JP2010190730A - 相関分光分析方法及び相関分光分析装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】電子制御装置50の解析制御系は、処理部50dと、メモリ50eと、時系列データ調製部50fと、有効データ割合調製部50gと、相関関数算出部50hと、判定部50iとを備える。処理部50dは、受光器からの蛍光強度を表す電気信号を受信し、ノイズ除去及び/又はA/D変換を施す。メモリ50eは、ディジタル化された計測値および/またはデータ値を記憶する。時系列データ調製部50fは、メモリの動作と同時進行で、相関関数算出部50hの要求に応じて、時系列データのデータ値Di、Djを計算して出力する。有効データ割合調製部50gは、データ値Di、Djに対応する有効データ割合Ri、Rjを計算して出力する。相関関数算出部50hは、データ値Di、Djと有効データ割合Ri、Rjを用いて相関関数値を算出する。
【選択図】図5
Description
図1Aは、一つの好ましい実施形態によるレーザー走査型共焦点蛍光顕微鏡の光学系を有する蛍光分光分析装置(光分析装置)10の構成を模式的に示したものである。
光分析装置10は、蛍光相関分光分析と蛍光相互相関分光分析が実行可能である。蛍光相関分光分析では、微小の蛍光観察領域をブラウン運動により通過する分子の移動(並進運動)の速さが観測される。
図1Aの光分析装置10に於いて、蛍光強度の計測は、概して、下記の態様(計測モード)にて実行可能である。
このモードは、従前と同様の態様であり、レーザー光源La〜nのうちのいずれか一つからの励起光が試料中の一点の測定ポイントに集光される。これにより測定ポイントから発せられる蛍光が受光器APDa〜nのいずれか一つにより受光されて時系列の蛍光強度の計測値が得られる(図2A参照)。
この場合には、ガルバノミラー16及び/又は対物レンズZ軸駆動機構(不図示)を作動して、励起光が対物レンズ18の視野内の任意に設定された測定ポイント(α、β、γ、δ)に順々に所定時間ずつ集光される。なお、各測定ポイントに割り当てられる所定時間は、互いに同一であっても異なっていてもよい。以下同様。
このモードに於いては、一つの測定ポイントに対して、レーザー光源La〜nのうちの二つ以上からの励起光が、逐次、順々に所定時間ずつ集光される。
このモードに於いては、ガルバノミラー16及び/又は対物レンズZ軸駆動機構を作動させる。これにより、対物レンズ18の視野内の任意に設定された測定ポイント(α、β、γ、δ)に、レーザー光源La〜nのうちの少なくとも二つ以上のレーザー光源からの励起光が、逐次、順々に所定時間ずつ集光される。
[マルチプルτ方式について]
上記の図2A又は図2Cに例示の如く、測定ポイント毎又は波長帯域毎の時系列データが抽出されると、相関関数値が算出される。かかる相関関数値の算出に於いて、本実施形態の光分析装置では、所謂「マルチプルτ方式」を採用して、相関関数値の遅延時間が大きな領域では、相関関数値の時間分解能を落とし、演算処理量の低減が図られる。
(a)0<τn≦16Δτのとき(計測時の時間間隔と同じ)
ΔT0=Δτ:(計測時の時間間隔と同じ)
Di(tk)=Mi(tp)
(b)16Δτ<τn≦32Δτのとき
ΔT1=2Δτ
Di(tk)=Mi(t2p)+Mi(t2p+1)
(c)32Δτ<τn≦64Δτのとき
ΔT2=4Δτ
Di(tk)=ΣMi(t2p+q)[総和は、q=0〜3]
(d)64Δτ<τn≦128Δτのとき
ΔT3=8Δτ
Di(tk)=ΣMi(t2p+q)[総和は、q=0〜7]
(e)128Δτ<τn≦256Δτのとき
ΔT4=16Δτ
Di(tk)=ΣMi(t2p+q)[総和は、q=0〜15]
(f)256Δτ<τn≦512Δτ
ΔT5=32Δτ
Di(tk)=ΣMi(t2p+q)[総和は、q=0〜31]
方法Aの場合、一単位に含まれる計測値の個数とは、異なる個数の計測値を一単位として、新たに時系列データが分割される。すなわち、(a)では、一つの計測値が、データ値に対応している。(b)では、二つの計測値を合算した値が、一つのデータ値となる。(c)では、四つの計測値を合算した値が、一つのデータ値となる。このように、データ値を得る際に、一単位に含まれる計測値の個数を異ならせて、データ値を得る。
(a)0<τn≦16Δτのとき(計測時の時間間隔と同じ)
ΔT0=Δτ:(計測時の時間間隔と同じ)
Di(tk)=D0 i(tk)=Mi(tp)
(b)16Δτ<τn≦32Δτのとき
ΔT1=2Δτ
Di(tk)=D2 i(tk)=D0 i(t2p)+D0 i(t2p+1)=Mi(t2p)+Mi(t2p+1)
(c)32Δτ<τn≦64Δτのとき
ΔT2=4Δτ
Di(tk)=D4 i(tk)=ΣD2 i(t2p+q)[総和は、q=0〜3]
(d)64Δτ<τn≦128Δτのとき
ΔT3=8Δτ
Di(tk)=D8 i(tk)=ΣD4 i(t2p+q)[総和は、q=0〜7]
(e)128Δτ<τn≦256Δτのとき
ΔT4=16Δτ
Di(tk)=D16 i(tk)=ΣD8 i(t2p+q)[総和は、q=0〜15]
(f)256Δτ<τn≦512Δτ
ΔT5=32Δτ
Di(tk)=D32 i(tk)=ΣD16 i(t2p+q)[総和は、q=0〜31]
方法Bの場合、複数のデータ値を一単位として、時系列データが分割される。すなわち、(i)では、方法Aの場合と同様に、一つの計測値が、データ値に対応している。(b)では、(i)によって得られたデータ値をもとに、二つのデータ値を合算した値が、新たな一つのデータ値となる。(c)では、四つのデータ値を合算した値が、新たな一つのデータ値となる。このように、データ値を得る際に、一単位に含まれるデータ値の個数が異ならせて、データ値を得る。
図2Aの如く、時系列データにデータ欠損領域がない場合には、そのまま、式(1)を用いて、好適には、上記のマルチプルτ方式にて相関関数値を算出することが可能である。
Σmie,t=tk・mje,t=tk+τn/m2
[総和は、kについて実行される。以下同様。]
により与えられる。
ΣRi(tk)・Rj(tk+τn)
となる。
Claims (30)
- 試料からの放射光の強度を計測し該放射光の時系列データの相関関数を算出する相関分光分析方法であって、
前記試料に於ける少なくとも一つの測定ポイントからの放射光の強度を連続した複数の離散時間に於いて計測する過程と、
前記少なくとも一つの測定ポイントに於いて計測された前記放射光の強度に基づいて相関関数値を算出する過程とを含み、
前記放射光の強度に基づいて相関関数値を算出する過程が、
前記放射光の強度の値である計測値からなる時系列データを抽出する過程と、
前記時系列データに於いて有効な値を有する有効データ値を決定する過程と、
複数の前記計測値を一単位として、前記時系列データを分割する過程と、
前記一単位に含まれる前記計測値を合算することによってデータ値を得る過程と、
前記データ値から時系列データを再構成する過程と、
各々の前記データ値について、該データ値を得るために合算した前記計測値の個数に対する、該計測値の中で前記有効データ値である計測値の個数の割合である有効データ割合を決定する過程と、
前記再構成された時系列データと前記有効データ割合に基づいて、前記相関関数値を算出する過程とを含むことを特徴とする方法。 - 前記相関関数値を算出した後に、
前記一単位に含まれる前記計測値の個数とは、異なる個数の計測値を一単位として、前記時系列データを分割する過程と、
該一単位に含まれる前記計測値を合算することによってデータ値を再構成する過程と、
前記再構成されたデータ値から時系列データを再構成する過程と、
各々の該再構成されたデータ値について、該データ値を得るために合算した前記計測値の個数に対する、該計測値の中で前記有効データ値である計測値の個数の割合である有効データ割合を決定する過程と、
該再構成された時系列データと該有効データ割合に基づいて、前記相関関数値を算出する過程とを含む請求項1に記載の方法。 - 前記相関関数値を算出した後に、
複数の前記データ値を一単位として、前記再構成された時系列データを分割する過程と、
前記複数のデータ値からなる一単位に含まれる、前記データ値を合算することによってデータ値を再構成する過程と、
前記再構成されたデータ値から時系列データを再構成する過程と、
各々の該再構成されたデータ値について、該データ値を得るために合算した前記計測値の個数に対する、該計測値の中で前記有効データ値である計測値の個数の割合である有効データ割合を決定する過程と、
該再構成された時系列データと該有効データ割合に基づいて、前記相関関数値を算出する過程とを含む請求項1または2に記載の方法。 - 請求項1から3の方法であって、前記相関関数値の遅延時間が大きいときの前記再構成された時系列データに含まれる前記データ値の数が、前記相関関数値の遅延時間が小さいときに比して、小さくされることを特徴とする方法。
- 請求項1から4の方法であって、前記有効データ値として決定されない前記計測値が0とされることを特徴とする方法。
- 請求項1から5の方法であって、前記放射光の強度を計測する過程に於いて、複数の前記測定ポイントにて前記放射光の強度が計測され、前記測定ポイントの各々に於ける前記放射光の強度の計測が所定時間毎に順々にあるいは同時に実行されることを特徴とする方法。
- 請求項1から6の方法であって、前記放射光の強度を計測する過程に於いて、複数の波長帯域の前記放射光の強度が計測され、前記複数の波長帯域の各々に於ける前記放射光の強度の計測が所定時間毎に順々にあるいは同時に実行されることを特徴とする方法。
- 請求項1から8の方法であって、前記試料からの放射光の強度が光学顕微鏡を用いて計測され、前記測定ポイントが前記光学顕微鏡の対物レンズの焦点領域であることを特徴とする方法。
- 請求項1から9の方法であって、前記相関関数値が前記時系列データの自己相関関数であることを特徴とする方法。
- 請求項1から9の方法であって、少なくとも二つの時系列データが構成され、前記相関関数値が前記少なくとも二つの時系列データの相互相関関数であることを特徴とする方法。
- 請求項9又は請求項9を引用する請求項10又は11の方法であって、前記光学顕微鏡がレーザー走査型共焦点光学顕微鏡の光学系を有し、前記試料に於けるレーザー光を照射した少なくとも一つの部位が前記測定ポイントとされることを特徴とする方法。
- 請求項1から12の方法であって、一つの前記測定ポイントに於いて複数の波長帯域の放射光が計測され、それぞれの前記波長帯域の前記時系列データが構成されることを特徴とする方法。
- 請求項1から13の方法であって、前記放射光が蛍光であることを特徴とする方法。
- 請求項9を引用する請求項14の方法であって、前記光学顕微鏡がレーザー共焦点光学顕微鏡の光学系を有し、複数の波長帯域のレーザー光を順々にあるいは同時に前記試料へ照射することにより、複数の波長帯域の放射光が計測され、それぞれの前記波長帯域の前記時系列データが構成されることを特徴とする方法。
- 試料からの放射光の強度を計測し該放射光の時系列データの相関関数を算出する相関分光分析を実行する光分析装置であって、
前記試料に於ける少なくとも一つの測定ポイントからの放射光の強度を連続した複数の離散時間に於いて計測する光計測部と、
前記少なくとも一つの測定ポイントに於いて計測された前記放射光の強度に基づいて相関関数値を算出する光分析部とを含み、
前記光分析部が、
前記放射光の強度の値である計測値からなる時系列データを抽出する手段と、
前記時系列データに於いて有効な値を有する有効データ値を決定する手段と、
複数の前記計測値を一単位として、前記時系列データを分割する手段と、
前記一単位に含まれる前記計測値を合算することによってデータ値を得る手段と、
前記データ値から時系列データを再構成する手段と、
各々の前記データ値について、該データ値を得るために合算した前記計測値の個数に対する、該計測値の中で前記有効データ値である計測値の個数の割合である有効データ割合を決定する手段と、
前記再構成された時系列データと前記有効データ割合に基づいて、前記相関関数値を算出する手段とを含むことを特徴とする装置。 - 前記一単位に含まれる前記計測値の個数とは、異なる個数の計測値を一単位として、前記時系列データを分割する手段と、
該一単位に含まれる前記計測値を合算することによってデータ値を再構成する手段と、
前記再構成されたデータ値から時系列データを再構成する手段と、
各々の該再構成されたデータ値について、該データ値を得るために合算した前記計測値の個数に対する、該計測値の中で前記有効データ値である計測値の個数の割合である有効データ割合を決定する手段と、
該再構成された時系列データと該有効データ割合に基づいて、前記相関関数値を算出する手段とを含む請求項16に記載の装置。 - 複数の前記データ値を一単位として、前記再構成された時系列データを分割する手段と、
前記複数のデータ値からなる一単位に含まれる、前記データ値を合算することによってデータ値を再構成する手段と、
前記再構成されたデータ値から時系列データを再構成する手段と、
各々の該再構成されたデータ値について、該データ値を得るために合算した前記計測値の個数に対する、該計測値の中で前記有効データ値である計測値の個数の割合である有効データ割合を決定する手段と、
該再構成された時系列データと該有効データ割合に基づいて、前記相関関数値を算出する手段とを含む請求項16または17に記載の方法。 - 請求項16から18の装置であって、前記相関関数値の遅延時間が大きいときの前記再構成された時系列データに含まれる前記データ値の数が、前記相関関数値の遅延時間が小さいときに比して、小さくされることを特徴とする装置。
- 請求項16から19の装置であって、前記有効データ値を決定する手段が、前記有効データ値として決定されない前記計測値を0に設定することを特徴とする装置。
- 請求項16から20の装置であって、前記光計測部が複数の前記測定ポイントにて所定時間毎に順々にあるいは同時に前記放射光の強度を計測することを特徴とする装置。
- 請求項16から21の装置であって、前記光計測部が複数の波長帯域の前記放射光の強度を所定時間毎に順々にあるいは同時に計測することを特徴とする装置。
- 請求項16から23の装置であって、前記光計測部が光学顕微鏡を含み、前記測定ポイントが前記光学顕微鏡の対物レンズの焦点領域であることを特徴とする装置。
- 請求項16から24の装置であって、前記相関関数値が前記時系列データの自己相関関数であることを特徴とする装置。
- 請求項16から25の装置であって、前記光分析部が少なくとも二つの時系列データを構成し、前記相関関数値が前記少なくとも二つの時系列データの相互相関関数であることを特徴とする装置。
- 請求項24又は請求項24を引用する請求項25又は26の装置であって、前記光学顕微鏡がレーザー走査型共焦点光学顕微鏡の光学系を有し、前記試料に於けるレーザー光を照射した少なくとも一つの部位が前記測定ポイントとされることを特徴とする装置。
- 請求項16から27の装置であって、一つの前記測定ポイントに於いて複数の波長帯域の放射光を計測し、それぞれの前記波長帯域の前記時系列データを構成することを特徴とする装置。
- 請求項16から28の装置であって、前記放射光が蛍光であることを特徴とする装置。
- 請求項24を引用する請求項29の装置であって、前記光学顕微鏡がレーザー共焦点光学顕微鏡の光学系を有し、複数の波長帯域のレーザー光を順々にあるいは同時に前記試料へ照射することにより、複数の波長帯域の放射光が計測され、それぞれの前記波長帯域の前記時系列データを構成することを特徴する装置。
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