JP7055793B2 - 選択的平面照明を伴う明視野顕微鏡 - Google Patents

Description

（関連出願）
本願は、米国出願第１５／２６６，３１０号（２０１６年９月１５日出願）に対する優先権を主張し、上記出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

（技術分野）
本発明は、概して、３次元顕微鏡法および蛍光ベースの顕微鏡法を含むサンプルを撮像するための顕微鏡法に関する。特に、本発明は、明視野情報を取得することと併せて選択的平面照明を実装する顕微鏡法に関する。

顕微鏡法は、例えば、（例えば、細胞、組織等の）生体物質および（例えば、粒子状物質等の）非生体物質等のサンプルの撮像を伴う分析技法のクラスを示す。公知である光ベースの（光学）顕微鏡技法は、例えば、明視野顕微鏡法、暗視野顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、および選択的平面照明顕微鏡法（ＳＰＩＭ）を含む。光ベースの顕微鏡技法は、撮像されているサンプル内に蛍光発光を誘発することによって改良され得る。さらに、いくつかの顕微鏡は、典型的には、サンプルを通して焦点の軸方向深度を走査し、複数の画像（焦点スタック）を取得し、その後、画像を処理し、３次元（３Ｄ）画像を生成することによって、サンプルの３Ｄ撮像を行うことが可能である。この取得後の処理は、典型的には、３Ｄ逆重畳アルゴリズム、位置合わせアルゴリズム等の使用を含む大量の計算を必要とする。

生体サンプルの３Ｄ蛍光撮像法は、典型的には、共焦点顕微鏡法またはＳＰＩＭによって実施される。共焦点顕微鏡法は、鮮明かつ高解像度の画像を送達することができるが、非常に時間がかかり、複雑な、したがって、高価なシステムハードウェアを要求する。ＳＰＩＭは、潜在的に、より迅速でより安価であるが、特別なサンプル調製および保持器を必要とする。ＳＰＩＭは、Ｈｕｉｓｋｅｎ、他、のＳｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｌａｎｅ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１３６（１２），ｐ．１９６３－１９７５（２００９）（その内容は、参照することによって全体として本明細書に組み込まれる）において説明されている。最近、明視野撮像法が、３Ｄ顕微鏡撮像方法として提案されている。明視野撮像法は、伝統的な顕微鏡の場合の光強度のみの捕捉と比較して、場面の光の強度と光線の進行の方向との両方に関する情報を捕捉する。しかしながら、これまでのところ、実験研究は、明視野撮像法は、容認できない量の画像アーチファクトおよび背景雑音を生成することを示している。明視野技術は、米国特許第７，９３６，３９２号（特許文献１）、米国特許第８，７１７，４８９号（特許文献１）、Ｌｅｖｏｙ、他のＬｉｇｈｔ Ｆｉｅｌｄ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＡＣＭ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ，Ｖｏｌ ２５（３），ｐ．１－１１，Ｐｒｏｃ．ＳＩＧＧＲＡＰＨ（２００６）、Ｃｏｈｅｎ、他、のＥｎｈａｎｃｉｎｇ Ｔｈｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ Ｔｈｅ ｌｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｕｓｉｎｇ ｗａｖｅｆｒｏｎｔ ｃｏｄｉｎｇ，ＯＰＴＩＣＳ ＥＸＰＲＥＳＳ，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．２０（２０１４）、および、Ｂｒｏｘｔｏｎ、他、のＷａｖｅ ｏｐｔｉｃｓ ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ３－Ｄ ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｈｅ ｌｉｇｈｔ ｆｉｅｌｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ＯＰＴＩＣＳ ＥＸＰＲＥＳＳ，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２１（２０１３）（それらの各々の内容は、参照することによって全体として本明細書に組み込まれる）に説明される。

３Ｄ顕微鏡撮像法のための顕微鏡および方法に対する継続的な必要性が存在する。特に、オルガノイドおよびスフェロイド等の複雑かつ機能的な生体サンプルの調査および分析のために３Ｄ情報を分析する迅速な顕微鏡撮像方法が必要とされる。

米国特許第７，９３６，３９２号明細書 米国特許第８，７１７，４８９号明細書

全部または一部を問わず、前述の問題および／または当業者によって観察され得る他の問題に対処するために、本開示は、下記に記載される実装において例として説明されるような方法、プロセス、システム、装置、器具、および／またはデバイスを提供する。

ある実施形態によると、明視野顕微鏡は、照明光を生成するために構成されている光源と、光源から照明光を受け取り、照明光を集束させられた照明光として出力するために構成されている集光レンズと、集束させられた照明光を集光レンズから受け取り、照明光を光シートとして出力するために構成されている光シート焦点調整デバイスと、サンプルをサンプル平面内に支持するために、かつ光シートをサンプル平面に対して非平行な照明方向に沿って受け取るために構成されているサンプルステージと、サンプルから検出光を受け取るために構成されている対物レンズと、対物レンズから検出光を受け取るために構成されているマイクロレンズアレイと、マイクロレンズアレイから検出光を受け取り、検出光の明視野パラメータを測定するために構成されている光検出器とを含む。

別の実施形態によると、サンプルから明視野画像を取得する方法は、サンプルを対物レンズの焦点面内に支持することと、照明光を生成することと、照明光を光シートとして集束させることと、光シートをサンプル平面に対して非平行な照明方向に沿ってサンプルに向けることによってサンプルを照射することであって、照射に応答して、サンプルは、検出光を放射する、ことと、検出光をマイクロレンズアレイを通して光検出器に向けることと、検出器において検出光の明視野パラメータを測定することとを含む。

別の実施形態によると、明視野顕微鏡は、本明細書に開示される方法の任意のものの全てまたは部分を実施するために構成されている。

本発明の他のデバイス、装置、システム、方法、特徴、および利点も、以下の図および詳述される説明の考察に応じて当業者に明白、または明白になるであろう。この説明に含まれるそのような追加のシステム、方法、特徴、および利点の全ては、本発明の範囲内であり、添付の請求項によって保護されることが意図される。
本明細書は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
明視野顕微鏡であって、前記明視野顕微鏡は、
照明光を生成するために構成されている光源と、
前記光源から前記照明光を受け取り、前記照明光を集束させられた照明光として出力するために構成されている集光レンズと、
前記集束させられた照明光を前記集光レンズから受け取り、前記照明光を光シートとして出力するために構成されている光シート焦点調整デバイスと、
サンプルをサンプル平面内に支持することと、前記光シートを前記サンプル平面に対して非平行な照明方向に沿って受け取ることとを行うために構成されているサンプルステージと、
前記サンプルから検出光を受け取るために構成されている対物レンズと、
前記対物レンズから前記検出光を受け取るために構成されているマイクロレンズアレイと、
前記マイクロレンズアレイから前記検出光を受け取り、前記検出光の明視野パラメータを測定するために構成されている光検出器と
を備えている、明視野顕微鏡。
（項目２）
前記光源は、前記サンプルから蛍光検出光を誘発するために有効な波長の前記照明光を生成するために構成されている、項目１に記載の明視野顕微鏡。
（項目３）
前記光源は、複数の照明光ビームを生成するために構成され、前記明視野焦点調整デバイスは、前記複数の照明光ビームを複数の光シートとして出力するために構成されている、項目１に記載の明視野顕微鏡。
（項目４）
前記光シート焦点調整デバイスは、円筒レンズと、１つ以上のスリットを備えている開口とから成る群から選択される、項目１に記載の明視野顕微鏡。
（項目５）
前記光源から前記サンプルへの照明光経路の少なくとも一部分を画定するために構成されている光学系と、前記サンプルから前記光検出器への検出光経路の少なくとも一部分を画定するために構成されている光学系とを備えている、項目１に記載の明視野顕微鏡。
（項目６）
前記光学系は、前記光シートを受け取り、前記光シートを前記サンプルに向かって反射することと、前記検出光を受け取り、前記検出光を前記光検出器に向かって伝送することとを行うために構成されているダイクロイックミラーを備えている、項目５に記載の明視野顕微鏡。
（項目７）
前記対物レンズは、前記照明光経路および前記検出光経路の両方の中に位置付けられている、項目５に記載の明視野顕微鏡。
（項目８）
前記光学系は、前記サンプル平面に対する照明方向の角度を調整するために構成されている可動鏡を備えている、項目５に記載の明視野顕微鏡。
（項目９）
前記可動鏡は、前記対物レンズの瞳に位置付けられている、項目８に記載の明視野顕微鏡。
（項目１０）
前記サンプルステージは、前記サンプルを前記サンプル平面内で平行移動させること、または、前記サンプル平面を前記光シートに対して回転させること、または、前述の両方を行うために構成されている、項目１に記載の明視野顕微鏡。
（項目１１）
前記サンプルステージは、サンプル容器のアレイを支持するように構成されている、項目１に記載の明視野顕微鏡。
（項目１２）
前記マイクロレンズアレイは、画像平面に位置付けられている、項目１に記載の明視野顕微鏡。
（項目１３）
前記光検出器は、前記マイクロレンズアレイから前記マイクロレンズアレイのレンズレットの１焦点距離に等しい距離を置いて位置付けられている、項目１に記載の明視野顕微鏡。
（項目１４）
前記光検出器は、前記明視野顕微鏡がガリレオ式構成を有するように、前記マイクロレンズアレイから距離を置いて位置付けられている、項目１に記載の明視野顕微鏡。
（項目１５）
前記光検出器は、前記明視野顕微鏡がケプラー式構成を有するように、前記マイクロレンズアレイから距離を置いて位置付けられている、項目１に記載の明視野顕微鏡。
（項目１６）
前記対物レンズと前記マイクロレンズアレイとの間にチューブレンズを備えている、項目１に記載の明視野顕微鏡。
（項目１７）
前記マイクロレンズアレイのｆ値が、前記瞳の直径および前記チューブレンズの焦点距離によって画定される撮像光学系のｆ値と合致する、項目１６に記載の明視野顕微鏡。
（項目１８）
前記光検出器から受け取られる明視野データを処理するために構成されているコンピューティングデバイスを備えている、項目１に記載の明視野顕微鏡。
（項目１９）
前記コンピューティングデバイスは、前記明視野データから３次元画像を生成するために構成されている、項目１８に記載の明視野顕微鏡。
（項目２０）
サンプルから明視野画像を取得する方法であって、前記方法は、
前記サンプルを対物レンズの焦点面内に支持することと、
照明光を生成することと、
前記照明光を光シートとして集束させることと、
前記光シートを前記サンプル平面に対して非平行な照明方向に沿って前記サンプルに向けることによって前記サンプルを照射することであって、前記照射に応答して、前記サンプルは、検出光を放射する、ことと、
前記検出光をマイクロレンズアレイを通して光検出器に向けることと、
前記検出器において前記検出光の明視野パラメータを測定することと
を含む、方法。
（項目２１）
前記測定された明視野パラメータに基づいて、前記サンプルの３次元画像を生成することを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記サンプルは、前記照明方向に沿って厚さを有し、前記照明方向に沿って前記サンプルを走査することなく、前記測定された明視野パラメータに基づいて前記サンプルの３次元画像を生成することをさらに含む、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記照明方向は、前記サンプル平面に対して４５～１３５°の範囲内である、項目２０に記載の方法。
（項目２４）
前記サンプル平面に対して前記照明方向の角度を調節することを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２５）
前記サンプル平面に沿って前記サンプルを走査することを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２６）
明視野パラメータを測定する間、前記サンプルを容器内に支持することを含む、項目２０に記載の方法。
（項目２７）
前記サンプルを照射することは、前記照明光をダイクロイックミラーから前記サンプルに向かって反射することを含み、前記検出光を向けることは、前記検出光を前記ダイクロイックミラーを通して伝送することを含む、項目２０に記載の方法。

本発明は、以下の図を参照することによってより深く理解されることができる。図内の構成要素は、必ずしも正確な縮尺率ではなく、代わりに、本発明の原理の例証が、強調される。図では、同様の参照番号が、異なる図面全体を通して対応する部分を示す。

図１は、サンプルに対して選択的平面照明顕微鏡（ＳＰＩＭ）を実施するために採用される顕微鏡に関する従来の構成の概略図である。 図２は、光シート、またはより具体的には、従来のＳＰＩＭにおけるサンプルが位置付けられる領域内の光シートの一部（その長さは切頭状のｚ軸に沿う）の概略図である。 図３は、従来のＳＰＩＭにおける３Ｄ処理のために複数の画像を取得するためのサンプルの厚さの走査のプロセスの概略図である。 図４は、本明細書に開示される代表的な実施形態による明視野顕微鏡の例の概略図である。 図５は、本明細書に開示される実施形態による光シートによって照明されるサンプルの概略図である。 図６は、本明細書に開示される実施形態による容器内に配置される間に光シートによって照明されるサンプルの概略図である。 図７は、本明細書に開示される別の実施形態による明視野顕微鏡（またはその一部）の例の概略図である。 図８は、本明細書に開示される別の実施形態による明視野顕微鏡の例の概略図である。 図９は、本明細書に開示される別の実施形態による明視野顕微鏡の例の概略図である。 図１０は、本明細書に開示される別の実施形態による明視野顕微鏡の例の概略図である。

本明細書で使用されるように、用語「サンプル」は、概して、本明細書に説明されるように、撮像が所望され、サンプルステージに搭載可能である任意の物体または物質を指す。サンプルは、生物学的（例えば、生体細胞、組織、オルガノイド、スフェロイド、細胞内成分、胞子、菌類、糸状菌、細菌、ウイルス、皮膚細胞等の生物由来の粒子、有機堆積物等）または非生物学的（例えば、化学化合物、粒子状物質等）であり得る。サンプルは、生理学的物質、食品サンプル、環境サンプル等であり得る。サンプルは、部分的または全体的に液体または固体であり得る。サンプルは、血液から血漿を調製すること、粘着性流体を希釈すること、サンプルを区分すること、サンプルを染色すること、試薬を添加すること、蛍光色素分子または他の標識を添加すること等、使用に先立って事前処理され得る。事前処理の方法はまた、当業者によって理解されるように、濾過、沈殿、希釈、蒸留、濃縮、干渉成分の不活化、色層分析、分離のステップ等を伴い得る。

本明細書で使用されるように、用語「光」は、概して、光子として量子化可能な電磁放射線を指す。本開示に関するように、光は、紫外線（ＵＶ）から赤外線の（ＩＲ）の範囲に及ぶ波長で伝搬し得る。したがって、本開示では、用語「光」は、可視領域内の電磁放射線に限定するように意図されない。本開示では、用語「光」、「光子」、および「放射」は、同義的に使用される。

本明細書で使用されるように、「照明光」および「励起光」等の用語は、サンプルを照明する目的のために生成され、伝送される光を指す。実施形態に応じて、照明光（または励起光）は、広帯域光または狭帯域光（すなわち、１つの波長またはいくつかの波長に及ぶ範囲に限定される）であり得る。蛍光ベースの実施形態では、サンプル上に入射する照明光（または励起光）は、蛍光発光を誘発するために有効な波長を有する。便宜上、蛍光ベースまたは非蛍光ベースの実施形態のいずれかの場合、具体的に別様に示されない限り、または文脈が別様な状況を必要としない限り、用語「照明光」および「励起光」は、本明細書では同義的に使用される。

本明細書で使用されるように、「検出光」および「放射光」等の用語は、サンプルから伝搬し、サンプルの画像を取得するために収集され得る光を指す。非蛍光ベースの実施形態では、検出光（または放射光）は、サンプルから散乱または反射される光、または、それを通して伝送される光であり得る。そのような非蛍光性光は、概して、サンプル上に入射する照明光と同一の波長を有し得る。蛍光ベースの実施形態では、検出光（または放射光）は、少なくとも蛍光発光の結果としてサンプルから放射される光を含み、放射される光は、サンプル上に入射する照明光より長い波長を有する。蛍光ベースの実施形態では、非蛍光性光は、検出光経路から遮断、フィルタリング、またはそれから離れるように偏向され、蛍光性光のみが、光検出器上に入射し、サンプルの画像を取得するために利用される。便宜上、用語「検出光」および「放射光」は、具体的に別様に示されない限り、または文脈が別様な状況を必要としない限り、本明細書では同義的に使用される。

本明細書で使用されるように、用語「レンズ」は、当業者によって理解されるように、実施形態およびレンズの機能に応じて、単一のレンズまたはレンズ群（一連のレンズ）のいずれかを指し得る。

図１は、サンプルＳに対して選択的平面照明顕微鏡法（ＳＰＩＭ）を実施するために採用される顕微鏡に対する従来の構成の概略図である。例証の目的のために、図１は、直交座標系（ｘ，ｙ，ｚ）を含み、その起点（ｘ＝０，ｙ＝０，ｚ＝０）は、サンプルＳおよび他の図示される特徴に対して任意に位置付けられる。この文脈では、ｘ軸およびｙ軸は、横断面内に存在すると解釈される。サンプルＳ、または照明されている少なくともサンプルＳのスライスは、この文脈において横断面内に対応する（またはそれと平行である）サンプル平面内に存在する。ｚ軸は、横断面、したがって、サンプル平面と直交性の軸または方向であると解釈される。故に、サンプルＳの厚さは、ｚ軸（またはｚ方向）に沿って画定される。

従来のＳＰＩＭ顕微鏡は、概して照明軸Ｉに沿って伝搬する照明光１０４のための照明光経路を画定する照明光学系と、概して検出軸Ｄに沿って伝搬する検出光１０８のための検出光経路を画定する検出光学系とを含む。当業者によって理解されるように、照明光学系は、他の光学構成要素と同様に、照明対物レンズ１１２を含み、検出光学系は、他の光学構成要素と同様に、検出対物レンズ１１６を含む。検出対物レンズ１１６は、（ｘ－ｙ横断面内の）焦点面ＦＰを有し、焦点が合った画像が、ＦＰにおいて検出光１０８を受け取る光検出器（図示せず）によって取得され得る。光シート顕微鏡法（ＬＳＭ）のタイプとして、照明光学系は、照明光１０４を薄く平面状の光シートに集束させるように構成され、すなわち、ビームは、実質的に直線的な断面を有する。図２は、光シート２２０、またはより具体的には、サンプルＳが位置付けられる領域内の光シート２２０の一部（ｚ軸に沿うその長さは、切り詰められている）の概略図である。従来のＳＰＩＭのさらなる特性として、（Ｘ軸に沿った）照明軸Ｉ（光シート２２０がそれに沿って伝搬する）は、（ｚ軸に沿った）検出軸Ｄ検出光１０８がそれに沿って伝搬するに対して直角である。さらに、サンプルＳは、サンプル平面が焦点面ＦＰ内に存在し、故に、検出軸Ｄに対して直角であるように位置付けられ、向けられ、光シート２２０は、光シート２２０がサンプルＳを通過するにつれて、焦点面ＦＰ（したがって、サンプル平面）に沿って伝搬する。故に、ＳＰＩＭは、事実上、サンプルＳを光学的に区分し、すなわち、サンプルＳの（ｚ軸方向の）厚さの小さい部分のみが、光シート２２０によって照明される。

図２に示されるように、光シート２２０がｘ軸に沿って進行するにつれて、（ｚ軸方向の）光シート２２０の厚さは、焦点、すなわち、「ビームウエスト」２２４に収束し、次いで、より大きい厚さに発散して戻る。照明光学系は、ビームウエスト２２４がサンプルＳを含むサンプルチャンバ（図示せず）内にあり、ビームウエスト２２４が焦点面ＦＰに存在するように、光シート２２０を位置付ける。概して、ビームウエスト２２４は、検出対物レンズ１１６の視野（ＦＯＶ）の中心に位置付けられ、かつサンプルＳの中心領域内に位置付けられる。

広視野顕微鏡法および共焦点顕微鏡法等の他の従来の技法と比較して、ＳＰＩＭは、ＳＰＩＭがサンプルＳを薄い光シート２２０（サンプル平面／焦点面ＦＰの周囲のサンプルＳの薄い体積または区分）にのみにさらすので、光退色、光損傷（例えば、光毒性）、および加熱のより低いリスクを伴ってサンプルＳを撮像することができる。しかしながら、ＳＰＩＭは、欠点を有する。共焦点顕微鏡法および他の従来の顕微鏡法の場合におけるように、３Ｄ撮像は、検出軸Ｄに沿ってサンプルＳを走査（または焦点面ＦＰを走査）し、複数の（本質的には２Ｄの）画像を徐々に（段階的に）取得し、それによって、画像のスタック（ｚスタック）を生成することを要求し、その後、複数の２Ｄ画像から３Ｄ画像を提供するための後処理が続く。図３は、従来のＳＰＩＭにおける３Ｄ処理のために複数の画像を取得するためのサンプルＳの厚さの走査のプロセスの概略図である。サンプルＳは、検出軸Ｄの複数の位置を通して、図３の両矢印によって示されるようなものに沿って一方または両方の方向に走査される。サンプルＳは、典型的には、電動式手段によって、サンプルＳを照明軸Ｉに対して検出軸Ｄに沿って移動させること、またはサンプルＳに対して照明軸Ｉを移動させることのいずれかによって走査される。図３は、３つの平行移動位置Ａ、Ｂ、およびＣを図示し、Ａ、Ｂ、およびＣにおいて、照明軸Ｉ（および焦点面ＦＰ、図１）が、サンプルＳを走査することの一部として位置付けられ、３Ｄ処理のためのｚスタックを構築し得る。別個の画像が、各位置Ａ、Ｂ、およびＣで取得され、デジタル的に記憶されなければならない。そして、そのように取得された画像の全ては、３Ｄ画像を構成するために、種々のソフトウェアに実装されたアルゴリズムを実行することによって処理されなければならない。３つの平行移動位置Ａ、Ｂ、およびＣのみの例証は、単純化のためであり、多くのさらなる画像（例えば、１００）が、走査プロセス中に取得されることに留意されたい。

別の欠点は、光シート照明が、一方の側からサンプルＳに進入し、光シート２２０が他方の側に向かってサンプルＳを通過するにつれて不透明な構造に直面する光シート２２０に起因して、影アーチファクトまたは縞を画像内に出現させ得ることである。Ｓａｎｔｉ，Ｐｅｔｅｒ Ａ．，Ｌｉｇｈｔ Ｓｈｅｅｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．５９（２），ｐ．１２９－１３８（２０１１）および米国特許第９，１３４，５２１号（その内容は、参照することによって全体として本明細書に組み込まれる）を参照されたい。さらに、サンプル平面は、一方の側のみからサンプルＳに進入する光シート２２０に起因して非均一に照明され得る。すなわち、光シート２２０がサンプルＳを通過するにつれての光吸収に起因して、光シート２２０が進入する側に最も近いサンプル平面部分が、光シート２２０が進入する側から最も遠いサンプル平面部分と比較してより良好に照明される。「両面照明」技法が、第１の照明対物レンズ１１２と反対のサンプルの側に第２の照明対物レンズを追加し、照明光１０４の第２の光シートを用いてサンプルＳを照射することによってこれらの問題に対処するために、開発された。しかしながら、追加の照明光経路は、顕微鏡のコストおよび複雑性を増加させる。さらに、両面照明は、（サンプルＳの厚さを通して検出軸Ｄに沿って）ｚ方向への光散乱を増加させ、それは、焦点外照明を増加させ、したがって、画像品質を低下させる。上で言及された米国特許第９，１３４，５２１号は、両面照明の問題に対処するための多方向ＳＰＩＭ（ｍＳＰＩＭ）と称される技法を開示し、それも、２つの異なる照明光経路の使用を必要とするが、代替の方式では、サンプルＳを交互に照明するような使用を必要とする。故に、ｍＳＰＩＭ技法は、要求されなければならない別個の画像の数を増やし、したがって、要求される計算上の画像統合の量を増加させる。ｍＳＰＩＭ技法は、サンプルＳを検出軸Ｄの周りに異なる角度位置に回転させることも必要とし、したがって、必要とされなければならない別個の画像の数をさらに増やし、顕微鏡のコストおよび複雑性をさらに増加させる。さらに、サンプル平面に対して２つ以上の光シートを適切に位置合わせすることは、困難であり得、それは、良好に集束させられた画像を取得するための能力を損なう。

加えて、ちょうど説明されたそれら等の公知のＳＰＩＭ技法は、典型的には、生理学的溶液または透明な溶液等の液体で満たされるサンプルチャンバを採用する。サンプルＳは、ロッドに取り付けられ、ロッドは、チャンバの中に挿入され、ステージに取り付けられ、ステージは、サンプルＳを平行移動させ、回転させるように動作させられる。これらの技法は、ガラスの顕微鏡スライド、マルチウェルマイクロプレート、および他のサンプル容器等の実験室内で一般的に見出されるサンプル支持器の使用と容易に適合的ではない。特に、サンプルＳが、マイクロプレートのウェル内または別のタイプの容器内に含まれるとき、「側面からの照明」技法は、実現可能ではない。

ここで、さらに詳細に説明されるであろうように、本開示は、光強度情報のみを捕捉する従来の撮像技法と比較して、明視野撮像法に基づいた迅速な３Ｄ撮像技法を実装するように構成されている顕微鏡を提供する。本明細書に開示される顕微鏡は、明視野撮像法を選択的照明方法と組み合わせ、選択的照明方法は、上で説明されるもの等の従来のＳＰＩＭ技法と比較して、実質的に異なる様式で光シートを利用する。本明細書に開示されるような顕微鏡の１つ以上の実施形態は、蛍光ベースであり得る。本明細書に開示されるような顕微鏡の１つ以上の実施形態は、特に、オルガノイドおよびスフェロイド等の複雑かつ機能的な生体サンプルから画像データを生成するために有用である。本明細書に開示されるような顕微鏡の１つ以上の実施形態は、容易に利用可能なある顕微鏡構成要素を利用し得、例えば、顕微鏡スライド、マルチウェルマイクロプレート、および、例えば、ガラス瓶、キュベット、試験管、サンプルセル、フローセル等の他のタイプのサンプル容器等の異なるタイプのサンプル支持器と適合性があり得る。本明細書に開示される顕微鏡は、落射蛍光構成において構築され得る。本明細書に開示される顕微鏡は、独立型器具として提供され得るか、または例えば、サンプルに対して異なるタイプの光学ベースの（例えば、蛍光、ルミネセンス、吸光）測定を実行するために構成されているマルチモードリーダ等の他のタイプの分析器具と統合され得る。

図４は、本明細書に開示される代表的な実施形態による明視野顕微鏡４００の例の概略図である。概して、種々のタイプの顕微鏡の構造および動作は、当業者によって理解されており、したがって、本明細書に教示される主題の理解を促進するために、顕微鏡４００のある構成要素および特徴は、手短にのみ説明される。顕微鏡４００は、概して、照明光（励起光）４０４を生成するために構成されている光源４２４と、分析下のサンプル（図示せず）を支持するためのサンプルステージ４２８と、検出光（放射光）４０８を収集する（その画像を捕捉する）ために構成されている光検出器（または画像センサ）４３２と、光源４２４からサンプルステージ４２８におけるサンプルへの照明（または励起）光経路を画定（すなわち、確立または提供）するための種々の照明光学系と、サンプルから光検出器４３２への検出（または放射）光経路を画定するための種々の検出光学系とを含み得る。いくつかの実施形態では、顕微鏡４００は、特定の励起波長でサンプルを励起し、励起に応答してより長い波長でサンプルから放射される蛍光性光を検出するために構成され得る。そのような実施形態では、当業者によって理解されるように、蛍光剤または蛍光色素分子（例えば、フルオレセイン）が、サンプルに添加され得る。そのような実施形態では、顕微鏡４００は、図４に図示されるような落射蛍光構成で構築され得る。他の実施形態では、顕微鏡４００は、サンプルを照明するために利用される光と実質的に同一の波長でサンプルから反射または散乱（またはそれを通して伝送）される光を検出するために構成され得る。

概して、光源４２４は、光（光学）顕微鏡法のために好適な任意の光源であり得る。例えば、光源４２４は、発光ダイオード（ＬＥＤ）またはソリッドステートレーザ等のソリッドステート光源であり得るか、または代替として、半導体ベースのレーザ（レーザダイオードまたはＬＤ）であり得る。いくつかの実施形態では、光源４２４は、異なる波長の光を生成する複数の光源（例えば、複数のＬＥＤ）を含み得る。そのような光源は、電動式ホイール（図示せず）等の波長選択器に搭載され得、波長選択器は、当業者によって理解されるように、所与の用途において利用されるべき光源（したがって、励起光の波長）の自動（コンピュータ化）選択を可能にする。いくつかの実施形態では、光源４２４は、所望される励起波長の光のみが通過することを可能にする励起フィルタ４３６と併せて動作する広帯域光源であり得る。

サンプルステージ４２８は、サンプルがサンプルステージ４２８によって位置付けられ、支持されるサンプル平面として図式的に描写されている。サンプルステージ４２８は、概して、任意のプラットフォームであり得、それは、サンプル、または、サンプルおよびサンプルを支持する基材（例えば、顕微鏡スライド、マイクロプレート、他の容器）をその上の固定位置に支持する。他の図面におけるように、例証の目的のために、図４は、直交座標系（ｘ，ｙ，ｚ）を含み、その起点（ｘ＝０，ｙ＝０，ｚ＝０）は、図示される顕微鏡４００に対して任意に位置付けられる。この文脈では、ｘ軸およびｙ軸は、横断面内に存在すると解釈され、ｚ軸は、横断面、したがって、サンプル平面に対して直角である軸または方向であると解釈される。故に、サンプルの厚さは、ｚ軸（またはｚ方向）に沿って画定される。いくつかの実施形態では、サンプルステージ４２８（したがって、その上のサンプル）は、当業者によって理解されるように、手動作動、または例えば、制御される精密マイクロモータを利用することによる電動作動によって可動であり得る。すなわち、サンプルステージ１０８の位置は、ユーザによってｘ軸、ｙ軸、および／またはｚ軸に沿って調節可能であり得る。例として、図１では、サンプルステージ４２８上方の矢印が、ｘ軸に沿った移動を示す。いくつかの実施形態では、１つ以上の軸に沿って平行移動可能であることに加え、サンプルステージ１０８は、１つ以上の軸の周りに回転可能であり得る。

概して、光検出器４３２は、例えば、カメラの基礎を形成するタイプの撮像デバイス等の光顕微鏡法に好適な任意の撮像デバイスであり得る。典型的な実施形態では、光検出器４３２は、例えば、電荷結合素子（ＣＣＤ）、または相補形金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）技術に基づく能動ピクセルセンサ（ＡＰＳ）等のマルチピクセル（またはピクセルで構成された）撮像デバイスである。いくつかの実施形態では、顕微鏡４００は、接眼レンズ（別個に示さず）も含み、それは、ユーザがサンプルを視認することを可能にし得、その場合、適切な光学構成要素（例えば、ビーム分割器）が、検出光４０８が光検出器４３２および接眼レンズの両方に向かわせられるように検出光経路を分割するために提供される。したがって、図１の光検出器４３２は、撮像デバイス、または撮像デバイスおよび接眼レンズの両方を図式的に表すと考えられ得る。

本実施形態では、照明光経路を画定する光学系（光学構成要素）は、集光レンズ４４０と、円筒レンズ４４４等の光シート焦点調整デバイスと、ビーム分割器４４８（例えば、ダイクロイックビーム分割器または鏡）と、（特に、蛍光ベースの実施形態における）励起フィルタ４３６と、対物レンズ４５２とを含む。実施形態に応じて、当業者によって理解されるように、例えば、他のレンズ（例えば、コリメートレンズ、中継レンズ、視野レンズ等、ビーム拡大器、他の鏡等）等の他の光学系も、含まれ得る。例えば、開口絞りおよび視野絞り（図示せず）が、含まれ得、それは、光源４２４と集光レンズ４４０との間に位置付けられ、光源４２４によって放射される照明光４０４の伝送をｘ方向およびｙ方向において限定し得る。

集光レンズ４４０は、光源４２４によって生成される照明光４０４を収集し、照明光４０４を集中させるために構成されている任意のレンズであり得る。円筒レンズ４４４は、集光レンズ４４０から受け取られた照明光４０４を薄く、平面状の光シート４５６の中に集束させるために構成されている任意のレンズであり得る。光シート４５６は、図２と併せて上で説明されるように、断面の１つの寸法（例えば、長さ）が、断面の他方の寸法（例えば、幅）を実質的に上回る概ね線形の断面を有することによって特徴付けられる。光シート４５６は、さらに下記に説明されるように、その厚さに沿ったサンプルの選択的照明のために利用される。光源４２４が、レーザビーム等の小径ビームを生成する場合、ビーム拡大器（図示せず）が、光源４２４と円筒レンズ４４４との間の照明光経路内に設置され、円筒レンズ４４４をより完全に充填し得る。円筒レンズ４４４の代わりとして、好適な代替は、開口絞りに提供され得るようなスリットであり得る。

ビーム分割器４４８が、いくつかの実施形態に含まれ、特に、図１に図示されるような落射蛍光装置を採用する実施形態に含まれる。ビーム分割器４４８は、照明光４０４のために予期される波長の光を反射し、かつ検出光４０８のために予期される波長の光を伝送するように構成されている。いくつかの実施形態では、ビーム分割器４４８は、異なる光学反射／伝送特性を有する複数のビーム分割器を含み得る。そのようなビーム分割器は、所望される反射／伝送スペクトルを伴うビーム分割器の自動（コンピュータ化）選択を可能にする電動式ホイール（図示せず）等の波長選択器に搭載され得る。ビーム分割器４４８は、可動であり得、すなわち、ビーム分割器４４８の位置は、調節可能であり得る。図示される実施形態では、ビーム分割器４４８は、図４の湾曲した矢印によって示されるように、ｘ軸の周りに回転可能であり、サンプル平面に対する照明軸Ｉの角度が調節されることを可能にする。この文脈では、照明軸Ｉは、光シート４５６がサンプル上に入射するとき、光シート４５６（照明光４０４）が伝搬する方向である。故に、照明軸Ｉの角度は、光シート４５６の入射角度である。本実施形態では、照明軸Ｉは、光シート４５６がビーム分割器４４８によって反射された後に伝搬する方向である。

対物レンズ４５２は、サンプルから発出する検出光４０８を収集し、検出光４０８を光検出器４３２上に集束させるために構成されている任意のデバイスであり得る。顕微鏡４００が落射蛍光構成を有する本実施形態では、対物レンズ４５２は、照明光経路Ｉおよび検出光経路Ｄ内に存在し、したがって、それも、照明光４０４（光シート４５６として）をサンプル上に伝送し、集束させるために構成されている。したがって、本実施形態では、（ビーム分割器４４８による偏向後の）照明光軸Ｉと検出光軸Ｄとは、一致し、照明および検出のための別個の対物レンズが、必要とされない。図示されるように、対物レンズ４５２は、対物レンズ４５２とビーム分割器４４８との間で対物レンズ４５２の正面において、瞳４６０を有する。

本実施形態では、検出光経路を画定する光学系（光学構成要素）は、対物レンズ４５２と、（それを通して検出光４０８を伝送するように構成されている）ビーム分割器４４８と、（特に、蛍光ベースの実施形態における）放射フィルタ４６４と、（特に、対物レンズ４５２が無限補正対物レンズであるときの）チューブレンズ（ｔｕｂｅ ｌｅｎｓ）４６８と、マイクロレンズアレイ４７２とを含む。

マイクロレンズアレイ４７２は、好適な基材上に支持される近接して群化されたマイクロレンズまたはレンズレット（ｌｅｎｓｌｅｔ）（約数マイクロメートル～数ミリメートルの直径を有するレンズ）の（典型的には、２Ｄの）アレイである。マイクロレンズアレイ４７２は、当業者に公知である微細加工技法を使用して構成され得る。マイクロレンズは、円形であり、マイクロレンズの支持基材上での近接した群化を可能にする六角形パターンで配列され得る。代替として、マイクロレンズは、正方形であり、支持基材上にグリッド様のパターンでは配列され得る。いくつかの実施形態では、マイクロレンズは、平凸である。マイクロレンズアレイ４７２は、光強度のみに基づく画像の代わりに、光検出器４３２がサンプルの照明される領域に関連付けられた明視野を捕捉することを可能にする様式で、光を光検出器４３２の能動感知要素上に集束させるように構成されている。故に、マイクロレンズアレイ４７２は、顕微鏡４００が明視野顕微鏡として機能することを可能にする。明視野は、光線の束の観点から定義され得、各光線は、大きさ（強さ）と、方向とを有する。光線の大きさは、放射輝度、すなわち、ワット（Ｗ）／平方メートル（ｍ^２）／ステラジアン（ｓｒ）で測定され得る光線に沿って進行する光の量によって与えられ得る。各光線の方向は、当業者によって理解されるように、空間座標および角度の両方に依存する多次元プレノプティック関数によって与えられ得る。１つの例として、光線は、４Ｄ関数Ｌ（ｕ，ｖ，ｓ，ｔ）によって表され得、Ｌは、２面パラメータ表現であり、２面パラメータによって、光線は、ｕ－ｖ平面上の点を通過し、そして、ｓ－ｔ平面上の点を通過すると考えられる。光線の位置および方向の両方に関する情報が、光検出器４３２によって取得され、サンプルの画像を生成するために利用される。マイクロレンズアレイ４７２は、例えば、数千または数百万ものマイクロレンズを含み得る。いくつかの実施形態では、光検出器４３２によって提供される能動感知要素（例えば、ピクセル）の数は、１つのマイクロレンズを通して伝送される光線が、いくつかの能動感知要素によって感知され得るように、マイクロレンズアレイ４７２によって提供されるマイクロレンズの数を実質的に上回る。いくつかの実施形態では、マイクロレンズは、隣接するマイクロレンズを通して伝送される光線が、互いに重複しないように、光検出器４３２のセンサに対してサイズを決定され、位置付けられる。

マイクロレンズアレイ４７２は、対物レンズ４５２またはチューブレンズ４６８等の光学列内の光学構成要素のうちの１つによって作成される中間画像平面等の画像平面に位置付けられ得る。いくつかの実施形態では、図示されるように、マイクロレンズアレイ４７２は、チューブレンズ４６８と光検出器４３２との間に位置付けられ得る。他の実施形態では、チューブレンズ４６８が、含まれず、マイクロレンズアレイ４７２が、事実上、チューブレンズ４６８に取って代わる。いくつかの実施形態では、マイクロレンズアレイ４７２は、光検出器４３２からマイクロレンズアレイ４７２のマイクロレンズの１焦点距離ｆに等しい距離を置いて位置付けられ得る。レンズの焦点距離ｆは、当業者によって理解されるように、レンズからその焦点（場面からの光線が収束する画像点）までの距離である。いくつかの実施形態では、マイクロレンズアレイ４７２のｆ値は、チューブレンズ４６８の瞳の直径および焦点距離によって定義される撮像光学系のＦ値に合致する。ｆ値は、当業者によって理解されるように、Ｎ＝ｆ／Ｄと表され得、ｆは、焦点距離であり、Ｄは、レンズの入射瞳の直径（有効口径）である。

図４を参照すると、顕微鏡４００は、光検出器４３２と電気通信するコンピューティングデバイス（またはシステムコントローラ）４７６をさらに含み得る。コンピューティングデバイス４７６は、光検出器４３２によって捕捉された明視野画像を受け取り、画像をデジタル化し、記録するように構成され得る。コンピューティングデバイス４７６は、３Ｄレンダリングのために有用である逆重畳アルゴリズムおよび／または他のアルゴリズムを実行することによって等、サンプルの３Ｄ画像を生成するために必要とされるように、捕捉された明視野データを処理するようにも構成され得る。コンピューティングデバイス４７６は、コンピュータスクリーン等の表示デバイス上に画像を表示するために、かつユーザが画像の表示を所望される様式で改良または制御することを可能にするために必要とされるように、３Ｄ画像を処理するようにも構成され得る。概して、これらの目的のために、コンピューティングデバイス４７６は、当業者によって理解されるように、（マイクロプロセッサ、メモリ等の）ハードウェアと、ソフトウェア構成要素とを含み得る。例えば、コンピューティングデバイス４７６は、全体制御を提供するメイン電子プロセッサ等のプロセッサと、専用制御動作または特定の信号処理タスクのために構成されている１つ以上の電子プロセッサ（例えば、グラフィック処理ユニット、すなわち、ＧＰＵ）とを含み得る。コンピューティングデバイス４７６は、データおよび／またはソフトウェアを記憶するための（揮発性および／または不揮発性の）１つ以上のメモリも含み得る。コンピューティングデバイス４７６は、１つ以上のタイプのユーザインターフェースデバイスを制御し、ユーザインターフェースデバイスとコンピューティングデバイスの構成要素との間にインタフェースを提供するための１つ以上のデバイス駆動部を含み得る。表示デバイスに加え、そのようなユーザインターフェースデバイスは、他のユーザ出力デバイス（例えば、プリンタ、可視インジケータまたは可視アラート、可聴インジケータまたは可聴アラート等）を含み、ユーザ入力デバイス（例えば、キーボード、キーパッド、タッチスクリーン、マウスコントローラ、ジョイスティック、トラックボール等）も含み得る。コンピューティングデバイス４７６は、メモリ内および／または１つ以上のタイプのコンピュータ読み取り可能な媒体上に含まれる１つ以上のタイプのコンピュータプログラムまたはソフトウェアも含み得る。コンピュータプログラムまたはソフトウェアは、本明細書に開示される方法の任意のものの全てまたは一部を実施するための命令（例えば、論理命令）を含み得る。コンピュータプログラムまたはソフトウェアは、アプリケーションソフトウェアおよびシステムソフトウェアを含み得る。システムソフトウェアは、ハードウェアとアプリケーションソフトウェアとの間の相互作用を含むコンピューティングデバイス４７６の種々の機能を制御し、管理するためのオペレーティングシステム（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）オペレーティングシステム）を含み得る。特に、オペレーティングシステムは、ユーザ出力デバイスを介して表示可能なグラフィックユーザインターフェース（ＧＵＩ）を提供し得、ユーザは、それを用いてユーザ入力デバイスの使用と相互作用し得る。コンピューティングデバイス４７６は、ＧＵＩによってグラフィック形態で提供するためのデータのフォーマット化および３Ｄ画像の生成等を含む光検出器４３２によって捕捉された撮像データを受信し、処理するための（ハードウェア、ファームウェア、および／またはソフトウェアで具現化され得るような）１つ以上のデータ取得／信号調整構成要素も含み得る。

図１は、本開示と一貫した顕微鏡１００の例の高レベルの概略図であることを理解されたい。当業者によって理解されるように、図１に具体的には示されていない他の光学系、電子機器、および機械的構成要素、および構造が、実践的な実装のために必要に応じて含まれ得る。

顕微鏡４００の一般的な動作の例として、調査下のサンプルが、必要に応じて顕微鏡法のために調製され、次いで、サンプルステージ４２８に搭載され得る。典型的には、サンプルは、好適なサンプル支持器（ガラススライド、マルチウェルプレートのウェル、他のタイプの受器等）上に支持され（その上に搭載され、それによって保持され、その中に含まれる等）、サンプル支持器は、次いで、サンプルステージ４２８に搭載される。光源４２４は、次いで、アクティブ化され、実施形態に応じて広帯域光または狭帯域光（例えば、所望される波長を中心とする）であり得る照明光４０４を生成する。本実施形態では、照明光４０４は、励起フィルタ４３６によって波長フィルタリングされる。照明光４０４は、集光レンズ４４０に向けられ、それによって集中させられる。照明光４０４は、次いで、照明光４０４を光シート４５６の中に集束させる円筒レンズ４４４に向かわせられる。照明光４０４は、次いで、ビーム分割器４４８によってサンプルに向かって反射され、それによって、照明光４０４は、照明軸Ｉ（ｚ軸）に沿うように伝搬する。本実施形態では、サンプル平面（ｘ－ｙ横断面）に対する照明軸の角度が、ビーム分割器４４８の向きによって決定される。照明光４０４は、次いで、対物レンズ４５２によってサンプルの選択される領域上に集束させられる。サンプル上への照明光４０４の入射は、依然として光シート４５６の形態で行われる。

照明に応答して、サンプルは、本実施形態では蛍光性光である検出光４０８を放射する。対物レンズ４５２は、検出光４０８を収集し、検出光４０８を画像平面に集束させる。代替として、チューブレンズ４６８が含まれる場合、対物レンズ４５２は、検出光４０８をチューブレンズ４６８に伝送し、チューブレンズ４６８は、検出光４０８を画像平面に集束させる。いずれの場合でも、ビーム分割器４４８は、検出光４０８が反射され、または減衰させられることなくビーム分割器４４８を通過することを可能にするように構成されている。本実施形態では、検出光４０８は、放射フィルタ４６４によって波長フィルタリングされる。本実施形態では、画像平面に位置付けられるマイクロレンズアレイ４７２は、検出光４０８の光線を光検出器４３２の能動感知要素上に集束させる。光検出器４３２は、明視野画像情報を電気信号としてコンピューティングデバイス４７６に出力し、コンピューティングデバイス４７６は、信号を処理し、サンプルの照明される領域の３Ｄ画像を生成する。

本実施形態では、サンプルが、光シート４５６によって照明され、それによって、選択的照明、すなわち、サンプルの選択された領域の照明を可能にする。図５は、本明細書に開示される実施形態による光シート４５６によって照明されるサンプルＳの概略図である。光シート４５６は、サンプルＳ内に位置付けられ得るビームウエスト５２４を有する。光シート４５６の照明軸Ｉ、したがって、照明の平面は、図１－３と併せて上で説明されるようなもの等の従来のＳＰＩＭ関連技法のそれと異なる。従来のＳＰＩＭでは、光シートは、サンプル平面（ｘ－ｙ）と平行である照明軸に沿って向けられる。故に、サンプルＳ全体の上の画像情報を得るために、従来のＳＰＩＭおよび共焦点顕微鏡技法は、サンプルＳがｚ方向に走査され、かつ別個の画像が走査の各反復において取得されることを要求する。次いで、複数の画像が、適切に処理され、サンプルの３Ｄビューを構成することが必要である。対照的に、本実施形態では、光シート４５６の照明軸Ｉが、サンプル平面と非平行な方向に向けられる。図４および５に具体的に図示される例では、光シート４５６は、サンプル平面に対して９０°、すなわち、直接ｚ軸に沿って向けられる。より一般的に、光シート４５６（したがって照明軸Ｉ）の角度は、サンプル平面に対して０～１８０°の範囲内であり得るが、実践では、光シート４５６の角度の範囲は、対物レンズ４５２および／または光学列の他の構成要素の物理的制約によって限定される。例えば、光シート４５６（したがって、照明軸Ｉ）の角度は、サンプル平面に対して４５～１３５°の範囲内であり得る。任意のそのような角度において、本実施形態では、光シート４５６によって提供される照明の選択される平面は、サンプルＳの厚さを通して（サンプルＳの選択される領域内に）向けられる。光シート４５６の角度または方向がｚ方向成分を有するので、本明細書に開示されるような光シート４５６は、「垂直」光シートと称され、それは、従来のＳＰＩＭに採用される「水平」光シートと対照をなし得る。

従来のＳＰＩＭと同様に、サンプルＳの照明を選択された平面（すなわち、平面の周囲の薄い体積）に限定することは、背景信号を低減させ、したがって、画像内により高いコントラストを生成し、サンプルＳの光退色、光損傷、および加熱（および生体サンプル内の応力）を低減させる。しかしながら、垂直の光シート４５６を用いて（すなわち、サンプル平面に対して９０°または他の非平行角度に向けられた状態で）、顕微鏡４００は、追加の利点を提供する。顕微鏡４００は、図４および５に示されるようなものと同様の一般的な落射照明タイプの構成を伴って構築され得、照明軸Ｉは、検出軸Ｄと一致している。そのような構成は、対物レンズ、ビーム分割器等の容易に利用可能な光学構成要素が利用されることを可能にする。

さらに、垂直の光シート４５６は、顕微鏡４００を多種多様なサンプル支持器（例えば、ガラススライド、マルチウェルマイクロプレート、ガラス瓶等）と適合性のあるものにする。図６は、本明細書に開示される実施形態による容器６８０内に配置されながら光シート４５６によって照明されるサンプルＳの概略図である。容器６８０は、アレイに配列される複数の容器６８０のうちの１つであり得る。例として、容器６８０は、ラック等によって支持されるマイクロプレートのウェル、ガラス瓶、または試験管であり得る。サンプルＳは、液体Ｌ内に浸漬され得る。他のサンプルは、他の容器６８０内に配置され得、同一の液体または異なる液体、同一の溶媒であるが異なる試薬を含むもの、または異なる複数の溶媒組成内に浸漬され得る。容器６８０の側面壁、および隣接する容器６８０間の固体媒体（例えば、マイクロプレートの固体構造）は、垂直の光シート４５６に干渉しない。さらに、容器６８０のタイプに応じて、光シート４５６は、容器６８０の固体構造に遭遇することなく、サンプルＳに対するある角度の範囲にわたって走査され得る。

追加の利点として、顕微鏡４００が、光強度データのみの代わりに、明視野データを取得するので、（少なくとも、顕微鏡４００によって撮像されるべきタイプの大部分のサンプルに対して）サンプルＳは、検出軸Ｄ（ｚ方向）に沿ってその厚さを通して走査される必要はない。すなわち、単一の明視野画像のみが、取得される必要があり、ｚスタックを導出するために、またはサンプルＳの３Ｄ画像を生成するために、デジタル後処理のみが（例えば、コンピューティングデバイス４７６によって）実施される必要がある。１つの非限定的な例として、使用可能なｚ範囲Δｚ（図５および６）は、典型的には、対物レンズ４５２の被写界深度より６～１０倍大きい。０．４ＮＡを特徴とする２０倍対物レンズに対して、公称のＤＯＦは、８μｍであり、その場合、典型的な明視野取得は、オルガノイドの撮像のための合理的な尺度である約５０μｍのアクセス可能なｚ範囲をもたらすであろう。Δｚにおける別の限界が、光シート４５６の長さによって設定される。ガウス光学に従って、光シート４５６は、対物レンズ４５２の焦点においてｙ寸法においてビームウエスト５２４を展開するであろう。光シート４５６の長さΔｚは、ビームウエスト５２４からの最大許容可能距離±（１／２）Δｚによって定義される。限界が、ｚの関数として、最大許容可能ビーム断面によって定義される。しかしながら、光源４２４（レーザ、ＬＥＤ等）の特性、コリメート光学系（例えば、円筒レンズ４４４）および瞳サイズ、対物レンズ４５２の開口数および焦点距離に応じて、光シート４５６の長さは、最高数ミリメートルであり得る。

本開示で前に記載したように、過去の研究では、明視野撮像法は、例えば、利用される最終再構成アルゴリズムにおける曖昧さに起因する画像アーチファクトおよび背景雑音を生成する。しかしながら、選択的平面照明が明視野撮像法と併せて実装される本明細書に開示される実施形態は、アーチファクトを低減させることによってサンプルの再構成された３Ｄ画像の品質を改良するであろう。

本明細書に開示される実施形態がサンプルＳのｚ方向における走査の要件を排除し得るが、サンプルＳのサイズおよび／または対物レンズ４５２の視野（ＦＯＶ）に応じて、サンプルＳ全体において画像情報を獲得することは、横断面を通した、例えば、ｘ方向またはｙ方向に沿ったサンプルＳの走査を要求し得る。サンプルＳの走査は、サンプルＳ自体を光シート４５６に対して移動（平行移動および／または回転）させることによって、および／または光シート４５６をサンプルＳに対して移動（平行移動および／または回転）させることによって行われ得る。１つの例として、サンプルステージ４２８は、図４のサンプルステージ４２８上方の矢印および図５のサンプルＳ上方の矢印によって示されるように、サンプルを平行移動するように構成され得る。別の例として、ビーム分割器４４８（すなわち、「走査鏡」）または照明光経路内の他のビーム指向構成要素は、この場合、サンプル上への光シート４５６の入射角度を調節することによって、サンプルを通して光シート４５６を走査するように（図４の湾曲した矢印によって示されるように）回転するように構成され得る。

図７は、別の実施形態による明視野顕微鏡７００（またはその一部）の例の概略図である。概して、顕微鏡７００は、上で説明され、図４に図示される顕微鏡４００の構成要素と同一または同様である構成要素を含み得る。しかしながら、本実施形態では、走査鏡４４８が、対物レンズ４５２の瞳に位置付けられる。この構成は、テレセントリックな条件を維持する利点である。顕微鏡光学系は、一定の視野角（好ましくは９０°）を場全体を横断した試料上に提供することによってテレセントリックであることから恩恵を得る。その結果、ＳＰＩＭに対して、これは、場全体を横断する試料に対する光シート４５６の一定の傾斜角度を意味する。１つ以上の追加の鏡７８４が、照明光経路内に提供され、図７に示されない検出光経路の光学系、例えば、上で説明され、図４に図示される放射フィルタ４６４、チューブレンズ４６８、マイクロレンズアレイ４７２、および光検出器４３２のための空間的収容を提供し得る。走査鏡４４８または別の鏡７８４のいずれかが、ビーム分割器として構成され得、検出光経路の光学系が、それに応じて位置付けられ得る。

図８は、別の実施形態による明視野顕微鏡８００の例の概略図である。概して、顕微鏡８００は、上で説明され、かつ図４に図示される顕微鏡４００の構成要素と同一または同様である構成要素を含み得る。しかしながら、本実施形態では、顕微鏡８００は、次いで、サンプル上に複数の光シート８５６として集束させられる複数の照明光ビーム８０４を生成するために構成されている光源８２４を含む。それに応答して、サンプルは、複数の検出光ビーム８０８を放射し得る。光源８２４は、例えば、複数の点源（例えば、複数のＬＥＤまたはレーザ放射体）、または光源と集光レンズ４４０との間の開口絞りに位置付けられる複数のピンホールまたはスリットに光を向ける１つ以上の光源を含み得る。スリットが提供されるとき、円筒レンズ４４４が、必要とされないこともある。別の例として、光源８２４は、デジタルマイクロミラーデバイス（ＤＭＤ）、シリコン上液晶（ＬＣｏＳ）デバイス、または液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）デバイスを含むか、またはそれに基づき得るもの等のアクティブな投射デバイスを含み得る。

図９は、別の実施形態による明視野顕微鏡９００の例の概略図である。概して、顕微鏡９００は、上で説明され、かつ図４に図示される顕微鏡４００の構成要素と同一または同様である構成要素を含み得る。しかしながら、本実施形態では、顕微鏡９００は、集束ガリレオ式構成を有する。このアプローチは、検出器位置におけるマイクロレンズアレイ４７２によって形成されるマイクロ画像内の詳細点を活用することによって、図４に示される顕微鏡４００の構成と比較して横方向の解像度の観点からの改良を可能にする。しかしながら、再構成アルゴリズムは、顕微鏡４００のために使用されるそれらと比較して異なり、対応に基づくステレオ投影に依拠する。用語「ガリレオ式」は、ガリレオタイプ望遠鏡との類似性を有する望遠鏡９００の光学レイアウトを指す。いくつかの実施形態では、マイクロレンズアレイ４７２は、チューブレンズ４６８に完全に取って代わり得る。

図１０は、別の実施形態による明視野顕微鏡１０００の例の概略図である。概して、顕微鏡１０００は、上で説明され、かつ図４に図示される顕微鏡４００の構成要素と同一または同様である構成要素を含み得る。しかしながら、本実施形態では、顕微鏡１０００は、集束ケプラー式構成を有する。この構成の光学レイアウトは、ケプラータイプの望遠鏡に関連するが、光学性能の観点から、ガリレオタイプに対するものと同一の利点が、当てはまる。ガリレオ式構成に関する良い点は、より長い距離である。一般的に、この構成は、所与の望遠鏡台に適合される場合、より大きい柔軟性を示す。ガリレオ式構成の良い点は、より短い光学列であり、アクセス可能なｚ範囲を横断する有効な解像度の変動が、より良好に制御され得ることである。

上で説明されるように、図４に示される構成では、マイクロレンズアレイ４７２は、光検出器４３２からマイクロレンズアレイ４７２のマイクロレンズの１焦点距離ｆに等しい距離を置いて位置付けられ得る。比較すると、図９に示されるガリレオ式構成では、マイクロレンズアレイ４７２は、光検出器４３２からマイクロレンズアレイ４７２のマイクロレンズの１焦点距離ｆを下回る距離を置いて位置付けられ得る。これに反して、図１０のケプラー式構成では、マイクロレンズアレイ４７２は、光検出器４３２からマイクロレンズアレイ４７２のマイクロレンズの１焦点距離ｆを上回る距離を置いて位置付けられ得る。

ガリレオ式構成およびケプラー式構成は、以下の薄いレンズの等式、（１／ｄ_ｏ）＋（１／ｄ_ｉ）＝（１／ｆ）によっても説明され得、式中、ｆは、マイクロレンズアレイ４７２のマイクロレンズの焦点距離であり、ｄ_ｉは、マイクロレンズと画像（光検出器４３２が位置付けられる場所）との間の距離であり、ｄ_ｏは、マイクロレンズと物体（チューブレンズ４６８によって形成される中間画像が位置付けられる場所）との間の距離である。中間画像は、例えば、図１０に、光線が収束から発散に遷移するように描写されるマイクロレンズアレイ４７２の真上の点として図式的に示される。ケプラー式構成に対する例として、焦点距離ｆ＝１０ｍｍ、およびレンズから物体への距離ｄ_ｏ＝２０ｍｍであると仮定して、（１／２０）＋（１／ｄ_ｉ）＝（１／１０）である。したがって、レンズから画像の距離ｄ_ｉ＝２０ｍｍである。ガリレオ式構成に対する例として、再び焦点距離ｆ＝１０ｍｍおよびレンズから物体の距離ｄ_ｏ＝－２０ｍｍ（負の符号は、図９に示されるように、マイクロレンズアレイ４７２および物体（中間画像）の相対的位置を考慮する）と仮定すると、（１／－２０）＋（１／ｄ_ｉ）＝（３／２０）である。したがって、レンズから画像の距離ｄ_ｉ＝６．６７ｍｍである。

本明細書に説明されるプロセス、サブプロセス、およびプロセスステップのうちの１つ以上のものは、１つ以上の電子またはデジタル制御式デバイス上でハードウェア、ファームウェア、ソフトウェア、または前述のもののうちの２つ以上のもの組み合わせによって行われ得ることを理解されたい。ソフトウェアは、例えば、図４に図式的に描写されるシステムコントローラ（コンピューティングデバイス）４７６等の好適な電子処理構成要素またはシステム内のソフトウェアメモリ（図示せず）内に常駐し得る。ソフトウェアメモリは、論理機能（すなわち、デジタル回路またはソースコード等のデジタル形態において、またはアナログ電気、音、またはビデオ信号等のアナログ源等のアナログ形態において実装され得る「論理」）を実装するための実行可能命令の順序付けられたリストを含み得る。命令は、例えば、１つ以上のマイクロプロセッサ、汎用プロセッサ、プロセッサの組み合わせ、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、またはフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡＳ）を含む処理モジュール内で実行され得る。さらに、概略図は、機能のアーキテクチャまたは物理的レイアウトによって限定されない物理的（ハードウェアおよび／またはソフトウェア）実装を有する、機能の論理分割を説明する。本明細書に説明されるシステムの例は、種々の構成で実装され、単一ハードウェア／ソフトウェアユニット内において、または別個のハードウェア／ソフトウェアユニット内において、ハードウェア／ソフトウェア構成要素として動作し得る。

実行可能命令は、電子システム（例えば、図４に示されるシステムコントローラ４７６）の処理モジュールによって実行されると、電子システムに、命令を実施するように指示するその中に記憶される命令を有するコンピュータプログラム製品として実装され得る。コンピュータプログラム製品は、電子コンピュータベースのシステム、プロセッサを含むシステム、または命令を命令実行システム、装置、またはデバイスから選択的にフェッチし、命令を実行し得る他のシステム等の命令実行システム、装置、またはデバイスによって、またはそれと関連して使用するための任意の非一過性コンピュータ読み取り可能な記憶媒体内に選択的に具現化され得る。本開示の文脈では、コンピュータ読み取り可能な記憶媒体は、命令実行システム、装置、またはデバイスによって、またはそれと関連して使用するためのプログラムを記憶し得る任意の非一過性手段である。非一過性コンピュータ読み取り可能な記憶媒体は、選択的に、例えば、電子、磁気、光学、電磁、赤外線、または半導体システム、装置、またはデバイスであり得る。非一過性コンピュータ読み取り可能な媒体のより具体的例の非包括的リストは、１つ以上のワイヤ（電子）を有する電気接続、ポータブルコンピュータディスケット（磁気）、ランダムアクセスメモリ（電子）、例えば、フラッシュメモリ（電子）等の消去可能プログラマブル読取専用メモリ、例えば、ＣＤ－ＲＯＭ、ＣＤ－Ｒ、ＣＤ－ＲＷ（光学）等のコンパクトディスクメモリ、およびデジタル多用途ディスクメモリ、すなわち、ＤＶＤ（光学）を含む。非一過性コンピュータ読み取り可能な媒体は、プログラムが、例えば、紙または他の媒体の光学的走査を介して電子的に捕捉され、次いで、コンパイルされ、解釈され、または別様に、必要な場合、好適な様式で処理され、コンピュータメモリまたは機械メモリ内に記憶されるように、さらにプログラムが印刷される紙または別の好適な媒体であり得ることに留意されたい。

本明細書で使用されるような用語「信号通信する」が、２つ以上のシステム、デバイス、構成要素、モジュール、またはサブモジュールが、あるタイプの信号経路を経由して進行する信号を介して、互いに通信可能であることを意味することも理解されたい。信号は、情報、電力、またはエネルギーを第１のシステム、デバイス、構成要素、モジュール、またはサブモジュールから、第１および第２のシステム、デバイス、構成要素、モジュール、またはサブモジュール間の信号経路に沿って、第２のシステム、デバイス、構成要素、モジュール、またはサブモジュールに通信し得る、通信、電力、データ、またはエネルギー信号であり得る。信号経路は、物理、電気、磁気、電磁、電気化学、光学、有線、または無線接続を含み得る。信号経路は、第１および第２のシステム、デバイス、構成要素、モジュール、またはサブモジュール間の追加のシステム、デバイス、構成要素、モジュール、またはサブモジュールも含み得る。

さらに概して、「通信する」および「連通する」（例えば、第１の構成要素は第２の構成要素と「通信する」または「連通する」）は、本明細書では、２つ以上の構成要素または要素間の構造的、機能的、機械的、電気的、信号、光学的、磁気的、電磁気的、イオン、または流体的な関係を示すために使用される。したがって、１つの構成要素が、第２の構成要素と連通すると言われることは、追加の構成要素が第１および第２の構成要素の間に存在する、および／またはそれらと動作可能に関連付けられる、またはそれらと係合され得る可能性を除外することを意図しない。

本発明の種々の側面または詳細は、発明の範囲から逸脱することなく変更され得ることを理解されたい。さらに、前述の説明は、例証の目的にすぎず、請求項によって定義されている本発明を限定する目的のものではない。

Claims (27)

1. 明視野顕微鏡であって、前記明視野顕微鏡は、
   照明光を生成するために構成されている光源と、
   前記光源から前記照明光を受け取り、前記照明光を集束させられた照明光として出力するために構成されている集光レンズと、
   前記集束させられた照明光を前記集光レンズから受け取り、前記照明光を照明光軸上で光シートとして出力するために構成されている光シート焦点調整デバイスであって、前記光シートは、自身の長さまたは幅と比べて比較的小さい厚さを有し、前記光シートの前記長さの方向に延びている長手方向軸を有する、光シート焦点調整デバイスと、
   サンプルをサンプル平面内に支持することと、前記光シートを前記サンプル平面に対して非平行な照明方向に沿って受け取ることとを行うために構成されているサンプルステージと、
   検出光軸上で前記サンプルから検出光を受け取ることと、前記光シートを受け取り前記サンプルの中に集束させることとを行うために構成されている対物レンズであって、前記検出光軸および前記照明光軸は、前記サンプルの体積における前記光シートの前記長手方向軸が前記検出光軸と位置合わせしていて前記検出光軸に沿って一致して延在するように、少なくとも、前記サンプルによって画定される体積において、互いに一致する、対物レンズと、
   前記対物レンズから前記検出光を受け取るために構成されているマイクロレンズアレイと、
   前記マイクロレンズアレイから前記検出光を受け取り、前記検出光の明視野パラメータを測定するために構成されている光検出器と
   を備えている、明視野顕微鏡。
2. 前記光源は、前記サンプルから蛍光検出光を誘発するために有効な波長の前記照明光を生成するために構成されている、請求項１に記載の明視野顕微鏡。
3. 前記光源は、複数の照明光ビームを生成するために構成され、前記光シート焦点調整デバイスは、前記複数の照明光ビームを複数の光シートとして出力するために構成されている、請求項１に記載の明視野顕微鏡。
4. 前記光シート焦点調整デバイスは、円筒レンズと、１つ以上のスリットを備えている開口とから成る群から選択される、請求項１に記載の明視野顕微鏡。
5. 前記光源から前記サンプルへの照明光経路の少なくとも一部分を画定することと、前記サンプルから前記光検出器への検出光経路の少なくとも一部分を画定することとを行うために構成されている光学系を備えている、請求項１に記載の明視野顕微鏡。
6. 前記光学系は、前記光シートを受け取り、前記光シートを前記サンプルに向かって反射することと、前記検出光を受け取り、前記検出光を前記光検出器に向かって伝送することとを行うために構成されているダイクロイックミラーを備えている、請求項５に記載の明視野顕微鏡。
7. 前記対物レンズは、前記照明光経路および前記検出光経路の両方の中に位置付けられている、請求項５に記載の明視野顕微鏡。
8. 前記光学系は、前記サンプル平面に対する照明方向の角度を調整するために構成されている可動鏡を備えている、請求項５に記載の明視野顕微鏡。
9. 前記可動鏡は、前記対物レンズの瞳に位置付けられている、請求項８に記載の明視野顕微鏡。
10. 前記サンプルステージは、前記サンプルを前記サンプル平面内で平行移動させること、または、前記サンプル平面を前記光シートに対して回転させること、または、前述の両方を行うために構成されている、請求項１に記載の明視野顕微鏡。
11. 前記サンプルステージは、サンプル容器のアレイを支持するように構成されている、請求項１に記載の明視野顕微鏡。
12. 前記マイクロレンズアレイは、画像平面に位置付けられている、請求項１に記載の明視野顕微鏡。
13. 前記光検出器は、前記マイクロレンズアレイから前記マイクロレンズアレイのレンズレットの１焦点距離に等しい距離を置いて位置付けられている、請求項１に記載の明視野顕微鏡。
14. 前記光検出器は、前記明視野顕微鏡がガリレオ式構成を有するように、前記マイクロレンズアレイから距離を置いて位置付けられている、請求項１に記載の明視野顕微鏡。
15. 前記光検出器は、前記明視野顕微鏡がケプラー式構成を有するように、前記マイクロレンズアレイから距離を置いて位置付けられている、請求項１に記載の明視野顕微鏡。
16. 前記対物レンズと前記マイクロレンズアレイとの間にチューブレンズを備えている、請求項１に記載の明視野顕微鏡。
17. 前記チューブレンズは、瞳の直径および焦点距離を有し、前記マイクロレンズアレイのｆ値が、前記チューブレンズの前記瞳の直径および前記焦点距離によって画定される撮像光学系のｆ値と合致する、請求項１６に記載の明視野顕微鏡。
18. 前記光検出器から受け取られる明視野データを処理するために構成されているコンピューティングデバイスを備えている、請求項１に記載の明視野顕微鏡。
19. 前記コンピューティングデバイスは、前記明視野データから３次元画像を生成するために構成されている、請求項１８に記載の明視野顕微鏡。
20. サンプルから明視野画像を取得する方法であって、前記方法は、
    前記サンプルを対物レンズの焦点面内に支持することと、
    照明光を生成することと、
    前記照明光を光シートとして集束させることであって、前記照明光は、照明光軸上にあり、前記光シートは、自身の長さまたは幅と比べて比較的小さい厚さを有し、前記光シートの前記長さの方向に延びている長手方向軸を有する、ことと、
    前記光シートを前記サンプル平面に対して非平行な照明方向に沿って前記サンプルに向けることによって前記サンプルを照射することであって、前記照射に応答して、前記サンプルは、検出光を放射する、ことと、
    前記検出光をマイクロレンズアレイを通して光検出器に向けることであって、前記検出光は、検出光軸上に向けられ、前記検出光軸および前記照明光軸は、前記サンプルの体積における前記光シートの前記長手方向軸が前記検出光軸と位置合わせしていて前記検出光軸に沿って一致して延在するように、少なくとも、前記サンプルによって画定される体積において、互いに一致する、ことと、
    前記検出器において前記検出光の明視野パラメータを測定することと
    を含む、方法。
21. 前記測定された明視野パラメータに基づいて、前記サンプルの３次元画像を生成することを含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記サンプルは、前記照明方向に沿って厚さを有し、前記照明方向に沿って前記サンプルを走査することなく、前記測定された明視野パラメータに基づいて前記サンプルの３次元画像を生成することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
23. 前記照明方向は、前記サンプル平面に対して４５～１３５°の範囲内である、請求項２０に記載の方法。
24. 前記サンプル平面に対する前記照明方向の角度を調節することを含む、請求項２０に記載の方法。
25. 前記サンプル平面に沿って前記サンプルを走査することを含む、請求項２０に記載の方法。
26. 明視野パラメータを測定する間、前記サンプルを容器内に支持することを含む、請求項２０に記載の方法。
27. 前記サンプルを照射することは、前記照明光をダイクロイックミラーから前記サンプルに向かって反射することを含み、前記検出光を向けることは、前記検出光を前記ダイクロイックミラーを通して伝送することを含む、請求項２０に記載の方法。
    

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