JP2018512609A - 顕微鏡を基体上に自動的に合焦するための方法、システム、及び装置 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる2015年2月18日に出願された米国特許仮出願第62/117,858号の利益を主張するものである。
本発明の実施形態に係る方法は、顕微鏡において基体(例えば、顕微鏡スライド)が存在するかどうかを自動的に検出し、顕微鏡において基体がイメージング分析のために適正に配向されるかどうかを判定し、顕微鏡を基体上に配置される試験片上に合焦し、試験片の1つ又は複数のイメージを収集するために用いられてよい。一部の実施形態では、対象となる方法は、自動機器を用いて実施することができ、機器は、方法ステップのそれぞれを自動的に実施するように構成される。一部の実施形態では、対象となる方法の1つ又は複数のステップは、手動で、例えば、オペレータによって実施することができる。例えば、一部の実施形態では、オペレータは、対象となる方法の一部を実施してよく、残りの方法ステップは、例えば、対象となる方法ステップの少なくとも一部を実施するように構成される自動機器を用いて実施されてよい。対象となる方法の態様が以下でさらに詳しく説明される。
本発明の態様は、対象となる方法を実施する、例えば、顕微鏡を試験片上に自動的に合焦し、試験片のデジタルイメージを収集するように構成されたシステム及びその装置を含む。対象となるシステム及び方法の種々のコンポーネントが以下で詳細に説明される。
実施例1:顕微鏡を試験片上に自動的に合焦し、試験片の合焦されたデジタルイメージを収集する
生物学的試験片が、図4に描画されるように2つの非反射性領域を含む基体の上側に配置される。試験片は、試験片内の複数の細胞をそれらの視覚識別を容易にするために染色する染色手順を受ける。次いで、基体が図3に描画される顕微鏡システムの試験片ホルダ上に配置され、システムを制御し自動フォーカス手順を実施するように構成されるコンピュータプロセッサ上で、自動フォーカス手順が開始される。
Claims (52)
- 顕微鏡を試験片上に自動的に合焦するための方法であって、
試験片を含む基体を顕微鏡の光軸に実質的に垂直に配置することと、
反射光ビームを生成するべく光源からの光ビームを前記試験片に反射するように誘導することと、
前記基体と前記顕微鏡の対物レンズとの間の距離を変化させることと、
前記反射光ビームの1つ又は複数の特徴の複数の測定値を検出器で収集することと、この場合、前記複数の測定値のそれぞれは、前記基体が前記対物レンズに対して前記顕微鏡の光軸に沿った異なる位置にあるときに収集され、
どの測定値が最適なF値を有するかを判定することと、
前記基体及び/又は前記対物レンズを、前記反射光ビームに関する測定値が最適なF値を有する前記基体と前記対物レンズとの間の距離に対応する最初の焦点位置に移動させることと、
前記基体及び/又は前記対物レンズを光軸に沿って前記最初の焦点位置よりも上及び/又は下に移動させることによって前記基体の複数のデジタルイメージを収集することと、
各イメージに関するフォーカスメトリックを判定するために少なくとも各イメージ内の関心領域を分析することと、
どのデジタルイメージが最良のフォーカスメトリックを有するかを判定することと、
前記顕微鏡を前記試験片上に自動的に合焦するために最良のフォーカスメトリックを有するイメージの位置に対応する最終焦点位置に前記基体及び/又は前記対物レンズを移動させることと、
を含む方法。 - 前記光源がレーザを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記光源が発光ダイオード(LED)を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 平行光ビームをもたらすべく前記光源からの光ビームを整形することを含む、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 前記顕微鏡が、自動合焦に用いられる第1の光源とイメージングに用いられる第2の光源との2つの別個の光源を備える、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 前記第1の光源からの光ビームを前記第2の光源からの光ビームに対してスペクトルシフトすることを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記第1の光源が、360nm〜1,000nmのスペクトル範囲内の放射波長を有するレーザ又はLEDであり、前記第2の光源が、390nm〜700nmのスペクトル範囲内の放射波長を有する白色光源である、請求項5に記載の方法。
- 前記顕微鏡が少なくとも2つの別個の検出チャネルを備え、第1の検出チャネルは自動合焦に用いられ、第2の検出チャネルはイメージングに用いられ、前記方法が、自動合焦に用いられる反射光ビームを前記イメージングに用いられる第2の検出チャネルから分離することを含む、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記顕微鏡が、自動合焦に用いられる第1の検出チャネルと、前記試験片から来る光ビームの少なくとも一部を収集するのに用いられる8つまでの異なるイメージング検出チャネルを備える、請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 前記反射光ビームを生成するべく第1の光源からの光ビームを前記試験片に反射するように誘導することが、前記光ビームを前記試験片上に合焦するべく前記対物レンズの後ろの射出瞳を通して導入し、前記射出瞳の後ろで同じ対物レンズを通過する反射光ビームを収集することを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記反射光ビームを生成するべく光源からの光ビームを前記試験片に反射するように誘導することが、前記光ビームを前記対物レンズに面する前記試験片の前面から反射させることを含む、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 前記反射光ビームを生成するべく光源からの光ビームを前記試験片に反射するように誘導することが、前記光ビームを前記対物レンズとは反対方向に面する前記試験片の底面から反射させることを含む、請求項1〜11のいずれかに記載の方法。
- 前記自動合焦に用いられる検出チャネルがフォトダイオードを含む、請求項8に記載の方法。
- 前記イメージングに用いられる検出チャネルがイメージセンサ装置又はCCDカメラを含む、請求項8に記載の方法。
- 前記イメージセンサ装置が、カラーイメージセンサ装置又はカラーCCDカメラである、請求項14に記載の方法。
- 前記試験片のデジタルイメージが、前記カラーイメージセンサ装置又はRGB CCDカメラによって収集される赤色、緑色、及び青色(RGB)光から形成される合成イメージである、請求項15に記載の方法。
- 前記反射光ビームを前記検出器上に合焦するために前記対物レンズの後ろ側に集束レンズを配置することを含む、請求項1〜16のいずれかに記載の方法。
- 前記方法が、前記試験片の焦点面よりも上又は下に存在する1つ又は複数の境界面から反射される焦点が合っていない光ビームを遮断するべく集束レンズの焦点面の空間開口を検出器の前に配置することを含む、請求項1〜17のいずれかに記載の方法。
- 前記空間開口が可変の直径を有し、前記方法が前記空間開口の直径を変化させることを含む、請求項18に記載の方法。
- どの測定値が最適なF値を有するかを判定することが、前記反射光ビームの強度を測定することを含む、請求項1〜19のいずれかに記載の方法。
- どのデジタルイメージが最良のフォーカスメトリックを有するかを判定することが、赤色、緑色、又は青色のデジタルイメージの強度をピクセル毎に測定することを含む、請求項16に記載の方法。
- どのデジタルイメージが最良のフォーカスメトリックを有するかを判定することが、グレースケールイメージの強度をピクセル毎に測定することを含む、請求項1〜21のいずれかに記載の方法。
- どのイメージが最良のフォーカスメトリックを有するかを判定することが、前記デジタルイメージの強度の第1の微分をピクセル毎に計算することを含む、請求項1〜22のいずれかに記載の方法。
- どのイメージが最良のフォーカスメトリックを有するかを判定することが、前記デジタルイメージの強度の第2の微分をピクセル毎に計算することを含む、請求項1〜23のいずれかに記載の方法。
- どのイメージが最良のフォーカスメトリックを有するかを判定することが、デジタル化された強度イメージのフーリエ変換を計算することを含む、請求項1〜24のいずれかに記載の方法。
- 前記基体がガラススライドを含む、請求項1〜25のいずれかに記載の方法。
- 前記試験片が生体サンプルを含む、請求項1〜26のいずれかに記載の方法。
- 前記試験片の少なくとも一部が可変の厚さを有する、請求項1〜27のいずれかに記載の方法。
- 前記試験片の少なくとも一部が不規則な表面を有する、請求項1〜28のいずれかに記載の方法。
- 前記試験片の少なくとも一部が可変の反射率値を有する、請求項1〜29のいずれかに記載の方法。
- 前記試験片が、前記基体の1つ又は複数の寸法にわたる可変のイメージコンテンツを有する、請求項1〜30のいずれかに記載の方法。
- 前記基体と前記対物レンズとの間の距離を変化させることが、前記基体及び/又は前記対物レンズを可変の速度で移動させることを含む、請求項1〜31のいずれかに記載の方法。
- 前記基体と前記対物レンズとの間の距離を変化させることが、前記基体及び/又は前記対物レンズを一定の速度で移動させることを含む、請求項1〜31のいずれかに記載の方法。
- 前記対物レンズに対する光軸に沿った複数の位置から前記試験片の複数のイメージを収集することが、前記基体及び/又は前記対物レンズを複数のステップで移動させることを含み、各ステップは前記顕微鏡の被写界深度に等しい、請求項1〜33のいずれかに記載の方法。
- 前記顕微鏡の被写界深度が、0.15μm〜10μmの範囲である、請求項34に記載の方法。
- 前記最初の焦点位置の不確定性区間をイメージングに用いられる前記対物レンズの被写界深度で割ることによって、最良の焦点位置を見つけるために収集するイメージの数を決定することを含む、請求項34に記載の方法。
- 前記最良の焦点位置を見つけるために収集される前記試験片のイメージの数が、3〜10の範囲である、請求項36に記載の方法。
- 前記顕微鏡を前記基体上の場所に自動的に合焦するのに必要とされる時間の量が2秒以下である、請求項1〜37のいずれかに記載の方法。
- 顕微鏡において基体が存在するかどうかを判定するための方法であって、
光源からの光ビームを、基体が存在する場合に前記基体が反射光ビームを生成することが見出されるべき場所へ誘導することと、
前記反射光ビームの強度を検出器で測定することと、
前記顕微鏡において前記基体が存在するかどうかを判定するために前記反射光ビームの強度が閾値を超過するかどうかを判定することと、
を含む方法。 - 顕微鏡における基体の配向を自動的に分析するための方法であって、
平坦な表面を含む基体を顕微鏡の光軸に実質的に垂直に配置することと、
2つの反射光ビームを生成するべく光源からの光ビームを前記平坦な表面上の第1の位置及び第2の異なる位置に順次に反射するように誘導することと、この場合、前記第1の位置は非反射性領域を含み、前記第2の位置は反射性領域を含み、
前記基体と前記顕微鏡の対物レンズとの間の距離を変化させることと、
前記2つの反射光ビームの1つ又は複数の特徴の複数の測定値を検出器で収集することと、この場合、前記複数の測定値のそれぞれは、前記基体が前記対物レンズに対して前記顕微鏡の光軸に沿った異なる位置にあるときに収集され、
前記2つの反射光ビームの測定値が閾値を超過する量だけ互いに異なるかどうかを判定することと、
前記2つの反射光ビームの測定値が閾値を超過する量だけ互いに異なる場合に、前記顕微鏡において前記基体が適正に配向されると判定することと、
前記2つの反射光ビームの測定値が閾値を超過する量だけ互いに異ならない場合に、前記顕微鏡において前記基体が不適正に配向されると判定することと、
を含む方法。 - 前記2つの反射光ビームの1つ又は複数の特徴の複数の測定値を収集することが、前記2つの反射光ビームの強度を測定することを含む、請求項40に記載の方法。
- 集束レンズ及び空間開口を前記検出器の前に配置することを含む、請求項41に記載の方法。
- 前記光源からの光ビームが、紫外(UV)光、可視光、又は赤外(IR)光を含む、請求項40〜42のいずれかに記載の方法。
- 前記基体がガラススライドを含む、請求項40〜43のいずれかに記載の方法。
- 前記光源がレーザを含む、請求項40〜44のいずれかに記載の方法。
- 前記光源が発光ダイオード(LED)を含む、請求項40〜45のいずれかに記載の方法。
- 平行光ビームをもたらすべく前記光源からの光ビームを整形することを含む、請求項40〜46のいずれかに記載の方法。
- 前記基体と前記対物レンズとの間の距離を変化させることが、前記基体及び/又は前記対物レンズを可変の速度で移動させることを含む、請求項40〜47のいずれかに記載の方法。
- 前記基体と前記対物レンズとの間の距離を変化させることが、前記基体及び/又は前記対物レンズを一定の速度で移動させることを含む、請求項40〜48のいずれかに記載の方法。
- 前記顕微鏡における前記基体の配向を自動的に分析するのに必要とされる時間の量が1秒以下である、請求項40〜49のいずれかに記載の方法。
- 顕微鏡を試験片上に自動的に合焦するための方法であって、
第1の反射光ビームを生成するべく光源からの第1の光ビームを第1の位置で基体に反射するように誘導することと、
前記第1の反射光ビームの強度を検出器で測定することと、
顕微鏡において基体が存在することを判定するために前記第1の反射光ビームの強度が閾値を超過することを判定することと、
第2の反射光ビームを生成するべく前記光源からの第2の光ビームを第2の異なる位置で前記基体に反射するように誘導することと、この場合、前記第2の位置は非反射性領域を含み、
前記基体と前記顕微鏡の対物レンズとの間の距離を変化させることと、
前記第1及び前記第2の反射光ビームの1つ又は複数の特徴の複数の測定値を検出器で収集することと、この場合、前記複数の測定値のそれぞれは、前記基体が前記対物レンズに対して前記顕微鏡の光軸に沿った異なる位置にあるときに収集され、
前記第1の反射光ビームの測定値が前記第2の反射光ビームの測定値とは閾値を超過する量だけ異なることを判定し、これにより、前記顕微鏡において前記基体が適正に配向されると判定することと、
前記第1の反射光ビームの1つ又は複数の特徴の複数の測定値を検出器で収集することと、この場合、前記複数の測定値のそれぞれは、前記基体が前記対物レンズに対して前記顕微鏡の光軸に沿った異なる位置にあるときに収集され、
どの測定値が最適なF値を有するかを判定することと、
前記基体及び/又は前記対物レンズを、前記第1の反射光ビームに関する測定値が最適なF値を有する前記基体と前記対物レンズとの間の距離に対応する最初の焦点位置に移動させることと、
前記基体及び/又は前記対物レンズを光軸に沿って前記最初の焦点位置よりも上及び/又は下に移動させることによって前記基体の複数のデジタルイメージを収集することと、
各イメージに関するフォーカスメトリックを判定するために少なくとも各イメージ内の関心領域を分析することと、
どのデジタルイメージが最良のフォーカスメトリックを有するかを判定することと、
前記顕微鏡を前記試験片上に自動的に合焦するために最良のフォーカスメトリックを有するイメージの位置に対応する最終焦点位置に前記基体及び/又は前記対物レンズを移動させることと、
を含む方法。 - 前記顕微鏡を前記試験片上に自動的に合焦するのに必要とされる時間の量が2秒以下である、請求項51に記載の方法。
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