CN107407551B - 用于使显微镜自动聚焦到基片上的方法、系统及装置 - Google Patents

Abstract

提供了一种用于使显微镜自动聚焦到样本上并采集所述样本的已聚焦图像的方法、系统及装置。所述方法的各个方面包括：在显微镜中检测基片的存在、判定所述基片是否处于用于成像的正确定向上、使所述显微镜聚焦到放置在所述基片上的样本上、以及采集所述样本的一个或多个图像。还提供了用于执行所述主题方法的系统和装置。

Description

用于使显微镜自动聚焦到基片上的方法、系统及装置

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年2月18日提交的申请号为62/117，858的美国临时专利申请的权益，该申请的全部内容通过引用并入本文。

背景技术

使用显微镜对样本进行自动化成像需要快速且准确地确定多个不同基片的任何一个的最佳焦点位置。此外，自动化成像系统必须能够可靠地处理不同的样本类型，该样本的图像内容在基片上可能是可变的。另外，自动化成像技术需要能够确定显微镜中是否存在基片，以及基片是否被正确地定向以用于成像。主题系统和方法解决了这些和其它需求。

发明内容

提供了一种用于使显微镜自动聚焦到样本上并采集样本的已聚焦图像的方法、系统及装置。该方法的各个方面包括：在显微镜中检测基片的存在，确定基片是否处于用于成像的正确定向，将显微镜聚焦在被安装在基片上的样本上，以及采集样本的一个或多个图像。还提供了用于实施主题方法的系统和装置。

在一些实施例中，用于使显微镜自动聚焦到样本上的方法包括将基片基本上垂直于显微镜的光轴放置，其中该基片包括样本；引导来自光源的光束从样本反射以产生反射光束；改变基片与显微镜的物镜之间的距离；利用检测器采集反射光束的一个或多个特性的多个测量值，其中在基片相对于物镜位于沿着显微镜的光轴的不同位置时采集多个测量值中的每一个测量值；确定哪个测量值具有最佳焦距值；将基片和/或物镜移动到对应于基片和物镜之间对反射光束的测量值具有最佳焦距值的距离的初始聚焦位置；通过沿着光轴在该初始聚焦位置上方和/或下方移动基片和/或物镜来采集基片的多个数字图像；分析每个图像中的至少一个兴趣区域以确定每个图像的焦点度量；确定哪个数字图像具有最佳焦点度量；以及将基片和/或物镜移动到最终聚焦位置，所述最终聚焦位置对应于具有使显微镜自动聚焦到样本上的最佳焦点度量的图像的位置。

在一些实施例中，光源包括激光器。在一些实施例中，光源包括发光二极管(LED)。在一些实施例中，该方法包括对来自光源的光束成形以产生准直光束。在一些实施例中，显微镜包括两个单独的光源，用于自动调焦的第一光源和用于成像的第二单独光源。在一些实施例中，该方法包括相对于来自第二光源的光束将来自第一光源的光束进行光谱移位。在一些实施例中，第一光源为发射波长在360nm至1000nm的光谱范围内任意处的激光器或LED，第二光源为发射波长在390nm至700nm的光谱范围内任意处的白光源。

在一些实施例中，显微镜包括至少两个单独的检测通道，其中第一检测通道用于自动调焦，并且第二单独检测通道用于成像，并且其中该方法包括从用于成像的第二个检测通道分离出用于进行自动调焦的反射光束。在一些实施例中，显微镜包括用于自动调焦的第一检测通道和用于采集来自样本的光束的至少一部分的多达8个不同的成像检测通道。在一些实施例中，引导来自第一光源的光束从样本反射以产生反射光束包括通过物镜后部的出射光瞳引入光束以聚焦在样本上，并采集穿过出射光瞳后部的相同物镜的反射光束。在一些实施例中，引导来自光源的光束从样本反射以产生反射光束包括从样本面向物镜的前表面反射光束。在一些实施例中，引导来自光源的光束从样本反射以产生反射光束包括从样本面向物镜的相反方向的底表面反射光束。

在一些实施例中，用于自动调焦的检测通道包括光电二极管。在一些实施例中，用于成像的检测通道包括图像传感器装置或CCD相机。在一些实施例中，图像传感器装置为彩色图像传感器装置或彩色CCD相机。在一些实施例中，样本的数字图像是由彩色图像传感器装置或RGB CCD相机采集的红色、绿色和蓝色(RGB)光形成的合成图像。

在一些实施例中，该方法包括将聚焦透镜放置在物镜的后侧以将反射光束聚焦在检测器上。在一些实施例中，该方法包括将空间孔放置在检测器前面的聚焦透镜的焦平面中，以阻挡从位于样本的焦平面上方或下方的一个或多个界面反射的离焦光束。在一些实施例中，空间孔具有可变直径，并且该方法包括改变空间孔的直径。

在一些实施例中，确定具有最佳焦距值的测量值包括测量反射光束的强度。在一些实施例中，确定具有最佳焦点度量的数字图像包括在逐像素的基础上测量红色、绿色或蓝色数字图像的强度。在一些实施例中，确定具有最佳焦点度量的数字图像包括在逐像素的基础上测量灰度图像的强度。在一些实施例中，确定具有最佳焦点度量的图像包括在逐像素的基础上计算数字图像的强度的一阶导数。在一些实施例中，确定具有最佳焦点度量的图像包括在逐像素的基础上计算数字图像的强度的二阶导数。在一些实施例中，确定具有最佳焦点度量的图像包括计算数字化强度图像的傅里叶变换。

在一些实施例中，基片包括载玻片。在一些实施例中，样本包括生物样本。在一些实施例中，样本的至少一部分具有可变的厚度。在一些实施例中，样本的至少一部分具有不规则表面。在一些实施例中，样本的至少一部分具有可变的反射率值。在一些实施例中，样本在基片的一个或多个尺寸上具有可变的图像内容。

在一些实施例中，改变基片与物镜之间的距离包括以可变速率移动基片和/或物镜。在一些实施例中，改变基片与物镜之间的距离包括以恒定速率移动基片和/或物镜。在一些实施例中，相对于物镜从沿着光轴的多个位置采集样本的多个图像包括以多个梯级移动基片和/或物镜，其中每个梯级等于显微镜的物镜的景深。在一些实施例中，显微镜的物镜的景深范围为0.15μm至10μm。

在一些实施例中，该方法包括通过将初始聚焦位置的不确定度区间除以用于成像的物镜的景深来确定要采集的用于找到最佳聚焦位置的图像的数量。在一些实施例中，所采集的样本的图像的数量的范围为3至10。在一些实施例中，使显微镜自动聚焦到基片上的位置所需的时间量为2秒或更短。

在一些实施例中，该方法包括将来自光源的光束引导至如果存在基片则其应当被发现以产生反射光束的位置；利用检测器测量反射光束的强度；以及确定反射光束的强度是否超过阈值以确定显微镜中是否存在基片。

在一些实施例中，该方法包括将基片基本上垂直于显微镜的光轴放置，其中该基片包括平坦表面；引导来自光源的光束顺序地从该平坦表面上的第一位置和第二不同位置反射以产生两个反射光束，其中第一位置包括非反射区域，第二位置包括反射区域；改变基片与显微镜的物镜之间的距离；利用检测器采集两个反射光束的一个或多个特性的多个测量值，其中在基片相对于物镜处于沿着显微镜的光轴的不同位置时采集多个测量值中的每一个测量值；确定两个反射光束的测量值彼此相差的量是否超过阈值；如果两个反射光束的测量值彼此相差的量超过该阈值，则确定该基片在显微镜中被正确地定向；并且如果两个反射光束的测量值彼此相差的量未超过该阈值，则确定该基片在显微镜中被错误地定向。

在一些实施例中，采集两个反射光束的一个或多个特性的多个测量值包括测量两个反射光束的强度。在一些实施例中，该方法包括将聚焦透镜和空间孔放置在检测器的前面。

在一些实施例中，来自光源的光束包括紫外(UV)光、可见光或红外(IR)光。在一些实施例中，基片包括载玻片。在一些实施例中，光源包括激光器。在一些实施例中，光源包括发光二极管(LED)。

在一些实施例中，该方法包括对来自光源的光束成形以产生准直光束。在一些实施例中，改变基片与物镜之间的距离包括以可变速率移动基片和/或物镜。在一些实施例中，改变基片与物镜之间的距离包括以恒定速率移动基片和/或物镜。在一些实施例中，自动分析显微镜中的基片定向所需的时间量为1秒或更短。

在一些实施例中，该方法包括引导来自光源的第一光束在第一位置处从基片反射以产生第一反射光束；利用检测器测量第一反射光束的强度；确定第一反射光束的强度超过阈值以确定在显微镜中存在基片；引导来自光源的第二光束在第二不同位置处从基片反射以产生第二反射光束，其中该第二位置包括非反射区域；改变基片与显微镜的物镜之间的距离；利用检测器采集第一反射光束和第二反射光束的一个或多个特性的多个测量值，其中在基片相对于物镜处于沿着显微镜的光轴的不同位置时采集多个测量值中的每一个测量值；确定第一反射光束的测量值与第二反射光束的测量值的相差量超过阈值，从而确定基片在显微镜中被正确地定向；利用检测器采集第一反射光束的一个或多个特性的多个测量值，其中在基片相对于物镜处于沿着显微镜的光轴的不同位置时采集多个测量值中的每一个测量值；确定哪个测量值具有最佳焦距值；将基片和/或物镜移动到对应于基片和物镜之间对第一反射光束的测量值具有最佳焦距值的距离的初始聚焦位置；通过沿着光轴在该初始聚焦位置上方和/或下方移动基片和/或物镜来采集基片的多个数字图像；分析每个图像中的至少一个兴趣区域以确定每个图像的焦点度量；确定哪个数字图像具有最佳焦点度量；以及将基片和/或物镜移动到最终聚焦位置，所述最终聚焦位置对应于具有使显微镜自动聚焦到样本上的最佳焦点度量的图像的位置。在一些实施例中，使显微镜自动聚焦到样本上所需的时间为2秒或更短。

附图说明

结合附图阅读下面的详细描述，可以最好地理解本发明。包含在附图中的图形如下：

图1是示出反射光信号以根据从基片反射采集的光电二极管计数为单位作为基片的z轴位置的函数的曲线图，其中z轴平行于显微镜的光轴。

图2是示出由于噪声在确定光电二极管信号中的峰值位置的z坐标中的不确定度区间或搜索区间的曲线图。

图3是根据本发明的实施例的光学系统的示意图。

图4是包括两个非反射标记的基片的图。

具体实施方式

提供了一种用于使显微镜自动聚焦到样本上并采集样本的聚焦图像的方法、系统及装置。该方法的各个方面包括：在显微镜中检测基片的存在，确定基片是否处于用于成像的正确的定向，将显微镜聚焦在设置在基片上的样本上，以及采集样本的一个或多个图像。还提供了用于实施主题方法的系统和装置。

在更详细地描述本发明之前，应当理解的是，本发明不限于所描述的特定实施例，因为这些当然会发生变化。还应当理解的是，本文使用的术语仅仅是为了描述特定的实施例，而并非是要限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限制。

在提供数值的范围的情况下，应当理解的是，除非上下文另有明确规定，否则至该下限单位的十分之一，在该范围的上限和下限之间的每个中间值，以及任何其它所述的或在该范围内的中间值都包含在本发明内。这些更小范围的上限和下限可以被独立地包含在该更小范围内，并且还包括在本发明内，受规定范围中的任何具体排除的限值的限制。在规定的范围包括限值的其中之一或两者的情况下，超出这些所包括的限值的任一或两者外的范围也包含在本发明中。

本文给出了某些范围，其数值前为术语“约”。术语“约”在本文中用于为其后的确切数字提供文字支持，以及提供接近或近似该术语后的数字的数字。在确定数字是接近或近似具体列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在其出现的上下文中提供具体列举的数字的实质上相等的数字。

除非另有定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然类似或等同于本文所述的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试，但是现在描述代表性的说明性方法和材料。

本说明书中引用的所有出版物和专利通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利被具体和单独地指示通过引用并入，并且通过引用并入本文以公开和描述与引用出版物有关的方法和/或材料。任何出版物的引用是因为其公开于提交日期之前，并且不应被解释为承认本发明借助于先前的发明不先于这些出版物。此外，提供的出版物的日期可能与实际出版日期不同，这可能需要进行独立地确认。

注意的是，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数，除非上下文另有明确规定。还应注意的是，可以起草权利要求以排除任何可选要素。因此，本声明旨在作为与引用权利要求要素或使用“否定”限制有关的使用“唯一”、“仅”等专用术语的先行基础。

对于本领域技术人员在阅读本公开内容时将显而易见的是，本文描述和示出的每个单独的实施例具有分立的部件和特征，其可以在不脱离本发明的范围或精神的情况下容易地与其他几个实施例中的任何实施例的特征分离或与其组合。任何列举的方法可以按照所列举的事件的顺序实施，或以逻辑上可能的任何其它顺序实施。

在进一步详细描述本发明的实施例的各个方面的情况下，首先更详细地回顾各种实施例的系统和装置的各个方面，接着讨论根据本发明的某些实施例的方法和装置。

方法

根据本发明的实施例的方法可用于自动检测显微镜中是否存在基片(例如显微镜载玻片)；检测基片在显微镜中是否被正确地定向以用于成像分析；将显微镜聚焦在放置在基片上的样本上；并且采集样本的一个或多个图像。在一些实施例中，主题方法可以使用自动化设备实施，其中设备被配置成自动执行每个方法步骤。在一些实施例中，主题方法的一个或多个步骤可以例如由操作者手动实施。例如，在一些实施例中，操作者可以实施主题方法的一部分，并且可以使用例如被配置成实施主题方法步骤的至少一部分的自动化设备来执行剩余的方法步骤。主题方法的各个方面在下面进一步详细描述。

在一些实施例中，主题方法包括通过将来自显微镜的光源的光束引导到如果基片存在于显微镜中则其应当被找到的位置来确定显微镜中是否存在基片。如果存在基片，则光束从该基片反射以产生反射光束。然后使用检测器测量反射光束的强度，并将测量的强度与阈值进行比较。如果测量的反射光束的强度超过阈值，则确定显微镜中存在基片。如果测量的反射光束的强度不超过阈值，则确定显微镜中不存在基片。在一些实施例中，用于确定显微镜中是否存在基片的阈值强度值由光电二极管测量的范围为40nA至510nA。

在一些实施例中，主题方法包括自动分析基片以确定基片在显微镜的样本支架上是否被正确地定向以用于成像。被“正确定向”指基片被放置在显微镜的样本支架上，使得显微镜将在其上聚焦的基片的表面朝向显微镜的物镜。在一些实施例中，用于确定基片在显微镜支架上是否被正确地定向的方法包括引导来自光源的光束在反射率变化的两个不同位置处顺序地从基片表面反射。在一些实施例中，产生了两个反射光束，一个来自基片的非反射区域，另一个来自基片的反射区域。

从基片的非反射区域反射的光束将具有与从基片的反射区域(载玻片未改变的表面)反射的光束不同的特性(例如，强度值)。因此，可以将第一反射光束和第二反射光束的一个或多个特性彼此比较，并且可以量化特性的差异。例如，在主题方法的一些实施例中，可以将来自基片的反射区域和非反射区域的反射光束的强度彼此进行比较，并将差值与阈值进行比较以确定基片定向是否正确。

如果来自两个反射光束的测量值彼此相差的量超过阈值，则确定基片在显微镜中处于正确定向。如果来自两个反射光束的测量值彼此相差的量未超过阈值，则确定基片在显微镜中处于不正确定向。在一些实施例中，主题方法包括改变基片与显微镜的物镜之间的距离，以便将基片沿着显微镜的光轴移动穿过多个不同的位置。将基片沿着显微镜的光轴移动穿过多个不同的位置可以通过移动基片、移动物镜或移动基片与物镜两者来实现，从而调节(例如，增加或减少)基片与物镜之间的距离。当将基片沿着显微镜的光轴移动穿过多个位置时，可以使用一个或多个检测器来采集一个或多个反射光束的一个或多个特性的多个测量值。

在一些实施例中，对来自两个反射光束中的每一个的测量值进行比较，以量化测量值之间的差异。在一些实施例中，主题方法包括以恒定速率改变基片与显微镜的物镜之间的距离，其中在某些实施例中，速率范围为100μm/s至500μm/s，例如150μm/s、200μm/s、250μm/s、300μm/s、350μm/s、400μm/s或450μm/s。在一些实施例中，主题方法包括以可变速率改变基片与显微镜的物镜之间的距离。例如，在一些实施例中，主题方法包括在第一时间段以范围为100μm/s至500μm/s，诸如150μm/s、200μm/s、250μm/s、300μm/s、350μm/s、400μm/s或450μm/s的第一速率改变基片与显微镜的物镜之间的距离，并且在第二时间段以范围为100μm/s至500μm/s，诸如100μm/s、150μm/s、200μm/s、250μm/s、300μm/s、350μm/s、400μm/s或450μm/s的第二速率改变基片与显微镜的物镜之间的距离。在一些实施例中，用于自动确定基片在显微镜中是否被正确地定向的主题方法在2秒或更短，或1秒或更短时间内实施。

在一些实施例中，主题方法包括将聚焦透镜和空间孔(在下面进一步描述)放置在检测器的前面，使得光束在到达检测器之前穿过聚焦透镜和空间孔。在一些实施例中，空间孔包括其尺寸(例如，直径)范围为50μm至500μm的孔，例如100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm或450μm。在一些实施例中，空间孔包括其尺寸(例如，直径)可变的孔，并且主题方法包括改变空间孔的直径以改变被允许通过孔的光束的一部分。在某些实施例中，主题方法包括将空间孔的直径从50μm改变到500μm，例如100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm或450μm。

用于确定基片在显微镜中是否被正确地定向的主题方法可以使用来自多种适当的单色光源(下文进一步描述)中的任何一种的光进行。在一些实施例中，来自光源的光可以包括具有波长范围为360nm至420nm的紫外光。在一些实施例中，来自光源的光可以包括具有波长范围为420nm至700nm的可见光(例如，白光)。在一些实施例中，来自光源的光可以包括具有波长范围为700nm至1μm的近红外光。

在一些实施例中，主题方法包括将显微镜自动聚焦在样本上，其中该方法包括沿着显微镜的光轴将基片和/或显微镜的物镜移动到位于特别接近(例如，位于几个景深的区间内)最佳聚焦位置的初始聚焦位置，采集在搜索区间内沿着光轴在不同坐标处拍摄的基片的多个数字图像，分析所采集的图像，以及确定具有找到最佳聚焦位置的最佳焦点度量的图像。在一些实施例中，搜索区间等于小于物镜的景深的10倍。“景深”指显微镜的物镜在平行于显微镜的光轴的方向上的轴向或纵向分辨能力，其由物镜的数值孔径确定。具有最佳焦点度量的图像对应于给定物镜的显微镜的最佳聚焦位置。主题方法的这些方面中的每一个在下面进一步详细描述。

在一些实施例中，该方法包括产生和测量来自基片的用于找到初始聚焦位置的反射光束的一个或多个特性。在某些实施例中，该方法包括引导来自适当的光源的光束至基片以从样本反射并产生反射光束。通过沿着光轴在指定的区间内移动基片或物镜或两者来改变基片与显微镜的物镜之间的距离，并且采集反射光束的一个或多个特性的多个测量值。分析采集的测量值以确定具有峰值的测量值。“峰值”指作为基片沿着显微镜的光轴的位置相对于物镜的位置的函数具有最大强度值的反射光束的测量值。一旦定位到峰值位置(对应于反射光束的最大强度值的轴向坐标)，则可以将基片和/或物镜移动到该位置(或者极为接近该位置的上方或下方)，其变成用于进一步搜索以识别最佳聚焦位置的初始位置。

如上所述，在一些实施例中，主题方法包括以恒定速率改变基片与显微镜的物镜之间的距离，其中在某些实施例中，速率范围为100μm/s至500μm/s，例如150μm/s、200μm/s、250μm/s、300μm/s、350μm/s、400μm/s或450μm/s。在一些实施例中，主题方法包括以可变速率改变基片与显微镜的物镜之间的距离。例如，在一些实施例中，主题方法包括在第一时间段以范围为100μm/s至500μm/s，诸如150μm/s、200μm/s、250μm/s、300μm/s、350μm/s、400μm/s或450μm/s的第一速率改变基片与显微镜的物镜之间的距离，并且在第二时间段以范围为100μm/s至500μm/s，诸如150μm/s、200μm/s、250μm/s、300μm/s、350μm/s、400μm/s或450μm/s的第二速率改变基片与显微镜的物镜之间的距离。通常，更快的速率对应于位于进一步低于或高于初始聚焦位置的区间内的移动，而更慢的速率对应于更靠近初始聚焦位置的区间内的移动。例如，如果搜索区间等于400μm(在初始聚焦位置下方200μm开始并在其上方200μm处完成)，则对于在初始聚焦位置下方200μm至50μm的区间内的移动以及在初始聚焦位置上方方50μm至200μm的区间内的移动，速率可以为200μm/s，同时对于在初始聚焦位置下方50μm和上方50μm的区间内的移动，速率可以为100μm/s。

在一些实施例中，主题方法包括在光束到达检测器之前对光束进行成形，以便控制和/或调节到达检测器的光束的一部分以用于分析。因此，在一些实施例中，该方法的方面包括将聚焦透镜和空间孔(在下面进一步描述)放置在检测器的前面，使得光束在到达检测器之前穿过聚焦透镜和空间孔。在一些实施例中，空间孔包括其尺寸(例如，直径)范围为50μm至500μm的孔，例如100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm或450μm。在一些实施例中，空间孔包括其尺寸(例如，直径)可变的孔，并且主题方法包括改变空间孔的直径以改变被允许通过孔的光束的一部分。在某些实施例中，主题方法包括将空间孔的直径从50μm改变到500μm，例如100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm或450μm。

用于将显微镜自动聚焦在样本上并采集样本的一个或多个数字图像的主题方法可以使用来自各种适当的光源(下面进一步描述)中的任何一种的单色光进行。在一些实施例中，来自光源的光可以包括具有波长范围为360nm至400nm的紫外光。在一些实施例中，来自光源的光可以包括具有波长范围为400nm至700nm的可见光(例如，白光)。在一些实施例中，来自光源的光可以包括具有波长范围为700nm至1000nm的近红外光。

在一些实施例中，使用具有用于自动调焦和成像的单独的光源的显微镜来实施主题方法。在一些实施例中，用于自动调焦和成像的光源可以包括相同类型的光，例如可以包括相同波长的激光或LED光。在一些实施例中，用于自动调焦的光源包括其波长与用于成像的光源的波长不同的光。例如，在某些实施例中，主题方法包括使用近红外(或紫外)光束来自动调焦，同时具有广谱(白光源)的可见光用于成像。

在某些实施例中，主题方法包括对来自光源的光束成形以产生准直光束。“准直光束”指其光线基本上彼此平行并因此随着光束穿过空间而最低限度地展开光束。在某些实施例中，可以使用一个或多个光学部件来将来自光源的光束成形为准直光束。例如，在一些实施例中，准直透镜或多个透镜的组合可以被定位在光束的路径中并用于将来自光源的光束成形为准直光束。

在一些实施例中，用于执行主题方法的显微镜包括至少两个单独的检测通道，一个检测通道用于自动调焦，另一个用于成像；从而分离自动调焦信号和成像信号并将其引导至不同的检测器。在某些实施例中，用于成像的检测通道的数量可以多于一个，其中从样本出来的光束根据某些不同的应用需要被分离到多个检测通道中。例如，如果采集荧光信号用于样本成像，则显微镜可以包括一个用于自动调焦的检测通道和多达8个不同的用于成像的检测通道。

在一些实施例中，主题方法包括引导反射光束沿着指定路径传播。例如，在一些实施例中，可以通过将光束引入位于物镜后部的出射光瞳来引导光束从样本反射。在通过出射光瞳进入物镜之后，光束从样本反射而产生反射光束。在某些实施例中，然后反射光束被引导回去并由同一物镜采集，通过物镜后部进入检测通道以用于分析。

在一些实施例中，主题方法包括引导光束从基片的前表面(面向物镜的表面)反射。在另一实施例中，主题方法包括引导光束从基片的底表面(位于前表面下方或上方并面向物镜的相反方向的表面)反射。

一旦基片已经被移动到初始聚焦位置，该方法的各个方面包括沿着光轴将基片和/或物镜移动到多个不同的位置，并且从每个不同的位置采集样本的多个数字图像。在一些实施例中，主题方法包括沿着显微镜的光轴以特定的距离增量移动基片和/或显微镜的物镜。在某些实施例中，每个梯级的尺寸等于显微镜的物镜的景深。在一些实施例中，用于实施主题方法的显微镜的物镜的景深范围为0.15μm至10μm，因此，在一些实施例中，用于采集多个数字图像的每个梯级的尺寸范围为0.15至10μm，例如0.25μm、0.5μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm或9μm。

主题方法的各个方面包括确定沿着显微镜的光轴需要采集的样本的数字图像的数量。在某些实施例中，确定要采集的数字图像的数量包括将初始聚焦位置的不确定度区间或搜索区间除以用于成像的物镜的景深。初始聚焦位置的“不确定度区间”或“搜索区间”指在其上所测量的用于确定初始聚焦位置的反射光束的特性中的变化(例如，反射光束的强度的变化)不大于信号噪声的距离。例如，参见图2。例如，对于给定的基片，如果用于确定基片的初始聚焦位置的强度峰值相对较窄且尖锐或明显，则不确定度区间将较小。相比之下，如果给定基片的强度峰值相对较宽且平坦，则不确定度区间将更大。在一些实施例中，所采集的样本的数字图像的数量的范围为3至10，例如4、5、6、7、8或9。例如，如果确定数值孔径为0.5的20X物镜的不确定度区间为10μm，并且景深为2μm，则待采集的图像的总数量为10除以2，即5；在初始聚焦位置采集1张图像，并在初始聚焦位置的每一侧采集2张图像(2张图像在初始聚焦位置下方采集，2张图像在初始聚焦位置上方采集)。

在一些实施例中，该方法的各个方面包括采集对应于物镜的全视场的全部数字图像。在某些实施例中，方法的各个方面包括通过仅选择视场的一部分来仅采集图像预定义的部分(例如，兴趣区域，ROI)。ROI可以具有可变尺寸，并且覆盖少至2×2像素的区域，大到完整大小的图像。例如，如果检测器的尺寸为1936×1456像素，则ROI可以分别在一个方向上具有范围为2像素至1936像素的可变尺寸，并在另一方向上具有范围为2像素至1456像素的可变尺寸。

该方法的各个方面包括分析所采集的数字图像以确定具有最佳焦点度量的图像。“最佳焦点度量”指在数据集中的该数字图像的测量或特性大于或优于所有其它采集的数字图像中的相同的测量或特性。在一些实施例中，方法的各个方面包括使用一个或多个分析算法对所采集的数字图像中的每一个执行数字图像分析。在某些实施例中，方法的各个方面包括逐像素地分析样本的数字图像，其中分析数字图像的每个单独的像素。然后将每个像素的分析结果相加或合计以确定数字图像的特性，然后可以将这些特性与为其它采集的数字图像所确定的相同的特性进行比较，以确定具有最佳焦点度量的数字图像。

在一些实施例中，使用计算机处理器分析样本的数字图像包括在逐像素的基础上测量全部图像的强度(例如，灰度强度)。在一些实施例中，该方法的各个方面包括在逐像素的基础上计算数字图像的强度的一阶导数。在一些实施例中，该方法的各个方面包括在逐像素的基础上计算数字图像的强度的二阶导数。在一些实施例中，该方法的各个方面包括计算数字化强度图像的傅里叶变换。在一些实施例中，图像传感器包括彩色图像传感器，其被配置成创建样本的由彩色图像传感器采集的红色、绿色和/或蓝色的光形成的数字图像。在这种实施例中，该方法的各个方面包括在逐像素的基础上测量样本的红色、绿色和/或蓝色数字图像的强度。

在一些实施例中，使用计算机处理器分析样本的数字图像包括在逐像素的基础上测量在显微镜视场内的所选择的兴趣区域(ROI)的强度(例如，灰度强度)。在一些实施例中，该方法的各个方面包括在逐像素的基础上计算ROI的强度的一阶导数。在一些实施例中，该方法的各个方面包括在逐像素的基础上计算ROI的强度的二阶导数。在一些实施例中，该方法的各个方面包括计算ROI的傅里叶变换。在一些实施例中，用于进一步分析的一个或多个ROI可以从不同的彩色图像(例如，红色，绿色或蓝色彩色图像)中选择，并通过图像处理以适当的方式组合以为某些应用创建适当的焦点度量计算算法。

在一些实施例中，用于将显微镜自动聚焦在样本上并采集具有最佳焦点度量的样本的数字图像的主题方法在5秒或更短的时间内实施，例如4秒或更短、3秒或更短、2秒或更短或者1秒或更短。

主题方法用于使用显微镜自动分析多个样本。例如，主题方法可以用于自动确定显微镜中是否存在基片(例如，显微镜载玻片)，以及基片在显微镜中是否被正确地定向。此外，主题方法用于将显微镜自动聚焦在被安装在基片上的样本上，并采集具有最佳焦点度量的样本的数字图像。具有最佳焦点度量的样本的数字图像是具有最佳的尖锐度或清晰度(例如，通过手动聚焦可以实现的相同的尖锐度或清晰度)的图像，并且适于进一步分析，例如，可以用于对样本的一个或多个部分进行进一步分析，或者可以由操作者或临床医师进行复查。因此，主题方法可以用于通过成像分析程序自动处理多个基片，其中每个基片都被放置在显微镜的样本支架上，显微镜聚焦在基片上的样本上，并且具有最佳焦点度量的数字图像通过显微镜采集以创建样本的适于进一步分析的数字图像。

现参照图1，示出了从基片反射时由光电探测器采集的反射信号(以光电二极管计数进行测量)作为基片的z轴位置的函数(其中z轴平行于显微镜的光轴)的曲线图。来自光源的光束已被引导至在限定位置(例如，包括裸玻璃或样本的位置)从基片反射，并且反射光束已被引导至包括光电二极管检测器的检测通道。当基片沿着显微镜的光轴从初始搜索位置移动，定位在预期焦点位置的上方或下方一定的区间的位置时，光电二极管计数的曲线图示出相对最大值或峰值，其对应于基片在显微镜的光轴中具有最高反射信号强度的位置。反射光束中的最高强度在当基片通过物镜的聚焦位置并且表面上的光束被聚焦到最小的光点时产生。一旦确定了相对最大值的z位置，就移动基片和/或物镜以将基片置于对应于峰值或峰值位置的上方/下方的不确定度区间内(如在下面参照图2进一步讨论的)。

现参照图2，示出了从基片反射时由光电探测器采集的反射信号(以光电二极管计数进行测量)作为基片的z轴位置的函数的曲线图。来自光源的光束已被引导至在限定位置(例如，包括裸玻璃或样本的位置)从基片反射，并且反射光束已被引导至包括光电二极管检测器的检测通道。当基片沿着显微镜的光轴移动时，光电二极管计数的曲线图示出相对最大值或峰值，其对应于基片在显微镜的光轴中具有最高反射信号强度的位置。峰值位置的不确定度区间由双头箭头表示，在所示的曲线图中表示z位置(ΔZ)的12μm的差异。

系统和装置

本发明的各个方面包括被配置成实施主题方法例如将显微镜自动聚焦在样本上并采集样本的数字图像的系统及其装置。下面详细描述主题系统和方法的各个组件。

主题系统的各个方面包括被配置成实施主题方法的光学显微镜。根据本发明的实施例的显微镜包括至少一个物镜、至少一个光源和至少一个检测通道。根据本发明的实施例的物镜被配置成从被成像的对象(例如，安装在基片上的样本)采集光并且聚焦光以创建对象的图像。在某些实施例中，物镜可以包括单个透镜或反射镜，或者可以包括多个光学部件，其被配置成采集来自被成像的对象的光并聚焦光以产生对象的图像。在一些实施例中，显微镜可以包括被配置成根据主题方法调节物镜和基片之间的距离的机动部件。

根据本发明的实施例的物镜可以具有任何适当的数值孔径(NA)。物镜的数值孔径描述了可以通过物镜采集的发射光信号的数量以及可以实现的衍射极限分辨率。根据阿贝衍射极限

定义的关系，更高的数值孔径转换成以波长为依赖方式的改进的分辨率。在一些实施例中，物镜的数值孔径范围为0.1至1.4，例如0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.05、1.1、1.15、1.2、1.25、1.3或1.35。

在一些实施例中，光源可以包括激光器或发光二极管(LED)。根据本发明的实施例的光源可以被配置成发射具有适当的波长(例如，可以具有任何适当的发射光谱)如上所述，范围为UV光到可见光到红外光的光。在某些实施例中，主题方法包括对来自光源的光束成形以产生准直光束。在某些实施例中，可以使用一个或多个光学部件来将光束成形为准直光束。例如，在一些实施例中，光学准直透镜或多个透镜的集合可以被定位在光束的路径中并用于将来自光源的光束成形为准直光束。

根据本发明的实施例的检测通道被配置成接收光束作为输入，并将输入光束引导至检测器进行分析。在一些实施例中，检测通道可以被配置成仅允许某一波长或某一波长范围的光进入检测通道。例如，在一些实施例中，检测通道可以包括被配置成仅允许某一波长范围的光进入检测通道的滤光器。在一些实施例中，显微镜可以包括多个检测通道，每个检测通道具有与之相关联的单独的检测器。

在一些实施例中，用于自动调焦的检测通道可以包括具有光电二极管的检测器。根据本发明的实施例的光电二极管被配置成吸收光的光子并将光转换成可以测量的电流。在一些实施例中，光电二极管可以包括滤光器、透镜或可以用于将光能转换成用于测量的电流的任何其它的适当的部件。

在一些实施例中，用于成像的检测通道可以包括具有图像传感器的检测器。根据本发明的实施例的图像传感器被配置成将光学图像转换成电子信号。图像传感器的示例包括但不限于电荷耦合装置(CCD)和互补金属氧化物半导体(CMOS)或N型金属氧化物半导体装置。在一些实施例中，图像传感器可以是有源像素传感器(APS)。在某些实施例中，图像传感器可以是彩色图像传感器。在一些实施例中，彩色图像传感器可以被配置成从样本采集红色、绿色和/或蓝色光并且从所采集的红色、绿色和/或蓝色光中生成样本的合成图像。

在一些实施例中，用于成像的检测通道可以包括相机。在一些实施例中，相机是提供极低噪声、快速的帧速率、宽的动态范围、较高的量子效率(QE)、较高的分辨率和大视场的CCD相机或科学CMOS相机(sCMOS)。这种相机可从科技供应商市购。

主题系统的各个方面还可以包括可用于控制和/或调节系统中的光束的至少一部分的附加组件。附加组件的示例包括但不限于反射镜、透镜、分束器、棱镜、衍射光栅、光电倍增管、滤光器、光束成形光学器件等。

在一些实施例中，主题系统的各个方面包括一个或多个聚焦透镜。根据本发明的实施例的聚焦透镜包括被配置成以适当的方式影响光束的聚焦的任何透镜。例如，在一些实施例中，聚焦透镜被配置成将光束聚焦在期望的焦点处。

在一些实施例中，主题系统的各个方面包括一个或多个空间孔。根据本发明的实施例的空间孔(亦称为空间滤波器)是被配置成消除由于系统的一个或多个光学部件中的缺陷或变化引起的光束中的像差的部件。在一些实施例中，空间孔包括被放置在光束的光路中的孔或开口，并允许光束的期望部分穿过孔，同时阻挡对应于光束的不期望的部分或结构的光。根据本发明的实施例的空间孔可以包括允许光通过的小的圆形孔或“针孔”孔。在一些实施例中，空间孔具有直径范围为50μm至500μm的孔，例如100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm或450μm。在某些实施例中，空间孔可以包括尺寸可变的孔，并且主题方法可以包括改变空间孔的尺寸(例如，改变直径)。在某些实施例中，空间孔可以包括其尺寸可以从50μm到500μm变化的孔，例如100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm或450μm。

本发明的各个方面包括由透明材料制成的刚性或半刚性结构的基片。这些材料包括但不限于塑料、玻璃和/或石英。在一些实施例中，基片是由任何适当的材料制成并且具有任何适当的诸如正方形、矩形、圆形、椭圆形或六边形的几何形状的显微镜载玻片。

在一些实施例中，基片的尺寸(例如，长度)在大小上的范围为从20mm开始，直到约25mm、直到约30mm、直到约35mm、直到约40mm、直到约45mm、直到约50mm、直到约55mm、直到约60mm、直到约65mm、直到约70mm、直到约75mm、直到约80mm。在一些实施例中，基片的另一尺寸在大小上的范围为从20mm开始，直到约25mm、直到约30mm、直到约35mm、直到约40mm、直到约45mm、直到约50mm、直到约55mm、直到约60mm、直到约65mm、直到约70mm、直到约75mm、直到约80mm。在一些实施例中，基片的厚度范围为从0.5mm开始，直到约0.8mm、直到约1mm、直到约1.2mm、直到约1.5mm。在一些实施例中，基片为标准的显微镜载玻片，其长约75mm、宽约25mm、厚约1mm。

在一些实施例中，基片可以包括一种或多种表面涂层或表面处理，例如含有聚合物(例如，L-多聚赖氨酸(poly-L-lysine)、硅烷)或蛋白质(例如，清蛋白)的那些。在一些实施例中，基片包括表面涂层或表面处理，其使基片的至少一部分不透明或半透明，例如磨砂或釉化处理。在一些实施例中，基片包括可用于标记的区域，例如可以放置适当的标签的端部或边角区域。在一些实施例中，基片使用标签设备进行打标，例如，将标签涂到基片表面、蚀刻和/或标记基片以产生标签或者打印或涂抹油墨和/或任何其它适当的标记材料到基片表面以产生标签的设备。在一些实施例中，基片可以包括可用于识别基片的条形码标签。

在一些实施例中，基片在其平面表面上包括一个或多个非反射区域，并且主题方法包括引导来自光源的光束从基片的非反射区域反射。根据本发明的实施例的非反射区域可以具有任何适当的形状和尺寸。例如，在一些实施例中，非反射区域在形状上可以为圆形、椭圆形、正方形、矩形或六边形。根据本发明的实施例的非反射区域可以具有范围为1mm至10mm的尺寸(例如，直径或侧边长度)，例如2mm至5mm。根据本发明的实施例的非反射区域具有适当的厚度。在一些实施例中，非反射区域的厚度范围可以为0至1mm，例如0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm或0.9mm。基片的非反射区域可以使用适当的技术创建，包括但不限于：将非反射涂层镀在基片的表面；处理基片的表面，例如，使用蚀刻技术处理等。

在一些实施例中，主题系统的各个方面包括已经放置在基片上的一个或多个样本。适于使用主题方法进行分析的样本包括任何类型的生物组织，包括但不限于：实体组织或半实体组织、生物流体、细胞(例如，血细胞)、生物分子等。在一些实施例中，样本的至少一部分可以具有可变的厚度，其中样本的部分的厚度在基片的一个或多个尺寸上变化。在一些实施例中，样本的至少一部分可以具有不规则的表面，其中样本的部分的表面在基片的一个或多个尺寸上变化。在一些实施例中，样本的至少一部分可以具有可变的反射率值，其中样本的部分的反射率在基片的一个或多个尺寸上变化。在某些实施例中，样本在基片的一个或多个尺寸上可以具有可变的图像内容。例如，在一些实施例中，样本的一部分可以具有第一图像内容(例如，样本包含致密浓度的细胞或分子的部分)，并且样本的另一部分可以具有第二图像内容(例如，标本不含任何细胞或分子的部分)。

在一些实施例中，样本已经经受一种或多种染色程序，其适于对样本的一个或多个部分进行染色或着色，以促进样本的视觉分析。在一些实施例中，样本已经与一种或多种结合剂接触，该粘合剂被配置成与样本稳定地联合以促进样本的视觉分析。

本发明的各个方面包括被配置成或适于控制或操作主题系统的一个或多个部件的控制器、处理器和计算机可读介质。在一些实施例中，如本文所述，系统包括与主题系统的一个或多个部件通信的控制器，并且被配置成控制系统的各个方面和/或执行主题系统的一个或多个操作或功能，例如，以实施本文所述的一种或多种方法。在一些实施例中，系统包括处理器和计算机可读介质，其可以包括存储器介质和/或存储介质。被实现为计算机可读存储器上的计算机可读指令的应用程序和/或操作系统可以由处理器执行以提供本文所述的一些或全部功能。

在一些实施例中，系统包括诸如图形用户界面(GUI)的用户界面，其适于或被配置成从用户接收输入，并且执行如本文所述的一种或多种方法。在一些实施例中，GUI被配置成向用户显示数据或信息。

现参照图3，描述了根据本发明的实施例的显微镜系统的部分。所描述的系统包括自动调焦LED、成像LED、CCD相机、准直仪、聚焦透镜、空间(针孔)孔、物镜以及被配置成执行主题方法的各种其它的光学部件。

现参照图4，示出了根据本发明的实施例的基片。所描述的基片包括两个非反射区域。示出了适当尺寸的示例，但是绝不旨在限制可用于根据本发明的实施例的系统和方法中的基片的尺寸。

示例

示例1：将显微镜自动聚焦到样本上并采集样本的聚焦的数字图像

如图4所示，将生物样本放置在包括两个非反射区域的基片的上侧。对样本进行染色处理，将样本中的多个细胞染色以促进对其的视觉识别。然后将基片放置在显微镜系统的样本支架上，如图3所示，并且在被配置成控制该系统并实施自动聚焦程序的计算机处理器上开始自动聚焦程序。

处理器引导来自光源的第一光束从基片的反射部分反射(即，除了基片的两个非反射区域中的一个以外的位置)。将反射光束引导至包括光电二极管检测器的检测通道，并且在光电二极管计数中测量反射光束的强度。测量的强度超过阈值强度值，因此处理器确定在显微镜中存在基片。

然后处理器引导来自显微镜的光源的第二光束从基片的非反射区域中的一个反射。当第一反射光束和第二反射光束都从基片反射时，通过移动基片和/或物镜来改变基片与物镜之间的距离。将反射光束的每一个引导至包括光电二极管的检测通道，并且由光电二极管测量两个反射光束的强度。将两个反射光束的强度测量值彼此进行比较，并测量其差值。确定两个反射光束之间的差值超过阈值，从而确认基片在显微镜中被正确地定位以用于成像分析。

如图1和图2所示，在所测量的第一反射光束的强度剖面中的相对最大值或峰值以显微镜的光轴中基片的位置的函数进行衡量。将具有峰值的强度测量值确定为具有最佳焦距值的测量值，并且将基片移动到显微镜的光轴上位于以等于不确定度区间的一半的距离高于或低于峰值位置的位置。

之后，确定为了识别具有最佳焦点度量的图像而应该拍摄的样本的数字图像的数量。这通过将初始聚焦位置的不确定度区间除以显微镜的物镜的景深来完成，产生范围为1至10的数值。

以与物镜的景深相同的大小的梯级沿着显微镜的光轴移动基片，并且使用成像传感器采集所计算的数量的图像。分析每个所采集的图像以在逐像素的基础上确定图像的强度值。比较每个图像的分析结果，并且选择具有最佳焦点度量(例如，在逐像素的基础上具有最高测量强度值)的图像作为最佳图像。然后将基片移动到显微镜的光轴上与具有最佳焦点度量的图像的位置相对应的位置，从而将显微镜自动聚焦在样本上。

确定显微镜中存在基片、确定基片是否处于用于分析的适当的定向、采集样本的所需数量的数字图像并将显微镜聚焦在样本上的全部过程在少于2秒内进行。

虽然为了清楚理解的目的通过说明和示例的方式对前述发明进行了详细的描述，但根据本发明的教导内容，对本领域普通技术人员显而易见的是，在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下，可以对其进行某些改变和修改。

因此，前面仅仅说明了本发明的原理。应当理解的是，尽管未明确描述或显示在本文中，本领域技术人员将能够设计各种体现本发明的原理以及包含在其精神和范围内的各种布置。此外，本文所述的所有示例和条件语言主要是为了帮助读者理解本发明的原理和发明人为促进本领域而贡献的概念，并且将被解释为不限于这些具体叙述的示例和条件。此外，本文中所有陈述本发明的原理、方面和实施例以及其具体示例都旨在包括其结构性与功能性等同物。此外，这些等同物旨在包括当前已知的等同物以及未来开发的等同物，即，所开发的执行相同功能的任何元件，而与结构无关。因此，本发明的范围并不旨在受限于本文所示和所述的示例性实施例。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求体现。

Claims (38)

1.一种用于使显微镜自动聚焦到样本上的方法，所述方法包括：

将基片基本上垂直于所述显微镜的光轴放置，其中所述基片包括所述样本；

引导来自光源的光束从所述样本反射以产生反射光束；

改变所述基片与所述显微镜的物镜之间的距离；

利用检测器采集所述反射光束的一个或多个特性的多个测量值，其中在所述基片相对于所述物镜位于沿着所述显微镜的光轴的不同位置时采集所述多个测量值中的每一个测量值；

确定具有最佳焦距值的测量值；

将所述基片和/或所述物镜移动到初始聚焦位置，所述初始聚焦位置对应于所述基片和所述物镜之间对所述反射光束的测量值具有所述最佳焦距值的距离；

通过将初始聚焦位置的不确定度区间除以用于成像的物镜的景深来确定要采集的用于找到最佳聚焦位置的数字图像的数量；

通过沿着所述光轴将所述基片和/或所述物镜以多个梯级移动到所述初始聚焦位置上方和/或下方来采集所述基片的所确定数量的数字图像，其中每个梯级等于所述物镜的景深；

至少分析每个图像中的兴趣区域以确定每个图像的焦点度量；

确定哪个图像具有最佳焦点度量；以及

将所述基片和/或所述物镜移动到最终聚焦位置，所述最终聚焦位置对应于所述图像的具有用于使所述显微镜自动聚焦到所述样本上的所述最佳焦点度量的位置。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述光源包括激光器。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述光源包括发光二极管(LED)。

4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，包括使来自所述光源的光束成形以产生准直光束。

5.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述显微镜包括两个单独的光源：用于自动调焦的第一光源以及用于成像的第二单独光源。

6.根据权利要求5所述的方法，包括相对于来自所述第二单独光源的光束对来自所述第一光源的光束进行光谱移位。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述第一光源为发射波长在360nm至1000nm的光谱范围内任意处的激光器或LED，并且其中所述第二单独光源为发射波长在390nm至700nm的光谱范围内任意处的白光源。

8.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述显微镜包括至少两个单独的检测通道，其中第一检测通道用于自动调焦，第二单独检测通道用于成像，并且其中所述方法包括从用于成像的所述第二单独检测通道分离出用于进行自动调焦的反射光束。

9.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述显微镜包括用于自动调焦的第一检测通道以及用于采集来自所述样本的光束的至少一部分的多达8个不同的成像检测通道。

10.根据权利要求5所述的方法，其中引导来自所述第一光源的光束从所述样本反射以产生反射光束包括通过所述物镜后部的出射光瞳引入所述光束以聚焦在所述样本上，并且采集穿过出射光瞳后部的所述物镜的反射光束。

11.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中引导来自所述光源的光束从所述样本反射以产生反射光束包括从所述样本面向所述物镜的前表面反射所述光束。

12.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中引导来自所述光源的光束从所述样本反射以产生反射光束包括从所述样本面向所述物镜的相反方向的底表面反射所述光束。

13.根据权利要求8所述的方法，其中用于自动调焦的所述检测通道包括光电二极管。

14.根据权利要求8所述的方法，其中用于成像的所述检测通道包括图像传感器装置或CCD相机。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述图像传感器装置为彩色图像传感器装置或彩色CCD相机。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述样本的数字图像是由所述彩色图像传感器装置或RGB CCD相机采集的红色、绿色和蓝色(RGB)光形成的合成图像。

17.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，包括将聚焦透镜放置在所述物镜的后侧以将所述反射光束聚焦到所述检测器上。

18.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述方法包括将空间孔放置在所述检测器前面的聚焦透镜的焦平面中，以阻挡从位于所述样本的焦平面上方或下方的一个或多个界面反射的离焦光束。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述空间孔具有可变直径，并且其中所述方法包括改变所述空间孔的直径。

20.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中确定哪个测量值具有所述最佳焦距值包括测量所述反射光束的强度。

21.根据权利要求16所述的方法，其中确定哪个数字图像具有所述最佳焦点度量包括在逐像素的基础上测量红色、绿色或蓝色数字图像的强度。

22.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中确定哪个数字图像具有所述最佳焦点度量包括在逐像素的基础上测量灰度图像的强度。

23.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中确定哪个图像具有所述最佳焦点度量包括在逐像素的基础上计算所述数字图像的强度的一阶导数。

24.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中确定哪个图像具有所述最佳焦点度量包括在逐像素的基础上计算所述数字图像的强度的二阶导数。

25.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中确定哪个图像具有所述最佳焦点度量包括计算数字化强度图像的傅里叶变换。

26.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述基片包括载玻片。

27.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述样本包括生物样本。

28.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述样本的至少一部分具有可变的厚度。

29.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述样本的至少一部分具有不规则表面。

30.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述样本的至少一部分具有可变的反射率值。

31.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述样本在所述基片的一个或多个尺寸上具有可变的图像内容。

32.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中改变所述基片与所述物镜之间的距离包括以可变速率移动所述基片和/或物镜。

33.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中改变所述基片与所述物镜之间的距离包括以恒定速率移动所述基片和/或所述物镜。

34.根据权利要求1所述的方法，其中所述物镜的景深范围为0.15μm至10μm。

35.根据权利要求1所述的方法，其中为了找到所述最佳聚焦位置而采集的所述样本的图像的数量在3到10之间。

36.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中使所述显微镜自动聚焦到所述基片上的位置所需的时间量为2秒或更短。

37.一种用于使显微镜自动聚焦到样本上的方法，所述方法包括：

引导来自光源的第一光束在第一位置处从基片反射以产生第一反射光束；

利用检测器测量所述第一反射光束的强度；

确定所述第一反射光束的所述强度超过阈值以确定在所述显微镜中存在所述基片；

引导来自所述光源的第二光束在与所述第一位置不同的第二位置处从所述基片反射以产生第二反射光束，其中所述第二位置包括非反射区域；

改变所述基片与所述显微镜的物镜之间的距离；

利用检测器采集所述第一反射光束和所述第二反射光束的一个或多个特性的多个测量值，其中在所述基片相对于所述物镜位于沿着所述显微镜的光轴的不同位置时采集所述多个测量值中的每一个测量值；

确定所述第一反射光束的所述测量值与所述第二反射光束的所述测量值的相差量超过阈值，从而确定所述基片在所述显微镜中被正确地定向；

利用检测器采集所述第一反射光束的一个或多个特性的多个测量值，其中在所述基片相对于所述物镜位于沿着所述显微镜的光轴的不同位置时采集所述多个测量值中的每一个测量值；

确定哪个测量值具有最佳焦距值；

将所述基片和/或所述物镜移动到初始聚焦位置，所述初始聚焦位置对应于所述基片和所述物镜之间对所述第一反射光束的测量值具有所述最佳焦距值的距离；

通过将初始聚焦位置的不确定度区间除以用于成像的物镜的景深来确定要采集的用于找到最佳聚焦位置的数字图像的数量；

通过沿着所述光轴将所述基片和/或所述物镜移动到所述初始聚焦位置上方和/或下方来采集所述基片的所确定数量的数字图像；

至少分析每个图像中的兴趣区域以确定每个图像的焦点度量；

确定哪个图像具有最佳焦点度量；以及

将所述基片和/或所述物镜移动到最终聚焦位置，所述最终聚焦位置对应于所述图像的具有用于使所述显微镜自动聚焦到所述样本上的所述最佳焦点度量的位置。

38.根据权利要求37所述的方法，其中使所述显微镜自动聚焦到所述样本上所需的时间量为2秒或更短。

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