the positional relationship between the objective lens and the pinhole.
  • the luminescent particles emit light without illumination light, for example, chemiluminescence or biological In the case of particles that emit light by light emission, illumination light is not required in the microscope.
  • the “at least one specific type of luminescent particle” associated with the “simultaneously generated signal” includes not only one type of luminescent particle but also some of the types contained in the sample solution. It should be understood that types of luminescent particles may be included. (Hereinafter, in the present specification, the term “signal” refers to a signal representing light from a light emitting particle unless otherwise specified.)
  • the simultaneously generated signal indicates at least one of the plurality of types of luminescent particles.
  • the signal is a signal of the kind of luminescent particles. If it is known in advance in which wavelength band the particles to be observed emit light, whether the simultaneously generated signal is a signal of the particles to be observed, or light emission other than the particles to be observed Whether the signal is a particle signal can be identified.
  • the data of the generation period of the signal generated simultaneously in the time series data of at least two wavelength bands is the data of the generation period of the simultaneously generated signal. It can be determined that the signal is a particle signal.
  • the detection of the signal generated simultaneously on the time series data of at least two wavelength bands is performed, for example, on the time series light intensity data of the first wavelength band among the plurality of wavelength bands.
  • the signal generation period of the signal representing the light of the luminescent particles in the time-series light intensity data of at least one wavelength band other than the first wavelength band of the plurality of wavelength bands is When overlapping with the generation period, the signal in the time-series light intensity data of the first wavelength band and the signal in the time-series light intensity data of at least one wavelength band other than the first wavelength band are It may be executed in such a manner that it is detected as a simultaneously generated signal.
  • the signal generation period in the time series light intensity data of one wavelength band is the time series light intensity of the other wavelength band.
  • those signals may be determined as simultaneously generated signals. If the number of bands to be measured is three or more, the signal generation period in the time-series light intensity data of one of the wavelength bands is one of the remaining two or more wavelength bands.
  • these signals When overlapped with the signal generation period in the time-series light intensity data of one wavelength band, these signals may be determined as simultaneously generated signals, and two or more of the remaining two or more wavelength bands When all the signal generation periods in the time-series light intensity data of the wavelength band overlap with each other, the signals may be determined to be generated simultaneously, or the time-series light intensity data of all the wavelength bands When the generation periods of the signals overlap with each other, the signals may be determined to be simultaneously generated signals. That is, it should be understood that a combination of wavelength bands to be referred to when determining that the signals are generated simultaneously may be arbitrarily selected.
  • the number of types of luminescent particles that can be identified is determined by the number of combinations of reference wavelength bands, and the number of types of luminescent particles that can be identified increases as the number of combinations of reference wavelength bands increases. Should also be understood.
  • the configuration of the present invention described above may be applied to an optical analysis method for individually detecting signals representing light from luminescent particles on time-series light intensity data as one aspect.
  • a process of individually detecting a signal representing light from the luminescent particles in each of the time-series light intensity data of a plurality of wavelength bands may be executed. Then, based on whether each signal is generated simultaneously in at least two selected wavelength bands of the plurality of wavelength bands, the type of the luminescent particles that emit light represented by each of the detected signals is determined. , You may come to identify. That is, according to such a configuration, it is possible to classify signals appearing in the time-series light intensity data according to the type of luminescent particles.
  • each signal appearing in time-series light intensity data can be classified according to the type of luminescent particles
  • each signal appears in each time-series light intensity data. It is possible to identify and classify the signal depending on whether it is a signal of the target particle or a signal of other particles. That is, as one aspect, signals generated simultaneously in at least two selected wavelength bands are identified as signals of particles to be observed among a plurality of types of light emitting particles, and light emitting particles other than the simultaneously generated signals are identified. May be identified as a signal of a luminescent particle other than the observation target particle. Conversely, a signal generated simultaneously in at least two selected wavelength bands may be classified into a plurality of types.
  • the light emitting particle may be identified as a signal of a light emitting particle other than the observation target particle, and a signal representing light from the light emitting particle other than the simultaneously generated signal may be identified as a signal of the observation target particle.
  • the wavelength bands to be measured are two wavelength bands
  • the signals generated simultaneously in the time-series light intensity data of the two wavelength bands are identified as the signals of the observation target particles, and the two wavelength bands
  • a signal representing light from the luminescent particles generated in only one of the time-series light intensity data may be identified as a signal of luminescent particles other than the observation target particles.
  • the signal generated at the same time in the intensity data is identified as the signal of the luminescent particle other than the observation target particle, and the signal representing the light from the luminescent particle generated in only one of the time-series light intensity data of the two wavelength bands It may be identified as a signal of an observation target particle.
  • the above-described configuration of the present invention may be applied to the scanning molecule counting method as described above. That is, in one embodiment of the method of the present invention, the measurement of the intensity of light in a plurality of wavelength bands from the light detection region is performed by changing the optical path of the optical system of the confocal microscope or the multiphoton microscope. In this process, each of the signals representing light from a single light emitting particle is individually detected in each of the time-series light intensity data thus obtained while moving the position of the light detection region. And for each detected signal, as described above, based on whether each signal occurred simultaneously in at least two selected wavelength bands of the plurality of wavelength bands, The type of the luminescent particles that emit light represented by each signal may be identified.
  • a sample solution containing luminescent particles is prepared by an arbitrary technique, and then the light detection region in the sample solution is prepared.
  • the light intensity is sequentially measured while moving the position, that is, while scanning the sample solution with the light detection region.
  • the moving light detection region includes light emitting particles moving at random, the light from the light emitting particles is measured, and thereby the presence of one light emitting particle is detected.
  • the signal representing the light from the luminescent particles is detected individually, thereby detecting the presence of each luminescent particle individually.
  • various information on the state of the particles in the solution is acquired.
  • the detection of the signal corresponding to one luminescent particle on the time-series light intensity data is performed in the form of the signal detected in time-series. May be made based on: In the embodiment, typically, when a pulsed signal having an intensity greater than a predetermined threshold is detected, the signal is a signal corresponding to one luminescent particle, and the generation period of the signal. In this case, it may be detected that one luminescent particle enters the light detection region. Further, in the case of the present invention, based on whether or not each signal is simultaneously generated in at least two selected wavelength bands of the plurality of wavelength bands, the type of luminescent particles corresponding to each signal is determined.
  • signals generated simultaneously in at least two selected wavelength bands are used as signals of observation target particles (or signals of light emission particles other than the observation target particles) among a plurality of types of light emission particles. It is possible to identify and identify signals other than the simultaneously generated signals as signals of luminescent particles other than the observation target particles (or as signals of the observation target particles). Therefore, it is possible to discriminate and detect the signal of the luminescent particles other than the observation target particles, and therefore, the signal of the luminescent particles other than the observation target particles can be excluded, so that deterioration in measurement accuracy can be avoided. .
  • the signals generated simultaneously in the time series light intensity data of the two wavelength bands are identified as the signals of the observation target particles, and the two wavelengths
  • the signal generated in only one of the time-series light intensity data in the band may be identified as the signal of the luminescent particles other than the observation target particles.
  • the signal generated at the same time is identified as the signal of the luminescent particle other than the observation target particle, and the signal generated in only one of the time-series light intensity data of the two wavelength bands is identified as the signal of the observation target particle. May be.
  • the signal generated simultaneously in the time-series light intensity data of the two wavelength bands, the signal generated only in the time-series light intensity data of one of the two wavelength bands, and the other time-series light of the two wavelength bands may be identified as separate observation target particles (that is, three types of luminescent particles may be identified).
  • the number of signals representing light from a single luminescent particle detected individually is counted and detected during movement of the position of the light detection region.
  • the number of luminescent particles may be counted (particle counting).
  • information on the number density or concentration of the luminescent particles in the sample solution can be obtained by combining the number of luminescent particles and the amount of movement of the position of the light detection region.
  • the total volume of the movement locus of the light detection region is specified by any method, for example, by moving the position of the light detection region at a predetermined speed, the number density or concentration of the luminescent particles is reduced. It can be calculated specifically.
  • the absolute number density value or concentration value is not directly determined, but the relative number density or concentration ratio with respect to a plurality of sample solutions or a standard sample solution serving as a reference for the concentration or number density is calculated. It may be like this.
  • the optical detection area is moved to change the position of the photodetection area by changing the optical path of the optical system. In this case, mechanical vibration and hydrodynamic action are not substantially generated, so that the luminescent particles in the sample solution are not affected by the mechanical action in a stable state (with no artifacts). It is possible to measure light (for example, it is difficult to always give a uniform flow rate when a flow is generated in a sample, the apparatus configuration is complicated, and the amount of sample required is greatly increased.
  • the luminescent particles or other substances in the solution may be altered or denatured due to the hydrodynamic action of the flow.
  • measurement and analysis can be performed with a small amount (about 1 to several tens of ⁇ L) of the sample solution as in the case of FCS, FIDA, and the like.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution may be appropriately changed based on the characteristics of the luminescent particles or the number density or concentration in the sample solution.
  • the manner of light detected from the luminescent particles can vary depending on its properties or number density or concentration in the sample solution.
  • the moving speed of the light detection region is increased, the amount of light obtained from one luminescent particle is reduced, so that light from one luminescent particle (particularly, observation target particle) can be measured with high accuracy or sensitivity.
  • the moving speed of the light detection region is preferably changed as appropriate.
  • the movement speed of the position of the light detection region in the sample solution is preferably the diffusion movement speed of the luminescent particles (average particle size due to Brownian motion). It is set higher than (moving speed).
  • the light detection region detects light emitted from one luminescent particle, and detects the luminescent particles individually. However, if the luminescent particles move randomly in the solution due to Brownian motion and enter and exit the photodetection region multiple times, a signal (representing its presence) is detected multiple times from one luminescent particle. Therefore, it becomes difficult to make the detected signal correspond to the presence of one luminescent particle.
  • the movement speed of the light detection region is set to be higher than the diffusion movement speed of the luminescent particles, so that one luminescent particle can correspond to one (representing the presence of particles). It becomes. Since the diffusion movement speed varies depending on the luminescent particles, it is preferable that the movement speed of the light detection region is appropriately changed according to the characteristics of the luminescent particles (particularly, the diffusion constant) as described above.
  • the change of the optical path of the optical system for moving the position of the light detection area may be performed by an arbitrary method.
  • the position of the light detection region may be changed by changing the optical path using a galvanometer mirror employed in a laser scanning optical microscope.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily set, and may be selected from, for example, a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, and a curve.
  • signals generated simultaneously in signals representing light from luminescent particles detected on time-series light intensity data in a plurality of wavelength bands are detected, and simultaneously generated signals and other signals are detected. Since the distinction is made from the signal, particle counting and determination of concentration or number density can be performed separately for the luminescent particles corresponding to the simultaneously generated signal and other luminescent particles, thereby eliminating the need for Such as observation and analysis of specific types of luminescent particles in the sample solution, and interaction of luminescent particles in the sample solution. This is advantageous for observation and analysis.
  • the above-described method of the present invention may be used for any optical analysis method other than the scanning molecule counting method.
  • signals generated simultaneously in at least two selected wavelength bands among the plurality of wavelength bands are identified as a signal of a luminescent particle other than the observation target particle among the plurality of types of luminescent particles, and thus, in various analyses, only a signal of the luminescent particle other than the observation target particle is extracted and ignored or It can be excluded.
  • the data on the generation period of simultaneously generated signals that is, the period in which light from luminescent particles other than the observation target particles is measured
  • the data of the generation period of the signal identified as the signal of the luminescent particle other than the observation target particle in the time-series light intensity data may be removed.
  • Examples of such an optical analysis method include fluorescence correlation spectroscopy (FCS), fluorescence intensity distribution analysis (FIDA), or fluorescence cross-correlation spectroscopy using time-series light intensity data representing the light intensity from the observation target particles. (FCCS) optical analysis may be used. According to such a configuration, it is possible to selectively exclude data during a period in which luminescent particles other than the observation target particles have entered the light detection region, and to perform analysis / analysis, thereby preventing deterioration of accuracy of results. It is done.
  • the method of the present invention is typically performed in a solution of a biological molecule such as a protein, peptide, nucleic acid, lipid, sugar chain, amino acid or aggregate thereof, or a particulate biological object such as a virus or cell.
  • a biological molecule such as a protein, peptide, nucleic acid, lipid, sugar chain, amino acid or aggregate thereof, or a particulate biological object such as a virus or cell.
  • a biological molecule such as a protein, peptide, nucleic acid, lipid, sugar chain, amino acid or aggregate thereof, or a particulate biological object such as a virus or cell.
  • non-biological particles eg, atoms, molecules, micelles, metal colloids, etc.
  • At least two light intensity data in time series obtained by light measurement in a plurality of wavelength bands using an optical system of a confocal microscope or a multiphoton microscope are used.
  • the period during which luminescent particles that emit light in the selected wavelength band enter the light detection region of the optical system of the confocal microscope or multiphoton microscope by individually detecting signals simultaneously generated in two selected wavelength bands Can be individually identified on the time-series light intensity data, and the luminescence that is different from each other, but has a common emission wavelength band, and was indistinguishable by measuring light only in that wavelength band It is possible to grasp when the light from the particles is detected on the time-series light intensity data.
  • a signal of a specific type of luminescent particle a luminescent particle that emits light of a selected wavelength band
  • the signal Noise separation can be achieved.
  • the method of the present invention is applied to the scanning molecule counting method, it is possible to achieve more precise detection of luminescent particles and particle counting.
  • the light detection mechanism itself is configured to detect light from the light detection region of a confocal microscope or a multiphoton microscope, as in the case of optical analysis technologies such as FCS, FCCS, and FIDA. Therefore, the amount of the sample solution may be a very small amount, and since statistical processing such as calculating the fluctuation of the fluorescence intensity is not executed, the number density or concentration of the particles is FCS, FCCS, FIDA, etc. It is applicable to sample solutions that are significantly lower than the levels required for photoanalysis techniques.
  • the sample solution In which the concentration of the luminescent particles is significantly lower than the level required for optical analysis techniques such as FCS, FCCS, FIDA, etc.
  • the concentration of the luminescent particles is significantly lower than the level required for optical analysis techniques such as FCS, FCCS, FIDA, etc.
  • the number or concentration of the luminescent particles to be observed is other luminescent particles or Even if the light of the observation target particle is buried in the light intensity data in the optical measurement technology that continuously measures the normal light intensity, it is relatively lower than the number or concentration of impurities.
  • Some can detect specific luminescent particles or observed subject to particles, and it is expected to improve the accuracy of the counting.
  • the present invention may be applied to the case where low-concentration luminescent particles are observed in a sample solution (such as a plasma sample) in which many fine particles that cause noise exist.
  • the configuration in which the method of the present invention is further incorporated into the scanning molecule counting method can enhance the presence or absence of interaction between the luminescent particles in a sample solution containing a plurality of types of luminescent particles having different emission wavelength bands. It becomes possible to detect with accuracy.
  • the present invention since signals generated simultaneously in time-series light intensity data in a plurality of wavelength bands are individually detected, the interaction between a plurality of types of luminescent particles in a sample solution is weak. Even when only a very small amount of a conjugate of the luminescent particles is formed (for example, a level difficult to detect with FCCS), the detection of the presence of the conjugate, counting, and the like can be achieved.
  • FIG. 1A is a schematic diagram of the internal structure of an optical analyzer that performs the method of the present invention.
  • FIG. 1B is a schematic diagram of a confocal volume (light detection region of a confocal microscope).
  • FIG. 1C is a schematic diagram of a mechanism for changing the direction of the mirror 7 to move the position of the light detection region in the sample solution.
  • 2A and 2B are a schematic diagram for explaining the principle of light detection in a scanning molecule counting method to which the method of the present invention is applied, and a schematic diagram of a time change of measured light intensity, respectively. is there.
  • 3 (A), (C), (D) and (E) are combinations of luminous particles identified by detecting simultaneously generated signals in light intensity data measured in a plurality of wavelength bands.
  • FIG. 3B is a schematic diagram of the temporal change (time-series light intensity data) of the light intensity measured in the cases of (A), (C), and (D), and FIG. It is a schematic diagram of the time change (time series light intensity data) of the light intensity measured in the case of E).
  • FIG. 4 is a flowchart showing a processing procedure of a scanning molecule counting method for performing measurement of light in a plurality of wavelength bands and detection / counting of signals simultaneously generated in the plurality of wavelength bands according to the method of the present invention. It is.
  • FIG. 5A and 5B respectively show the case where the observation target particle traverses the light detection region while performing Brownian motion and the position of the light detection region in the sample solution is faster than the diffusion movement speed of the observation target particle. It is a model figure showing the mode of movement of a particle when observation object particles cross a photodetection field by moving by.
  • FIG. 5C shows the signal processing process of the detection signal in the processing procedure for detecting the presence of the luminescent particles from the measured time-series light intensity data (time change of the photon count) according to the scanning molecule counting method. It is a figure explaining an example.
  • FIG. 6A shows an actual measurement example (bar graph) of measured photon count data, a curve (dotted line) obtained by smoothing the data, and a Gaussian function (solid line) fitted in the pulse existence region. Yes. In the figure, a signal labeled “noise” is ignored as it is a signal due to noise or foreign matter.
  • FIG. 6B is a diagram for explaining processing for determining whether or not signals generated in time-series light intensity data in different wavelength bands are generated simultaneously.
  • FIG. 7A shows the measurement of light in a plurality of wavelength bands, the detection of signals simultaneously generated in a plurality of wavelength bands, and the generation period of noise or the like in time-series light intensity data according to the method of the present invention.
  • FIG. 7B is a diagram for explaining processing for detecting simultaneously occurring signals in a plurality of measured wavelength bands and specifying a generation period of noise or the like.
  • FIG. 8 shows light intensity data (photon count data) (upper two stages) in two wavelength bands obtained in the scanning molecule counting method (Example 1) executed according to the method of the present invention, The example shows data after smoothing of intensity data (middle stage) and a pulse (pulse-like signal) (lower stage) specified by fitting a bell-shaped function.
  • FIG. 8 shows light intensity data (photon count data) (upper two stages) in two wavelength bands obtained in the scanning molecule counting method (Example 1) executed according to the method of the present invention, The example shows data after smoothing of intensity data (middle stage) and a pulse (pulse-like signal) (lower stage) specified by fitting a bell-shaped function.
  • FIG. 9 shows (A) the results of detection experiments of oligonucleotides labeled with two-color fluorescent dyes obtained in Example 1 carried out according to the method of the present invention, and (B) obtained by FCCS. The results of detection experiments for oligonucleotides labeled with two-color fluorescent dyes are shown. The error bars in each plot indicate a width that is three times the SD value of three measurements.
  • FIG. 10 shows one luminescent particle (fluorescent dye molecule TAMRA) in a sample solution containing a plurality of types of luminescent particles obtained in the scanning molecule counting method (Example 2) performed according to the method of the present invention. Results of counting are shown.
  • FIG. 10 shows one luminescent particle (fluorescent dye molecule TAMRA) in a sample solution containing a plurality of types of luminescent particles obtained in the scanning molecule counting method (Example 2) performed according to the method of the present invention. Results of counting are shown.
  • 11A shows the time-series light intensity data of the sub-measurement wavelength band from the time-series light intensity data of the main measurement wavelength band in the FCS (Example 3) executed by applying the method of the present invention.
  • 4 schematically shows a process of reconstructing temporally continuous data after deleting data in a period corresponding to a period determined as a noise period.
  • 11B and 11C show the number of particles and the translational diffusion time of the luminescent particles (fluorescent dye molecules ATTO) obtained in FCS (Example 3) executed by applying the method of the present invention. Results are shown. In the figure, error bars indicate three times the SD value.
  • FIG. 12 is an example of the time change of the photon count (light intensity) obtained in the conventional optical analysis technique for calculating the fluctuation of the fluorescence intensity.
  • FIG. 12A shows that the concentration of particles in the sample is sufficient. This is a case where measurement accuracy is given, and (B) is a case where the concentration of particles in the sample is significantly lower than in (A).
  • Optical analyzer confocal microscope 2 ... Light source 3 ... Single mode optical fiber 4 ... Collimator lenses 5, 14a ... Dichroic mirrors 6, 7, 11 ... Reflection mirror 8 ... Objective lens 9 ... Microplate 10 ... Well (sample solution container) DESCRIPTION OF SYMBOLS 12 ... Condenser lens 13 ... Pinhole 14 ... Barrier filter 15 ... Multi-mode optical fiber 16 ... Photo detector 17 ... Mirror deflector 17a ... Stage position change device 18 ... Computer
  • the method according to the present invention may be implemented by being incorporated into a scanning molecule counting method or an optical analysis method such as FCS, FCCS, FIDA or the like.
  • FCS scanning molecule counting method
  • FCCS optical analysis method
  • FIDA optical analysis method
  • FIG. 1A An optical system and a light detection of a confocal microscope schematically illustrated in FIG. 1A capable of measuring light in a plurality of different wavelength bands
  • optical analyzer 1 includes optical systems 2 to 17 and a computer 18 for controlling the operation of each part of the optical system and acquiring and analyzing data. Composed.
  • the optical system of the optical analyzer 1 may be the same as the optical system of a normal confocal microscope, in which the laser light (Ex) emitted from the light source 2 and propagated through the single mode fiber 3 is a fiber.
  • the light is emitted as a divergent light at an angle determined by a specific NA at the outgoing end of the light, becomes parallel light by the collimator 4, is reflected by the dichroic mirror 5, the reflection mirrors 6, 7, and the objective lens 8 Is incident on.
  • the light source 2 may be provided with a plurality of light emitting sources (lasers) so that the wavelength of the excitation light can be appropriately selected according to the wavelength of the light that excites the light emitting particles.
  • lasers light emitting sources
  • a microplate 9 in which a sample container or well 10 into which a sample solution of 1 to several tens of ⁇ L is dispensed is typically arranged is emitted from the objective lens 8.
  • the laser light is focused in the sample solution in the sample container or well 10 to form a region with high light intensity (excitation region).
  • luminescent particles that are the object of observation typically molecules to which a luminescent label such as a fluorescent dye has been added are dispersed or dissolved, and when the luminescent particles enter the excitation region, they emit light during that time. The particles are excited and light is emitted.
  • the emitted light (Em) passes through the objective lens 8 and the dichroic mirror 5, is reflected by the mirror 11, is collected by the condenser lens 12, and passes through the pinhole 13.
  • the pinhole 13 is disposed at a position conjugate with the focal position of the objective lens 8, and is schematically shown in FIG. Only the light emitted from the focal region of the laser beam, that is, the excitation region passes through the pinhole 13 and the light from other than the focal plane is blocked.
  • the focal region of the laser light illustrated in FIG. 1B is a light detection region in the present optical analyzer having an effective volume of about 1 to 10 fL, and is referred to as a confocal volume.
  • the light intensity is a Gaussian or Lorentzian distribution with the center of the region at the apex, and the effective volume is defined by the plane where the light intensity is 1 / e 2.
  • the light that has passed through the pinhole 13 is divided and divided by the wavelength band in such a manner that the light of a part of the wavelength band is reflected by the dichroic mirror 14a and the light of the remaining wavelength band is transmitted.
  • Each component of light is transmitted through the corresponding barrier filter 14 (here, only the light component of a specific wavelength band is selected) and introduced into the multimode fiber 15 to correspond to the photodetector.
  • the photodetector 16 an ultrasensitive photodetector that can be used for photon counting is preferably used, so that light from one luminescent particle, for example, one or several fluorescent dye molecules can be used. The weak light can be detected.
  • the optical path of the optical system is further changed to change the inside of the sample solution by the light detection region.
  • a mechanism is provided for scanning, i.e., moving the position of the focal region (i.e., the light detection region) within the sample solution.
  • a mirror deflector 17 that changes the direction of the reflection mirror 7 may be employed as schematically illustrated in FIG.
  • Such a mirror deflector 17 may be the same as a galvanometer mirror device provided in a normal laser scanning microscope.
  • the mirror deflector 17 is driven in cooperation with light detection by the light detector 16 under the control of the computer 18.
  • the movement trajectory of the position of the light detection region may be arbitrarily selected from a circle, an ellipse, a rectangle, a straight line, a curve, or a combination thereof (so that various movement patterns can be selected by the program in the computer 18). It may be.)
  • the position of the light detection region may be moved in the vertical direction by moving the objective lens 8 up and down.
  • a stage (not shown) of the microscope is provided with a stage position changing device 17a for moving the horizontal position of the microplate 9 in order to change the well 10 to be observed. Good.
  • the operation of the stage position changing device 17a may be controlled by the computer 18.
  • the above optical system is used as a multiphoton microscope. In that case, since there is light emission only in the focal region (light detection region) of the excitation light, the pinhole 13 may be removed.
  • the optical systems 2 to 5 for generating excitation light may be omitted.
  • the optical system of the confocal microscope is used as it is.
  • Embodiments of the Invention in Scanning Molecule Counting Methods As described in the “Summary of the Invention” section, in one aspect, the method of the invention is advantageously implemented in combination with a scanning molecule counting method. In other words, one embodiment of the invention can be said to improve the scanning molecule counting method.
  • embodiments of the present invention in the scanning molecule counting method will be described.
  • the concentration or number density of the observation target particles is lower than that, for example, as shown in FIG. 12B, the observation target particles are at a level that only occasionally enters the light detection region CV. As shown on the right side of the figure, a significant light intensity signal (photon count) appears only in part of the measurement time, making it difficult to accurately calculate fluctuations in light intensity. .
  • the concentration of the observation target particle is much lower than the level at which about one observation target particle is always present in the light detection area during measurement, the influence of the background is considered in the calculation of the light intensity fluctuation. The measurement time is long in order to obtain significant light intensity data sufficient for calculation.
  • a mechanism (mirror deflector 17) for moving the position of the light detection region is driven to change the optical path, and the pattern is schematically shown in FIG.
  • the light detection is performed while moving the position of the light detection region CV in the sample solution, that is, while scanning the sample solution by the light detection region CV.
  • FIG. 2A when the light detection region CV moves (time to to t2 in the figure) and passes through the region where one luminescent particle exists (t1), Light is emitted from the luminescent particles, and a pulse-like signal having a significant light intensity (Em) appears as depicted in FIG.
  • the movement of the position of the light detection region CV and the light detection are executed, and pulse-like signals (significant light intensity) appearing in the meantime illustrated in FIG. 2B are detected one by one.
  • the luminescent particles are individually detected, and the number of the luminescent particles is counted to obtain information on the number, concentration, or number density of the luminescent particles present in the measured region.
  • statistical calculation processing such as calculation of fluctuation of fluorescence intensity is not performed, and luminescent particles are detected one by one. Therefore, FCS, FCCS, FIDA, etc. are sufficient. Even with a sample solution in which the concentration of particles to be observed is so low that analysis cannot be performed with high accuracy, information on the concentration or number density of particles can be acquired.
  • the Such simultaneously generated pulsed signals are considered to correspond to one luminescent particle having an emission wavelength in all of the selected wavelength bands (separately having an emission wavelength in each of the selected wavelength bands). It is extremely rare for the luminescent particles to jump into the confocal volume (CV) at the same time.)
  • the pulse signal generated at the same time indicates that one type of luminescent particles contained in the sample solution. It can be identified as a signal, and a pulsed signal other than the pulsed signal generated at the same time can be identified as a signal of another kind of luminescent particles.
  • the presence and number density or concentration of each of a plurality of types of particles are one aspect. It is advantageously used when acquiring the information. Specifically, for example, as illustrated in FIG. 3A, particles a that emit light of wavelength I, particles b that emit light of wavelength II, and light of wavelengths I and II are emitted into the sample solution.
  • particles a that emit light of wavelength I, particles b that emit light of wavelength II, and light of wavelengths I and II are emitted into the sample solution.
  • the particle c is contained, as shown in FIG. 3B, when the particle a passes the CV (t1), the particle b has the CV only on the time-series light intensity data of the wavelength I.
  • the above-mentioned signal identification method on the time-series light intensity data can be advantageously used for detection of molecular binding reaction or dissociation reaction.
  • the particle a when inspecting the presence / absence or degree of a binding reaction between a particle a and another particle b, the particle a is labeled with a luminescent substance that emits light of wavelength I (typically a fluorescent dye, and so on).
  • the particles b are labeled with a luminescent substance that emits light of wavelength II.
  • a signal appears only at the wavelength I or the wavelength II, respectively.
  • the particle c before decomposition is prepared by adding both a label that emits light of wavelength I and a label that emits light of wavelength II. And then the decomposition reaction to be examined is carried out.
  • the particle c is decomposed by a decomposition reaction, a particle a to which a label that emits light of wavelength I is added and a particle b to which a label that emits light of wavelength II is added are generated.
  • a or b passes CV (t1 or t2), a signal appears only at wavelength I or wavelength II, while undecomposed particle c is CV.
  • the degradation reaction that can be tested in this embodiment include a degradation reaction with a restriction enzyme or polymerase that specifically degrades nucleic acids, and a degradation reaction with protease.
  • the method for detecting the pulsed signal generated simultaneously in the selected wavelength band according to the present invention to identify the luminescent particles is another aspect in addition to the luminescent particles to be observed in the sample solution.
  • the contaminant x is also a single luminescent particle.
  • the particle a passes through the CV (t1), a signal appears only at the wavelength I, and when the contaminant x passes through the CV (t2). Will cause signals to appear at both wavelengths I and II. Therefore, a signal generated simultaneously in the time series light intensity data of wavelengths I and II obtained by light measurement of the sample solution is identified as a contaminant x, and the time series light intensity data of wavelength I is identified.
  • the observation target particle is a light emitting particle that emits light of wavelengths I and II, and the contaminant emits only one of the wavelengths I and II. If not, it is possible to confirm the presence of the observation target particles and obtain information on the number density or concentration by referring only to the signals generated simultaneously in the time series light intensity data of the wavelengths I and II.
  • the measurement of light is measured in three or more wavelength bands.
  • the signal generated simultaneously in the selected wavelength band may be detected to identify the type of the luminescent particle.
  • the present invention may be used. It should be understood that it belongs to the scope of
  • FIG. 4 shows a processing process in the present embodiment expressed in the form of a flowchart.
  • the particles to be observed in the method of the present invention are any particles as long as they are dispersed particles in the sample solution and move randomly, such as dissolved molecules.
  • it may be a biomolecule such as a protein, peptide, nucleic acid, lipid, sugar chain, amino acid or aggregate thereof, virus, cell, metal colloid, or other non-biological molecule (sample solution) Is typically an aqueous solution, but is not limited thereto, and may be an organic solvent or any other liquid.
  • the observation target particle may be a particle that emits light itself, or a particle to which a luminescent label (fluorescent molecule, phosphorescent molecule, chemical / bioluminescent molecule) is added in an arbitrary manner.
  • a luminescent label that emits light in one wavelength band is added to one particle, and light in another wavelength band is applied to the other particle.
  • a sample solution may be prepared by appropriately mixing both particles and exposing them to conditions that cause a binding reaction.
  • the sample solution is a sample solution that has been subjected to conditions that induce a decomposition reaction after adding different luminescent labels that emit light in different wavelength bands to the particle. May be.
  • one luminescent label is added to the specific particle or two luminescent labels having different emission wavelengths are added. Will be.
  • the wavelength band to be detected may be appropriately selected based on the emission wavelength band of the luminescent particles in the sample. How to select the particle to be observed in the sample solution, how to add a luminescent label to the particle to be observed, and how to select the detection wavelength band.
  • a person skilled in the art can select various observation target particles or luminescent label combinations and detection wavelength bands for realizing the method of the present invention, and identify the luminescent particles according to the teaching of the present invention. It should be understood that any case is within the scope of the present invention.
  • the light intensity in the optical analysis by the scanning molecule counting method of the present embodiment is measured by driving the mirror deflector 17 during the measurement to detect the light detection area in the sample solution. Other than the movement of the position (scanning in the sample solution), it may be performed in the same manner as the light intensity measurement process in the FCCS that measures the light intensity in a plurality of wavelength bands (FIG. 4). Step 100). In the operation process, typically, after injecting the sample solution into the well 10 of the microplate 9 and placing it on the stage of the microscope, the user inputs an instruction to start measurement to the computer 18.
  • the computer 18 stores a program stored in a storage device (not shown) (a procedure for changing the optical path to move the position of the light detection region in the sample solution, and during the movement of the position of the light detection region).
  • a program stored in a storage device (not shown) (a procedure for changing the optical path to move the position of the light detection region in the sample solution, and during the movement of the position of the light detection region).
  • the procedure for detecting light from the light detection region irradiation of excitation light and measurement of light intensity in the light detection region in the sample solution are started.
  • the measurement is started, first, light having the excitation wavelength of the luminescent particles in the sample solution is emitted from the light source 2 under the control of the processing operation according to the program of the computer 18.
  • the wavelength of excitation light emitted from the light source 2 is emitted so that light in a plurality of wavelength bands to be detected is emitted from the light emitting particles.
  • a selection is made. Therefore, particularly when the luminescent particles emit fluorescence of only one wavelength band with respect to excitation light of one wavelength band, laser beams of a plurality of wavelength bands are emitted simultaneously.
  • the mirror deflector 17 drives the mirror 7 (galvanometer mirror) under the control of the processing operation according to the program of the computer 18 and executes the movement of the position of the light detection region in the well 10.
  • the photodetector 16 converts the sequentially detected light into an electrical signal and transmits it to the computer 18, and the computer 18 uses the transmitted signal to obtain time-series light intensity data from the transmitted signal in an arbitrary manner. Generate and save.
  • each of the plurality of photodetectors 16 detects light in different wavelength bands, and time-series light intensity data is generated for each detected different wavelength band.
  • the photodetector 16 is an ultra-sensitive photodetector that can detect the arrival of one photon, so that light detection is performed sequentially over a predetermined period of time every predetermined unit time.
  • time-series light intensity data is time-series photon count data. It may be.
  • the moving speed of the position of the light detection region during the measurement of the light intensity may be a predetermined speed that is arbitrarily set, for example, experimentally or so as to suit the purpose of analysis.
  • the movement of the position of the light detection region is executed in a manner in which the movement distance is grasped.
  • the movement speed is basically a constant speed.
  • the present invention is not limited to this.
  • the moving speed of the position of the light detection region in order to quantitatively and accurately execute individual detection of luminescent particles from the measured time-series light intensity data, or counting of the number of luminescent particles.
  • the moving speed is preferably set to a value faster than the random movement of the luminescent particles, that is, the moving speed due to the Brownian movement.
  • the luminescent particles to be observed are particles that are dispersed or dissolved in a solution and move freely at random, and therefore the position moves with time due to Brownian motion. Accordingly, when the moving speed of the position of the light detection region is slower than the movement of the particle due to Brownian motion, the particle moves randomly within the region as schematically illustrated in FIG.
  • the particle crosses the light detection region in a substantially straight line, so that in the time-series light intensity data, the upper part of FIG.
  • the profile of the change in light intensity corresponding to each particle is substantially the same (when the particle passes through the light detection region substantially linearly, the profile of the change in light intensity is the excitation light intensity distribution and
  • the movement speed of the position of the light detection region is based on the average movement speed (diffusion movement speed) due to the Brownian motion of the particles so that the correspondence between each light emitting particle and the light intensity can be easily identified. Is also set faster.
  • the moving speed of the position of the light detection region may be set to 15 mm / s, which is 10 times or more.
  • various movement speeds of the position of the light detection region are set, and the profile of the change in light intensity is expected to be expected (typically, the excitation light intensity distribution and Preliminary experiments for finding conditions that are substantially the same) may be repeatedly performed to determine a suitable moving speed of the position of the light detection region.
  • the computer 18 performs processing according to the program stored in the storage device to obtain the following light intensity data. An analysis may be performed.
  • the trajectory of one observation target particle passing through the light detection region is a substantially straight line as shown in FIG.
  • the change in the light intensity in the signal corresponding to the particle has a substantially bell-shaped profile reflecting the light intensity distribution in the light detection region (determined by the optical system). Accordingly, when the time width ⁇ in which the light intensity exceeding the appropriately set threshold value Io continues is within a predetermined range, it is determined that the signal having the light intensity profile corresponds to the passage of one particle through the light detection region. In other words, one luminescent particle may be detected.
  • (Ii) Counting of luminous particles when performing batch detection and counting of luminous particles from time-series light intensity data, first, time-series light intensity data (FIG. 5C). , The uppermost stage “detection result (unprocessed)”) is subjected to a smoothing (smoothing) process (step 110 in FIG. 4 and the upper stage “smoothing” in FIG. 5C).
  • the light emitted by the luminescent particles is probabilistically emitted, and data values may be lost in a very short time. Therefore, such a data value loss can be ignored by the smoothing process.
  • the smoothing process may be performed, for example, by a moving average method (for example, an adjacent average method, an algorithm of Savinsky-golay method), a percentile filter method, or an FFT filter method.
  • a moving average method for example, an adjacent average method, an algorithm of Savinsky-golay method
  • percentile filter method for example, a percentile filter method
  • FFT filter method for example, a percentile filter method
  • the parameters for executing the smoothing process such as the number of data points averaged at a time in the moving average method and the number of moving averages, are the moving speed (scanning of the position of the light detection region at the time of acquiring the light intensity data).
  • Speed scanning of the position of the light detection region at the time of acquiring the light intensity data.
  • BIN TIME may be set as appropriate.
  • a smoothing process is performed in order to detect a time region (pulse existing region) where a significant pulse-like signal (hereinafter referred to as “pulse signal”) exists.
  • a first derivative value with respect to time of the subsequent time-series light intensity data is calculated (step 120).
  • the time differential value of the time-series light intensity data has a large change in the value at the time of change of the signal value, as illustrated in the lower “time differential” in FIG. By reference, significant signal start and end points can be advantageously determined.
  • a significant pulse signal is sequentially detected on the time-series light intensity data, and it is determined whether or not the detected signal is a signal corresponding to the luminescent particles. Specifically, first, on the time-series time differential value data of the time-series light intensity data, with reference to the time differential value sequentially, the start point and the end point of one pulse signal are searched and determined, A pulse presence region is identified (step 130). When one pulse existence area is specified, a bell-shaped function fitting is performed on the smoothed time-series light intensity data in the pulse existence area (see FIG. 5C, “bell-shaped function fitting”).
  • Parameters such as the peak (maximum value) intensity Imax of the bell-shaped function, the pulse width (full width at half maximum) w, and the correlation coefficient (of the least square method) in the fitting are calculated (step 140).
  • the bell-shaped function to be fitted is typically a Gaussian function, but may be a Lorentz-type function. Whether or not the calculated bell-shaped function parameter is within a range assumed for the bell-shaped profile parameter drawn by the pulse signal detected when one luminescent particle passes through the light detection region, That is, it is determined whether or not the peak intensity, pulse width, and correlation coefficient of the pulse are within predetermined ranges (step 150). Thus, as shown on the left of FIG.
  • a signal for which the calculated bell-shaped function parameter is determined to be within an assumed range in the signal corresponding to one luminescent particle is It is determined that the signal corresponds to one luminescent particle, and thus one luminescent particle is detected and counted as one particle (the number of particles is counted up (step 160)).
  • a pulse signal whose calculated bell-shaped function parameter is not within the assumed range is ignored as noise.
  • the search and determination of the pulse signal in the processing of the above steps 130 to 160 is repeatedly executed over the entire area of the time-series light intensity data, and is counted as a particle every time one luminescent particle is detected.
  • the search for the pulse signal in the entire area of the time-series light intensity data is completed (step 170)
  • the count value of the particles obtained so far is set as the number of luminescent particles detected in the time-series light intensity data.
  • the above steps 110 to 170 are executed for each time-series light intensity data in different wavelength bands, and the number of pulse signals corresponding to the luminescent particles in each wavelength band is determined. May be counted. Note that the process of individually detecting and counting the luminescent particle signals from the time-series light intensity data is not limited to the above procedure, and may be executed by any method.
  • the pulse signals are determined as simultaneously generated signals.
  • those pulse signals May be determined to be simultaneously generated pulse signals.
  • the relative increase (decrease) in the count value of the simultaneously generated signal under a certain condition is caused by the binding reaction. It means an increase (reduction) in strength or degree of progression.
  • the decomposition reaction of one particle as illustrated in FIG. 3D when one particle is decomposed and particles having only one luminescent label are generated, Since signals other than the simultaneously generated signals are considered to be generated, when a signal other than the simultaneously generated signals is detected, it can be evidence of the occurrence of such a decomposition reaction (see the following note).
  • the degree of decomposition reaction By comparing the count value of the simultaneously generated signal with the count value of the other signals, it is possible to evaluate the degree of decomposition reaction, the degree of progress, and the like. For example, when the above light measurement and signal detection are performed under various environmental conditions, the relative reduction in the count value of the simultaneously generated signal under a certain condition is caused by the strength of the decomposition reaction or It means an increase in the degree of progress. [(Note) However, as will be shown in the embodiments described later, in actual experiments, it is difficult to make the CVs of the excitation lights having different wavelengths completely coincide with each other. In the light detection region, there may be a region where only excitation light of one wavelength is irradiated.
  • the signal other than the simultaneously generated signal includes the signal of the combined body of two particles in the inspection of the binding reaction in FIG. 3C, and the decomposition reaction in FIG. In this case, there is a possibility that the signal of the particle before decomposition is included. Therefore, in the inspection of the binding reaction in FIG. 3C, the number of signals other than the simultaneously generated signals cannot be determined to be the absolute number of the conjugate as it is, and FIG.
  • the presence or absence of the decomposition reaction cannot be determined only from the presence of signals other than the simultaneously generated signals.
  • it is possible to evaluate relative changes in the degree of strength of the binding reaction or decomposition reaction and the degree of progression by comparing the count value of the simultaneously generated signal with the count value of the other signals.
  • the simultaneously generated signals are detected.
  • the count value of the simultaneously generated signal is considered to be proportional to the number density or concentration of the observation target particle, and therefore, by paying attention to the count value, the number density or concentration of the observation target particle is considered. It becomes possible to acquire information regarding.
  • the simultaneously generated signal is used as a signal of particles other than the observation target particle or impurities, the presence of the observation target particle is confirmed by the presence other than the simultaneously generated signal, and the emission of the observation target particle is confirmed.
  • increase / decrease in signals other than the simultaneously generated signal corresponds to increase / decrease in observation target particles, so that the increase / decrease in observation target particles in the sample solution can be detected from the change in the count value of signals other than the simultaneously generated signals. . ]
  • the number density or concentration of luminescent particles in time-series light intensity data can be determined using the count value of each luminescent particle and the total volume of the area through which the light detection area passes during acquisition of time-series light intensity data It is.
  • the effective volume of the light detection region varies depending on the wavelength of excitation light or detection light, the numerical aperture of the lens, and the adjustment state of the optical system, it is generally difficult to calculate from the design value. It is not easy to calculate the total volume of the region through which the light detection region passes. Therefore, typically, for a solution having a known concentration of luminescent particles (reference solution), measurement of light intensity, particle detection and counting as described above under the same conditions as the measurement of the sample solution to be examined.
  • the total volume of the area through which the photodetection area has passed that is, the relationship between the number of detected luminescent particles and the concentration is determined from the number of detected luminescent particles and the concentration of the luminescent particles in the reference solution. It may be.
  • a plurality of solutions having different concentrations are prepared as reference solutions, and measurement is performed on each of the solutions.
  • the calculated average value of Vt is adopted as the total volume Vt of the region through which the light detection region has passed. It may be.
  • the volume of the light detection region and the total volume of the region through which the light detection region has passed are given by any method, for example, using FCS or FIDA, without depending on the above method. It's okay.
  • the relationship between the concentration C of various standard particles and the number N of particles (formula (6)) with respect to the assumed movement pattern of the light detection region may be stored in advance in a storage device of the computer 18 so that the information on the relationship stored as appropriate when the user of the device performs the optical analysis can be used.
  • a solution having a known concentration of luminescent particles having luminescent wavelengths in all selected wavelength bands is prepared as a reference solution.
  • detection and counting of simultaneously generated signals are executed, and the total volume of the area through which the light detection area has passed is calculated from the count value and concentration. Vt may be determined.
  • the count value of the simultaneously generated signal is used for the luminescent particles corresponding to the simultaneously generated signal, and the simultaneously generated signal
  • the value obtained by subtracting the count value of the simultaneously generated signal from the count value of all signals on the time-series light intensity data in the wavelength band of the emission wavelength of the luminescent particle is used. Good.
  • the optical analysis method in which the above-described method of the present invention is incorporated in the scanning molecule counting method, it is possible to obtain more diverse information than the scanning molecule counting method based on light measurement in one wavelength band,
  • optical analysis is performed on a sample solution containing various kinds of luminescent particles by the scanning molecule counting method, it is possible to reduce or eliminate the influence of unnecessary data and obtain a highly accurate result.
  • statistical processing is performed in the analysis process of FCS, FCCS, FIDA, etc. using a small amount of sample solution as in FCS, FCCS, FIDA, etc.
  • the method of the present invention is based on the time-series light intensity data measured by optical analysis technology using a confocal microscope such as FCS, FCCS, FIDA, etc. It is advantageously used to remove light signals from particles other than the observation target particles.
  • a specific type of luminescent particle is used as an observation target particle, and a wavelength band including the emission wavelength (referred to as “main measurement wavelength band”) is used.
  • main measurement wavelength band a wavelength band including the emission wavelength
  • sub-measurement wavelength band Is present in the wavelength band including the emission wavelength other than the “main measurement wavelength band” of “contaminants etc.” (referred to as “sub-measurement wavelength band”) and the time-series light intensity data
  • the sub-measurement wavelength band is selected so as not to include the emission wavelength of the observation target particle. According to such a configuration, when a significant signal is generated in the “sub-measurement wavelength band”, that is, when a significant signal is simultaneously generated in the main measurement wavelength band and the sub-measurement wavelength band, the signal generation period is reached. In this case, it is assumed that “contamination etc.” has entered the light detection region.
  • the generation period data of the signal generated simultaneously in the main measurement wavelength band and the sub measurement wavelength band is removed or deleted from the time series light intensity data of the main measurement wavelength band analyzed by FCS, FCCS, FIDA, etc.
  • FCS, FCCS, FIDA, etc a more accurate or improved calculation result by FCS, FCCS, FIDA, or the like can be obtained based on the time-series light intensity data in which the influence of impurities or the like is reduced or removed.
  • FIG. 7A shows the processing steps in the embodiment in which the method of the present invention is applied to the FCS or the like as described above in the form of a flowchart.
  • step 200 measurement of light and generation of time-series light intensity data are executed in a normal manner in FCS or the like.
  • FCCS usually, as observation target particles
  • the two emission wavelengths of the observation target particles are different from each other.
  • FIG. 7B shows an actual example of the time-series light intensity data (upper stage) of the main measurement wavelength band and the time-series light intensity data (lower stage) of the sub-measurement wavelength band thus obtained.
  • the main measurement wavelength band is set to 650 nm to 690 nm and the sub measurement wavelength band is set to 565 nm to 595 nm
  • the observation target particle is excited by the excitation light 633 nm and detected in the main measurement wavelength band. It is known that contaminants and the like are excited in the excitation light 543 nm and detected in the main measurement wavelength band and the sub measurement wavelength band.
  • the sub-measurement wavelength band corresponds to the light intensity (photon count) also in the main measurement wavelength band.
  • the generation period of the pulse-like signal it can be determined that signals generated simultaneously in the main measurement wavelength band and the sub-measurement wavelength band appear.
  • the simultaneously generated signals are detected (step 210), and these simultaneously generated signals are detected.
  • the occurrence period (simultaneous occurrence period) is assumed to be a period when it entered the light detection area such as a foreign substance, so it is specified as a “noise period” that should be ignored in the analysis process to be executed later. Is done.
  • a period other than the noise period is specified as a period during which the observation target particle enters the light detection region, that is, a “signal period” (step 220).
  • the “noise period” is deleted from the time-series light intensity data used for the analysis process (step 230), and the time-series light intensity data from which the noise period is deleted is obtained.
  • the analysis calculation process (calculation of autocorrelation function or cross-correlation function or generation and fitting of histogram) by FCS, FCCS, FIDA, etc. is executed in a normal manner (step 240).
  • the generation period of the signal generated simultaneously in the main measurement wavelength band and the sub-measurement wavelength band that is, the data of the period in which the contaminants in the sample solution entered the light detection region. Since analysis calculation processing such as FCS, FCCS, and FIDA can be executed, improvement in accuracy of results obtained by analysis calculation processing is expected.
  • oligonucleotides labeled with two-color fluorescent dyes at various ratios (double-labeled oligonucleotides)
  • the sample solution containing a nucleotide) and an oligonucleotide labeled with a single color fluorescent dye (single-labeled oligonucleotide) was measured in two wavelength bands, and generated simultaneously in the obtained time-series light intensity data.
  • the signal (simultaneous pulse) was detected and counted, and the concentration measurement range of the double-labeled oligonucleotide (luminescent particles corresponding to the simultaneous pulse) by the method of the present invention was verified.
  • the concentration measurement range of the double-labeled oligonucleotide by FCCS was also verified.
  • each of the above oligonucleotides was dissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) to a concentration of 100 ⁇ M. Next, each solution was diluted with a phosphate buffer solution containing 0.05% (w / w) Tween 20, and a solution ⁇ containing 488 pA and pA647 at 10 pM each and a solution ⁇ containing 488 pA647 at 10 pM were obtained. Prepared.
  • the solution ⁇ and the solution ⁇ are mixed at a volume ratio of 100: 0, 50:50, 10:90, 5:95, 0: 100, and a single labeled oligonucleotide (488 pA) is added to each fluorescent dye.
  • PA647 was prepared such that the ratio of the double-labeled oligonucleotide 488pA647 was 100%, 50%, 10%, 5%, 0%.
  • Alexa488 detects fluorescence in the wavelength band of 510 to 560 nm when excited with excitation light of 488 nm. On the other hand, when Alexa 647 is excited with 633 nm excitation light, fluorescence is detected in the wavelength band of 650 to 690 nm.
  • a single molecule fluorescence measurement device MF-20 (Olympus Co., Ltd.) equipped with a confocal fluorescence microscope optical system and a photon counting system is used as the optical analysis device.
  • time-series light intensity data photon count data
  • the excitation light is 488 nm laser light (200 ⁇ W) and 633 nm laser light (1000 ⁇ W)
  • the bandpass filter is used for the excitation light of 488 nm and 633 nm with 510-560 nm and 650-690 nm.
  • the light in the two wavelength bands was separately measured at the same time, and time-series light intensity data for each of the excitation light 488 nm and the excitation light 633 nm was generated.
  • the moving speed of the position of the light detection region in the sample solution was 15 mm / second, the BIN TIME was 10 ⁇ sec, and each sample solution was measured three times for 2 seconds.
  • smoothing processing is performed on the time-series light intensity data of each wavelength band acquired for each sample solution according to the processing procedure described in “A. (3) (ii) Counting of luminescent particles” above.
  • DCC Degree of Cross Correlation
  • nab the average number of particles calculated from the cross-correlation function
  • na the average number of particles calculated from the autocorrelation function of fluorescence with respect to the excitation light 488 nm
  • nb is relative to the excitation light 633 nm. It is the average number of particles calculated from the autocorrelation function of fluorescence.
  • FIG. 8 shows the photon count data (a) for the excitation light 488 nm and the photon count data (b) for the excitation light 633 nm obtained by executing the scanning molecule counting method according to the method of the present invention.
  • a part of the pulse signal (d) determined as the signal of the luminescent particles by the data (c) after fitting and the fitting is shown.
  • pulses generated simultaneously in the pulse signal on the data for the excitation light 488 nm (dotted line) and the pulse signal on the data for the excitation light 633 nm (solid line).
  • a signal in the figure, a signal added as a simultaneous signal) was observed.
  • Such a simultaneous pulse signal is considered to be a signal of light emitted from a double-labeled oligonucleotide, and thus, by the method of the present invention, particles labeled with two-color fluorescent dyes are detected separately from others. It was shown to be possible.
  • FIG. 9 shows the ratio of simultaneous pulse signals (A) for sample solutions containing double-labeled oligonucleotides mixed at various ratios calculated by the scanning molecule counting procedure according to the method of the present invention, and FCCS.
  • DCC (B) for the sample solution containing the double-labeled oligonucleotide mixed at various ratios calculated by the formula (1) with respect to the ratio of the double-labeled oligonucleotide in the sample solution (double-label oligo mixing ratio).
  • FIG. Referring to these figures, in the result (A) obtained by the scanning molecule counting method of the method of the present invention, the simultaneous pulse signal is expressed with respect to the double-label oligo mixing ratio over the entire examined region.
  • the present invention it has been shown that detection of double labeled luminescent particles and determination of their concentration can be achieved in a concentration range significantly lower than that possible with FCCS. (In other words, when the simultaneous pulse signal is identified as the observation target particle and the other signals are identified as particles other than the observation target particle, the observation target particle is detected in the concentration range lower than before or its concentration is set.
  • the luminescent particles in the sample solution can be identified.
  • the ratio of the simultaneously generated pulse signal can be smaller than the value theoretically expected from the ratio of the double-labeled luminescent particles in the sample solution.
  • the relationship between the amount of double-labeled luminescent particles and the amount of simultaneously generated pulse signals is proportional or has a one-to-one relationship. Based on this, it is possible to estimate the increase or decrease or concentration of double-labeled luminescent particles in the sample solution.
  • Concentration detection of target particles in sample solution containing impurities Detects the concentration of target particles by scanning molecule counting method in sample solutions containing contaminants with the same emission wavelength as the target particles. In this case, it was verified that the accuracy was improved by the method of the present invention.
  • the fluorescent dye TAMRA was used as an observation target particle, and the fluorescent dye ATTO590 was used as a model of impurities.
  • TAMRA detects fluorescence in the wavelength band of 565 to 595 nm when excited with excitation light of 543 nm. Further, when ATTO 590 is excited with 543 nm excitation light, fluorescence is detected in a wavelength band of 565 to 595 nm and a wavelength band of 650 to 690 nm.
  • a solution containing ATTO590 at 100 pM and TAMRA at 0 pM, 1 pM and 10 pM in a phosphate buffer containing 0.05% Tween20 was prepared.
  • a control solution a solution not containing ATTO590 and containing TAMRA at 0 pM, 1 pM and 10 pM was prepared.
  • the measurement and analysis of light were performed in the same manner as in Example 1 using the above sample solutions, setting the excitation light to 543 nm laser light (500 ⁇ W), and the detection wavelength bands to 565 to 595 nm and 650 to 690 nm.
  • the number of pulse signals corresponding to the luminescent particles on the time-series light intensity data in each detection wavelength band and the number of simultaneously generated pulse signals were obtained.
  • a set of pulse signals having a pulse signal peak time within 100 ⁇ sec was determined as the simultaneously generated pulse signal.
  • FIG. 10 is a plot of the number of pulses obtained for each sample solution obtained by the above procedure versus the concentration of TAMRA in the sample solution.
  • Mean square error R 2 0.9898).
  • the value ( ⁇ ) obtained by subtracting the number of simultaneously detected pulse signals from the number of pulses of the sample solution containing ATTO590 is generally proportional to the concentration in the entire concentration range observed, and is a straight line of an approximate curve obtained by the method of least squares.
  • the simultaneous pulse signal is assumed to be light from ATTO 590, which is a model of impurities. Therefore, the above results show that the proportional relationship between the concentration of TAMRA as the observation target particle and the pulse signal can be improved by eliminating the simultaneous pulse signal corresponding to ATTO590 from the pulse signal of the sample solution containing ATTO590. ing.
  • the above results show that when the observation target particles in the sample solution containing impurities are detected and the concentration is measured by the scanning molecule counting method, the simultaneous pulse signal is generated from the particles other than the observation target according to the method of the present invention. It is suggested that the accuracy in the detection of the observation target particle and the measurement of the concentration can be improved by discriminating as the above-mentioned signal and excluding these simultaneous pulse signals from the data.
  • the sample was fluorescently labeled with a fluorescent dye ATTO633, and DNA (plasmid pbr322, Takara Bio Inc., Cat. No. 3035) was fluorescently labeled with a fluorescent dye SYTOX Orange (Invitrogen, Cat. No. S-11368). Things (fluorescently labeled DNA) were used as a model for contaminants.
  • ATTO 633 detects fluorescence in the wavelength band of 650 to 690 nm when excited with excitation light of 633 nm. Further, when SYTOX Orange bound to DNA is excited with excitation light of 543 nm, fluorescence is detected in a wavelength band of 565 to 595 nm and a wavelength band of 650 to 690 nm.
  • a solution containing 100 pM ATTO633, 1 pM DNA, 9 nM SYTOX Orange in an aqueous solution containing 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) was prepared (when SYTOX Orange and DNA were mixed in the preparation of the solution). And SYTOX Orange was sufficiently bound to the DNA by incubation at room temperature for 30 minutes).
  • a solution containing 100 pM ATTO633 and no fluorescently labeled DNA was prepared.
  • excitation light is 543 nm laser light (300 ⁇ W) and 633 nm laser light (100 ⁇ W), and 565-595 nm and 650 ⁇ with respect to excitation light 543 nm and 633 nm using a bandpass filter.
  • the light intensities in the two wavelength bands of 690 nm were separately measured simultaneously, and time-series light intensity data for each of the excitation light 543 nm and the excitation light 633 nm was generated. The measurement was performed twice for each sample solution for 20 seconds.
  • the detection wavelength of 650 to 690 nm is the main measurement wavelength band
  • the detection wavelength of 565 to 595 nm is the sub-measurement wavelength band.
  • the autocorrelation function of the time series light intensity data in the main measurement wavelength band is calculated in the normal FCS mode, and the autocorrelation function is calculated.
  • the time when the photon count value exceeds 2 photons is detected in the sub-measurement wavelength band, and 50 ⁇ before and after that time.
  • a period of seconds was identified as a “noise period”.
  • the data of the period corresponding to the “noise period” is deleted in the main measurement wavelength band, and the data of the “signal period” before and after the deleted period is concatenated.
  • the data was reconstructed into temporally continuous data, and the autocorrelation function was calculated and fitted.
  • FIGS. 11B and 11C show autocorrelation without executing the “noise period” deletion in the time-series light intensity data for the sample solution (solution containing ATTO633 and fluorescently labeled DNA).
  • the average number of particles, translational diffusion time (with DNA), and time series light intensity data for the above sample solution are deleted.
  • the average number of particles and translational diffusion time (simultaneous signal deletion) when the correlation function is calculated and fitted, and the average number of particles and translational diffusion time (no DNA) for the control solution (a solution of ATTO633 without DNA) Respectively.
  • the average number of particles and the translational diffusion time for the sample solution calculated without performing the “noise period” deletion are larger than the average number of particles and the translational diffusion time for the control solution, respectively.
  • deletion of the “noise period” was performed to calculate the average particle number and translational diffusion time for the sample solution, those values approached the values for the control solution, respectively.
  • light in a plurality of wavelength bands is measured according to the above-described method of the present invention, and the time series light intensity data of the plurality of wavelength bands are simultaneously generated.
  • the signals are classified according to whether or not the pulse-like signals generated in the time-series light intensity data are generated simultaneously in a plurality of wavelength bands, and thereby, the luminescent particles in the sample solution are classified.
  • the type can be specified.
  • the method of the present invention individually detects signals simultaneously generated in a plurality of wavelength bands, and thus a sample of luminescent particles corresponding to signals simultaneously generated in a plurality of wavelength bands. Even if the number density or concentration in the solution is low, it is possible to accurately “pick up” pulse signals generated simultaneously in a plurality of wavelength bands from time-series light intensity data.
  • FCS and FCCS are available. Analyzes of light-emitting particles with a low concentration that cannot be observed with optical analysis techniques that use optical processing. Usually, in optical analysis techniques such as FCS and FCCS, the concentration of particles to be observed requires about 1 nM, but according to the present invention, luminescent particles of several pM are observed according to the present invention.
  • the target particle can be used, and in any light measurement / analysis experiment, it is also possible to eliminate or reduce the influence of light from luminescent particles other than the observation particle of several pM from the measurement / analysis result. is there.
  • light measurement is performed in three or more wavelength bands, signals simultaneously generated in at least two of the wavelength bands are detected, and the simultaneously generated signals detected and For each of the other signals, the same analysis as described above (particle counting, determination of concentration or number density, etc.) may be performed, and it should be understood that such cases are also within the scope of the present invention. .

Abstract

共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡を用いた光計測に於いて、時系列光強度データ上の信号の対応する発光粒子の種類の識別又は観測対象粒子以外の発光粒子に対応する信号の識別を可能にする光分析技術が提供される。本発明の光分析技術は、複数の種類の発光粒子を含む試料溶液内の光検出領域からの複数の波長帯域の光の強度を別々に且つ同時に測定し各波長帯域の時系列の光強度データを生成し、少なくとも二つの波長帯域の時系列光強度データに於いて同時に発生した信号を検出し、一つの同時に発生した信号を一個の少なくとも一つの特定の種類の発光粒子の信号として識別する。

Description

複数の波長帯域の光計測を用いた光分析方法
　本発明は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いて、溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はこれらの凝集体（以下、これらを「粒子」と称する。）、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の対象物、或いは、非生物学的な粒子からの光を検出して、それらの状態（相互作用、結合・解離状態など）の分析又は解析に於いて有用な情報を取得することが可能な光分析方法に係り、より詳細には、上記の如き光学系を用いて複数の波長帯域の光計測を行い、その計測結果に於いて、粒子の種類を識別しながら、或いは、観測したい粒子（観測対象粒子）からの信号と、それ以外の信号又はノイズとを区別しながら、種々の光分析を可能にする方法に係る。なお、本明細書に於いて、光を発する粒子（以下、「発光粒子」と称する。）は、それ自身が光を発する粒子、又は、任意の発光標識若しくは発光プローブが付加された粒子のいずれであってもよく、発光粒子から発せられる光は、蛍光、りん光、化学発光、生物発光、散乱光等であってよい。
　近年の光計測技術の発展により、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）も可能な超高感度の光検出技術とを用いて、一光子又は蛍光一分子レベルの微弱光の検出・測定が可能となっている。そこで、そのような微弱光の計測技術を用いて、生体分子等の特性、分子間相互作用又は結合・解離反応の検出を行う装置又は方法が種々提案されている。例えば、蛍光相関分光分析（Fluorescence　Correlation　Spectroscopy：ＦＣＳ。例えば、特許文献１、２、非特許文献１－３参照）に於いては、レーザー共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いて、試料溶液中の微小領域（顕微鏡のレーザー光が集光された焦点領域－コンフォーカル・ボリュームと称される。）内に出入りする蛍光分子又は蛍光標識された分子（蛍光分子等）からの蛍光強度の測定が為され、その測定された蛍光強度の自己相関関数の値から決定される微小領域内に於ける蛍光分子等の平均の滞留時間（並進拡散時間）及び滞留する分子の数の平均値に基づいて、蛍光分子等の運動の速さ又は大きさ、濃度といった情報の取得、或いは、分子の構造又は大きさの変化や分子の結合・解離反応又は分散・凝集といった種々の現象の検出が為される。また、蛍光相互相関分光分析（Fluorescence　cross-correlation　Spectroscopy：ＦＣＣＳ。例えば、非特許文献４、特許文献５）では、二つの発光波長の異なる蛍光分子等を含む試料溶液について、ＦＣＳと同様の装置を用いて二つの発光波長の光強度が測定され、その測定された二つの発光波長の光強度の相互相関関数の値に基づいて、二つの発光波長の異なる蛍光を発する粒子の運動に相関があるか否か、即ち、それらの粒子が互いに結合又は相互作用をしているか否か、或いは、相互作用している物質の数又は割合が推定される。更に、蛍光強度分布分析(Fluorescence-Intensity　Distribution　Analysis：ＦＩＤＡ。例えば、特許文献３)やフォトンカウンティングヒストグラム（Photon　Counting　Histogram：ＰＣＨ。例えば、特許文献４）では、ＦＣＳと同様に計測されるコンフォーカル・ボリューム内に出入りする蛍光分子等の蛍光強度のヒストグラムが生成され、そのヒストグラムの分布に対して統計的なモデル式をフィッティングすることにより、蛍光分子等の固有の明るさの平均値とコンフォーカル・ボリューム内に滞留する分子の数の平均値が算定され、これらの情報に基づいて、分子の構造又は大きさの変化、結合・解離状態、分散・凝集状態などが推定されることとなる。またその他に、特許文献６、７に於いては、共焦点顕微鏡の光学系を用いて計測される試料溶液の蛍光信号の時間経過に基づいて蛍光性物質を検出する方法が提案されている。特許文献８は、フローサイトメータに於いて流通させられた蛍光微粒子又は基板上に固定された蛍光微粒子からの微弱光をフォトンカウンティング技術を用いて計測してフロー中又は基板上の蛍光微粒子の存在を検出するための信号演算処理技術を提案している。
　特に、ＦＣＳ、ＦＣＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術とを用いた微小領域の蛍光測定技術を用いた方法によれば、測定に必要な試料は、従前に比して極めて低濃度且微量でよく（一回の測定で使用される量は、たかだか数十μＬ程度）、測定時間も大幅に短縮される（一回の測定で秒オーダーの時間の計測が数回繰り返される。）。従って、これらの技術は、特に、医学・生物学の研究開発の分野でしばしば使用される希少な或いは高価な試料についての分析を行う場合や、病気の臨床診断や生理活性物質のスクリーニングなど、検体数が多い場合に、従前の生化学的方法に比して、低廉に、或いは、迅速に実験又は検査が実行できる強力なツールとなることが期待されている。
特開２００５－０９８８７６ 特開２００８－２９２３７１ 特許第４０２３５２３号 国際公開２００８－０８０４１７ 特許第３５１７２４１号 特開２００７－２０５６５ 特開２００８－１１６４４０ 特開平４－３３７４４６号公報
金城政孝、蛋白質　核酸　酵素　Vol.４４、No.９、１４３１－１４３８頁　１９９９年 エフ・ジェイ・メイヤー・アルムス（F.J.Meyer-Alms）、フルオレセンス・コリレーション・スペクトロスコピー（Fluorescence　Correlation　Spectroscopy）、アール・リグラー編（R.Rigler）、スプリンガー（Springer）、ベルリン、２０００年、２０４－２２４頁 加藤則子外４名、遺伝子医学、Vol.６、No.２、２７１－２７７頁 バイオフィジカル・ジャーナル（Biophysical　Journal）　Volume　72（1997）1878-1886
　上記のＦＣＳ、ＦＣＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング技術を用いた光分析技術では、計測される光は、蛍光一分子又は数分子から発せられた光であるが、その光の解析に於いて時系列に測定された蛍光強度データの自己相関関数若しくは相互相関関数の演算又はヒストグラムに対するフィッティングといった蛍光強度のゆらぎを演算する統計的処理が実行され、個々の蛍光分子等からの光の信号を個別に参照又は分析するわけではない。即ち、これらの光分析技術に於いては、複数の蛍光分子等からの光の信号が統計的に処理され、蛍光分子等について統計平均的な特性が検出されることとなる。従って、これらの光分析技術に於いて統計的に有意な結果を得るためには、試料溶液中の観測対象となる蛍光分子等の濃度又は数密度は、平衡状態に於いて、一回の秒オーダーの長さの計測時間のうちに統計的処理が可能な数の蛍光分子等が微小領域内を入出するように、好適には、微小領域内に常に一個程度の蛍光分子等が存在しているレベルである必要がある。実際、コンフォーカル・ボリュームの体積は、１ｆＬ程度となるので、上記の光分析技術に於いて使用される試料溶液中の蛍光分子等の濃度は、典型的には、１ｎＭ程度若しくはそれ以上であり、１ｎＭを大幅に下回るときには、蛍光分子等がコンフォーカル・ボリューム内に存在しない時間が生じて統計的に有意な分析結果が得られないこととなる。一方、特許文献６～８に記載の蛍光分子等の検出方法では、蛍光強度の統計的演算処理が含まれておらず、試料溶液中の蛍光分子等が１ｎＭ未満であっても蛍光分子等の検出が可能であるが、溶液中でランダムに運動している蛍光分子等の濃度又は数密度を定量的に算出するといったことは達成されていない。
　そこで、本願出願人は、特願２０１０－０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、観測対象となる発光粒子の濃度又は数密度が、ＦＣＳ、ＦＣＣＳ、ＦＩＤＡなどの統計的処理を含む光分析技術で取り扱われるレベルよりも低い試料溶液中の発光粒子の状態又は特性を定量的に観測することを可能にする新規な原理に基づく光分析技術を提案した。かかる新規な光分析技術に於いては、端的に述べれば、ＦＣＳ、ＦＣＣＳ、ＦＩＤＡ等と同様に共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系などの溶液中の微小領域からの光が検出可能な光学系を用いるところ、試料溶液内に於いて光の検出領域である微小領域の位置を移動させながら、即ち、微小領域により試料溶液内を走査しながら、試料溶液中に分散してランダムに運動する発光粒子が微小領域内を横切るときに、その発光粒子から発せられる光を検出し、これにより、試料溶液中の発光粒子の一つ一つを個別に検出して、発光粒子のカウンティングや試料溶液中の発光粒子の濃度又は数密度に関する情報の取得を可能にする。この新規な光分析技術（以下、「走査分子計数法」と称する。）によれば、測定に必要な試料がＦＣＳ、ＦＣＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術と同様に微量（例えば、数十μＬ程度）であってもよく、また、測定時間が短く、しかも、ＦＣＳ、ＦＣＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術の場合に比して、より低い濃度又は数密度の発光粒子の存在を検出し、その濃度又は数密度等の特性を定量的に検出することが可能となる。
　ところで、上記の走査分子計数法に於いては、一つの発光粒子が光の検出領域へ進入した際にその発光粒子の発した光が時系列の光強度データ上に於いて山型又は概ね釣鐘状のプロファイルの強度変化、即ち、パルス状の信号として現れ、そのパルス状の信号の各々が発光粒子の一つ一つに対応するとの仮定の下、パルス状信号が時系列の光強度データ上に於いて一つずつ検出され、検出されたパルス状信号の数が光検出領域を通過した発光粒子の数として計数される。しかしながら、その場合、共通の発光波長を有するが互いに異なる種類の発光粒子は互いに区別することはできず、或いは、試料溶液中に観測対象となる発光粒子以外の発光粒子であって、しかも観測対象粒子と共通の発光波長を有しているものが存在すると、観測対象粒子以外の発光粒子からの光による光強度変化（パルス状信号）を誤って観測対象粒子として検出してしまい、測定結果の精度の悪化にも通ずる。また、ＦＣＳ、ＦＣＣＳ、ＦＩＤＡなどの光計測技術に於いても同様に、観測対象粒子以外の発光粒子であって、観測対象粒子と共通の発光波長を有しているものがあると、計測された時系列の光強度データに於いて観測対象粒子以外の成分の寄与が重畳されることとなり、測定結果の精度が悪化することとなる。
　上記の如き測定精度の悪化を防ぐためには、測定された光強度データ上に於いて、或る種類の発光粒子からの光の信号とそれと共通の発光波長を有する別の種類の発光粒子からの光の信号とが識別可能であること、或いは、観測対象粒子からの光の信号と観測対象粒子以外の発光粒子からの光の信号とが識別可能であり、観測対象粒子以外の発光粒子からの光の信号を選択的に除去可能となっていることが好ましい。この点に関し、上記の走査分子計数法に関連した説明から理解される如く、現在の共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系と超高感度の光検出技術とを組み合わせた光計測技術に於いては、経時的に測定された時系列光強度データ上に於いて現れる各々の発光粒子に対応する光の強度変化又はパルス状信号を個別に検出することが可能となっている。従って、時系列光強度データ上の或る種類の発光粒子からの光の信号とそれとは別の種類の発光粒子からの光の信号との識別、観測対象粒子からの光の信号と観測対象粒子以外の発光粒子からの光の信号との識別、或いは、観測対象粒子以外の発光粒子からの光の信号の選択的除去に於いて、各々の発光粒子の信号を個別に検出する手法が利用できそうである。
　かくして、本発明の一つの課題は、上記の如き共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系と超高感度の光検出技術とを組み合わせて光を計測する方法に於いて、共通の発光波長を有する複数の種類の発光粒子が存在する試料溶液中の或る種類の発光粒子からの光に対応する光の強度変化又は信号を個別に検出し識別できるようにする新規な方法を提案することである。
　また、上記の如き光を計測する方法に於いて、光強度データ上で或る種類の発光粒子からの光に対応する信号を選択的に識別するだけでなく、時系列の光強度データ上に於いて現れる信号がいずれの種類の発光粒子に対応するのか、例えば、観測対象粒子に対応するのか、或いは、観測対象粒子以外の発光粒子に対応するのかを個別に判定できるようになっている方が更に好ましい。従って、本発明のもう一つの課題は、上記の如き共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系と超高感度の光検出技術とを組み合わせて光を計測する手法に於いて計測される光強度データ上に現れた信号が、複数の種類の発光粒子のうちのいずれの信号であるかを判定可能にする新規な手法を提案することである。
　本発明によれば、上記の課題は、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いてランダムに運動する複数の種類の発光粒子を含む試料溶液中からの光を検出し分析する方法であって、試料溶液内の前記光学系の光検出領域からの複数の波長帯域の光の強度を波長帯域毎に且つ同時に測定し時系列の光強度データを前記波長帯域の各々について別々に生成する過程と、発光粒子からの光を表す信号にして前記時系列光強度データのうちの少なくとも二つの波長帯域の時系列光強度データに於いて同時に発生した信号を検出する過程とを含み、前記検出された同時に発生した信号を前記複数の種類の発光粒子のうちの少なくとも一つの特定の種類の発光粒子の信号として識別することを特徴とする方法により達成される。かかる構成に於いて、「ランダムに運動する発光粒子」とは、試料溶液中に分散又は溶解した原子、分子又はそれらの凝集体などの、光を発する粒子であって、基板などに固定されず、溶液中を自由にブラウン運動している粒子であれば任意の粒子であってよい。かかる発光粒子は、典型的には、蛍光性粒子であるが、りん光、化学発光、生物発光、光散乱等により光を発する粒子であってもよい。共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の「光検出領域」とは、それらの顕微鏡に於いて光が検出される微小領域であり、対物レンズから照明光が与えられる場合には、その照明光が集光された領域に相当する（共焦点顕微鏡に於いては、特に対物レンズとピンホールとの位置関係により確定される。発光粒子が照明光なしで発光する場合、例えば、化学発光又は生物発光により発光する粒子の場合には、顕微鏡に於いて照明光は要しない。）。また、「同時に発生した信号」に対応づけられる「少なくとも一つの特定の種類の発光粒子」には、一種類の発光粒子だけではなく、試料溶液中に含まれている種類のうちのいつくかの種類の発光粒子が含まれていてもよいことは理解されるべきである。（なお、以下、本明細書に於いて、「信号」という場合には、特に断らない限り、発光粒子からの光を表す信号を指すものとする。）
　端的に述べれば、上記の本発明の方法では、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて、複数種類の発光粒子を含む試料溶液について光計測・分析を行う場合に於いて、まず、複数の波長帯域の光強度が波長帯域毎に且つ同時に測定され、かかる測定により生成された複数の波長帯域の時系列の光強度データのうちの少なくとも二つの波長帯域のデータに於いて同時に発生した信号の各々を個別に検出することにより、時系列の光強度データ上に於いて、同時に発生した信号が存在している期間と同時に発生した信号が存在していない期間とが区別されることとなる。同時に発生した信号が存在している期間に於いては、前記の少なくとも二つの波長帯域の全てに発光波長帯域を有する発光粒子が光検出領域に進入したと考えられるので、その期間に於いて、複数の種類の発光粒子のうちの少なくとも一つの特定の種類の発光粒子が光検出領域に包含されたと判断でき、従って、その同時に発生した信号が複数の種類の発光粒子のうちの少なくとも一つの特定の種類の発光粒子の信号であると識別できることとなる。そして、観測対象となる粒子がいずれの波長帯域に於いて光を発するかを予め把握しておけば、前記の同時に発生した信号が、観測対象粒子の信号であるのか、観測対象粒子以外の発光粒子の信号であるのかが識別可能となる。即ち、観測対象粒子の光が一つの波長帯域のみにて検出されるものであれば、少なくとも二つの波長帯域の時系列データに於いて同時に発生した信号の発生期間のデータは、その観測対象粒子の信号ではないと判別することができ、また、逆に、観測対象粒子の光が少なくとも二つの波長帯域にて検出されるものであれば、同時に発生した信号の発生期間のデータがその観測対象粒子の信号であると判別することが可能となる。
　上記の本発明の構成に於いて、少なくとも二つの波長帯域の時系列データ上で同時に発生した信号の検出は、例えば、複数の波長帯域のうちの第一の波長帯域の時系列光強度データに於ける発光粒子の光を表す信号の発生期間が前記複数の波長帯域のうちの第一の波長帯域以外の少なくとも一つの波長帯域の時系列光強度データに於ける発光粒子の光を表す信号の発生期間と重なるとき、前記第一の波長帯域の時系列光強度データに於ける前記信号と前記第一の波長帯域以外の少なくとも一つの波長帯域の時系列光強度データに於ける前記信号とが同時に発生した信号として検出される態様にて実行されてよい。例えば、光の測定に於いて、測定される帯域数が二つである場合には、一方の波長帯域の時系列光強度データに於ける信号の発生期間が他方の波長帯域の時系列光強度データに於ける信号の発生期間と重なった時、それらの信号は、同時に発生した信号として判定されてよい。また、測定される帯域数が三つ以上である場合には、そのうちの一つの波長帯域の時系列光強度データに於ける信号の発生期間が、残りの二つ以上の波長帯域のうちの一つの波長帯域の時系列光強度データに於ける信号の発生期間と重なった時に、それらの信号が同時に発生した信号と判定されてもよく、残りの二つ以上の波長帯域のうちの二つ以上の波長帯域の時系列光強度データに於ける信号の発生期間の全てと重なった時に、それらの信号が同時に発生した信号と判定されてもよく、或いは、全ての波長帯域の時系列光強度データに於ける信号の発生期間が互いに重なった時に、それらの信号が同時に発生した信号と判定されてもよい。即ち、同時に発生した信号であると判定する際に参照する波長帯域の組合せは、任意に選択されてよいことは理解されるべきである。そして、参照する波長帯域の組合せの数によって、識別可能な発光粒子の種類の数が決定され、参照する波長帯域の組合せの数が多いほど、識別可能な発光粒子の種類の数が多くなることも理解されるべきである。
　上記の本発明の構成は、一つの態様として、時系列光強度データ上の発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する光分析方法に於いて適用されてよい。その場合、上記の本発明の構成に於いて、複数の波長帯域の時系列光強度データの各々に於いて発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する過程が実行されてよい。そして、検出された信号の各々が表す光を発した発光粒子の種類を、各信号が複数の波長帯域のうちの少なくとも二つの選択された波長帯域に於いて同時に発生したか否かに基づいて、識別するようになっていてよい。即ち、かかる構成によれば、時系列光強度データに於いて現れた信号を発光粒子の種類に応じて分類することが可能となる。
　上記の如く、時系列光強度データに於いて現れた信号を発光粒子の種類に応じて分類することが可能になると、時系列光強度データに於いて現れた信号の各々を、各信号が観測対象粒子の信号であるか、それ以外の粒子の信号であるかにより識別し分類することが可能となる。即ち、一つの態様として、少なくとも二つの選択された波長帯域に於いて同時に発生した信号を複数の種類の発光粒子のうちの観測対象粒子の信号として識別し、同時に発生した信号以外の発光粒子からの光を表す信号を前記観測対象粒子以外の発光粒子の信号として識別するようになっていてもよく、逆に、少なくとも二つの選択された波長帯域に於いて同時に発生した信号を複数の種類の発光粒子のうちの観測対象粒子以外の発光粒子の信号として識別し、同時に発生した信号以外の発光粒子からの光を表す信号を観測対象粒子の信号として識別するようになっていてもよい。特に、測定される波長帯域が二つの波長帯域である場合には、二つの波長帯域の時系列光強度データに於いて同時に発生した信号を観測対象粒子の信号として識別し、二つの波長帯域の時系列光強度データの一方のみに於いて発生した発光粒子からの光を表す信号を観測対象粒子以外の発光粒子の信号として識別するようになっていてもよく、二つの波長帯域の時系列光強度データに於いて同時に発生した信号を観測対象粒子以外の発光粒子の信号として識別し、二つの波長帯域の時系列光強度データの一方のみに於いて発生した発光粒子からの光を表す信号を観測対象粒子の信号として識別するようになっていてもよい。
　また、上記の本発明の構成は、上記に述べた如き走査分子計数法に適用されてもよい。即ち、本発明の方法の一つの態様に於いて、光検出領域からの複数の波長帯域の光の強度の測定が共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の光路を変更することにより試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動させながら実行され、かくして得られた時系列光強度データの各々に於いて単一の発光粒子からの光を表す信号の各々が個別に検出される過程が実行され、その場合に、上記の如く、検出された信号の各々について、各信号が複数の波長帯域のうちの少なくとも二つの選択された波長帯域に於いて同時に発生したか否かに基づいて、各信号の表す光を発した発光粒子の種類を識別するようになっていてよい。
　上記の本発明が適用される走査分子計数法の基本的な構成に於いては、まず、発光粒子を含む試料溶液を任意の手法にて調製した後、試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動しながら、即ち、試料溶液内を光検出領域により走査しながら、逐次的に、光強度の測定が行われる。そうすると、移動する光検出領域が、ランダムに運動している発光粒子を包含したときに、発光粒子からの光が測定され、これにより、一つの発光粒子の存在が検出されることとなる。そして、逐次的に検出された光の強度を表す時系列光強度データに於いて発光粒子からの光を表す信号を個別に検出して、これにより、発光粒子の存在を一つずつ個別に検出し、粒子の溶液内での状態に関する種々の情報が取得されることとなる。なお、単一の発光粒子からの光を表す信号を個別に検出する際、時系列光強度データ上に於ける１つの発光粒子に対応する信号の検出は、時系列に検出される信号の形状に基づいて為されてよい。実施の形態に於いて、典型的には、所定の閾値より大きい強度を有するパルス状の信号が検出されたときに、その信号が１つの発光粒子に対応する信号であり、その信号の発生期間に於いて１つの発光粒子が光検出領域に入ったと検出されるようになっていてよい。また、本発明の場合には、各信号が複数の波長帯域のうちの少なくとも二つの選択された波長帯域に於いて同時に発生したか否かに基づいて、各信号に対応する発光粒子の種類を識別し、或いは、発光粒子に対応する各信号を発光波長帯域に基づいて分類することが可能となっているので、或る選択された発光波長帯域の発光粒子の信号のみを抽出したり、或いは、発光波長帯域に基づいて分類された信号の群毎に信号を抽出するといったことが可能となる。
　更に、既に述べた如く、少なくとも二つの選択された波長帯域に於いて同時に発生した信号を複数の種類の発光粒子のうちの観測対象粒子の信号（或いは観測対象粒子以外の発光粒子の信号）として識別し、同時に発生した信号以外の信号を観測対象粒子以外の発光粒子の信号として（或いは観測対象粒子の信号として）識別することも可能となるので、走査分子計数法に於いて、観測対象粒子の信号と観測対象粒子以外の発光粒子の信号とを区別して検出することが可能となり、従って、観測対象粒子以外の発光粒子の信号が排除可能となるので、測定精度の悪化を回避できることとなる。この場合も、測定される波長帯域が二つの波長帯域である場合には、二つの波長帯域の時系列光強度データに於いて同時に発生した信号を観測対象粒子の信号として識別し、二つの波長帯域の時系列光強度データの一方のみに於いて発生した信号を観測対象粒子以外の発光粒子の信号として識別するようになっていてもよく、二つの波長帯域の時系列光強度データに於いて同時に発生した信号を観測対象粒子以外の発光粒子の信号として識別し、二つの波長帯域の時系列光強度データの一方のみに於いて発生した信号を観測対象粒子の信号として識別するようになっていてもよい。なお、二つの波長帯域の時系列光強度データに於いて同時に発生した信号、二つの波長帯域の一方の時系列光強度データに於いてのみ発生した信号及び二つの波長帯域の他方の時系列光強度データに於いてのみ発生した信号をそれぞれ別々の観測対象粒子として識別するようになっていてもよい（即ち、３種類の発光粒子を識別するようになっていてよい。）。
　上記の本発明に於ける走査分子計数法の実行に際しては、個別に検出された単一の発光粒子からの光を表す信号の数を計数して光検出領域の位置の移動中に検出された発光粒子の数を計数するようになっていてよい（粒子のカウンティング）。その場合、発光粒子の数と光検出領域の位置の移動量と組み合わせることにより、試料溶液中の発光粒子の数密度又は濃度に関する情報が得られることとなる。特に、任意の手法により、例えば、所定の速度にて光検出領域の位置を移動するなどして、光検出領域の位置の移動軌跡の全体積を特定すれば、発光粒子の数密度又は濃度が具体的に算定できることとなる。勿論、絶対的な数密度値又は濃度値を直接的に決定するのではなく、複数の試料溶液又は濃度若しくは数密度の基準となる標準試料溶液に対する相対的な数密度若しくは濃度の比を算出するようになっていてもよい。また、上記の本発明に於いては、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動するよう構成されていることにより、光検出領域の移動は、速やかであり、且つ、試料溶液に於いて機械的振動や流体力学的な作用が実質的に発生しないので、試料溶液中の発光粒子が力学的な作用の影響を受けることなく（アーティファクトの無い状態で）安定した状態にて、光の計測が可能である（例えば、試料に流れを発生させる場合には常に一様な流速を与えることは困難であると共に、装置構成が複雑となり、また、必要な試料量が大幅に増大すると共に、流れによる流体力学的作用によって溶液中の発光粒子又はその他の物質が変質又は変性してしまう可能性がある。）。そして、試料溶液を流通させるといった構成が必要ではないので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の場合と同様に微量（１～数十μＬ程度）の試料溶液にて計測及び分析が可能である。
　また、上記の光検出領域の位置を移動する際、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、発光粒子の特性又は試料溶液中の数密度又は濃度に基づいて適宜変更されてよい。当業者に於いて理解される如く、発光粒子から検出される光の態様は、その特性又は試料溶液中の数密度又は濃度によって変化し得る。特に、光検出領域の移動速度が速くなると、１つの発光粒子から得られる光量は低減することとなるので、１つの発光粒子（特に、観測対象粒子）からの光が精度よく又は感度よく計測できるように、光検出領域の移動速度は、適宜変更されることが好ましい。
　更に、上記の光検出領域の位置を移動する過程に於いて、試料溶液内での光検出領域の位置の移動速度は、好適には、発光粒子の拡散移動速度（ブラウン運動による粒子の平均の移動速度）よりも高く設定される。上記に説明されている如く、本発明の方法では、光検出領域が１つの発光粒子から発せられる光を検出して、発光粒子を個別に検出する。しかしながら、発光粒子が溶液中でブラウン運動することによりランダムに移動して、複数回、光検出領域を出入りする場合には、１つの発光粒子から複数回、（その存在を表す）信号が検出されてしまい、検出された信号と１つの発光粒子の存在とを対応させることが困難となる。そこで、上記の如く、光検出領域の移動速度を発光粒子の拡散移動速度よりも高く設定し、これにより、１つの発光粒子を、１つの（粒子の存在を表す）信号に対応させることが可能となる。なお、拡散移動速度は、発光粒子によって変わるので、上記の如く、発光粒子の特性（特に、拡散定数）に応じて、光検出領域の移動速度は適宜変更されることが好ましい。
　光検出領域の位置の移動のための光学系の光路の変更は、任意の方式で為されてよい。例えば、レーザー走査型光学顕微鏡に於いて採用されているガルバノミラーを用いて光路を変更して光検出領域の位置が変更されるようになっていてよい。光検出領域の位置の移動軌跡は、任意に設定されてよく、例えば、円形、楕円形、矩形、直線及び曲線のうちから選択可能であってよい。
　なお、本発明によれば、複数の波長帯域の時系列光強度データ上で検出された発光粒子からの光を表す信号に於いて同時に発生した信号を検出し、同時に発生した信号とそれ以外の信号との区別が為されるので、粒子のカウンティング及び濃度又は数密度の決定は、同時に発生した信号に対応する発光粒子とそれ以外の発光粒子とで別々に実行可能であり、これにより、不要なデータの影響を低減し、或いは、それらを無視又は削除することが可能となり、従って、試料溶液中の特定の種類の発光粒子についての観測・分析や、試料溶液中の発光粒子の相互作用の観測・分析を行う場合に有利である。
　ところで、上記の本発明の方法は、走査分子計数法以外の任意の光分析方法に利用されてよい。特に、複数の種類の発光粒子のうちの観測対象粒子の信号を個別に特定する必要がない場合には、複数の波長帯域のうちの少なくとも二つの選択された波長帯域に於いて同時に発生した信号が前記複数の種類の発光粒子のうちの観測対象粒子以外の発光粒子の信号として識別され、これにより、種々の解析に於いて、観測対象粒子以外の発光粒子の信号のみを抽出して無視又は除外することが可能となる。また、実行される光分析方法の態様によって、時系列光強度データに於いて、同時に発生した信号の発生期間のデータ、即ち、観測対象粒子以外の発光粒子からの光が測定されている期間のデータを削除又は除去可能である場合には、時系列光強度データに於いて観測対象粒子以外の発光粒子の信号として識別された信号の発生期間のデータが除去されるようになっていてよい。そのような光分析方法としては、例えば、観測対象粒子からの光強度を表す時系列光強度データを用いた蛍光相関分光法（ＦＣＳ）、蛍光強度分布解析法（ＦＩＤＡ）又は蛍光相互相関分光法（ＦＣＣＳ）による光分析であってよい。かかる構成によれば、観測対象粒子以外の発光粒子が光検出領域に進入した期間のデータを選択的に排除して分析・解析を実行することが可能となり、結果の精度の悪化の防止が図られる。
　本発明の方法は、典型的には、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞などの粒子状の生物学的な対象物の溶液中の状態の分析又は解析の用途に用いられるが、非生物学的な粒子（例えば、原子、分子、ミセル、金属コロイドなど）の溶液中の状態の分析又は解析に用いられてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。
　上記の如く、本発明の方法に於いては、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いて複数の波長帯域に於ける光測定により得られた時系列の光強度データに於いて少なくとも二つの選択された波長帯域にて同時に発生した信号を個別に検出することによって、選択された波長帯域の光を発する発光粒子が共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系の光検出領域に進入した期間を時系列光強度データ上で個別に特定することが可能となり、互いに異なる発光粒子ではあるが一部に共通の発光波長帯域を有しその波長帯域のみの光の計測では見分けのつかなかった発光粒子からの光が時系列光強度データ上で何時検出されているかが把握できることとなる。そして、かかる構成によれば、或る特定の種類の発光粒子（選択された波長帯域の光を発する発光粒子）の信号及びその発生期間を抽出することができるので、時系列光強度データ上での各データの個別の取捨選択或いはデータの分類ができることとなる。従って、例えば、同時に発生した信号を、測定に於ける有意な信号として識別する場合、或いは、逆に同時に発生した信号を測定に於けるノイズ等として識別する場合には、高い精度にてシグナル・ノイズ分離が達成され得る。特に、同時に発生した信号を測定に於けるノイズ等として識別する場合には、時系列光強度データ上からのノイズ等のみの除去が可能となるので、ＦＣＳ、ＦＩＤＡ、ＰＣＨ、ＦＣＣＳなどの解析に於けるノイズ除去のための一つの手段として有利に利用可能である。
　また、本発明の方法を走査分子計数法に適用する場合には、より精密な発光粒子の検出及び粒子のカウンティングが達成可能となる。走査分子計数法は、その光検出機構自体については、ＦＣＳ、ＦＣＣＳ、ＦＩＤＡなどの光分析技術の場合と同様に、共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光検出領域からの光を検出するよう構成されているので、試料溶液の量は、同様に微量であってよく、しかも、蛍光強度のゆらぎを算出するといった統計的処理が実行されないので、粒子の数密度又は濃度がＦＣＳ、ＦＣＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い試料溶液に適用可能である。そのような走査分子計数法に更に本発明の方法による構成を組み込んで、少なくとも二つの選択された波長帯域にて同時に発生した信号と、それ以外の信号とを区別できるようにしたときには、試料溶液中の発光粒子の濃度がＦＣＳ、ＦＣＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析技術に必要であったレベルよりも大幅に低い場合であって、或る特定の発光粒子と、その発光粒子と共通の発光波長帯域を有しその波長帯域のみの光の計測では見分けのつかなかった異なる発光粒子とが試料溶液中に存在している場合、或いは、観測対象となる発光粒子の数又は濃度が他の発光粒子又は夾雑物の数又は濃度に比して相対的に低く、通常の光強度を連続的に計測する光計測技術に於ける光強度データに於いては観測対象粒子の光が埋もれてしまう場合であっても、或る特定の発光粒子又は観測対象となる粒子を検出でき、また、そのカウンティングの精度も向上することが期待される。例えば、ノイズの原因となる微粒子が多数存在する試料溶液（血漿サンプルなど）中に於いて低濃度の発光粒子を観測する場合に本発明が適用されてよい。
　更に、走査分子計数法に更に本発明の方法を組み込んだ構成は、互いに異なる発光波長帯域を有する複数の種類の発光粒子を含む試料溶液に於いて、それらの発光粒子の相互作用の有無を高精度に検出することが可能となる。本発明によれば、複数の波長帯域の時系列光強度データに於いて同時に発生する信号を個別に検出するようになっているので、試料溶液中の複数の種類の発光粒子の相互作用が弱く、それらの発光粒子の結合体が微量しか形成されない場合（例えば、ＦＣＣＳでは検出困難なレベル）でも、結合体の存在の検出、カウンティング等が達成可能である。
　本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
図１（Ａ）は、本発明の方法を実行する光分析装置の内部構造の模式図である。図１（Ｂ）は、コンフォーカル・ボリューム（共焦点顕微鏡の光検出領域）の模式図である。図１（Ｃ）は、ミラー７の向きを変更して試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動する機構の模式図である。 図２（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、本発明の方法が適用される走査分子計数法に於ける光検出の原理を説明する模式図及び計測される光強度の時間変化の模式図である。 図３（Ａ）、（Ｃ）、（Ｄ）及び（Ｅ）は、複数の波長帯域にて測定された光強度データに於いて同時に発生する信号を検出することにより識別される発光粒子の組合せの例を模式的に示した図である。図３（Ｂ）は、（Ａ）、（Ｃ）及び（Ｄ）の場合に計測される光強度の時間変化（時系列光強度データ）の模式図であり、図３（Ｆ）は、（Ｅ）の場合に計測される光強度の時間変化（時系列光強度データ）の模式図である。 図４は、本発明の方法に従って複数の波長帯域の光の計測及び複数の波長帯域にて同時に発生する信号の検出・計数を実行する走査分子計数法の処理手順をフローチャートの形式で表した図である。 図５（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ、観測対象粒子がブラウン運動をしながら光検出領域を横切る場合及び試料溶液内の光検出領域の位置を観測対象粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動することにより観測対象粒子が光検出領域を横切る場合の粒子の運動の態様を表すモデル図である。図５（Ｃ）は、走査分子計数法に従って、計測された時系列光強度データ（フォトンカウントの時間変化）から発光粒子の存在を検出するための処理手順に於ける検出信号の信号処理過程の例を説明する図である。 図６（Ａ）は、計測されたフォトンカウントデータの実測例（棒グラフ）と、データをスムージングして得られる曲線（点線）と、パルス存在領域にてフィッティングされたガウス関数（実線）を示している。図中、「ノイズ」と付された信号は、ノイズ又は異物による信号であるとして無視される。図６（Ｂ）は、異なる波長帯域の時系列光強度データに於いて発生した信号が同時に発生したか否かを判定する処理を説明する図である。 図７（Ａ）は、本発明の方法に従って、複数の波長帯域の光の計測、複数の波長帯域にて同時に発生する信号の検出及び時系列光強度データ上に於けるノイズ等の発生期間の除去を実行して、ＦＣＳ等の解析を行う場合の処理手順をフローチャートの形式で表した図である。図７（Ｂ）は、測定された複数の波長帯域にて同時に発生する信号を検出し、ノイズ等の発生期間を特定する処理を説明する図である。 図８は、本発明の方法に従って実行された走査分子計数法（実施例１）に於いて得られた二つの波長帯域に於ける光強度データ（フォトンカウントデータ）（上二段）と、光強度データのスムージング後のデータ（中段）と、釣鐘型関数のフィッティングにより特定されたパルス（パルス状信号）（下段）の例を示している。 図９は、（Ａ）本発明の方法に従って実行された実施例１に於いて得られた二色の蛍光色素にて標識されたオリゴヌクレオチドの検出実験の結果と、（Ｂ）ＦＣＣＳにより得られた二色の蛍光色素にて標識されたオリゴヌクレオチドの検出実験の結果を、それぞれ示している。各プロットに於けるエラーバーは、それぞれ、３回の測定のＳＤ値の３倍の幅を示している。 図１０は、本発明の方法に従って実行された走査分子計数法（実施例２）に於いて得られた、複数の種類の発光粒子を含む試料溶液中の一つの発光粒子（蛍光色素分子ＴＡＭＲＡ）のカウンティングの結果を示している。 図１１（Ａ）は、本発明の方法を適用して実行されたＦＣＳ（実施例３）に於いて、主測定波長帯域の時系列光強度データから、副測定波長帯域の時系列光強度データでノイズ期間と判定された期間に対応する期間のデータを削除した後、時間的に連続したデータを再構成する過程を模式的に示したものである。図１１（Ｂ）、（Ｃ）は、本発明の方法を適用して実行されたＦＣＳ（実施例３）に於いて得られた発光粒子（蛍光色素分子ＡＴＴＯ）の粒子数と並進拡散時間の結果を示している。図中エラーバーは、ＳＤ値の３倍を示している。 図１２は、従来の蛍光強度のゆらぎを算出する光分析技術に於いて得られるフォトンカウント（光強度）の時間変化の例であり、（Ａ）は、試料内の粒子の濃度が、十分な計測精度が与えられる程度である場合であり、（Ｂ）は、（Ａ）の場合よりも大幅に試料内の粒子の濃度が低い場合である。
１…光分析装置（共焦点顕微鏡）
２…光源
３…シングルモードオプティカルファイバー
４…コリメータレンズ
５、１４ａ…ダイクロイックミラー
６、７、１１…反射ミラー
８…対物レンズ
９…マイクロプレート
１０…ウェル（試料溶液容器）
１２…コンデンサーレンズ
１３…ピンホール
１４…バリアフィルター
１５…マルチモードオプティカルファイバー
１６…光検出器
１７…ミラー偏向器
１７ａ…ステージ位置変更装置
１８…コンピュータ
　以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
光分析装置の構成
　本発明による方法は、走査分子計数法、或いは、ＦＣＳ、ＦＣＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析方法に組み込まれて実行されてよい。この点に関し、本発明の方法に於いては、特に、複数の互いに異なる波長帯域の光の測定及び解析が実行されるので、本発明の方法は、走査分子計数法、或いは、ＦＣＳ、ＦＣＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析方法が実現可能であり、且つ、複数の互いに異なる波長帯域の光の測定が可能な図１（Ａ）に模式的に例示されている如き共焦点顕微鏡の光学系と光検出器とを組み合わせてなる光分析装置１により実現可能である。
　具体的には、図１（Ａ）を参照して、光分析装置１は、光学系２～１７と、光学系の各部の作動を制御すると共にデータを取得し解析するためのコンピュータ１８とから構成される。光分析装置１の光学系は、通常の共焦点顕微鏡の光学系と同様であってよく、そこに於いて、光源２から放射されシングルモードファイバー３内を伝播したレーザー光（Ｅｘ）が、ファイバーの出射端に於いて固有のＮＡにて決まった角度にて発散する光となって放射され、コリメーター４によって平行光となり、ダイクロイックミラー５、反射ミラー６、７にて反射され、対物レンズ８へ入射される。なお、発光粒子を励起する光の波長によって適宜、励起光の波長が選択できるように、図示の如く、光源２に於いて複数の発光源（レーザー）が設けられていてよい。同時に観測しようとする発光粒子のための励起光の波長が異なる場合には、同時に複数の発光源から光が出射され、対物レンズ８へ導入される。
　対物レンズ８の上方には、典型的には、１～数十μＬの試料溶液が分注される試料容器又はウェル１０が配列されたマイクロプレート９が配置されており、対物レンズ８から出射したレーザー光は、試料容器又はウェル１０内の試料溶液中で焦点を結び、光強度の強い領域（励起領域）が形成される。試料溶液中には、観測対象物である発光粒子、典型的には、蛍光色素等の発光標識が付加された分子が分散又は溶解されており、発光粒子が励起領域に進入すると、その間、発光粒子が励起され光が放出される。放出された光（Ｅｍ）は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー５を通過し、ミラー１１にて反射してコンデンサーレンズ１２にて集光され、ピンホール１３を通過する。なお、当業者に於いて知られている如く、ピンホール１３は、対物レンズ８の焦点位置と共役の位置に配置されており、これにより、図１（Ｂ）に模式的に示されている如きレーザー光の焦点領域、即ち、励起領域内から発せられた光のみがピンホール１３を通過し、焦点面以外からの光は遮断される。図１（Ｂ）に例示されたレーザー光の焦点領域は、通常、１～１０ｆＬ程度の実効体積を有する本光分析装置に於ける光検出領域であり、コンフォーカル・ボリュームと称される。コンフォーカル・ボリュームに於いては、典型的には、光強度が領域の中心を頂点とするガウス型分布又はローレンツ型分布となり、実効体積は、光強度が１／ｅ２となる面を境界とする略楕円球体の体積である。
　かくして、ピンホール１３を通過した光は、ダイクロイックミラー１４ａに於いて、一部の波長帯域の光が反射し、残りの波長帯域の光が透過する態様にて波長帯域により分割され、分割された光の各成分は、それぞれ、対応するバリアフィルター１４を透過して（ここで、特定の波長帯域の光成分のみが選択される。）、マルチモードファイバー１５に導入されて、対応する光検出器１６に到達し、時系列の電気信号に変換された後、コンピュータ１８へ入力され、後に説明される態様にて光分析のための処理が為される。光検出器１６としては、好適には、フォトンカウンティングに使用可能な超高感度の光検出器が用いられ、これにより、１つの発光粒子からの光、例えば、一個又は数個の蛍光色素分子からの微弱光が検出可能となる。
　上記の構成に於いて、特に、走査分子計数法を実行する場合には、上記の光分析装置の光学系に於いて、更に、光学系の光路を変更して試料溶液内を光検出領域により走査する、即ち、試料溶液内に於いて焦点領域（即ち、光検出領域）の位置を移動するための機構が設けられる。かかる光検出領域の位置を移動するための機構としては、例えば、図１（Ｃ）に模式的に例示されている如く、反射ミラー７の向きを変更するミラー偏向器１７が採用されてよい。かかるミラー偏向器１７は、通常のレーザー走査型顕微鏡に装備されているガルバノミラー装置と同様であってよい。また、所望の光検出領域の位置の移動パターンを達成するべく、ミラー偏向器１７は、コンピュータ１８の制御の下、光検出器１６による光検出と協調して駆動される。光検出領域の位置の移動軌跡は、円形、楕円形、矩形、直線、曲線又はこれらの組み合わせから任意に選択されてよい（コンピュータ１８に於けるプログラムに於いて、種々の移動パターンが選択できるようになっていてよい。）。なお、図示していないが、対物レンズ８を上下に移動することにより、光検出領域の位置が上下方向に移動されるようになっていてもよい。上記の如く、試料溶液を移動するのではなく、光学系の光路を変更して光検出領域の位置を移動する構成によれば、試料溶液内に機械的な振動や流体力学的な作用が実質的に発生することがなくなり、観測対象物に対する力学的な作用の影響を排除することが可能となり、安定的な計測が達成される。なお、ＦＣＳ、ＦＣＣＳ、ＦＩＤＡ等の光分析方法のみを実行する場合には、反射ミラー７の向きを変更する機構は設けられなくてよい。
　なお、追加的な構成として、顕微鏡のステージ（図示せず）には、観察するウェル１０を変更するべく、マイクロプレート９の水平方向位置を移動するためのステージ位置変更装置１７ａが設けられていてよい。ステージ位置変更装置１７ａの作動は、コンピュータ１８により制御されてよい。
　発光粒子が多光子吸収により発光する場合には、上記の光学系は、多光子顕微鏡として使用される。その場合には、励起光の焦点領域（光検出領域）のみで光の放出があるので、ピンホール１３は、除去されてよい。また、発光粒子が化学発光や生物発光現象により励起光によらず発光する場合には、励起光を生成するための光学系２～５が省略されてよい。発光粒子がりん光又は散乱により発光する場合には、上記の共焦点顕微鏡の光学系がそのまま用いられる。
Ａ．走査分子計数法に於ける本発明の実施形態
　「発明の概要」の欄に記載されている如く、一つの態様として、本発明の方法は、走査分子計数法と組み合わせて有利に実現される。換言すれば、本発明の一つの実施形態は、走査分子計数法を改良するものであるということができる。以下、走査分子計数法に於ける本発明の実施形態について説明する。
１.走査分子計数法の原理
　ＦＣＳ、ＦＣＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術は、従前の生化学的な分析技術に比して、必要な試料量が極めて少なく、且つ、迅速に検査が実行できる点で優れている。しかしながら、ＦＣＳ、ＦＣＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術では、原理的に、観測対象粒子の濃度や特性は、蛍光強度のゆらぎに基づいて算定されるので、精度のよい測定結果を得るためには、試料溶液中の観測対象粒子の濃度又は数密度が、図１２（Ａ）に模式的に描かれているように、蛍光強度の計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域ＣＶ内に存在するレベルであり、同図の右側に示されている如く、計測時間中に常に有意な光強度（フォトンカウント）が検出されることが要求される。もし観測対象粒子の濃度又は数密度がそれよりも低い場合、例えば、図１２（Ｂ）に描かれているように、観測対象粒子がたまにしか光検出領域ＣＶ内へ進入しないレベルである場合には、同図の右側に例示されている如く、有意な光強度の信号（フォトンカウント）が、計測時間の一部にしか現れないこととなり、精度のよい光強度のゆらぎの算定が困難となる。また、観測対象粒子の濃度が計測中に常に一個程度の観測対象粒子が光検出領域内に存在するレベルよりも大幅に低い場合には、光強度のゆらぎの演算に於いて、バックグラウンドの影響を受けやすく、演算に十分な量の有意な光強度データを得るために計測時間が長くなる。
　そこで、本願出願人は、特願２０１０－０４４７１４及びＰＣＴ／ＪＰ２０１１／５３４８１に於いて、観測対象粒子の濃度が、上記の如きＦＣＳ、ＦＩＤＡ等の分光分析技術にて要求されるレベルよりも低い場合でも、観測対象粒子の数密度又は濃度等の特性の検出を可能にする新規な原理に基づく「走査分子計数法」を提案した。
　走査分子計数法に於いて実行される処理としては、端的に述べれば、光検出領域の位置を移動するための機構（ミラー偏向器１７）を駆動して光路を変更し、図２にて模式的に描かれているように、試料溶液内に於いて光検出領域ＣＶの位置を移動しながら、即ち、光検出領域ＣＶにより試料溶液内を走査しながら、光検出が実行される。そうすると、例えば、図２（Ａ）の如く、光検出領域ＣＶが移動する間（図中、時間ｔｏ～ｔ２）に於いて１つの発光粒子の存在する領域を通過する際（ｔ１）には、発光粒子から光が放出され、図２（Ｂ）に描かれている如く有意な光強度（Ｅｍ）のパルス状の信号が出現することとなる。かくして、上記の光検出領域ＣＶの位置の移動と光検出を実行し、その間に出現する図２（Ｂ）に例示されている如きパルス状の信号（有意な光強度）を一つずつ検出することによって、発光粒子が個別に検出され、その数をカウントすることにより、計測された領域内に存在する発光粒子の数、或いは、濃度若しくは数密度に関する情報が取得できることとなる。かかる本発明の光分析技術の原理に於いては、蛍光強度のゆらぎの算出の如き統計的な演算処理は行われず、発光粒子が一つずつ検出されるので、ＦＣＳ、ＦＣＣＳ、ＦＩＤＡ等では十分な精度にて分析ができないほど、観測されるべき粒子の濃度が低い試料溶液でも、粒子の濃度若しくは数密度に関する情報が取得可能である。
２．本発明による複数種類の発光粒子の識別の態様
　本発明の方法を組み込んで走査分子計数法を実行する場合には、まず、上記の原理に従って、複数の種類の発光粒子を含む試料溶液について複数の波長帯域にて別々に且つ同時に光強度の測定（フォトンカウンティング）が経時的に実行され、測定された各波長帯域についての時系列光強度データ（フォトンカウンティングデータ）の各々に於いて発光粒子に対応するパルス状の信号が一つずつ検出され、しかる後、検出されたパルス状信号に於いて、選択された少なくとも二つの波長帯域の時系列光強度データ上で同時に発生したパルス状信号が検出される。かかる同時に発生したパルス状信号は、選択された波長帯域の全てに於いて発光波長を有する一つの発光粒子に対応すると考えられるので（選択された波長帯域の各々に於いて発光波長を有する別々の発光粒子が同時にコンフォーカル・ボリューム（ＣＶ）に飛びこむことは、極めて稀である。）、同時に発生したパルス状信号は、試料溶液に含まれている発光粒子のうちの一つの種類の発光粒子の信号として識別することができ、同時に発生したパルス状信号以外のパルス状信号は、別の種類の発光粒子の信号として識別することができることとなる。
　上記の本発明による選択された波長帯域にて同時に発生したパルス状信号を検出して発光粒子を識別する手法は、一つの態様としては、複数種類の粒子のそれぞれの存在及び数密度又は濃度等の情報を取得する際に有利に用いられる。具体的には、例えば、図３（Ａ）に例示されている如く、試料溶液中に波長Ｉの光を発する粒子ａ、波長IIの光を発する粒子ｂ及び波長Ｉと波長IIの光を発する粒子ｃとが含有されている場合、図３（Ｂ）に示される如く、粒子ａがＣＶを通過したとき（ｔ１）には波長Ｉの時系列光強度データ上のみに、粒子ｂがＣＶを通過したとき（ｔ２）には波長IIの時系列光強度データ上のみに、粒子ｃがＣＶを通過したとき（ｔ３）には波長Ｉ及び波長IIの両方の時系列光強度データ上に、それぞれ、パルス状信号が出現する。従って、波長Ｉ及び波長IIの両方の時系列光強度データ上に同時に発生したパルス状信号を検出することにより、波長Ｉの時系列光強度データ上では、粒子ａ～ｃの識別が可能となる。そして、粒子ａ～ｃのパルス状信号の数を別々に計数することにより、それぞれの数密度又は濃度及びその他の情報を得ることが可能となる。
　上記の時系列光強度データ上に於ける信号の識別の手法は、分子の結合反応又は解離反応の検出に有利に用いることが可能である。例えば、或る粒子ａと別の粒子ｂとの結合反応の有無・程度を検査する場合、粒子ａを波長Ｉの光を発する発光物質（典型的には蛍光色素。以下同様）にて標識し、粒子ｂを波長IIの光を発する発光物質にて標識する。その場合、図３（Ｃ）に例示されている如く、粒子ａ又は粒子ｂの単体がＣＶを通過したとき（ｔ１又はｔ２）には、それぞれ、波長Ｉ又は波長IIに於いてのみ信号が出現するが、粒子ａと粒子ｂとが結合体（ａ＋ｂ）を形成し、その結合体がＣＶを通過したとき（ｔ３）には、波長Ｉ及び波長IIの両方に於いて信号が同時に発生するので、その同時に発生した信号を検出又は計数することにより、粒子ａと粒子ｂとの結合反応の確認又はその強さの程度の見積もりが可能となる。このような態様にて検査可能な結合反応の例としては、例えば、二つのタンパク質の相互作用、標的核酸のハイブリダイゼーションなどが挙げられる。
　また、或る粒子の分解反応の有無・程度を検査する場合には、分解前の粒子ｃに、波長Ｉの光を発する標識と波長IIの光を発する標識の両方が付加されたものが準備され、しかる後、検査されるべき分解反応が実行される。ここで、粒子ｃが分解反応によって分解され、波長Ｉの光を発する標識が付加された粒子ａと波長IIの光を発する標識が付加された粒子ｂとが生成されるとすると、図３（Ｄ）に例示されている如く、粒子ａ又はｂがＣＶを通過したとき（ｔ１又はｔ２）には、波長Ｉ又は波長IIに於いてのみ信号が出現する一方、分解されていない粒子ｃがＣＶを通過したとき（ｔ３）には、波長Ｉ及び波長IIの両方に於いて信号が同時に発生することとなる。かくして、同時に発生する信号の頻度と、波長Ｉ、IIのうちの一方にのみ発生する信号の頻度とを比較することによって、粒子ｃの分解反応の確認又はその強さの程度の見積もりが可能となる。この態様にて検査可能な分解反応の例としては、核酸を特異的に分解する制限酵素又はポリメラーゼによる分解反応やプロテアーゼによる分解反応が挙げられる。
　更に、上記の本発明による選択された波長帯域にて同時に発生したパルス状信号を検出して発光粒子を識別する手法は、別の態様として、試料溶液中に観測対象となる発光粒子の他に、その観測対象粒子と共通の発光波長を有する夾雑物が含まれているとき、観測対象粒子からの信号のみを選択する場合又は観測対象粒子以外の粒子からの信号を排除する場合に有利に用いられる。例えば、図３（Ｅ）に模式的に描かれている如く、試料溶液中に於いて、波長Ｉの光を発する粒子ａの信号を検出しようとする際に、即ち、粒子ａが観測対象粒子であるときに、同様に波長Ｉの光を発する夾雑物ｘが存在している場合であって、夾雑物ｘが波長IIの光も発する場合（夾雑物ｘも一つの発光粒子である。）には、図３（Ｆ）に例示されている如く、粒子ａがＣＶを通過とき（ｔ１）には、波長Ｉのみに信号が出現し、夾雑物ｘがＣＶを通過したとき（ｔ２）には、波長Ｉ及びIIの双方に信号が出現することとなる。従って、かかる試料溶液についての光測定によって得られた波長Ｉ及びIIの時系列光強度データに於いて同時に発生した信号については、夾雑物ｘであると識別し、波長Ｉの時系列光強度データに於いてのみ発生した信号を参照することにより、粒子ａの存在の確認及び数密度又は濃度についての情報を得ることが可能となる。この態様は、例えば、種々の夾雑物を含む生体試料、例えば、血液サンプルに於いて、低濃度の観測対象となる粒子を検出する場合などに有利に用いられる。また、図示していないが、上記の態様とは逆に、観測対象粒子が波長Ｉ及びIIの光を発する発光粒子であり、夾雑物が波長Ｉ及びIIのうちのいずれか一方の光しか放出しないときには、波長Ｉ及びIIの時系列光強度データに於いて同時に発生した信号のみを参照することによって、観測対象粒子の存在の確認及び数密度又は濃度についての情報を得ることが可能となる。
　なお、図３の例では、二つの波長帯域に於いて光の測定を行う場合が示されているが、三つ以上の波長帯域にて光の測定の測定を行い、そこで、得られた各波長帯域の時系列光強度データに於いて、選択された波長帯域にて同時に発生した信号を検出して、発光粒子の種類を識別するようになっていてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。
３．走査分子計数法の処理操作過程
　図１（Ａ）に例示の光分析装置１を用いた本発明の方法の構成を組み込んだ走査分子計数法の実施形態に於いては、具体的には、（１）発光粒子を含む試料溶液の調製過程、（２）試料溶液の光強度の測定処理過程、及び（３）測定された光強度の分析処理過程とが実行される。図４は、フローチャートの形式にて表した本実施形態に於ける処理過程を示している。
（１）試料溶液の調製
　本発明の方法に於いて観測対象となる粒子は、溶解された分子等の、試料溶液中にて分散しランダムに運動する粒子であれば、任意のものであってよく、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖鎖、アミノ酸若しくはこれらの凝集体などの生体分子、ウイルス、細胞、或いは、金属コロイド、その他の非生物学的分子などであってよい（試料溶液は、典型的には水溶液であるが、これに限定されず、有機溶媒その他の任意の液体であってよい。）。また、観測対象粒子は、それ自体が発光する粒子であってもよく、或いは、発光標識（蛍光分子、りん光分子、化学・生物発光分子）が任意の態様にて付加された粒子であってよい。例えば、二つの粒子の結合反応について検査する場合には、既に述べた如く、一方の粒子に或る波長帯域の光を放出する発光標識を付加し、他方の粒子に別の波長帯域の光を放出する別の発光標識を付加した後、両方の粒子を適宜混合して、結合反応を惹起する条件に曝されたものが、試料溶液とされてよい。また、一つの粒子の分解反応について検査する場合には、その粒子に互いに異なる波長帯域の光を放出する別々の発光標識を付加した後、分解反応を惹起する条件に曝したものが、試料溶液とされてよい。また、夾雑物を含有する溶液中に於ける或る特定の粒子を検出する場合には、その特定の粒子に一つの発光標識が付加されるか、二つの互いに発光波長の異なる発光標識が付加されることとなる。そして、検出する波長帯域は、試料中の発光粒子の発光波長帯域に基づいて適宜選択されてよい。試料溶液中にて、観測対象となる粒子を如何に選択するか、或いは、観測対象となる粒子に如何に発光標識を付加するか、検出波長帯域を如何に選択するかは、実験の実施者により適宜選択されてよく、当業者に於いて、本発明の方法を実現する種々の観測対象粒子又は発光標識の組合せ及び検出波長帯域を選択でき、本発明の教示に従って、発光粒子の識別が行われる限り、如何なる場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。
（２）試料溶液の光強度の測定
　本実施形態の走査分子計数法による光分析に於ける光強度の測定は、測定中にミラー偏向器１７を駆動して、試料溶液内での光検出領域の位置の移動（試料溶液内の走査）を行う他は、複数の波長帯域の光強度の測定を行うＦＣＣＳに於ける光強度の測定過程と同様の態様にて実行されてよい（図４－ステップ１００）。操作処理に於いて、典型的には、マイクロプレート９のウェル１０に試料溶液を注入して顕微鏡のステージ上に載置した後、使用者がコンピュータ１８に対して、測定の開始の指示を入力すると、コンピュータ１８は、記憶装置（図示せず）に記憶されたプログラム（試料溶液内に於いて光検出領域の位置を移動するべく光路を変更する手順と、光検出領域の位置の移動中に光検出領域からの光を検出する手順）に従って、試料溶液内の光検出領域に於ける励起光の照射及び光強度の計測を開始する。計測が開始されると、まず、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、光源２から、試料溶液中の発光粒子の励起波長の光が出射される。特に、本実施形態に於いては、複数の波長帯域の光を検出するので、検出されるべき複数の波長帯域の光が発光粒子から放出されるよう光源２から出射される励起光の波長の選択が為される。従って、特に発光粒子が一つの波長帯域の励起光に対して一つの波長帯域のみの蛍光を放出する場合には、複数の波長帯域のレーザー光が同時に出射されることとなる。一方、ミラー偏向器１７は、コンピュータ１８のプログラムに従った処理動作の制御下、ミラー７（ガルバノミラー）を駆動して、ウェル１０内に於いて光検出領域の位置の移動を実行し、これと同時に光検出器１６は、逐次的に検出された光を電気信号に変換してコンピュータ１８へ送信し、コンピュータ１８では、任意の態様にて、送信された信号から時系列の光強度データを生成して保存する。なお、本実施形態に於いては、複数の光検出器１６の各々が、互いに異なる波長帯域の光を検出し、検出された互いに異なる波長帯域毎に時系列光強度データが生成される。また、典型的には、光検出器１６は、一光子の到来を検出できる超高感度光検出器であるので、光の検出は、所定時間に亘って、逐次的に、所定の単位時間毎（ＢＩＮ　ＴＩＭＥ）に、例えば、１０μ秒毎に光検出器に到来するフォトンの数を計測する態様にて実行されるフォトンカウンティングであり、時系列の光強度のデータは、時系列のフォトンカウントデータであってよい。
　光強度の計測中の光検出領域の位置の移動速度は、任意に、例えば、実験的に又は分析の目的に適合するよう設定された所定の速度であってよい。検出された発光粒子（又はそれらのうちの観測対象粒子－以下同様）の数に基づいて、その数密度又は濃度に関する情報を取得する場合には、光検出領域の通過した領域の大きさ又は体積が必要となるので、移動距離が把握される態様にて光検出領域の位置の移動が実行されることが好ましい。なお、計測中の経過時間と光検出領域の位置の移動距離とが比例関係にある方が測定結果の解釈が容易となるので、移動速度は、基本的に、一定速度であることが好ましいが、これに限定されない。
　ところで、光検出領域の位置の移動速度に関して、計測された時系列の光強度データからの発光粒子の個別の検出、或いは、発光粒子の数のカウンティングを、定量的に精度よく実行するためには、かかる移動速度は、発光粒子のランダムな運動、即ち、ブラウン運動による移動速度よりも速い値に設定されることが好ましい。本実施形態に於いて観測対象となる発光粒子は、溶液中に分散又は溶解されて自由にランダムに運動する粒子であるので、ブラウン運動によって位置が時間と伴に移動する。従って、光検出領域の位置の移動速度が粒子のブラウン運動による移動に比して遅い場合には、図５（Ａ）に模式的に描かれている如く、粒子が領域内をランダムに移動し、これにより、光強度がランダムに変化し（光検出領域の励起光強度は、領域の中心を頂点として外方に向かって低減する。）、個々の発光粒子に対応する有意な光強度の変化（発光粒子からの光を表す信号）を特定することが困難となる。そこで、好適には、図５（Ｂ）に描かれている如く、粒子が光検出領域を略直線に横切り、これにより、時系列の光強度データに於いて、図５（Ｃ）の上段に例示の如く、個々の粒子に対応する光強度の変化のプロファイルが略同様となり（粒子が略直線的に光検出領域を通過する場合には、光強度の変化のプロファイルは、励起光強度分布と略同様となる。）、個々の発光粒子と光強度との対応が容易に特定できるように、光検出領域の位置の移動速度は、粒子のブラウン運動による平均の移動速度（拡散移動速度）よりも速く設定される。
　具体的には、拡散係数Ｄを有する発光粒子がブラウン運動によって半径Ｗｏの光検出領域（コンフォーカルボリューム）を通過するときに要する時間Δｔは、平均二乗変位の関係式
　　（２Ｗｏ）２＝６Ｄ・Δｔ　　　…（１）
から、
　　Δｔ＝（２Ｗｏ）２／６Ｄ　　　…（２）
となるので、発光粒子がブラウン運動により移動する速度（拡散移動速度）Ｖdifは、概ね、
　　Ｖdif＝２Ｗｏ／Δｔ＝３Ｄ／Ｗｏ　　　…（３）
となる。そこで、光検出領域の位置の移動速度は、かかるＶdifを参照して、それよりも十分に早い値に設定されてよい。例えば、発光粒子の拡散係数が、Ｄ＝２．０×１０－１０ｍ２／ｓ程度であると予想される場合には、Ｗｏが、０．６２μｍ程度だとすると、Ｖdifは、１．０×１０－３ｍ／ｓとなるので、光検出領域の位置の移動速度は、その１０倍以上の１５ｍｍ／ｓと設定されてよい。なお、発光粒子の拡散係数が未知の場合には、光検出領域の位置の移動速度を種々設定して光強度の変化のプロファイルが、予想されるプロファイル（典型的には、励起光強度分布と略同様）となる条件を見つけるための予備実験を繰り返し実行して、好適な光検出領域の位置の移動速度が決定されてよい。
（３）光強度の分析
　上記の処理により試料溶液の時系列の光強度データが得られると、コンピュータ１８に於いて、記憶装置に記憶されたプログラムに従った処理により、下記の如き光強度の分析が実行されてよい。
（ｉ）一つの観測対象粒子の検出
　時系列の光強度データに於いて、一つの観測対象粒子の光検出領域を通過する際の軌跡が、図５（Ｂ）に示されている如く略直線状である場合、その粒子に対応する信号に於ける光強度の変化は、（光学系により決定される）光検出領域の光強度分布を反映した略釣鐘状のプロファイルを有する。従って、適宜設定される閾値Ｉｏを超える光強度が継続する時間幅Δτが所定の範囲にあるとき、その光強度のプロファイルを有する信号が一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されるようになっていてよい。また、光検出領域の光強度分布が、ガウス分布：
　　Ｉ＝Ａ・ｅｘｐ（－２ｔ２／ａ２）　　　…（４）
であると仮定できるときには、有意な光強度のプロファイル（バックグラウンドでないと明らかに判断できるプロファイル）に対して式（４）をフィッティングして算出された強度Ａ及び幅ａが所定の範囲内にあるとき、その光強度のプロファイルが一つの粒子が光検出領域を通過したことに対応すると判定され、一つの発光粒子の検出が為されてよい。（強度Ａ及び幅ａが所定の範囲外にあるときには、ノイズ又は異物として分析に於いて無視されてよい。）
（ii）発光粒子のカウンティング
　一つの処理方法の例として、時系列光強度データからの発光粒子の一括的な検出及びカウンティングを行う際には、まず、時系列光強度データ（図５（Ｃ）、最上段「検出結果（未処理）」）に対して、スムージング（平滑化）処理が為される（図４－ステップ１１０、図５（Ｃ）中上段「スムージング」）。発光粒子の発する光は確率的に放出されるものであり、微小な時間に於いてデータ値の欠落が生じ得るため、かかるスムージング処理によって、前記の如きデータ値の欠落を無視できることとなる。スムージング処理は、例えば、移動平均法（例えば、隣接平均法、サビンスキー-ゴレイ(Savinsky-golay)法のアルゴリズム）、パーセンタイルフィルタ法、ＦＦＴフィルタ法により為されてよい。なお、スムージング処理を実行する際のパラメータ、例えば、移動平均法に於いて一度に平均するデータ点数や移動平均の回数など、は、光強度データ取得時の光検出領域の位置の移動速度（走査速度）、ＢＩＮ　ＴＩＭＥに応じて適宜設定されてよい。
　次いで、スムージング処理後の時系列光強度データに於いて、有意なパルス状の信号（以下、「パルス信号」と称する。）が存在する時間領域（パルス存在領域）を検出するために、スムージング処理後の時系列光強度データの時間についての一次微分値が演算される（ステップ１２０）。時系列光強度データの時間微分値は、図５（Ｃ）中下段「時間微分」に例示されている如く、信号値の変化時点に於ける値の変化が大きくなるので、かかる時間微分値を参照することによって、有意な信号の始点と終点を有利に決定することができる。
　しかる後、時系列光強度データ上に於いて、逐次的に、有意なパルス信号を検出し、検出された信号が発光粒子に対応する信号であるか否かが判定される。具体的には、まず、時系列光強度データの時系列の時間微分値データ上にて、逐次的に時間微分値を参照して、一つのパルス信号の始点と終点とが探索され決定され、パルス存在領域が特定される（ステップ１３０）。一つのパルス存在領域が特定されると、そのパルス存在領域に於けるスムージングされた時系列光強度データに対して、釣鐘型関数のフィッティングが行われ（図５（Ｃ）下段「釣鐘型関数フィッティング」）、釣鐘型関数のパルスのピーク（最大値）強度Ｉｍａｘ、パルス幅（半値全幅）ｗ、フィッティングに於ける（最小二乗法の）相関係数等のパラメータが算出される（ステップ１４０）。なお、フィッティングされる釣鐘型関数は、典型的には、ガウス型関数であるが、ローレンツ型関数であってもよい。そして、算出された釣鐘型関数のパラメータが、一つの発光粒子が光検出領域を通過したときに検出されるパルス信号が描く釣鐘型のプロファイルのパラメータについて想定される範囲内にあるか否か、即ち、パルスのピーク強度、パルス幅、相関係数が、それぞれ、所定範囲内にあるか否か等が判定される（ステップ１５０）。かくして、図６（Ａ）左に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが一つの発光粒子に対応する信号に於いて想定される範囲内にあると判定された信号は、一つの発光粒子に対応する信号であると判定され、これにより、一つの発光粒子が検出されたこととなり、一つの粒子としてカウントされる（粒子数がカウントアップされる。ステップ１６０）。一方、図６（Ａ）右に示されている如く、算出された釣鐘型関数のパラメータが想定される範囲内になかったパルス信号は、ノイズとして無視される。
　上記のステップ１３０～１６０の処理に於けるパルス信号の探索及び判定は、時系列光強度データの全域に渡って繰り返し実行され、一つの発光粒子が検出される毎に、粒子としてカウントされる。そして、時系列光強度データの全域のパルス信号の探索が完了すると（ステップ１７０）、それまで得られた粒子のカウント値が時系列光強度データに於いて検出された発光粒子の数とされる。特に、本実施形態に於いては、互いに異なる波長帯域の時系列光強度データの各々について、上記のステップ１１０～１７０が実行され、それぞれの波長帯域についての発光粒子に対応するパルス信号の数が計数されてよい。なお、時系列光強度データから発光粒子の信号を個別に検出してカウンティングする処理は、上記の手順に限らず、任意の手法により実行されてよい。
（iii）同時に発生した信号の検出及びカウント
　上記の如く複数の波長帯域の時系列光強度データに於ける発光粒子に対応する信号（パルス信号）の検出が完了すると、検出された信号のうちで、選択された波長帯域の時系列光強度データに於いて同時に発生した信号が検出される。或る時系列光強度データに於ける信号と他の時系列光強度データに於ける信号とが同時に出現したか否かは、各々の信号の発生期間が互いに重複しているか否かによって判定されてよい。かかる判定は、具体的には、例えば、図６（Ｂ）に例示されている如く、或る波長帯域（第一の波長帯域：波長Ｉ）の時系列光強度データに於ける発光粒子に対応するパルス信号の始点ｔｘｓと終点ｔｘｅの間に別の波長帯域（波長II）の時系列光強度データのパルス信号の始点ｔｙｓ又は終点ｔｙｅのうちの少なくとも一方が存在するとき、即ち、
　　ｔｘｓ＜ｔｙｓ＜ｔｘｅ　　　…（５ａ）
　　ｔｘｓ＜ｔｙｅ＜ｔｘｅ　　　…（５ｂ）
のうちの少なくとも一方が成立したとき、波長Ｉと波長IIに於いて同時に発生したパルス信号が発生したと判定する態様にて為されてよい。そして、かかる判定を時系列光強度データ上で順に繰り返すことにより、選択された波長帯域の時系列光強度データに於ける同時に発生したパルス信号の全てが検出され、その数が計数されるようになっていてよい。なお、選択された波長帯域が３つ以上であるときには、選択された波長帯域の全てに於いて発生期間が重複するパルス信号が存在していたとき、そのパルス信号が同時に発生した信号として判定される。また、別の態様として、第一の波長帯域に於けるパルス信号のピークの時間と別の波長帯域に於けるパルス信号のピークの時間との差が所定時間内だったとき、それらのパルス信号は同時に発生したパルス信号であると判定されてよい。
（iv）分析並びに発光粒子の数密度又は濃度の決定
　上記の如く検出された同時に発生した信号とそのカウント値は、実験の態様に応じて、種々の分析に利用される。例えば、図３（Ｃ）に例示されている如き二つの粒子の結合反応を確認する実験に於いては、同時に発生した信号は、二つの粒子の結合体からの信号であり、従って、同時に発生した信号が検出されたときには、そのことが二つの粒子の結合反応が生じたことの証拠となる。そして、同時に発生した信号以外の信号は、結合反応を起こしていない粒子に対応する信号であると考えられるので、同時に発生した信号のカウント値とそれ以外の信号のカウント値とを比較することにより、二つの粒子の結合反応の強さの程度を評価することが可能となる。例えば、種々の環境条件にて、上記の光の測定と信号の検出を行った場合に、或る条件に於ける同時に発生した信号のカウント値の相対的な増大（低減）は、結合反応の強さ又は進行の程度の増大（低減）を意味することとなる。また、図３（Ｄ）に例示されている如き一つの粒子の分解反応を確認する実験に於いては、一つの粒子が分解して、一つの発光標識のみを有する粒子が生成されると、同時に発生した信号以外の信号が生ずると考えられるので、同時に発生した信号以外の信号が検出されたときには、かかる分解反応の発生の証拠となり得る（下記の注参照）。そして、同時に発生した信号のカウント値とそれ以外の信号のカウント値とを比較することにより、分解反応の強さの程度、進行の程度等を評価することが可能となる。例えば、種々の環境条件にて、上記の光の測定と信号の検出を行った場合に、或る条件に於ける同時に発生した信号のカウント値の相対的な低減は、分解反応の強さ又は進行の程度の増大を意味することとなる。
［（注）ただし、後に説明される実施例に於いて示されるように、実際の実験に於いては、互いに波長の異なる励起光のＣＶを空間的に完全に一致させることは困難であるため、光検出領域に於いて、一つの波長の励起光のみが照射される領域が生じる場合がある。その場合、互いに波長の異なる励起光の照射領域が一致していれば、同時に発生した信号となるべき信号が、同時に発生した信号以外の信号に含まれていることとなる。即ち、同時に発生した信号以外の信号には、図３（Ｃ）の結合反応の検査に於いては、二つの粒子の結合体の信号が含まれ、図３（Ｄ）の分解反応の検査に於いては、分解前の粒子の信号が含まれている可能性がある。従って、図３（Ｃ）の結合反応の検査に於いては、同時に発生した信号以外の信号の数がそのまま結合体の絶対的な数であると判断することはできず、また、図３（Ｄ）の分解反応の検査に於いては、同時に発生した信号以外の信号の存在からだけでは、分解反応の有無を判断することはできないこととなる。しかしながら、同時に発生した信号のカウント値とそれ以外の信号のカウント値との比較により結合反応又は分解反応の強さの程度、進行の程度の相対的な変化を評価することは可能である。]
　更に、複数の種類の発光粒子を含む試料溶液に於いて、同時に発生した信号に対応する発光粒子を観測対象粒子とする場合には、同時に発生した信号が検出されたことによって、観測対象粒子の存在が確認されることとなり、かかる同時に発生した信号のカウント値は、観測対象粒子の数密度又は濃度に比例すると考えられるので、そのカウント値に着目することにより、観測対象粒子の数密度又は濃度に関する情報を取得することが可能となる。また、逆に、同時に発生した信号を観測対象粒子以外の粒子又は夾雑物の信号とする場合には、同時に発生した信号以外の存在により、観測対象粒子の存在が確認され、観測対象粒子の発光波長の時系列光強度データ上の信号のカウント値から同時に発生した信号のカウント値を除外することにより、より精度よく観測対象粒子の数密度又は濃度に関する情報を取得することが可能となる。［前記の如く、実際の実験に於いては、互いに波長の異なる励起光のＣＶを空間的に完全に一致させることは困難であり、光検出領域に於いて、一つの波長の励起光のみが照射される領域が生じるため、同時に発生した信号以外の信号の存在のみから観測対象粒子の存在は証明されない。しかしながら、同時に発生した信号以外の信号の増減は、観測対象粒子の増減に対応するので、同時に発生した信号以外の信号のカウント値の変化から試料溶液中の観測対象粒子の増減が検出できることとなる。］
　時系列光強度データに於ける発光粒子の数密度又は濃度は、各発光粒子のカウント値と、時系列光強度データの取得の間に光検出領域の通過した領域の総体積を用いて決定可能である。しかしながら、光検出領域の実効体積は、励起光又は検出光の波長、レンズの開口数、光学系の調整状態に依存して変動するため、設計値から算定することは、一般に困難であり、従って、光検出領域の通過した領域の総体積を算定することも簡単ではない。そこで、典型的には、発光粒子の濃度が既知の溶液（参照溶液）について、検査されるべき試料溶液の測定と同様の条件にて、上記に説明した光強度の測定、粒子の検出及びカウンティングを行い、検出された発光粒子の数と参照溶液の発光粒子の濃度とから、光検出領域の通過した領域の総体積、即ち、発光粒子の検出数と濃度との関係が決定されるようになっていてよい。参照溶液の発光粒子としては、好ましくは、各発光粒子と同様の波長特性を有する発光標識（蛍光色素等）であってよい。具体的には、例えば、発光粒子の濃度（数密度）Ｃの参照溶液について、その発光粒子の検出数がＮであったとすると、光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔは、
　　　Ｖｔ＝Ｎ／Ｃ　　　…（６）
により与えられる。また、参照溶液として、複数の異なる濃度の溶液が準備され、それぞれについて測定が実行されて、算出されたＶｔの平均値が光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔとして採用されるようになっていてよい。そして、Ｖｔが与えられると、粒子のカウンティング結果がｎの試料溶液の発光粒子の濃度（数密度）ｃは、
　　　ｃ＝ｎ／Ｖｔ　　　…（７）
により与えられる。なお、光検出領域の体積、光検出領域の通過した領域の総体積は、上記の方法によらず、任意の方法にて、例えば、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを利用するなどして与えられるようになっていてよい。また、本実施形態の光分析装置に於いては、想定される光検出領域の移動パターンについて、種々の標準的な粒子についての濃度Ｃと粒子の数Ｎとの関係（式（６））の情報をコンピュータ１８の記憶装置に予め記憶しておき、装置の使用者が光分析を実施する際に適宜記憶された関係の情報を利用できるようになっていてよい。
　特に、同時に発生した信号に対応する発光粒子の数密度又は濃度を算出する際には、参照溶液として、選択された波長帯域の全てに発光波長を有する発光粒子の濃度が既知の溶液が準備され、その溶液についての光強度の測定により得られた時系列光強度データに於いて同時に発生した信号の検出及びカウンティングが実行され、そのカウント値と濃度とから光検出領域の通過した領域の総体積Ｖｔが決定されてよい。複数種類の発光粒子を含む試料溶液中の各発光粒子の濃度の算出の際には、同時に発生した信号に対応する発光粒子については、同時に発生した信号のカウント値が用いられ、同時に発生した信号以外の信号に対応する発光粒子については、その発光粒子の発光波長の波長帯域の時系列光強度データ上の全ての信号のカウント値から同時に発生した信号のカウント値を差し引いた値が用いられてよい。
　かくして、上記の本発明の方法を走査分子計数法に組み込んだ光分析方法によれば、一波長帯域の光測定による走査分子計数法よりも多様な情報を取得することができ、また、複数の種類の発光粒子を含む試料溶液について走査分子計数法により光分析を行う場合に、不要なデータの影響を低減又は排除して、精度の良い結果を得ることが可能となる。なお、上記の本発明の方法による走査分子計数法によれば、ＦＣＳ、ＦＣＣＳ、ＦＩＤＡ等と同様に微量の試料溶液を用いて、ＦＣＳ、ＦＣＣＳ、ＦＩＤＡ等の解析過程に於いて統計的処理を含む光分析技術で良好な計測可能なレベル（典型的には１ｎＭ程度）よりも低い濃度（数ｐＭ程度）の発光粒子についての種々の情報が得られることは理解されるべきことである。
Ｂ．ＦＣＳ等に於ける本発明の実施形態
　別の態様として、本発明の方法は、ＦＣＳ、ＦＣＣＳ、ＦＩＤＡ等の共焦点顕微鏡を用いた光分析技術に於いて、測定された時系列光強度データから観測対象粒子以外の粒子からの光の信号を除去するために有利に用いられる。具体的には、ＦＣＳ、ＦＣＣＳ、ＦＩＤＡ等による計測に於いて、或る特定の種類の発光粒子を観測対象粒子として、その発光波長を含む波長帯域（「主測定波長帯域」とする。）の光を計測して時系列光強度データを生成する際に、試料溶液中に「主測定波長帯域」に発光波長を有する別の発光粒子又はその他の夾雑物（「夾雑物等」とする。）が存在する場合には、「夾雑物等」の「主測定波長帯域」以外の発光波長を含む波長帯域（「副測定波長帯域」とする。）にて光の計測及び時系列光強度データの生成が為される（副測定波長帯域は、観測対象粒子の発光波長を含まないよう選択される。）。かかる構成によれば、「副測定波長帯域」にて有意な信号が発生したとき、即ち、主測定波長帯域と副測定波長帯域とに同時に有意な信号が発生したときには、その信号の発生期間に於いて光検出領域に「夾雑物等」が進入していると想定される。そこで、ＦＣＳ、ＦＣＣＳ、ＦＩＤＡ等により解析される主測定波長帯域の時系列光強度データから主測定波長帯域と副測定波長帯域とに同時に発生した信号の発生期間のデータを除去又は削除し、これにより、夾雑物等の影響が低減又は除去された時系列光強度データに基づいて、ＦＣＳ、ＦＣＣＳ、ＦＩＤＡ等による、より精度の良い又は改善された演算結果が得られることとなる。
　図７（Ａ）は、上記の如くＦＣＳ等に於いて本発明の方法を適用する実施形態に於ける処理過程をフローチャートの形式にて表したものである。同図を参照して、まず、ＦＣＳ等における通常の態様にて光の測定及び時系列光強度データの生成が実行される（ステップ２００）。ただし、この場合、主測定波長帯域だけでなく、副測定波長帯域についても同時に光の測定及び時系列光強度データの生成が為される（なお、ＦＣＣＳに於いては、通常、観測対象粒子として二つの種類の粒子が選択され、それぞれの粒子の発光波長にて光測定が実行されるところ、本発明の方法が適用される場合には、観測対象粒子の二つの発光波長とは、別の波長帯域が副測定波長帯域として任意に選択される。）。図７（Ｂ）は、かくして得られた主測定波長帯域の時系列光強度データ（上段）と、副測定波長帯域の時系列光強度データ（下段）の実際の例を示したものである。この例では、主測定波長帯域を６５０ｎｍ～６９０ｎｍに設定し、副測定波長帯域を５６５ｎｍ～５９５ｎｍに設定した際に、観測対象粒子は励起光６３３ｎｍにて励起されて主測定波長帯域にて検出され、夾雑物等は励起光５４３ｎｍにて励起されて主測定波長帯域および副測定波長帯域にて検出されることが分かっている。そうすると、夾雑物等が光検出領域に進入したときには、副測定波長帯域において図示の如く有意な信号が出現するので（これに対応して、主測定波長帯域に於いても光強度（フォトンカウント）の増大が観察される。）、そのパルス状の信号の発生期間に於いて主測定波長帯域と副測定波長帯域にて同時に発生した信号が出現していると判定することができる。かくして、副測定波長帯域の時系列光強度データに於いて有意なパルス状の信号の発生を順次検出することによって、同時に発生した信号の検出が為され（ステップ２１０）、それらの同時に発生した信号の発生期間（同時発生期間）は、夾雑物等の光検出領域に進入した期間であると想定されるので、後で実行される分析処理に於いては無視されるべき「ノイズ期間」として特定される。一方、かかるノイズ期間以外の期間は、観測対象粒子の光検出領域に進入した期間、即ち、「シグナル期間」として特定される（ステップ２２０）。そして、後の分析処理に於いて可能であれば、分析処理に利用される時系列光強度データから「ノイズ期間」が削除され（ステップ２３０）、かかるノイズ期間を削除した時系列光強度データを用いて、通常の態様にてＦＣＳ、ＦＣＣＳ、ＦＩＤＡ等による分析演算処理（自己相関関数若しくは相互相関関数の演算又はヒストグラムの生成及びフィッティング）が実行される（ステップ２４０）。
　上記の構成によれば、主測定波長帯域と副測定波長帯域にて同時に発生した信号の発生期間、即ち、試料溶液中の夾雑物等が光検出領域に進入した期間のデータを排除して、ＦＣＳ、ＦＣＣＳ、ＦＩＤＡ等の分析演算処理が実行可能となるので、分析演算処理によって得られた結果の精度の向上が期待される。
　上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の如き実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
二色の蛍光色素にて標識されたオリゴヌクレオチドの検出実験
　本発明の方法を組み込んだ走査分子計数法に従って、種々の割合にて二色の蛍光色素にて標識されたオリゴヌクレオチド（二重標識オリゴヌクレオチド）と一色の蛍光色素にて標識されたオリゴヌクレオチド（一重標識オリゴヌクレオチド）とを含む試料溶液について二つの波長帯域にて光測定を行い、得られた時系列光強度データにて同時に発生した信号（同時発生パルス）の検出及びカウンティングを行い、本発明による方法による二重標識オリゴヌクレオチド（同時発生パルスに対応する発光粒子）の濃度測定可能範囲を検証した。対照実験としてＦＣＣＳによる二重標識オリゴヌクレオチドの濃度測定可能範囲も検証した。
　試料としては、下記の二重標識オリゴヌクレオチド及び一重標識オリゴヌクレオチドを準備した。
（二重標識オリゴヌクレオチド）
・488pA647：Alexa488-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-Alexa647
［５’末端に蛍光色素Alexa488を、３’末端に蛍光色素Alexa647を修飾したオリゴヌクレオチド］
（一重標識オリゴヌクレオチド）
・488pA：Alexa488-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa
［５’末端にAlexa488修飾したオリゴヌクレオチド］
・pA647：aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa- Alexa647
［３’末端にAlexa647修飾したオリゴヌクレオチド］
試料溶液は、次のように調製した。：上記のオリゴヌクレオチドをそれぞれ１０ｍＭ　Tris-HCl(pH8.0)に１００μＭとなるように溶解させた。次いで、各溶液を0.05%(w/w)Tween　20を含むリン酸緩衝溶液を用いて希釈し、488pAとpA647とを各々１０ｐＭにて含む溶液αと、488pA647を１０ｐＭにて含む溶液βとを調製した。そして、溶液βと溶液αとを、体積比で100:0、50:50、10:90、5:95、0:100となるように混合し、各蛍光色素について、一重標識オリゴヌクレオチド（488pA、pA647）に対する二重標識オリゴヌクレオチド488pA647の割合が１００％、５０％、１０％、５％、０％となる溶液を調製した。なお、Alexa488は、４８８ｎｍの励起光で励起すると５１０～５６０ｎｍの波長帯域で蛍光が検出される。一方、Alexa647は６３３ｎｍの励起光で励起すると、６５０～６９０ｎｍの波長帯域で蛍光が検出される。
　光の測定及び分析に於いては、光分析装置として、共焦点蛍光顕微鏡の光学系とフォトンカウンティングシステムを備えた１分子蛍光測定装置ＭＦ－２０（オリンパス株式会社）を用い、上記の「Ａ．（２）試料溶液の光強度の測定」にて説明した態様に従って、上記の各試料溶液について、時系列光強度データ（フォトンカウントデータ）を取得した。その際、励起光は、４８８ｎｍのレーザー光（２００μＷ）と６３３ｎｍのレーザー光（１０００μＷ）とを用い、バンドパスフィルターを用いて、励起光４８８ｎｍ及び６３３ｎｍに対して、５１０－５６０ｎｍと６５０－６９０ｎｍの二つの波長帯域の光をそれぞれ別々に同時に測定し、励起光４８８ｎｍ及び励起光６３３ｎｍのそれぞれに対する時系列光強度データを生成した。試料溶液中に於ける光検出領域の位置の移動速度は、１５ｍｍ／秒とし、ＢＩＮ　ＴＩＭＥを１０μ秒とし、各試料溶液について２秒間の測定を３回ずつ行った。光強度の測定後、上記の「Ａ．（３）（ii）発光粒子のカウンティング」に記載された処理手順に従って、各試料溶液について取得された各波長帯域の時系列光強度データにスムージング処理を施し、スムージングされたデータに於いて、パルス信号の始点及び終点を決定した後、各パルス信号にガウス関数を最小二乗法によりフィッティングして、（ガウス関数に於ける）ピーク強度、パルス幅（半値全幅）、相関係数を決定した。そして、下記の条件:
　　　２０μ秒＜パルス幅＜４００μ秒
　　　ピーク強度＞１（フォトン／１０μ秒）　　　…（Ａ）
　　　相関係数＞０．９５
を満たすパルス信号のみを発光粒子（二重標識オリゴヌクレオチド及び一重標識オリゴヌクレオチド）に対応する信号であると判定する一方、上記の条件を満たさないパルス信号はノイズとして無視し、発光粒子に対応する信号であると判定された信号の数を「パルス数」として計数した。
　次いで、励起光４８８ｎｍのデータと励起光６３３ｎｍのデータ上の発光粒子として判定されたパルス信号を比較して、パルス信号のピーク（最大値）の時刻の差が３０μ秒以内となるパルス信号を同時に発生したパルス信号（同時発生パルス信号）として判定し、その数を計数した。そして、同時発生パルス数Ｎａｂ、励起光４８８ｎｍのデータ上のパルス数Ｎａ及び励起光６３３ｎｍのデータ上のパルス数Ｎｂを用いて、下記の式により、同時発生パルス信号の割合を算出した。
　　（同時発生パルス信号の割合）＝Ｎａｂ／（Ｎａ＋Ｎｂ－Ｎａｂ）　　　…（８）
　対照実験としてのＦＣＣＳに於いては、上記と同じ試料溶液を用い、上記と同じ励起波長及び検出波長条件の下、通常のＦＣＣＳの態様にて、励起光４８８ｎｍに対する蛍光、励起光６３３ｎｍに対する蛍光をそれぞれ測定してそれぞれ時系列光強度データを生成し、励起光４８８ｎｍに対する蛍光の自己相関関数、励起光６３３ｎｍに対する蛍光の自己相関関数、及び、励起光４８８ｎｍに対する蛍光と励起光６３３ｎｍに対する蛍光との相互相関関数を算出し、フィッティングにより平均粒子数を決定した。測定は、各試料溶液について一回２０秒間の測定を３回ずつ行った。また、上記の同時発生パルス信号の割合と比較する目的で、ＤＣＣ（Degree　of　Cross　Correlation）を下記の式にて算出した。
　　ＤＣＣ＝ｎａｂ／（ｎａ＋ｎｂ－ｎａｂ）　　　…（９）
ここに於いて、ｎａｂは、相互相関関数から算出される平均粒子数であり、ｎａは、励起光４８８ｎｍに対する蛍光の自己相関関数から算出される平均粒子数であり、ｎｂは、励起光６３３ｎｍに対する蛍光の自己相関関数から算出される平均粒子数である。
　図８は、本発明の方法による走査分子計数法を実行して得られた励起光４８８ｎｍに対するフォトンカウントデータ（ａ）、励起光６３３ｎｍに対するフォトンカウントデータ（ｂ）、これらのデータにスムージング処理を施した後のデータ（ｃ）及びフィッティングにより発光粒子の信号として判定されたパルス信号（ｄ）の一部を示している。特に図８（ｄ）を参照して理解される如く、励起光４８８ｎｍに対するデータ上のパルス信号（一点鎖線）と励起光６３３ｎｍに対するデータ上のパルス信号（実線）とに於いて、同時に発生したパルス信号（図中、同時発生信号と付された信号）が観察された。かかる同時発生パルス信号は、二重標識オリゴヌクレオチドから発せられた光の信号であると考えられ、かくして、本発明の方法によって、二色の蛍光色素にて標識された粒子を他と区別して検出することが可能であることが示された。
　図９は、本発明の方法による走査分子計数法の手順によって算出された種々の割合にて混合された二重標識オリゴヌクレオチドを含む試料溶液についての同時発生パルス信号の割合（Ａ）と、ＦＣＣＳによって算出された種々の割合にて混合された二重標識オリゴヌクレオチドを含む試料溶液についてのＤＣＣ（Ｂ）をそれぞれ試料溶液中の二重標識オリゴヌクレオチドの割合（ダブルラベルオリゴ混合率）に対してプロットした図である。これらの図を参照して、本発明の方法の走査分子計数法により得られた結果（Ａ）に於いては、検査した領域全域に亘ってダブルラベルオリゴ混合率に対して同時発生パルス信号の割合は、比例し、３回の測定のばらつきも非常に小さかった。ダブルラベルオリゴ混合率＝１００％のとき、二重標識オリゴヌクレオチドの濃度は、１０ｐＭであり、ダブルラベルオリゴ混合率＝５％のときには、二重標識オリゴヌクレオチドの濃度は、０．５ｐＭとなるので、図９（Ａ）の結果は、本発明によれば、０．５ｐＭ程度の二重標識された発光粒子を検出し、また、その濃度を決定できることを示唆している（下記の（注）参照）。一方、ＦＣＣＳによる結果（図９（Ｂ））に於いては、ダブルラベルオリゴ混合率が５０％未満では、ダブルラベルオリゴ混合率とＤＣＣとの比例関係が失われ、ばらつきも大きかった。
　かくして、本発明によれば、二重標識された発光粒子の検出及びその濃度の決定が、ＦＣＣＳで可能な範囲よりも大幅に低い濃度範囲で達成可能であることが示された。（即ち、同時発生パルス信号を観測対象粒子として識別し、それ以外の信号を観測対象粒子以外の粒子として識別した場合に、従前よりも低い濃度域にて観測対象粒子を検出し又はその濃度を特定できることを示している。）また、上記の結果により、本発明によれば、複数の種類の発光粒子の相互作用（結合反応又は分解反応）の検査に於いて、試料溶液中の発光粒子の濃度がＦＣＣＳで可能な範囲よりも大幅に低い場合、或いは、相互作用が弱く、結合体又は分解物が相対的に僅かしか生成されないためにＦＣＣＳでは検出が困難である場合でも、発光粒子の相互作用の有無の検出及び／又はその強さの程度の評価が可能であることが示された。
［（注）実際の実験に於いては、共焦点顕微鏡の光学系に於ける色収差に起因して、複数の波長の励起光の照射領域（ＣＶ）を完全に一致させることは通常困難である。そのため、光検出領域に於いて、複数の波長のうちのいずれか一方の波長の光のみが照射される領域が生成され、かかる領域に二重標識された発光粒子が進入した場合には、複数の波長帯域の時系列光強度データ上に信号が同時に発生しないこととなる。従って、図９（Ａ）に見られるように、同時発生パルス信号の割合は、試料溶液中の二重標識された発光粒子の割合から理論的に期待される値よりも小さく成り得る。しかしながら、同図から理解される如く、二重標識された発光粒子の量と同時発生パルス信号の量との関係は、比例するか若しくは一対一の関係になるので、同時発生パルス信号の量に基づいて試料溶液中の二重標識された発光粒子の増減又は濃度を推定することが可能となる。］
夾雑物を含む試料溶液中に於ける観測対象粒子の濃度検出
　観測対象粒子と共通の発光波長を有する夾雑物が含まれている試料溶液に於いて走査分子計数法により観測対象粒子の濃度を検出する場合に、本発明の方法により精度が向上することを検証した。
　試料は、蛍光色素ＴＡＭＲＡを観測対象粒子として、蛍光色素ＡＴＴＯ５９０を夾雑物のモデルとして用いた。ＴＡＭＲＡは、５４３ｎｍの励起光で励起すると５６５～５９５ｎｍの波長帯域で蛍光が検出される。また、ATTO590は５４３ｎｍの励起光で励起すると、５６５～５９５ｎｍの波長帯域および６５０～６９０ｎｍの波長帯域で蛍光が検出される。試料溶液としては、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝液中に、ＡＴＴＯ５９０を１００ｐＭにて含み、ＴＡＭＲＡを０ｐＭ、１ｐＭ及び１０ｐＭにて含む溶液を調製した。また、対照溶液として、ＡＴＴＯ５９０を含有せず、ＴＡＭＲＡを０ｐＭ、１ｐＭ及び１０ｐＭにて含む溶液を調製した。
　光の測定及び分析は、上記の試料溶液をそれぞれ用いて、励起光を５４３ｎｍのレーザー光（５００μＷ）とし、検出波長帯域を５６５～５９５ｎｍ及び６５０～６９０ｎｍとして、実施例１と同様に実行し、それぞれの検出波長帯域の時系列光強度データ上の発光粒子に対応するパルス信号数と、同時発生パルス信号数とを得た。なお、同時発生パルス信号の検出の際には、パルス信号のピークの時刻が１００μ秒以内のパルス信号の組を同時発生パルス信号として判定した。
　図１０は、上記の手順により得られた各試料溶液について得られたパルス数を試料溶液中のＴＡＭＲＡの濃度に対してプロットしたものである。同図を参照して、ＡＴＴＯ５９０を含まない試料溶液のパルス数（△）は、観測した全濃度域に於いて、濃度に対して概ね比例し、最小自乗法による近似曲線の直線性は高かった（ｙ切片＝０．２７、平均自乗誤差Ｒ２＝０．９９９８）。これに対し、ＡＴＴＯ５９０を含む試料溶液のパルス数（○）は、低濃度域で、濃度に対する比例関係が観測されず、最小自乗法による近似曲線の直線性は低かった（ｙ切片＝３０．９２、平均自乗誤差Ｒ２＝０．９８９８）。しかしながら、ＡＴＴＯ５９０を含む試料溶液のパルス数から同時検出パルス信号数を差し引いた値（□）は、観測した全濃度域に於いて、濃度に対して概ね比例し、最小自乗法による近似曲線の直線性は、ＡＴＴＯ５９０を含む試料溶液の場合よりも改善された（ｙ切片＝１０．８０、平均自乗誤差Ｒ２＝０．９９９７）。ここに於いて、同時発生パルス信号は、夾雑物のモデルであるＡＴＴＯ５９０からの光であると想定される。従って、上記の結果は、ＡＴＴＯ５９０を含む試料溶液のパルス信号からＡＴＴＯ５９０に対応する同時発生パルス信号を排除することにより、観測対象粒子であるＴＡＭＲＡの濃度とパルス信号との比例関係を改善できることを示している。即ち、上記の結果は、走査分子計数法により夾雑物を含む試料溶液中の観測対象粒子の検出及び濃度の測定を行う場合に、本発明の方法に従って、同時発生パルス信号を観測対象以外の粒子の信号として識別し、それらの同時発生パルス信号をデータから排除することにより、観測対象粒子の検出及び濃度の測定に於ける精度を改善できることを示唆している。
夾雑物を含む試料溶液中に於ける観測対象粒子のＦＣＳによる計測
　観測対象粒子と共通の発光波長を有する夾雑物が含まれている試料溶液に於いて観測対象粒子についてＦＣＳによる光分析を実行する場合に、本発明の方法により分析結果の精度が向上することを検証した。
　試料は、蛍光色素ＡＴＴＯ６３３を観測対象粒子として、ＤＮＡ（プラスミドｐｂｒ３２２、タカラバイオ株式会社、Cat.No.3035）を蛍光色素ＳＹＴＯＸ　Ｏｒａｎｇｅ（インビトロジェン社、Cat.No.S-11368）にて蛍光標識したもの（蛍光標識ＤＮＡ）を夾雑物のモデルとして用いた。ＡＴＴＯ６３３は、６３３ｎｍの励起光で励起すると６５０～６９０ｎｍの波長帯域で蛍光が検出される。また、ＤＮＡに結合したＳＹＴＯＸ　Ｏｒａｎｇｅは５４３ｎｍの励起光で励起すると、５６５～５９５ｎｍの波長帯域および６５０～６９０ｎｍの波長帯域で蛍光が検出される。試料溶液としては、１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む水溶液中に１００ｐＭ　ＡＴＴＯ６３３、１ｐＭ　ＤＮＡ、９ｎＭ　ＳＹＴＯＸ　Ｏｒａｎｇｅを含む溶液を調製した（同溶液の調製に於いて、ＳＹＴＯＸ　ＯｒａｎｇｅとＤＮＡを混合したときに３０分間室温にてインキュベーションして、ＳＹＴＯＸ　ＯｒａｎｇｅをＤＮＡに十分に結合させた。）。また、対照溶液として、１００ｐＭ　ＡＴＴＯ６３３を含み、蛍光標識ＤＮＡを含まない溶液を調製した。
　光の測定及び分析には、光分析装置として、１分子蛍光測定装置ＭＦ－２０（オリンパス株式会社）を用いた。光測定の際、励起光は、５４３ｎｍのレーザー光（３００μＷ）と６３３ｎｍのレーザー光（１００μＷ）とを用い、バンドパスフィルターを用いて、励起光５４３ｎｍ及び６３３ｎｍに対して、５６５－５９５ｎｍと６５０－６９０ｎｍの二つの波長帯域の光強度をそれぞれ別々に同時に測定し、励起光５４３ｎｍ及び励起光６３３ｎｍのそれぞれに対する時系列光強度データを生成した。測定は、各試料溶液について２０秒間の測定を２回ずつ行った。ここで、観測対象粒子であるＡＴＴＯ６３３は６５０～６９０ｎｍの波長帯域で蛍光が検出されるので、検出波長６５０～６９０ｎｍが主測定波長帯域であり、検出波長５６５～５９５ｎｍが副測定波長帯域である。時系列光強度データの分析に於いては、通常のＦＣＳの態様にて、主測定波長帯域（検出波長６５０－６９０ｎｍ）の時系列光強度データの自己相関関数を演算し、その自己相関関数に下記の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 （ここに於いて、τは、相関時間、Ｎは、ＣＶ内の平均粒子数、ＡＲは、ストラクチャパラメータ（ＣＶの長軸ｗｚと横方向半径ｗｏとの比（ＡＲ＝ｗｚ／ｗｏ））、τＤは、並進拡散時間である。）
をフィッティングし、平均粒子数Ｎと並進拡散時間τＤとを決定した。なお、「Ｂ．ＦＣＳ等に於ける本発明の実施形態」に於いて記載されている如く、夾雑物等（蛍光標識ＤＮＡ）に対応する主測定波長帯域と副測定波長帯域との双方に同時に発生した信号を除去する場合には、上記の自己相関関数の演算及びフィッティングに先だって、副測定波長帯域に於いて、フォトンカウント値が２フォトンを超えている時間を検出し、その時間の前後５０μ秒の期間を「ノイズ期間」として特定した。そして、図１１（Ａ）に描かれている如く、主測定波長帯域に於いて「ノイズ期間」に対応する期間のデータを削除し、削除された期間の前後の「シグナル期間」のデータを連結して、時間的に連続なデータに再構成し、自己相関関数の演算及びフィッティングを行った。
　図１１（Ｂ）、（Ｃ）は、上記の試料溶液（ＡＴＴＯ６３３及び蛍光標識ＤＮＡを含む溶液）についての時系列光強度データに於いて上記の「ノイズ期間」の削除を実行せずに自己相関関数の演算及びフィッティングを行った場合の平均粒子数と並進拡散時間（ＤＮＡあり）、上記の試料溶液についての時系列光強度データに於いて上記の「ノイズ期間」の削除を実行してから自己相関関数の演算及びフィッティングを行った場合の平均粒子数と並進拡散時間（同時発生信号削除）、及び、対照溶液（ＤＮＡを含まないＡＴＴＯ６３３の溶液）についての平均粒子数と並進拡散時間（ＤＮＡなし）を、それぞれ示している。同図から理解される如く、「ノイズ期間」の削除を実行せずに算出された試料溶液についての平均粒子数と並進拡散時間は、それぞれ対照溶液についての平均粒子数と並進拡散時間よりも大きくなったが、「ノイズ期間」の削除を実行して試料溶液についての平均粒子数と並進拡散時間を算出すると、それらの値は、それぞれ対照溶液についての値に近づいた。これらの結果は、上記の本発明の方法に従って、同時発生信号を「ノイズ期間」として識別して、ＦＣＳ等の解析演算に於いて除外することによって、観測対象粒子以外の発光粒子からの光の寄与が排除又は低減され、解析演算の結果の精度が改善されることを示している。
　かくして、上記の実施例の結果から理解される如く、上記の本発明の方法に従って、複数の波長帯域の光を測定し、測定された複数の波長帯域の時系列光強度データに於いて同時に発生した信号の各々を個別に検出することにより、試料溶液中に含まれている特定の種類の発光粒子の検出及びその濃度の決定が可能となる。また、本発明によれば、時系列光強度データに於いて発生したパルス状信号が複数の波長帯域で同時に発生したものか否かによって信号を分類し、これにより、試料溶液中の発光粒子の種類を特定できることとなる。更に、複数の波長帯域で同時に発生した信号に観測対象粒子かそれ以外の発光粒子を対応させ、同時に発生した信号のみを選択又は除外することによって、観測対象粒子の検出、濃度の検出及びその他の任意の分析に於いて、観測対象粒子以外の発光粒子からの光の影響が低減され、測定結果又は分析結果の精度の改善が期待される。この点に関し、特に理解されるべきことは、本発明の方法では、複数の波長帯域で同時に発生した信号を個別に検出するので、複数の波長帯域で同時に発生した信号に対応する発光粒子の試料溶液中に於ける数密度又は濃度が低くても、時系列光強度データから複数の波長帯域で同時に発生したパルス信号を精度よく「拾い出す」ことが可能であるので、ＦＣＳ、ＦＣＣＳ等の統計的処理を利用する光分析技術では観測不能な程度の低濃度の発光粒子についての光分析が可能となる。通常、ＦＣＳ、ＦＣＣＳ等の光分析技術では、観測対象となる粒子の濃度は、概ね１ｎＭ程度必要であったが、上記の実施例の如く、本発明によれば、数ｐＭの発光粒子を観測対象粒子とすることができ、また、任意の光測定・分析実験に於いて、数ｐＭの観測対象粒子以外の発光粒子からの光の影響を測定・分析結果から排除又は低減することも可能である。
　なお、本発明の方法に従って、三つ以上の波長帯域にて光測定を行い、その波長帯域のうちの少なくとも二つの波長帯域にて同時に発生した信号を検出し、検出された同時に発生した信号及びそれ以外の信号のそれぞれについて上記と同様の分析（粒子カウンティング、濃度又は数密度の決定等）が行われてもよく、そのような場合も本発明の範囲に属することは理解されるべきである。

Claims (15)

  1. 　共焦点顕微鏡又は多光子顕微鏡の光学系を用いてランダムに運動する複数の種類の発光粒子を含む試料溶液中からの光を検出し分析する方法であって、
    　前記試料溶液内の前記光学系の光検出領域からの複数の波長帯域の光の強度を波長帯域毎に且つ同時に測定し時系列の光強度データを前記波長帯域の各々について別々に生成する過程と、
    　発光粒子からの光を表す信号にして前記時系列光強度データのうちの少なくとも二つの波長帯域の時系列光強度データに於いて同時に発生した信号を個別に検出する過程とを含み、
    　前記検出された同時に発生した信号を前記複数の種類の発光粒子のうちの少なくとも一つの特定の種類の発光粒子の信号として識別することを特徴とする方法。
  2. 　請求項１の方法であって、前記複数の波長帯域のうちの第一の波長帯域の時系列光強度データに於ける発光粒子の光を表す信号の発生期間が前記複数の波長帯域のうちの第一の波長帯域以外の少なくとも一つの波長帯域の時系列光強度データに於ける発光粒子の光を表す信号の発生期間と重なるとき、前記第一の波長帯域の時系列光強度データに於ける前記信号と前記第一の波長帯域以外の少なくとも一つの波長帯域の時系列光強度データに於ける前記信号とが同時に発生した信号として検出されることを特徴とする方法。
  3. 　請求項１又は２の方法であって、更に、前記時系列光強度データの各々に於いて発光粒子からの光を表す信号の各々を個別に検出する過程を含み、前記信号の各々が表す光を発した前記発光粒子の種類を、各信号が前記複数の波長帯域のうちの少なくとも二つの選択された波長帯域に於いて同時に発生したか否かに基づいて識別することを特徴とする方法。
  4. 　請求項３の方法であって、前記少なくとも二つの選択された波長帯域に於いて同時に発生した信号を前記複数の種類の発光粒子のうちの観測対象粒子の信号として識別し、前記同時に発生した信号以外の前記発光粒子からの光を表す信号を前記観測対象粒子以外の発光粒子の信号として識別することを特徴とする方法。
  5. 　請求項４の方法であって、前記複数の波長帯域が二つの波長帯域であり、前記二つの波長帯域の時系列光強度データに於いて同時に発生した信号を前記観測対象粒子の信号として識別し、前記二つの波長帯域の時系列光強度データの一方のみに於いて発生した前記発光粒子からの光を表す信号を前記観測対象粒子以外の発光粒子の信号として識別することを特徴とする方法。
  6. 　請求項３の方法であって、前記少なくとも二つの選択された波長帯域に於いて同時に発生した信号を前記複数の種類の発光粒子のうちの観測対象粒子以外の発光粒子の信号として識別し、前記同時に発生した信号以外の前記発光粒子からの光を表す信号を前記観測対象粒子の信号として識別することを特徴とする方法。
  7. 　請求項６の方法であって、前記複数の波長帯域が二つの波長帯域であり、前記二つの波長帯域の時系列光強度データに於いて同時に発生した信号を前記観測対象粒子以外の発光粒子の信号として識別し、前記二つの波長帯域の時系列光強度データの一方のみに於いて発生した前記発光粒子からの光を表す信号を前記観測対象粒子の信号として識別することを特徴とする方法。
  8. 　請求項３乃至７のいずれかの方法であって、前記光検出領域からの複数の波長帯域の光の強度の測定が前記光学系の光路を変更することにより前記試料溶液内に於いて前記光検出領域の位置を移動させながら実行され、前記時系列光強度データの各々に於いて単一の発光粒子からの光を表す信号の各々が個別に検出されることを特徴とする方法。
  9. 　請求項８の方法であって、更に、前記個別に検出された単一の発光粒子からの光を表す信号の数を計数する過程を含むことを特徴とする方法。
  10. 　請求項８の方法であって、前記光検出領域の位置が所定の速度にて移動されることを特徴とする方法。
  11. 　請求項８乃至１０のいずれかの方法であって、前記光検出領域の位置が前記試料溶液中の発光粒子の拡散移動速度よりも速い速度にて移動されることを特徴とする方法。
  12. 　請求項１１の方法であって、更に、前記試料溶液中の発光粒子からの光を表す信号の数に基づいて、該発光粒子の数密度又は濃度を決定する過程を含むことを特徴とする方法。
  13. 　請求項１の方法であって、前記複数の波長帯域のうちの少なくとも二つの選択された波長帯域に於いて同時に発生した信号を前記複数の種類の発光粒子のうちの観測対象粒子以外の発光粒子の信号として識別することを特徴とする方法。
  14. 　請求項１３の方法であって、前記時系列光強度データに於いて前記観測対象粒子以外の発光粒子の信号として識別された信号の発生期間のデータが除去されることを特徴とする方法。
  15. 　請求項１４の方法であって、前記複数の波長帯域の前記時系列光強度データのうち、前記観測対象粒子からの光強度を表す時系列光強度データを用いて、蛍光相関分光法、蛍光強度分布解析法又は蛍光相互相関分光法による光分析を実行する方法。
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