JP2008180637A - 光信号解析方法および光信号解析装置 - Google Patents

Abstract

【課題】解析処理に要する時間が短い光信号解析装置を提供する。
【解決手段】光信号解析装置１００は、試料Ｓ内の測定点から発せられる光を検出する光検出部１３０と、光信号解析に必要な制御を行なう制御部１６０とを有している。制御部１６０に含まれる解析部は、光検出器１４２により検出される測定点からの蛍光信号に対応するデータを利用して、あらかじめ設定された遅延時間の範囲(最小遅延時間τ_ｍｉｎ＝τ０、最大遅延時間τ_ｍａｘ＝ｎτ０（ｎは自然数）)において、そのうちの一部の遅延時間（τ）における相関値Ｇ（τ）を算出し、算出した相関値Ｇ（τ）に基づいた統計値、あるいはその値を用いて擬似分子数（分子数の近似値）を算出する。
【選択図】 図１

Description

本発明は、光信号解析方法と光信号解析装置に関する。

特許文献１および非特許文献１〜３は、光信号解析方法を開示している。その光信号解析方法では、自己相関関数や相互相関関数などを推定するために、通常の測定で得られた何万〜何十万個のデータを計算に繰り返し用い、得られた相関カーブに対して最終的にフィッティングをかけて評価に必要な複数のパラメータを算出する。

非特許文献４は、画像化に用いたパラメータは空間軸に相関手法を適用させて計算し、異なる二次元平面位置における蛍光強度総和を元に、相関値を算出し、結果を等高線で表示する手法を開示している。非特許文献４の手法は、本発明のように時間軸測定データを元にする相関手法と異なる。
特開２００６−７８３７７号公報 「New Concept in Correlator Design」, Klaus Sch-tzel, Inst. Phys. Conf. Ser. No.77, P175, 1985. 「Noise on Multiple-Tau Photon Correlation Data」, Klaus Sch-tzel, SPIE Vol.1430, P109, Photon Correlation Spectroscopy: Multicomponent Systems, 1991. 「Photon Correlation Measurements at Large Lag Times」, Klaus Sch-tzel et al., Journal of Modern Optics, Vol.35, No.4, P711, 1988. 「Image Correlation Spectroscopy. II. Optimization for Ultrasensitive Detection of Preexisting Platelet-Derived Growth Factor-β Receptor Oligomers on Intace Cells.」, Paul W. Wiseman and Nils o. Petersen, Biophysical Journal, Vol.76, P963, 1999.

特許文献１および非特許文献１〜３の光信号解析方法では、一回の測定で一個所のみを測定する場合であっても、相関カーブを得るためには、大量の測定データを計算に繰り返し用いる。計算とフィッティングとパラメータ算出に要する時間は、測定点の個数が増えるにつれて倍増していく。また、パラメータ評価の精度を上げるためには、プロット値＝遅延時間を増やし、多数のプロット値＝多数の遅延時間に対して相関分析法を適用させ、何万〜何十万個のデータを繰り返し計算に用い、きれいな相関カーブを得る必要がある。このような手法は解析処理に要する時間が長く、測定点が複数ある多数パラメータを評価する領域観察への応用は実用的ではない。

本発明は、この様な実状を考慮して成されたものであり、その目的は、解析処理に要する時間が短い光信号解析装置および光信号解析方法を提供することである。

本発明による光信号解析装置は、試料内の測定点から発せられる光を検出する光検出手段と、前記光検出手段により検出される前記測定点からの蛍光信号に対応するデータを利用して、あらかじめ設定された遅延時間の範囲(最小遅延時間τ_ｍｉｎ＝τ０、最大遅延時間τ_ｍａｘ＝ｎτ０（ｎは自然数）)において、そのうちの一部の遅延時間（τ）における相関値（Ｇ（τ））に基づいた統計値、あるいはその値を用いて擬似分子数（分子数の近似値）を算出する解析手段とを含むことを特徴とする。

本発明による別の光信号解析装置は、試料内の測定点から発せられる光を検出する光検出手段と、前記光検出手段により検出される前記測定点からの蛍光信号に対応するデータを利用して、あらかじめ設定された遅延時間の範囲(最小遅延時間τ_ｍｉｎ＝τ０、最大遅延時間τ_ｍａｘ＝ｎτ０（ｎは自然数）)において、そのうちの一部の遅延時間（τ）における相関値（Ｇ（τ））に基づいた統計値、あるいはその値を用いて擬似拡散時間（拡散時間の近似値）を算出する解析手段とを含むことを特徴とする。

本発明によるまた別の光信号解析装置は、試料内の測定点から発せられる光を検出する光検出手段と、前記光検出手段により検出される前記測定点からの蛍光信号に対応するデータを利用して、前記測定点について、あらかじめ設定された蛍光強度におけるフォトンカウンティングヒストグラムを算出する解析手段とを含むことを特徴とする。

本発明による光信号解析方法は、試料内の測定点から発せられる光を検出するステップと、前記測定点からの蛍光信号に対応するデータを利用して、あらかじめ設定された遅延時間の範囲(最小遅延時間τ_ｍｉｎ＝τ０、最大遅延時間τ_ｍａｘ＝ｎτ０（ｎは自然数）)において、そのうちの一部の遅延時間（τ）における相関値（Ｇ（τ））に基づいた統計値、あるいはその値を用いて擬似分子数（分子数の近似値）を算出するステップとを含むことを特徴とする。

本発明による別の光信号解析方法は、試料内の測定点から発せられる光を検出ステップと、前記測定点からの蛍光信号に対応するデータを利用して、あらかじめ設定された遅延時間の範囲(最小遅延時間τ_ｍｉｎ＝τ０、最大遅延時間τ_ｍａｘ＝ｎτ０（ｎは自然数）)において、そのうちの一部の遅延時間（τ）における相関値（Ｇ（τ））に基づいた統計値、あるいはその値を用いて擬似拡散時間（拡散時間の近似値）を算出するステップとを含むことを特徴とする。

本発明によるまた別の光信号解析方法は、試料内の測定点から発せられる光を検出ステップと、前記測定点からの蛍光信号に対応するデータを利用して、前記測定点について、あらかじめ設定された蛍光強度におけるフォトンカウンティングヒストグラムを算出するステップとを含むことを特徴とする。

本発明によれば、解析処理に要する時間が短い光信号解析装置および光信号解析方法が提供される。

以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。

＜第一実施形態＞
擬似分子数Ｎ’によるＦＣＳ／ＦＣＣＳイメージング
本実施形態は、選定した領域内の複数の測定点においてＦＣＳ／ＦＣＣＳの分子数の近似値（擬似分子数）を算出し、これを輝度値として表示するＦＣＳ／ＦＣＣＳイメージング解析方法である。

図１は、本発明の第一実施形態による光信号解析装置を概略的に示している。図１に示すように、光信号解析装置１００は、試料Ｓに励起光を照射する光照射部１１０と、試料Ｓ内の測定点から発せられる光を検出する光検出部１３０と、光信号解析に必要な制御を行なう制御部１６０とを有している。

光照射部１１０は光源１１２とミラー１１６とダイクロイックミラー１２２とガルバノミラー１２４と対物レンズ１２６とを含んでいる。光源１１２は、試料Ｓに含まれる蛍光色素を励起して試料Ｓから光（蛍光）を発せされるための励起光を発する。ミラー１１６は、光源１１２から発せられる励起光をダイクロイックミラー１２２に向けて反射する。ダイクロイックミラー１２２は、励起光をガルバノミラー１２４に向けて反射し、試料Ｓから発せられる蛍光を透過する。ガルバノミラー１２４は、励起光を対物レンズ１２６に向けて反射するとともに、その反射方向を変更する。対物レンズ１２６は、励起光を収束して試料Ｓ内の測定点に照射するとともに、試料Ｓ内の測定点からの光を取り込む。

光検出部１３０は、対物レンズ１２６とガルバノミラー１２４とダイクロイックミラー１２２を光照射部１１０と共有している。光検出部１３０はさらに、収束レンズ１３２とピンホール１３４とコリメートレンズ１３６と蛍光フィルター１３８と収束レンズ１４０と光検出器１４２とを含んでいる。収束レンズ１３２は、ダイクロイックミラー１２２を透過した光を収束する。ピンホール１３４は、収束レンズ１３２の焦点に配置されている。つまり、ピンホール１３４は、試料Ｓ内の測定点に対して共役な位置にあり、測定点からの光だけを選択的に通す。コリメートレンズ１３６は、ピンホール１３４を通過した光を平行にする。蛍光フィルター１３８は、試料Ｓから発せられる蛍光だけを選択的に透過する。収束レンズ１４０は、蛍光フィルター１３８を透過した蛍光を収束する。収束レンズ１４０は、コリメートレンズ１３６と共同して、ピンホール１３４の像を光検出器１４２に投影する。光検出器１４２は、入射した光の強度に対応した信号を出力する。すなわち、光検出器１４２は、試料Ｓ内の測定点からの蛍光信号を出力する。

制御部１６０は例えばパーソナルコンピューターで構成される。制御部１６０は、試料Ｓの全体画像の取得と表示、観察領域の指定および最小遅延時間と最大遅延時間の設定の入力待ち、測定点の選定と位置の決定、解析（擬似分子数の算出）などを行う。

図１に示される制御部の機能ブロックを図２に示す。制御部１６０は、図２に示すように、表示部１６６と入力部１６８とミラー制御部１６２と画像形成部１６４と選定部１７０とデータ抽出部１７２と解析部１７４とを含んでいる。ミラー制御部１６２は、試料Ｓの全体画像を取得する際、励起光の照射位置を試料Ｓの全体に対してラスター走査するようにガルバノミラー１２４を制御する。画像形成部１６４は、ミラー制御部１６２から入力される励起光の照射位置の情報と光検出器１４２の出力信号とから試料Ｓの全体画像を形成する。表示部１６６は、試料Ｓの全体画像や解析結果を表示する。入力部１６８は、例えばマウスやキーボードを含み、表示部１６６と共同してＧＵＩを構成する。このＧＵＩは、観察領域の指定、最小遅延時間と最大遅延時間の設定、解析結果の表示の仕方の指定などに利用される。選定部１７０は、光信号解析に際して、指定された観察領域に対して測定点を選定し、その位置を決定する。測定点の個数は一つであっても複数であってもよい。選定部１７０は、ここでは、マトリックス状に二次元的に整列した複数の測定点（Ｐ１，Ｐ２，…，Ｐｍ）を選定する。ミラー制御部１６２は、選定部１７０によって選定された測定点（Ｐ１，Ｐ２，…，Ｐｍ）に順番に励起光を照射するようにガルバノミラー１２４を制御する。データ抽出部１７２は、光検出器１４２から出力される蛍光信号から、蛍光信号に対応する計算用のデータを抽出する。解析部１７４は、光検出器１４２により検出される測定点からの蛍光信号に対応するデータを利用して、あらかじめ設定された遅延時間の範囲(最小遅延時間τ_ｍｉｎ＝τ０、最大遅延時間τ_ｍａｘ＝ｎτ０（ｎは自然数）)において、そのうちの一部の遅延時間（τ）における相関値Ｇ（τ）を算出し、算出した相関値Ｇ（τ）に基づいた統計値、あるいはその値を用いて擬似分子数（分子数の近似値）を算出する。解析部１７４は、例えば、一つの遅延時間τにおける相関値Ｇ（τ）を算出する。解析部１７４は、ここでは、最小遅延時間τ０における相関値Ｇ（τ０）を算出する。

図１において、光源１１２から発せられた励起光は、ミラー１１６とダイクロイックミラー１２２とガルバノミラー１２４と対物レンズ１２６を経て試料Ｓ内の測定点に照射される。励起光が照射される測定点は、ガルバノミラー１２４によって、一定時間ごとに順番に変更される。励起光を受けた試料Ｓは測定点から蛍光を発する。試料Ｓからの光（蛍光のほかに不所望な反射光などを含む）は、対物レンズ１２６とガルバノミラー１２４とダイクロイックミラー１２２と収束レンズ１３２を経てピンホール１３４に至る。ピンホール１３４は測定点と共役な位置にあるため、試料Ｓ内の測定点からの光だけがピンホール１３４を通過する。ピンホール１３４を通過した光すなわち試料Ｓ内の測定点からの光はコリメートレンズ１３６を経て蛍光フィルター１３８に至り、試料Ｓ内の測定点から発せられた蛍光だけが蛍光フィルター１３８を透過する。蛍光フィルター１３８を透過した蛍光は収束レンズ１４０を経て光検出器１４２に入射する。光検出器１４２は、入射光すなわち試料Ｓ内の測定点から発せられた蛍光信号を出力する。この蛍光信号は解析部１７４に入力され、解析処理に供される。

ある観察領域内の測定点間の変化や関係の観察において、相関パラメータの近似値を用いてもよい場合が多い。本実施形態では、多数のプロット値と複数の遅延時間において、何十万個のデータを用いて繰返し相関手法を適応させるのではなく、一つのプロット値＝最小の遅延時間τ０において、データのすべてを用いて相関演算を一回だけ行ない、その演算結果に基づいて分子数Ｎの近似値である擬似分子数Ｎ’を求める。

測定点Ｐｉ（ｉはｍ以下の自然数）における自己相関解析式は、次の（１）式で表される。

ここで、Ｄｉは測定点Ｐｉにおけるデータ、Ｎ₁₂はデータの総数である。

擬似分子数Ｎ’は、最小遅延時間τ０における相関値Ｇ（τ０）を用いて、次の（２）式で表される。

本実施形態では、まず、観察領域を決め、この観察領域における測定点数を決定する。次に、観測領域と測定点数に基づいて測定するピクセル位置とスキップするピクセル数を決める。続いて、各測定点において一定時間のデータ収集を行い、データの初期処理を行う。次に、このデータを用いて最小プロット値＝最小遅延時間のみにおける相関値を計算し、分子数の近似値である擬似分子数を求める。

以下、本実施形態における光信号解析について図３のフローチャートに沿って説明する。

［ステップＳ１０１］
図４に示すように、試料Ｓの一部の領域を四角形の枠１９０で囲むことにより観察領域を指定する。

また、相関値を計算するための最小遅延時間と最大遅延時間を設定する。

［ステップＳ１０２］
画像化しようとする画像サイズに基づいて、観察領域内のピクセル数においてスキップするピクセル数を算出し、測定点の位置を決める。測定点の間隔は均一で、測定点の配置は観察領域に最大限近似するようにする。

［ステップＳ１０３］
データを読み込む。

［ステップＳ１０４］
測定点を判断し、Ｙｅｓの場合はステップＳ１０５に進み、Ｎｏの場合はステップＳ１１１に進む。

［ステップＳ１０５］
測定点Ｐｉに対して、読み込みデータ数をカウントする。

［ステップＳ１０６］
測定点ＰｉのデータＩ_ｐｉに対して、データの総和を計算する。このステップでは、読み込みデータの和計算処理を行う。

［ステップＳ１０７］
測定点ＰｉのデータＩ_ｐｉに対して、データの積和を計算する。このステップでは、ＦＣＳの最小ビンタイム＝最小遅延時間τ０において隣接するデータの積和計算処理を行う。

［ステップＳ１０８］
測定点Ｐｉでの測定が終了したか否かを判断し、Ｙｅｓの場合はステップＳ１０９に進み、Ｎｏの場合はステップＳ１０３に戻る。

［ステップＳ１０９］
測定点ＰｉのデータＩ_ｐｉに対して、相関値の計算を行う。つまり、ステップＳ１０５〜Ｓ１０７の結果を式Ｇ（τ０）＝Ｓ１０７＊Ｓ１０５／Ｓ１０６＊Ｓ１０６に代入し、最小プロット値＝最小遅延時間τ０における自己相関値を算出する。

［ステップＳ１１０］
１／［Ｇ（τ０）−１］を計算して擬似分子数Ｎ’を求める。

［ステップＳ１１１］
測定（選定した測定点における擬似分子数の計算）が終了したか否かを判断し、Ｙｅｓの場合はステップＳ１１２に進み、Ｎｏの場合はステップＳ１０３に戻る。

［ステップＳ１１２］
図５に示すように、各測定点における擬似分子数を輝度値として画像を表示する。また、必要に応じて、図６に示すように、各測定点における擬似分子数の表１９２を表示したり、画像の横軸に沿った擬似分子数の変動カーブ１９４や縦軸に沿った擬似分子数の変動カーブ１９６を表示したり、マウスで選択された測定点の擬似分子数の数値１９８をピンポイント表示したりする。

本実施形態では、擬似分子数の計算には、ただ一回の相関値の計算を要するだけであるので、高速に処理できる。各測定点での擬似分子数を輝度値として画像を表示することにより、隣接する二つの測定点間の変化や観察領域内の任意の二つの測定点間または複数の測定点間の変化を一枚の画像から相対的に観察したり評価したりすることが可能である。また、擬似分子数の表や擬似分子数の変動カーブを表示したり、選択された一つの測定点での擬似分子数をピンポイント表示したりすることにより、試料の物理的性質を多方面から観察したり評価したりすることが可能である。

＜第二実施形態＞
擬似分子拡散時間Ｄｔ’によるＦＣＳ／ＦＣＣＳイメージング
本実施形態は、選定した領域内の複数の測定点においてＦＣＳ／ＦＣＣＳ演算による拡散時間の近似値（擬似拡散時間）を算出し、これを輝度値として表示するＦＣＳ／ＦＣＣＳイメージング解析方法である。

本実施形態による光信号解析装置は基本的に第一実施形態と同じ構成である。相違部分は、解析部１７４において、複数の測定点のそれぞれにおける自己相関手法と相互相関手法による拡散時間の推定を行う点である。

つまり、解析部１７４は、光検出器１４２により検出される測定点からの蛍光信号に対応するデータを利用して、あらかじめ設定された遅延時間の範囲(最小遅延時間τ_ｍｉｎ＝τ０、最大遅延時間τ_ｍａｘ＝ｎτ０（ｎは自然数）)において、そのうちの一部の遅延時間（τ）における相関値Ｇ（τ）を算出し、算出した相関値Ｇ（τ）に基づいた統計値、あるいはその値を用いて擬似拡散時間（拡散時間の近似値）を算出する。解析部１７４は、例えば、一つの遅延時間τにおける相関値Ｇ（τ）を算出する。解析部１７４は、ここでは、最小遅延時間τ０における相関値Ｇ（τ０）を算出する。

本実施形態では、まず、観察領域を決め、この観察領域における測定点の位置を決め、各測定点において一定時間のデータ収集を行い、データの初期処理を行う。次に、このデータを用いてＦＣＳの最小プロット値＝最小遅延時間のみにおける相関値Ｇ（τ０）を求める。ここまでは第一実施形態と同様である。続いて、Ｇ（ｍ）＝［Ｇ（τ０）−１］／２を基準値としてτ＝Ｄｔ１におけるＧ（Ｄｔ１）を計算し、Ｇ（Ｄｔ１）をＧ（ｍ）に近似していく方法で擬似拡散時間Ｄｔ’を求める。

以下、本実施形態における光信号解析について図７のフローチャートに沿って説明する。

［ステップＳ２０１］
図４に示すように、試料Ｓの一部の領域を四角形の枠１９０で囲むことにより観察領域を指定する。

また、相関値を計算するための最小遅延時間と最大遅延時間を設定する。

［ステップＳ２０２］
画像化しようとする画像サイズに基づいて、観察領域内のピクセル数においてスキップするピクセル数を算出し、測定点の位置を決める。測定点の間隔は均一で、測定点の配置は観察領域に最大限近似するようにする。

［ステップＳ２０３］
データを読み込む。

［ステップＳ２０４］
測定点を判断し、Ｙｅｓの場合はステップＳ２０５に進み、Ｎｏの場合はステップＳ２１９に進む。

［ステップＳ２０５］
測定点Ｐｉに対して、読み込みデータ数をカウントする。

［ステップＳ２０６］
測定点ＰｉのデータＩ_ｐｉに対して、データの総和を計算する。このステップでは、読み込みデータの和計算処理を行う。

［ステップＳ２０７］
測定点ＰｉのデータＩ_ｐｉに対して、データの積和を計算する。このステップでは、ＦＣＳの最小プロット値＝最小遅延時間τ０において隣接するデータの積和計算処理を行う。

［ステップＳ２０８］
測定点Ｐｉでの測定が終了したか否かを判断し、Ｙｅｓの場合はステップＳ２０９に進み、Ｎｏの場合はステップＳ２０３に戻る。

［ステップＳ２０９］
測定点ＰｉのデータＩ_ｐｉに対して、相関値の計算を行う。つまり、ステップＳ２０３〜ステップＳ２０５の結果を式Ｇ（τ０）＝Ｓ２０７＊Ｓ２０５／Ｓ２０６＊Ｓ２０６に代入し、最小プロット値＝最小遅延時間τ０における自己相関値を算出する。

［ステップＳ２１０］
ステップＳ２０９で算出したＧ（τ０）を用いて、規格化基準値１との間の中間値Ｇ（ｍ）＝［Ｇ（τ０）−１］／２を算出する。

［ステップＳ２１１〜Ｓ２１８］
Ｇ（Ｄｔ１）とＧ（ｍ）の大きさを比較し、擬似拡散時間の計算を行う。つまり、二つの値の差が一定の値より小さくなった場合、Ｄｔ_ｉ＝Ｄｔ１とする。Ｄｔ１は最小遅延時間と最大遅延時間の間の範囲内の値である。

ステップＳ２１１において、Ｇ（Ｄｔ１）とＧ（ｍ）の差が一定の値δより小さいか否かを判断する。Ｙｅｓの場合は、ステップＳ２１２において、Ｄｔ_ｉ＝Ｄｔ１とし、ステップＳ２１３において、ｉ＝ｉ＋１として測定点を次の測定点に変え、ステップＳ２０３に戻る。Ｎｏの場合はステップＳ２１４に進む。

ステップＳ２１４では、Ｇ（Ｄｔ１）がＧ（ｍ）より小さいか否かを判断する。Ｙｅｓの場合は、ステップＳ２１５において、Ｇ（Ｄｔ１−τ０）を計算する。つまり、遅延時間τ＝Ｄｔ１−τ０においてデータの積和計算処理を行い、遅延時間τ＝Ｄｔ１−τ０における自己相関値を算出する。続いて、ステップＳ２１６において、Ｄｔ_ｉ＝Ｄｔ１−τ０とし、ステップＳ２１１に戻る。Ｎｏの場合は、ステップＳ２１７において、Ｇ（Ｄｔ１＋τ０）を計算する。つまり、遅延時間τ＝Ｄｔ１＋τ０においてデータの積和計算処理を行い、遅延時間τ＝Ｄｔ１＋τ０における自己相関値を算出する。続いて、ステップＳ２１８において、Ｄｔ_ｉ＝Ｄｔ１＋τ０とし、ステップＳ２１１に戻る。

［ステップＳ２１９］
測定（選定した測定点における擬似拡散時間の計算）が終了したか否かを判断し、Ｙｅｓの場合はステップＳ２２０に進み、Ｎｏの場合はステップＳ２０３に戻る。

［ステップＳ２２０］
図５と同様に、各測定点における擬似拡散時間を輝度値として画像を表示する。また、必要に応じて、図６と同様に、各測定点における擬似拡散時間の表を表示したり、画像の横軸に沿った擬似拡散時間の変動カーブや縦軸に沿った擬似拡散時間の変動カーブを表示したり、マウスで選択された測定点の擬似拡散時間の数値をピンポイント表示したりする。

本実施形態では、擬似拡散時間の計算には、数回の相関値の計算を要するだけであるので、高速に処理できる。各測定点での擬似拡散時間を輝度値として画像を表示することにより、隣接する二つの測定点間の変化や観察領域内の任意の二つの測定点間または複数の測定点間の変化を一枚の画像から相対的に観察したり評価したりすることが可能である。また、擬似拡散時間の表や擬似拡散時間の変動カーブを表示したり、選択された一つの測定点での擬似拡散時間をピンポイント表示したりすることにより、試料の物理的性質を多方面から観察したり評価したりすることが可能である。

＜第三実施形態＞
フォトンカウンティングヒストグラムによるイメージング
本実施形態は、選定した領域内の複数の測定点において蛍光強度を決め、所定強度におけるフォトンカウンティングヒストグラムを算出し、これを輝度値として表示する解析方法である。

本実施形態による光信号解析装置は基本的に第一実施形態と同じ構成である。相違部分は、解析部１７４において、複数の測定点のそれぞれにおける蛍光強度を決め、所定強度におけるフォトンカウンティングヒストグラムの計算を行う点である。

つまり、解析部１７４は、光検出器１４２により検出される測定点からの蛍光信号に対応するデータを利用して、あらかじめ設定された蛍光強度におけるフォトンカウンティングヒストグラムを算出する。

本実施形態では、まず、観察領域を決め、この観察領域における測定点の位置を決め、各測定点において一定時間のデータ収集を行う。ここまでは第一実施形態と同様である。次に、蛍光信号のある強度値を所定強度にする。続いて、所定強度におけるフォトンカウンティングヒストグラムを算出する。

以下、本実施形態における光信号解析について図８のフローチャートに沿って説明する。

［ステップＳ３０１］
図４に示すように、試料Ｓの一部の領域を四角形の枠１９０で囲むことにより観察領域を指定する。

［ステップＳ３０２］
画像化しようとする画像サイズに基づいて、観察領域内のピクセル数においてスキップするピクセル数を算出し、測定点の位置を決める。測定点の間隔は均一で、測定点の配置は観察領域に最大限近似するようにする。

［ステップＳ３０３］
蛍光信号のある強度値を所定強度に設定する。

［ステップＳ３０４］
測定点を判断し、Ｙｅｓの場合はステップＳ３０５に進み、Ｎｏの場合はステップＳ３０８に進む。

［ステップＳ３０５］
データを読み込む。

［ステップＳ３０６］
測定点ＰｉのデータＩ_ｐｉが所定強度であるか否かを判断し、Ｙｅｓの場合はステップＳ３０７に進み、Ｎｏの場合はステップＳ３０４に戻る。

［ステップＳ３０７］
測定点ＰｉのデータＩ_ｐｉに対して、所定強度におけるフォトンカウンティングヒストグラムを計算する。つまり、所定強度の出現回数を計算する。

［ステップＳ３０８］
測定（選定した測定点におけるフォトンカウンティングヒストグラムの計算）が終了したか否かを判断し、Ｙｅｓの場合はステップＳ３０９に進み、Ｎｏの場合はステップＳ３０４に戻る。

［ステップＳ３０９］
図５と同様に、各測定点におけるフォトンカウンティングヒストグラムを輝度値として画像を表示する。また、必要に応じて、図６と同様に、各測定点におけるフォトンカウンティングヒストグラムの表を表示したり、画像の横軸に沿ったフォトンカウンティングヒストグラムの変動カーブや縦軸に沿ったフォトンカウンティングヒストグラムの変動カーブを表示したり、マウスで選択された測定点のフォトンカウンティングヒストグラムの数値をピンポイント表示したりする。

本実施形態では、各測定点でのフォトンカウンティングヒストグラムを輝度値として画像を表示することにより、隣接する二つの測定点間の変化や観察領域内の任意の二つの測定点間または複数の測定点間の変化を一枚の画像から相対的に観察したり評価したりすることが可能である。また、フォトンカウンティングヒストグラムの表やフォトンカウンティングヒストグラムの変動カーブを表示したり、選択された一つの測定点でのフォトンカウンティングヒストグラムをピンポイント表示したりすることにより、試料の物理的性質を多方面から観察したり評価したりすることが可能である。また、フォトンカウンティングヒストグラムを用いているため、分子種の明るさ、濃度など相関演算による解析とは異なるパラメーターでの評価が可能である。

本実施形態において、ステップＳ３０３において設定する蛍光強度値は複数であってもよい。

これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。

本発明の第一実施形態による光信号解析装置を概略的に示している。 図１に示される制御部の機能ブロック図である。 第一実施形態における光信号解析のフローチャートである。 試料Ｓと観察領域を示している。 各測定点における擬似分子数を輝度値として表示した画像を示している。 図５に示した画像に加えて、擬似分子数の表と、擬似分子数の変動カーブと、一つの測定点の擬似分子数の数値とを示している。 第二実施形態における光信号解析のフローチャートである。 第三実施形態における光信号解析のフローチャートである。

符号の説明

１００…光信号解析装置、１１０…光照射部、１１２…光源、１１６…ミラー、１２２…ダイクロイックミラー、１２４…ガルバノミラー、１２６…対物レンズ、１３０…光検出部、１３２…収束レンズ、１３４…ピンホール、１３６…コリメートレンズ、１３８…蛍光フィルター、１４０…収束レンズ、１４２…光検出器、１６０…制御部、１６２…ミラー制御部、１６４…画像形成部、１６６…表示部、１６８…入力部、１７０…選定部、１７２…データ抽出部、１７４…解析部、１９０…枠、１９２…表、１９４…変動カーブ、１９６…変動カーブ、１９８…数値。

Claims (32)

1. 試料内の測定点から発せられる光を検出する光検出手段と、
   前記光検出手段により検出される前記測定点からの蛍光信号に対応するデータを利用して、あらかじめ設定された遅延時間の範囲(最小遅延時間τ_ｍｉｎ＝τ０、最大遅延時間τ_ｍａｘ＝ｎτ０（ｎは自然数）)において、そのうちの一部の遅延時間（τ）における相関値（Ｇ（τ））に基づいた統計値、あるいはその値を用いて擬似分子数（分子数の近似値）を算出する解析手段とを含むことを特徴とする光信号解析装置。
2. 前記解析手段は、一つの遅延時間（τ）の一点に関する相関分析法を適用し、前記一つの遅延時間（τ）の一点における相関値により前記擬似分子数を算出することを特徴とする請求項１に記載の光信号解析装置。
3. 前記一つの遅延時間は、最小遅延時間（τ０）であることを特徴とする請求項２に記載の光信号解析装置。
4. 前記擬似分子数を輝度値として画像を表示する表示手段をさらに有することを特徴とする請求項１〜３に記載の光信号解析装置。
5. 観察領域を指定する領域指定手段と、前記観察領域に対して一つまたは複数の測定点を選定する選定手段をさらに有することを特徴とする請求項１〜４に記載の光信号解析装置。
6. 前記解析手段は、前記選定手段によって選定された測定点について前記擬似分子数を算出することを特徴とする請求項１に記載の光信号解析装置。
7. 試料内の測定点から発せられる光を検出する光検出手段と、
   前記光検出手段により検出される前記測定点からの蛍光信号に対応するデータを利用して、あらかじめ設定された遅延時間の範囲(最小遅延時間τ_ｍｉｎ＝τ０、最大遅延時間τ_ｍａｘ＝ｎτ０（ｎは自然数）)において、そのうちの一部の遅延時間（τ）における相関値（Ｇ（τ））に基づいた統計値、あるいはその値を用いて擬似拡散時間（拡散時間の近似値）を算出する解析手段とを含むことを特徴とする光信号解析装置。
8. 前記解析手段は、一つの遅延時間（τ）の一点に関する相関分析法を適用し、前記一つの遅延時間（τ）の一点における相関値により前記擬似拡散時間を算出することを特徴とする請求項７に記載の光信号解析方法。
9. 前記一つの遅延時間は、最小遅延時間（τ０）であることを特徴とする請求項８に記載の光信号解析装置。
10. 前記擬似拡散時間を輝度値として画像を表示する表示手段をさらに有することを特徴とする請求項７〜９に記載の光信号解析装置。
11. 観察領域を指定する領域指定手段と、前記観察領域に対して一つまたは複数の測定点を選定する選定手段をさらに有することを特徴とする請求項７〜１０に記載の光信号解析装置。
12. 前記解析手段は、前記選定手段によって選定された測定点について前記擬似拡散時間を算出することを特徴とする請求項７に記載の光信号解析装置。
13. 試料内の測定点から発せられる光を検出する光検出手段と、
    前記光検出手段により検出される前記測定点からの蛍光信号に対応するデータを利用して、前記測定点について、あらかじめ設定された蛍光強度におけるフォトンカウンティングヒストグラムを算出する解析手段とを含むことを特徴とする光信号解析装置。
14. 前記フォトンカウンティングヒストグラムを輝度値として画像を表示する表示手段をさらに有することを特徴とする請求項１３に記載の光信号解析装置。
15. 観察領域を指定する領域指定手段と、前記観察領域に対して一つまたは複数の測定点を選定する選定手段をさらに有することを特徴とする請求項１３に記載の光信号解析装置。
16. 前記解析手段は、前記選定手段によって選定された測定点について前記フォトンカウンティングヒストグラムを算出することを特徴とする請求項１３に記載の光信号解析装置。
17. 試料内の測定点から発せられる光を検出するステップと、
    前記測定点からの蛍光信号に対応するデータを利用して、あらかじめ設定された遅延時間の範囲（最小遅延時間τ_ｍｉｎ＝τ０、最大遅延時間τ_ｍａｘ＝ｎτ０（ｎは自然数））において、そのうちの一部の遅延時間（τ）における相関値（Ｇ（τ））に基づいた統計値、あるいはその値を用いて擬似分子数（分子数の近似値）を算出するステップとを含むことを特徴とする光信号解析方法。
18. 前記擬似分子数は、一つの遅延時間（τ）の一点に関する相関分析法を適用し、前記一つの遅延時間（τ）の一点における相関値により算出することを特徴とする請求項１７に記載の光信号解析方法。
19. 前記一つの遅延時間は、最小遅延時間（τ０）であることを特徴とする請求項１８に記載の光信号解析方法。
20. 前記擬似分子数を輝度値として画像を表示することを特徴とする請求項１７〜１９に記載の光信号解析方法。
21. 観察領域を指定し、前記観察領域に対して一つまたは複数の測定点を選定することを特徴とする請求項１７〜２０に記載の光信号解析方法。
22. 選定した測定点について前記擬似分子数を算出することを特徴とする請求項１７に記載の光信号解析方法。
23. 試料内の測定点から発せられる光を検出ステップと、
    前記測定点からの蛍光信号に対応するデータを利用して、あらかじめ設定された遅延時間の範囲(最小遅延時間τ_ｍｉｎ＝τ０、最大遅延時間（τ_ｍａｘ＝ｎτ０（ｎは自然数）)において、そのうちの一部の遅延時間（τ）における相関値（Ｇ（τ））に基づいた統計値、あるいはその値を用いて擬似拡散時間（拡散時間の近似値）を算出するステップとを含むことを特徴とする光信号解析方法。
24. 前記擬似拡散時間は、一つの遅延時間（τ）の一点に関する相関分析法を適用し、前記一つの遅延時間（τ）の一点における相関値により算出することを特徴とする請求項２３に記載の光信号解析方法。
25. 前記一つの遅延時間は、最小遅延時間（τ０）であることを特徴とする請求項２４に記載の光信号解析方法。
26. 前記擬似拡散時間を輝度値として画像を表示することを特徴とする請求項２３〜２５に記載の光信号解析方法。
27. 観察領域を指定し、前記観察領域に対して一つまたは複数の測定点を選定することを特徴とする請求項２３〜２６に記載の光信号解析方法。
28. 選定した測定点について前記擬似拡散時間を算出することを特徴とする請求項２３に記載の光信号解析方法。
29. 試料内の測定点から発せられる光を検出ステップと、
    前記測定点からの蛍光信号に対応するデータを利用して、前記測定点について、あらかじめ設定された蛍光強度におけるフォトンカウンティングヒストグラムを算出するステップとを含むことを特徴とする光信号解析方法。
30. 前記フォトンカウンティングヒストグラムを輝度値として画像を表示することを特徴とする請求項２９に記載の光信号解析方法。
31. 観察領域を指定し、前記観察領域に対して一つまたは複数の測定点を選定することを特徴とする請求項２９〜３０に記載の光信号解析方法。
32. 選定した測定点について前記フォトンカウンティングヒストグラムを算出することを特徴とする請求項２９〜３１に記載の光信号解析方法。

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