CN109716199A - 具有选择性平面照明的光场显微镜 - Google Patents

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Abstract

一种光场显微镜，包括：光片聚焦装置，其构造为用于将照射光输出为光片；以及微透镜阵列，其在物镜与光检测器之间。样品被沿着不与样品平面平行的方向的光片辐照。可以从样品获得光场数据而无需扫描样品的厚度。显微镜结合选择性平面照明实现光场采集。

Description

具有选择性平面照明的光场显微镜
相关申请
本申请要求2016年9月15日提交的美国专利申请No.15/266,310的优先权，该美国专利申请的全部内容以引用的方式并入本文。
技术领域
本发明总体涉及用于成像样品的显微术，包括三维显微术和基于荧光的显微术。具体地说，本发明涉及结合采集光场信息来实现选择性平面照明的显微术。
背景技术
显微术表示一类分析技术，涉及样品(例如生物材料(例如细胞、组织等)和非生物材料(例如颗粒物质))的成像。已知的基于光(光学)的显微技术包括例如明视场显微术、暗场显微术、共聚焦显微术、以及选择性平面照明显微术(SPIM)。可以通过在被成像的样品中诱导荧光来增强基于光的显微技术。此外，一些显微镜能够对样品进行三维(3D)成像，通常通过扫描样品的轴向焦深以获取多个图像(焦点的堆叠)并随后处理这些图像以生成3D图像。这种采集后处理通常需要大量计算，包括使用3D反卷积(deconvolution)算法、配准(registration)算法等。
生物样品的3D荧光成像通常通过共聚焦显微术或SPIM进行。共聚焦显微术可以实现出色且高度分辨的图像，但非常耗时且需要复杂且昂贵的系统硬件。SPIM可能更快、更便宜，但需要专门的样品制备和保持架。Huisken等人在Selective plane illuminationmicroscopy techniques in developmental biology,Development,Vol.136(12),p.1963-1975(2009)中描述了SPIM，其内容的全文通过引用的方式并入本文。最近，正提出光场成像作为3D显微成像方法。与在常规显微镜的情况下仅捕获光强度相比，光场成像捕获关于场景中的光强度和光线的行进方向的信息。然而，到目前为止，实验工作已经表明，光场成像产生不可接受量的图像伪影(image artifacts)和背景噪声。在以下专利或文献中描述了光场技术：美国专利No.7,936,392；美国专利No 8,717,489；Levoy等人的LightField Microscopy,ACM Transactions on Graphics,Vol 25(3),p.1-11,Proc.SIGGRAPH(2006)；以及Cohen等人的Enhancing the performance of the light field microscopeusing wavefront coding,OPTICS EXPRESS,Vol.22,No.20(2014)；以及Broxton等人的Wave optics theory and 3-D deconvolution for the light field microscope,OPTICS EXPRESS,Vol.21,No.21(2013)；这些专利和文献中的每一个的全部内容以引用的方式并入本文。
对3D显微成像的显微镜和方法一直存在需求。具体地说，对于诸如类器官(organoids)和球状体(spheroids)等复杂的和功能性的生物样品的研究和分析，需要解析3D信息的快速显微成像方法。
发明内容
为了整体或部分地解决前述问题和/或本领域的技术人员可能已经观察到的问题，本发明提供了在如下文列举的实施方式中通过举例来说明的方法、工艺、系统、设备、器具和/或装置。
根据一个实施例，一种光场显微镜，包括：光源，其构造为用于生成照射光；聚光器透镜，其构造为用于接收来自所述光源的所述照射光，并将所述照射光输出为经聚光的(focused)照射光；光片(light-sheet)聚焦装置，其构造为用于接收来自所述聚光器(condenser)的所述经聚光的照射光，并且将所述照射光输出为光片；样品台，其构造为用于将样品支撑在样品平面中，并且用于接收沿着不与所述样品平面平行的照射方向的所述光片；物镜，其构造为用于接收来自所述样品的检测光；微透镜阵列，其构造为接收来自所述物镜的所述检测光；以及光检测器，其构造为用于接收来自所述微透镜阵列的所述检测光，并且测量所述检测光的光场参数。
根据另一实施例，一种用于从样品获取光场图像的方法，包括：将所述样品支撑在物镜的焦平面中；生成照射光；将所述照射光聚焦为光片；通过将所述光片沿不与所述样品平面平行的照射方向引导至所述样品来辐照(irradiating)所述样品，其中，响应于所述辐照，所述样品发射检测光；引导所述检测光通过微透镜阵列到达光检测器；以及在所述光检测器处测量所述检测光的光场参数。
根据另一实施例，一种光场显微镜，构造为执行本文披露的任何方法中的全部或部分。
在查看以下附图和详细说明时，本领域的技术人员将会或将变得更加容易地理解本发明的其它装置、设备、系统、方法、特征和优点。希望的是，全部这种附加的系统、方法、特征和优点都包括在本说明书内、都在本发明的范围以内并受所附权利要求保护。
附图说明
通过参考以下附图可以更好地理解本发明。附图中的部件不一定按比例绘制，而是主要用于示出本发明的原理。在附图中，全部不同视图中相应的部分具有相同的附图标记。
图1是用于在样品上实施选择性平面照明显微术(SPIM)的显微镜的常规构造的示意图。
图2是常规SPIM中的光片，或者更具体地说光片(其沿z轴的长度被截短)的放置样品的区域的部分的示意图。
图3是在常规SPIM中扫描样品的厚度以获取用于3D处理的多个图像的过程的示意图。
图4是根据本文披露的代表性实施例的光场显微镜的实例的示意图。
图5是根据本文披露的实施例的被光片照射的样品的示意图。
图6是根据本文披露的实施例的被光片照射并布置在容器中的样品的示意图。
图7是根据本文披露的另一实施例的光场显微镜(或其一部分)的实例的示意图。
图8是根据本文披露的另一实施例的光场显微镜的实例的示意图。
图9是根据本文披露的另一实施例的光场显微镜的实例的示意图。
图10是根据本文披露的另一实施例的光场显微镜的实例的示意图。
具体实施方式
如本文中所用的，术语“样品”通常是指需要成像并且能够安装到本文描述的样品台的任何物体或材料。样品可以是生物的(例如，生物细胞、组织、类器官、球状体、细胞内组分、孢子、真菌，霉菌、细菌、病毒、及诸如皮肤细胞、碎屑等生物衍生的颗粒)或非生物的(例如，化合物、颗粒物等)。样品可以是生理材料、食品样品、环境样品等。样品可以部分或完全地为液体或固体。样品可在使用前进行预处理，诸如从血液中制备血浆、稀释粘稠液体、对样品进行切片、对样品进行染色、添加试剂、添加荧光团或其它标记等。如本领域技术人员所理解的，预处理方法还可以包括过滤、沉淀、稀释、蒸馏、浓缩，干扰组分的失活、色谱分析、分离步骤等。
如本文中所用的，术语“光”通常是指可量化为光子的电磁辐射。作为本发明涉及的光，光可以以从紫外(UV)到红外(IR)的范围内的波长传播。因此，在本发明中，术语“光”不旨在限于可见光范围内的电磁辐射。在本发明中，术语“光”、“光子”和“辐照”可互换使用。
如本文中所用的，诸如“照射光”和“激发光”等术语是指为了照射样品而产生和透射的光。根据一个实施例，照射光(或激发光)可以是宽带光或窄带光(即，被限于一个波长或跨越几个波长的范围)。在基于荧光的实施例中，入射在样品上的照射光(或激发光)具有有效诱导荧光的波长。为方便起见，在本文中，在基于荧光或基于非荧光的实施例的情况下，术语“照射光”和“激发光”可互换使用，除非另有明确说明或上下文另有规定。
如本文中所用的，诸如“检测光”和“发射光”等术语是指从样品传播并且可以被收集以获取样品的图像的光。在基于非荧光的实施例中，检测光(或发射光)可以是从样品散射或反射或者透过样品的光。这种非荧光通常可以具有与入射在样品上的照射光相同的波长。在基于荧光的实施例中，检测光(或发射光)至少包括由于荧光性而从样品发射的光，所述从样品发射的光具有比入射在样品上的照射光更长的波长。在基于荧光的实施例中，非荧光被阻挡、滤波或被偏离出检测光路，使得仅荧光入射在光检测器上并用于获取样品的图像。为方便起见，术语“检测光”和“发射光”在本文中可互换使用，除非另有明确说明或上下文另有规定。
如本文中所用的，术语“透镜”可以指单个透镜或透镜组(一系列透镜)，如本领域技术人员所理解的，这取决于实施例以及透镜的功能。
图1是用于在样品S上实施选择性平面照明显微术(SPIM)的显微镜的常规构造的示意图。出于说明的目的，图1包括笛卡尔(x,y,z)参考系，其原点(x＝0，y＝0，z＝0)相对于样品S和其它示出的特征任意定位。在本文中，x轴和y轴位于横向平面(transverse plane)中。样品S或至少一片被照射的样品S位于样品平面中，该样品平面在本文中对应于(或平行于)横向平面。z轴是与横向平面、并且由此与样品平面正交的轴线或方向。因此，沿z轴(或z方向)限定样品S的厚度。
常规SPIM显微镜包括：照射光学器件，其限定了照射光104的基本沿照射轴线I传播的照射光路；以及检测光学器件，其限定了检测光108的基本沿检测轴线D传播的检测光路。照射光学器件包括照射物镜112以及其它光学部件，并且检测光学器件包括检测物镜116以及其它光学部件，如本领域技术人员所理解的。检测物镜116具有焦平面FP(在横向的x-y平面中)，在焦平面FP处，可以通过接收检测光108的光检测器(未示出)获取聚焦图像。作为一种光片显微术(LSM)，照射光学器件构造为将照射光104聚焦成薄的平面光片，即，具有基本为直线的横截面的光束。图2是光片220的示意图，或者更具体地说是光片220(其沿z轴的长度被截短)的放置样品S的区域的部分的示意图。作为常规SPIM的另一特征，光片220沿其传播的照射轴线I(沿x轴)与检测光108沿其传播的检测轴线D(沿z轴)正交。此外，样品S被定位和取向成使得样品平面位于焦平面FP中并因此与检测轴线D正交，并且当光片220穿过样品S时，光片220沿着焦平面FP(并且由此沿着样品平面)传播。因此，SPIM实际上光学地切割样品S，即，仅样品S的(沿z轴方向的)一小部分厚度被光片220照射。
如图2所示，当光片220沿x轴行进时，光片220的(沿z轴方向的)厚度会聚到焦点或“光束腰”224，并且随后发散回到更大的厚度。照射光学器件定位光片220，使得光束腰224位于包含样品S的样品室(未示出)中并在焦平面FP处。通常，光束腰224位于检测物镜116的视场(FOV)的中央并位于样品S的中央区域。
与诸如宽视场和共焦显微术等其它常规技术相比，因为SPIM仅将样品S暴露于薄的光片220(样品平面/焦平面FP附近的样品S的薄体积或区段)，所以SPIM可以以较低的光漂白、光损伤(例如光毒性)和受热的风险对样品S进行成像。然而，SPIM具有缺点。如在共聚焦显微术和其它常规显微术的情况中那样，3D成像需要沿着检测轴线D扫描样品S(或扫描焦平面FP)以递增地(逐步地)获取多个(基本上2D的)图像，并且从而产生一叠图像(z向堆叠)，然后进行后处理以根据多个2D图像渲染(render)出3D图像。图3是在常规SPIM中扫描样品S的厚度以获取用于3D处理的多个图像的过程的示意图。沿如图3中的双向箭头所指的一个或两个方向，通过检测轴线D上的多个位置，对样品S进行扫描。通常通过电动装置使样品S相对于照射轴线I沿检测轴线D移动(平移)或者使照射轴线I相对于样品S移动来扫描样品S。图3示出了可以定位照射轴线I(和焦平面FP，图1)的三个平移位置A、B和C，以作为扫描样品S以构建用于3D处理的z向堆叠的一部分。必须在每个位置A、B和C处获取单独的图像并进行数字化存储。然后，必须通过执行各种软件实现的算法来处理如此获取的所有图像以构建3D图像。应注意的是，仅三个平移位置A、B和C的图示是简化的，并且在扫描过程期间获取了更多个图像(例如，100个)。
另一缺点是，由于光片220从一侧进入样品S并且当光片220朝向另一侧穿过样品S时可能遇到不透明结构，因此光片照射(light sheet illumination)可能导致图像中出现阴影式伪影或条纹。参见Santi,Peter A.的Light Sheet Fluorescence Microscopy:AReview,Journal of Histochemistry&Cytochemistry,Vol.59(2),p.129-138(2011)；以及U.S.专利No.9,134,521；这些文献的全部内容以引用的方式并入本文。另外，由于光片220仅从一侧进入样品S，因此样品平面可能被不均匀地照射。也就是说，由于当光片220穿过样品S时的光吸收，因此与样品平面的距离光片220进入的一侧最远的部分相比，样品平面的最接近光片220进入的一侧的部分被更好地照射。已经开发了“双侧照射”技术以通过在样品的与第一照射物镜112相反的一侧上添加第二照射物镜并且用第二照射光104的第二光片来辐照样品S以解决这些问题。然而，附加的照射光路增加了显微镜的成本和复杂性。此外，双侧照射增加了z方向上(沿着检测轴线D，穿过样品S的厚度)的光散射，这增加了离焦(out-of-focus)照射并且因此降低了图像质量。上面引用的美国专利No.9,134,521披露了被称为多向SPIM(mSPIM)的技术，以解决双侧照射的问题，双侧照射还需要使用两个不同的照射光路，并以交替的方式交替地照射样品S。因此，mSPIM技术使必需的单独图像的数量翻倍，从而增加了所需的计算图像融合的量。mSPIM技术还需要将样品S绕检测轴线D旋转到不同的角度位置，从而进一步增加必需的单独图像的数量，并进一步增加显微镜的成本和复杂性。此外，可能难以使两个或更多个光片相对于样品平面适当地对准，这损害了获得良好聚焦图像的能力。
另外，已知的SPIM技术(诸如刚刚描述的那些)通常采用填充有液体(诸如生理溶液或清洁溶液等)的样品室。将样品S附接到杆上，所述杆插入(样品)室中，并且附接到操作为平移和旋转样品S的台。这些技术不容易与实验室中常见的样品支撑件(诸如玻璃显微镜载玻片、多孔微孔板以及其它样品容器)的使用相兼容。特别是当样品S被容纳在微孔板的孔中或其它类型的容器中时，“从侧面照射”技术是不可行的。
如现在将进一步详细描述的，本发明提供了一种显微镜，与仅捕获光强度信息的常规成像技术相比，该显微镜构造为基于光场成像实现快速三维(3D)成像技术。如本文所披露的显微镜将光场成像与选择性照射方法相结合，该选择性照射方法与诸如如上所述的常规SPIM技术相比以明显不同的方式利用光片。如本文所披露的显微镜的一个或多个实施例可以是基于荧光的。如本文所披露的显微镜的一个或多个实施例可特别用于从复杂和功能性生物样品(诸如类器官和球状体等)产生图像数据。如本文所披露的显微镜的一个或多个实施例可以利用容易获得的某些显微镜部件，并且可以与不同类型的样品支撑件相兼容，所述样品支撑件诸如为显微镜载玻片、多孔微孔板和其它类型的样品容器，诸如药瓶、比色皿、试管、样品池、流动池等。本文披露的显微镜可以设置成落射荧光构造。如本文所披露的显微镜可以设置为独立仪器或者可以与诸如多模式读取器等其它类型的分析仪器集成在一起，所述多模式读取器例如构造为用于在样品上执行不同类型的基于光学(例如，荧光、冷光和吸光度)的测量。
图4是根据本文披露的代表性实施例的光场显微镜400的实例的示意图。通常，本领域技术人员理解各种类型的显微镜的结构和操作，并且因此仅简要描述显微镜400的某些部件和特征以便于理解本文教导的主题。显微镜400通常可以包括：光源424，其构造为用于生成照射光(激发光)404；样品台428，其用于支撑分析中的样品(未示出)；光检测器(图像传感器)432，其构造为收集检测光(发射光)408(捕获检测光408的图像)；各种照射光学器件，其用于限定(即，建立或提供)从光源424到样品台428处的样品的照射(或激发)光路；以及各种检测光学器件，其用于限定从样品到光检测器432的检测(或发射)光路。在一些实施例中，显微镜400可以构造为用于在特定激发波长下激发样品，并且检测响应于该激发而从样品发射的波长更长的荧光。在该实施例中，如本领域技术人员所理解的，可以将荧光剂或荧光团(例如荧光素)添加到样品中。在该实施例中，显微镜400可以设置成落射荧光构造，如图4所示。在其它实施例中，显微镜400可以构造为用于检测从样品反射或散射(或透射)的光，所述光的波长与用于照射样品的光的波长基本相同。
通常，光源424可以是适于光(光学)显微术的任何光源。例如，光源424可以是诸如发光二极管(LED)或固态激光器等固态光源，或者作为选择可以是基于半导体的激光器(激光二极管或LD)。在一些实施例中，光源424可以包括生成不同波长的光的多个光源(例如，多个LED)。这样的光源可以安装到诸如机动轮(未示出)等波长选择器，机动轮能够自动(通过计算机处理)选择光源并且因此能够在给定的应用中利用激发光的波长，如本领域技术人员所理解的。在一些实施例中，光源424可以是与激发滤波器436结合操作的宽带光源，激发滤波器436仅允许期望的光激发波长穿过。
样品台428被示意性地描绘为样品平面，样品位于该样品平面并被样品台428支撑。样品台428通常可以是用于支撑在其上的固定位置的样品、或者支撑在其上的固定位置的样品和支撑样品的基板(例如显微镜载玻片、微孔板、其它容器)的任何平台。如在其它附图中那样，出于说明的目的，图4包括笛卡尔(x,y,z)参考系，其原点(x＝0，y＝0，z＝0)相对于所示显微镜400任意定位。在本文中，x轴和y轴位于横向平面中，并且z轴是与横向平面、并且由此与样品平面正交的轴线或方向。因此，沿z轴(或z方向)限定样品的厚度。在一些实施例中，如本领域技术人员所理解，样品台428(并且由此其上的样品)可以通过手动或机动致动来移动，例如，通过利用受控精密微型马达来移动。也就是说，用户可以沿x轴、y轴和/或z轴来调节样品台108的位置。作为实例，在图1中，样品台428上方的箭头表示沿x轴移动。在一些实施例中，除了可沿一个或多个轴线平移外，样品台108还可以围绕一个或多个轴线旋转。
通常，光检测器432可以是适于光显微术的任何成像装置，诸如为形成相机的主要部分(basis)的成像装置的类型。在常规实施例中，光检测器432是多像素(或像素化)成像装置，诸如电荷耦合器件(CCD)或基于互补金属氧化物半导体(CMOS)技术的有源像素传感器(APS)。在一些实施例中，显微镜400还可包括目镜或接目镜(未单独示出)以使用户能够观察样品，在这种情况下，提供适当的光学部件(例如，分束器)以使检测光路分叉，从而将检测光408导向光检测器432和目镜两者。因此，图1中的光检测器432可以被视为示意性地表示成像装置，或者成像装置和目镜两者。
在本实施例中，限定照射光路的光学器件(光学部件)包括聚光器透镜440、诸如柱面透镜444等光片聚焦装置、分束器448(例如，二向色分束器或反射镜)、激发滤波器436(特别是在基于荧光的实施例中)、以及物镜452。根据一个实施例，可以包括其它光学器件，诸如其它透镜(例如，准直透镜、中继透镜、场透镜等；光束扩展器、其它反射镜等)，如本领域技术人员所理解的。例如，可以包括孔径光阑和场光阑(未示出)，孔径光阑和场光阑可以位于光源424与聚光器透镜440之间，以限制光源424发射的照射光404的沿x方向和y方向的透射。
聚光器透镜440可以是构造为用于收集由光源424生成的照射光404并会聚照射光404的任何透镜。柱面透镜444可以是构造为用于将从聚光器透镜440接收的照射光404聚焦成薄的平面光片456的任何透镜。光片456的特征在于具有基本为直线的横截面，并且横截面的一个尺寸(例如，长度)显著大于横截面的另一尺寸(例如，宽度)，如上文结合图2所述。如下面进一步描述的，光片456用于沿着样品的厚度选择性地照射样品。如果光源424产生诸如激光束等小直径光束，则可以将光束扩展器(未示出)放置在光源424与柱面透镜444之间的照射光路中，以使光束更充分地填充柱面透镜444。作为柱面透镜444的替代，合适的替代方案可以是狭缝，狭缝诸如可以设置在孔径光阑(光圈)处。
在一些实施例中，特别是在采用如图1所示的落射荧光设施的实施例中，包括分束器448。分束器448构造为反射预期用于照射光404的波长的光，并且透过预期用于检测光408的波长的光。在一些实施例中，分束器448可以包括具有不同光学反射/透射特性的多个分束器。这样的分束器可以安装到诸如机动轮(未示出)等波长选择器，机动轮能够自动(通过计算机处理)选择具有期望的反射/透射光谱的分束器。分束器448可以是可移动的，即，分束器448的位置可以是可调节的。在图示的实施例中，分束器448可绕x轴旋转，如图4中的弯曲箭头所示，使得能够调节照射轴线I相对于样品平面的角度。在本文中，照射轴线I是当光片456入射到样品上时光片456(照射光404)沿其传播的方向。因此，照射轴线I的角度是光片456的入射角。在本实施例中，照射轴线I是光片456在被分束器448反射之后沿其传播的方向。
物镜452可以是构造为用于收集从样品发射的检测光408并将检测光408聚焦到光检测器432上的任何装置。在显微镜400具有落射荧光构造的本实施例中，物镜452处于照射光路I以及检测光路D中，并且由此也构造为用于将照射光404(作为光片456)透射和聚焦到样品上。因此，在该实施例中，照射光轴I(在被分束器448偏转之后)和检测光轴D重合，并且不需要分别用于照射和检测的单独的物镜。如图所示，物镜452在其前方具有光瞳(pupil)460，光瞳460在物镜452与分束器448之间。
在本实施例中，限定检测光路的光学器件(光学部件)包括物镜452、分束器448(构造为使检测光408从中透过)、发射滤波器464(特别是在基于荧光的实施例中)、镜筒透镜468(特别是在物镜452是无限远校正物镜时)、以及微透镜阵列472。
微透镜阵列472是支撑在合适的基板上的紧密聚集(closely grouped)的微透镜或小透镜(直径在微米到几毫米的透镜)的阵列(通常是二维的)。可以使用本领域技术人员已知的微制造技术来构造微透镜阵列472。微透镜可以是圆形的并且以六边形格子图案布置，以允许微透镜在支撑基板上紧密聚集。作为选择，微透镜可以是正方形的并且在支撑基板上以网格状图案布置。在一些实施例中，微透镜是平凸式的(plano-convex)。微透镜阵列472构造为以下述方式将光聚焦到光检测器432的有源感测元件上：允许光检测器432捕获与样品的被照射区域相关联的光场而不是仅基于光强度的图像。因此，微透镜阵列472允许显微镜400用作光场显微镜。光场可以由光线的束(bundle)来限定，其中每根光线均具有幅度(强度)和方向。光线的幅度可以由辐射度(发光度)给出，即沿着光线行进的光的量，光量可以以瓦特(W)每球面度(sr)每平方米(m2)来测量。如本领域技术人员所理解的，每根光线的方向可以由依赖于空间坐标和角度的多维全光函数(plenoptic function)给出。作为一个实例，光线可以由四维函数L(u,v,s,t)表示，所述四维函数L(u,v,s,t)是双平面参数化，通过该双平面参数化，光线被视作穿过u-v平面上的点，并且随后穿过s-t平面上的点。与光线的位置和方向两者有关的信息被光检测器432获取并用于生成样品的图像。微透镜阵列472可以包括例如成千上万个微透镜。在一些实施例中，由光检测器432提供的有源感测元件(例如，像素)的数量远大于由微透镜阵列472提供的微透镜的数量，使得透射通过一个微透镜的光线可以被几个有源传感元件感测到。在一些实施例中，微透镜的尺寸及微透镜相对于光检测器432的传感器的位置被设置为，使得透过相邻微透镜的光线不会彼此重叠。
微透镜阵列472可以位于像平面，例如由诸如物镜452或镜筒透镜468等光学系统(optical train)中的光学部件之一产生的中间像平面处。在一些实施例中并且如图所示，微透镜阵列472可以位于镜筒透镜468与光检测器432之间。在其它实施例中，不包括镜筒透镜468，并且微透镜阵列472实际上取代了镜筒透镜468。在一些实施例中，微透镜阵列472可以定位在距光检测器432的距离等于微透镜阵列472的微透镜的一倍焦距f的位置处。如本领域技术人员所理解的，透镜的焦距f是从透镜到其焦点(来自场景(scene)的光线会聚的像点)的距离。在一些实施例中，微透镜阵列472的f值(光圈数)与由镜筒透镜468的光瞳直径和焦距限定的成像光学器件的f值匹配。本领域技术人员所理解的，f值可以表示为N＝f/D，其中f是焦距，并且D是透镜的入射光瞳(有效光圈)的直径。
参考图4，显微镜400还可以包括与光检测器432电通信的计算装置(或系统控制器)476。计算装置476可以构造为接收由光检测器432捕获的光场图像，并且数字化并记录该图像。计算装置476还可以构造为根据需要处理所捕获的光场数据，以生成样品的3D图像，诸如通过执行反卷积和/或对3D渲染有用的其它算法。计算装置476还可以构造为根据需要处理3D图像以在诸如计算机屏幕等显示装置上显示图像，并且用于使用户能够以期望的方式增强或控制图像的显示。通常，出于这些目的，计算装置476可以包括硬件(微处理器、存储器等)和软件组件，如本领域技术人员所理解的。例如，计算装置476可以包括处理器，诸如提供整体控制的主电子处理器，以及构造为用于专用控制操作或特定信号处理任务的一个或多个电子处理器(例如，图形处理单元，或GPU)。计算装置476还可以包括用于存储数据和/或软件的一个或多个存储器(易失性的和/或非易失性的)。计算装置476还可以包括一个或多个装置驱动器，用于控制一种或多种类型的用户界面装置，并提供用户界面装置与计算装置的部件之间的接口。除了显示装置之外，这样的用户界面装置可以包括其它用户输出装置(例如，打印机、可视指示器或警报、可听指示器或警报等)以及用户输入装置(例如，键盘、按键、触摸屏、鼠标控制器、操纵杆、轨迹球等)。计算装置476还可以包括包含在存储器中和/或一种或多种类型的计算机可读介质上的一种或多种类型的计算机程序或软件。计算机程序或软件可以包含用于执行本文披露的任何方法的全部或部分的指令(例如，逻辑指令)。计算机程序或软件可以包括应用软件和系统软件。系统软件可以包括操作系统(例如，Microsoft操作系统)，操作系统用于控制和管理计算装置476的各种功能，包括硬件和应用软件之间的交互。具体地说，操作系统可以提供可经由用户输出装置显示的图形用户界面(GUI)，并且用户可以使用该图形用户界面与用户输入装置的使用进行交互。计算装置476还可以包括一个或多个数据采集/信号调节部件(可以体现在硬件、固件和/或软件中)，以用于接收和处理由光检测器432捕获的成像数据(包括用于通过GUI以图形形式呈现的格式化数据)、生成3D图像等。
应理解的是，图1是符合本发明的显微镜100的实例的高级(概略)示意图。如本领域技术人员所理解的，根据实际实施方式的需要可以包括图1中未具体示出的其它光学器件、电子器件以及机械部件和结构。
作为显微镜400的一般操作的实例，可以根据需要制备用于显微术的被研究的样品，并且随后将样品安装到样品台428。通常，样品被支撑(安装、保持、容纳等)于合适的样品支撑件(载玻片、多孔板的孔、其它类型的容器等)，并且随后样品支撑件被安装到样品台428。然后，光源424被激活以生成照射光404，照射光404取决于实施例而可以是宽带光或窄带光(例如，集中于所需波长)。在本实施例中，照射光404由激发滤波器436进行波长滤波。照射光404被引导至聚光器440并被聚光器440会聚。然后将照射光404引导到柱面透镜444，柱面透镜444将照射光404聚焦成光片456。然后，照射光404被分束器448朝向样品反射，由此照射光404沿着照射轴线I(z轴)传播。在本实施例中，照射轴线相对于样品平面(横向x-y平面)的角度由分束器448的取向决定。然后，照射光404被物镜452聚焦到样品的选定区域上。入射在样品上的照射光404仍然是光片456的形式。
响应于该照射，样品发射检测光408，在本实施例中，检测光408是荧光。物镜452收集检测光408并将检测光408聚焦在像平面上。作为选择，如果包括镜筒透镜468，则物镜452使检测光408透射到镜筒透镜468，并且镜筒透镜468将检测光408聚焦在像平面处。在任一情况下，分束器448构造为允许检测光408穿过分束器448而不被反射或衰减。在本实施例中，检测光408由发射滤波器464进行波长滤波。位于本实施例中的像平面处的微透镜阵列472将检测光408的光线聚焦到光检测器432的有源传感元件上。光检测器432将光场图像信息作为电信号输出到计算装置476，计算装置476处理该信号以生成样品的照射区域的3D图像。
在本实施例中，通过光片456照射样品，从而能够实施选择性照射，即照射样品的选定区域。图5是根据本文披露的实施例的被光片456照射的样品的示意图。光片456具有光束腰524，光束腰524可以位于样品S中。光片456的照射轴线I，以及因此照射平面，均不同于常规SPIM相关技术，诸如上文结合图1至图3所描述的。在常规SPIM中，光片沿着与样品(x-y)平面平行的照射轴线被引导。因此，为了获得关于整个样品S的图像信息，常规SPIM以及共聚焦显微术技术要求沿z方向扫描样品S并且在扫描的每次迭代时获取单独的图像。然后，需要适当地处理多个图像以构建样品的3D视图。与之相反，在本实施例中，光片456的照射轴线I沿与样品平面不平行的方向取向。在图4和图5中具体示出的实例中，光片456相对于样品平面成90度取向，即，直接沿z轴取向。更一般地，光片456(并且因此照射轴线I)相对于样品平面的角度可以在0到180度的范围内，尽管实际上光片456的角度范围受到光学系统的物镜452和/或其它部件的物理约束的限制。例如，光片456(以及因此照射轴线I)相对于样品平面的角度可以在45到135度的范围内。在任何这样的角度下，在本实施例中，由光片456提供的选定的照射平面被引导通过样品S的厚度(在样品S的选定区域中)。因为光片456的角度或方向具有在z方向上的分量，所以如本文所披露的光片456可被称为“竖直”光片，其可与在常规SPIM中所使用的“水平”光片相对照。
与常规SPIM一样，将对样品S的照射限制在选定的平面(即，一平面周围的薄层(thin volume))会减少背景信号，并且由此在图像中产生更高的对比度，并减少样品的光漂白、光损伤和受热(以及活体样品中的应力)。然而，利用竖直光片456(即，相对于样品平面以90度或其它非平行角度取向)，显微镜400提供了额外的优点。显微镜400可以设置成常规的落射照射类型的构造，如图4和图5所示，其中照射轴线I与检测轴线D重合。这种构造允许使用容易获得的光学部件，诸如物镜、分束器等。
此外，竖直光片456使显微镜400与各种样品支撑件相兼容，样品支撑件诸如为载玻片、多孔微孔板、药瓶等。图6是根据本文披露的实施例的被光片456照射并布置在容器680中的样品S的示意图。容器680可以是布置成阵列的多个容器680中的一个。作为实例，容器680可以是由支架等支撑的微孔板的孔、药瓶或试管。样品S可以浸没在液体L中。其它样品可以布置在其它容器680中，并且可以浸没在相同的液体或不同的液体中，或者浸没在含有不同的试剂的相同溶剂中，或不同的多溶剂组合物中。容器680的侧壁和相邻容器680之间的固体介质(例如，微孔板的固体结构)不会干扰竖直光片456。此外，根据容器680的类型，光片456可以在相对于样品S成一定角度的范围内扫描，而不会遇到容器680的固体结构。
作为另外的优点，因为显微镜400获取光场数据而不仅仅是光强度数据，因此不需要沿检测轴线D(z方向)扫描通过样品S的厚度(至少对于要由显微镜400成像的类型的大多数样品而言)。也就是说，仅需要获取单个光场图像，并且仅需要执行数字后处理(例如，通过计算装置476)以便导出z堆叠或以其它方式产生样品S的3D图像。作为一个非限定性实例，可用的z范围Δz(图5和图6)通常比物镜452的景深(DOF)大6到10倍。对于具有0.4NA的20X物镜，标称DOF为8μm，在这种情况下，典型的光场采集将导致约50μm的可利用的z范围(z-range)，该z范围是用于类器官成像的合理测量。光片456的长度设定了Δz的另一限制。根据高斯光学器件，光片456将在物镜452的焦点处在y维度上形成其光束腰524。光片456的长度Δz由从光束腰524起的最大可接受距离±(1/2)Δz限定。该限制被最大可接受光束横截面限定为z的函数。然而，取决于光源424(激光器、LED等)、准直光学器件(例如，柱面透镜444)的特性，以及物镜452的光瞳尺寸、数值孔径和焦距，光片456的长度可以达到数毫米。
如在本发明的前文中所指出的，由于例如所使用的最终重建算法中的模糊性，在过去的工作中，光场成像已经产生图像伪影和背景噪声。然而，预期本文披露的结合光场成像实施选择性平面照明的实施例将通过减少伪影来改善样品的重建3D图像的质量。
尽管本文披露的实施例可以消除沿z方向扫描样品S的要求，但取决于样品S的尺寸和/或物镜452的视场(FOV)，获得关于整个样品S的图像信息可能需要通过横向平面扫描样品S，例如沿x方向或y方向。可以通过相对于光片456移动(平移和/或旋转)样品S本身和/或通过相对于样品S移动(平移和/或旋转)光片456来完成扫描样品S。作为一个实例，样品台428可以构造为平移样品S，如图4中的样品台428上方的箭头和图5中的样品S上方的箭头所示。作为另一实例，分束器448(或“扫描反射镜”)或照射光路中的其它光束控制部件可构造为旋转(如图4中的弯曲箭头所示)，以便(在这种情况下)通过调整光片456在样品上的入射角来使光片456扫描样品。
图7是根据另一实施例的光场显微镜700(或其一部分)的实例的示意图。通常，显微镜700可以包括与以上所述并在图4中示出的显微镜400相同或相似的部件。然而，在本实施例中，扫描反射镜448位于物镜452的光瞳处。这种构造具有保持远心(telecentric)状态的优点。通过在整个场上对样本提供恒定不变的视角(优选90°)，显微镜光学器件受益于远心。因此，对于SPIM，这意味着在整个场上光片456相对于样本具有恒定不变的倾斜角。可以在照射光路中设置一个或多个附加反射镜784，以为图7中未示出的检测光路的光学器件提供空间调节(spatial accommodation)，所述光学器件例如为发射滤波器464、镜筒透镜468、微透镜阵列472和光检测器432，如上文所述并在图4中示出的。扫描反射镜448或另一反射镜784可以构造为分束器，并且检测光路的光学器件可以被相应地定位。
图8是根据另一实施例的光场显微镜800的实例的示意图。通常，显微镜800可以包括与以上所述并在图4中示出的显微镜400相同或相似的部件。然而，在本实施例中，显微镜800包括光源824，光源824构造为用于生成多个照射光束804，然后将多个照射光束804聚焦成样品上的多个光片856。作为响应，样品可以发射多个检测光束808。光源824可以例如包括将光引导到位于光源与聚光器透镜440之间的孔径光阑处的多个针孔或狭缝的多个点源(例如，多个LED或激光发射器)或者一个或多个光源。在设置有狭缝时，可能不需要柱面透镜444。作为另一实例，光源824可以包括有源投影装置，诸如可以包括或基于数字微镜器装置(DMD)、硅基液晶(LCoS)装置或液晶显示器(LCD)装置。
图9是根据另一实施例的光场显微镜900的实例的示意图。通常，显微镜900可以包括与以上所述并在图4中示出的显微镜400相同或相似的部件。然而，在本实施例中，显微镜900具有聚焦式伽利略构造。与图4中所示的显微镜400的构造相比，该方法通过开发由微透镜阵列472在检测器位置处形成的微图像中的细节，实现了横向分辨率方面的增强。然而，重建算法与用于显微镜400的重建算法不同，并且依赖于基于对应关系(correspondences)的立体投影(stereographic projection)。术语“伽利略”指的是显微镜900的光学布局，其与伽利略型望远镜具有相似性。在一些实施例中，微透镜阵列472可以完全替代镜筒透镜468。
图10是根据另一实施例的光场显微镜1000的实例的示意图。通常，显微镜1000可以包括与以上所述并在图4中示出的显微镜400相同或相似的部件。然而，在本实施例中，显微镜1000具有聚焦式开普勒构造。这种构造的光学布局与开普勒型望远镜有关，但就光学性能而言，其与伽利略型应用的优点相同。相对于伽利略构造的优点是距离更长。通常，这种构造在适配于给定的显微镜座时显示出更大的灵活性。伽利略构造的优点是较短的光学系统，并且可以更好地控制可利用的z范围内的有效分辨率的变化。
如上文所述，在图4所示的构造中，微透镜阵列472可以定位在距光检测器432的距离等于微透镜阵列472的微透镜的一倍焦距f的位置处。相比之下，在图9所示的伽利略构造中，微透镜阵列472可以定位在距光检测器432的距离小于微透镜阵列472的微透镜的一倍焦距f的位置处。另一方面，在图10所示的开普勒构造中，微透镜阵列472可以定位在距光检测器432的距离大于微透镜阵列472的微透镜的一倍焦距f的位置处。
伽利略和开普勒构造也可以通过以下薄透镜方程来描述：(1/do)+(1/di)＝(1/f)，其中f是微透镜阵列472的微透镜的焦距，di是微透镜与(定位光检测器432处)图像之间的距离，并且do是微透镜与(定位由镜筒透镜468形成的中间图像处)物体之间的距离。中间图像例如在图10中示意性地示出为微透镜阵列472正上方的点，在该点处光线被描绘为从会聚过渡到发散。作为开普勒构造的实例，假设焦距f＝10mm并且镜头到物体的距离do＝20mm，则(1/20)+(1/di)＝(1/10)。因此，透镜到图像的距离di＝20mm。作为伽利略构造的实例，再次假设焦距f＝10mm并且镜头到物体的距离do＝-20mm(负号表示微透镜阵列472和物体(中间图像)的相对位置，如图9所示)，则(1/-20)+(1/di)＝(3/20)。因此，透镜到图像的距离di＝6.67mm。
将理解的是，本文描述的过程、子过程和过程步骤中的一个或多个可以由在一个或多个电子或数字受控装置上的硬件、固件、软件或前述两个或更多个的组合执行。软件可以存在于适当的电子处理部件或系统中的软件存储器(未示出)中，例如，图4中示意性描绘的系统控制器(计算装置)476。软件存储器可以包括用于实现逻辑功能(即，可以以诸如数字电路或源代码等数字形式，或者以诸如模拟源(诸如模拟电的、声音的或视频的信号)等模拟形式实现的“逻辑”)的可执行指令的有序列表。指令可以在处理模块内执行，处理模块包括例如一个或多个微处理器、通用处理器、处理器组合、数字信号处理器(DSP)、专用集成电路(ASIC)或现场可编程门阵列(FPGA)。此外，示意图描述了具有物理(硬件和/或软件)实现方式的功能的逻辑划分，该物理实现方式不受架构或功能的物理布局的限制。本文中描述的系统的实例可以以各种构造实现，并且运行为单个硬件/软件单元中或者多个不同的硬件/软件单元中的硬件/软件部件。
可执行指令可以实现为存储有指令的计算机程序产品，当由电子系统的处理模块(例如，图4中所示的系统控制器476)执行时，指令指导电子系统执行指令。计算机程序产品可以选择性地体现为用于或关于指令执行系统、设备或装置(诸如基于电子计算机的系统、包含处理器的系统)，或可以选择性地从指令执行系统、设备或装置获取指令并执行该指令的其它系统的任何非暂时性计算机可读存储介质。在本发明的上下文中，计算机可读存储介质是可以存储用于或关于指令执行系统、设备或装置的程序的任何非暂时性装置。非暂时性计算机可读存储介质可以选择性地是例如电、磁、光、电磁、红外或半导体系统、设备或装置。非暂时性计算机可读介质的更具体实例的非穷举列表包括：具有一个或多个电线的电连接件(电)；便携式计算机磁盘(磁)；随机存取存储器(电)；只读存储器(电)；可擦除可编程只读存储器，诸如闪存等(电)；光盘存储器，诸如CD-ROM、CD-R、CD-RW等(光)；以及数字通用盘存储器，即DVD(光)。应注意的是，由于程序可以经由例如片材或其它介质的光学扫描而以电子方式获取，然后编译、解释、或在必要时以适当方式进行其它处理，并且随后储存在计算机存储器或机械存储器内，因此非暂时性计算机可读存储介质甚至可以是打印程序的片材或其它适当的介质。
还应理解的是，本文使用的术语“信号通信”是指两个或多个系统、装置、部件、模块或子模块能够经由沿某些类型的信号路径行进的信号而彼此通信。信号可以是沿第一和第二系统、装置、部件、模块或子模块之间的信号路径从第一系统、装置、部件、模块或子模块向第二系统、装置、部件、模块或子模块传达信息、电力或能量的通信、电力、数据或能量信号。信号路径可以包括物质的、电的、磁的、电磁的、电化学的、光的、有线的或无线的连接。信号路径还可以包括第一和第二系统、装置、部件、模块或子模块之间的附加的系统、装置、部件、模块或子模块。
更一般地，本文使用的诸如“连通”和“进行连通”(例如，第一部件与第二部件“连通”或“与……进行连通”)等术语表示两个或多个部件或元件之间的结构的、功能的、机械的、电的、信号的、光的、磁的、电磁的、离子的或流体的关系。因此，实际上一个部件被描述为与第二部件连通并不是指排除了附加部件出现在第一与第二部件之间和/或与第一和第二部件可操作地相联或接合的可能性。
应理解的是，在不脱离本发明范围的情况下，可以对本发明的各个方面和细节作出改变。此外，前述描述仅意在说明的目的，而并非意在限制—本发明由权利要求书限定。

Claims (27)

1.一种光场显微镜，包括：
光源，其构造为用于生成照射光；
聚光器透镜，其构造为用于接收来自所述光源的所述照射光，并将所述照射光输出为经聚光的照射光；
光片聚焦装置，其构造为用于接收来自所述聚光器的所述经聚光的照射光，并且将所述照射光输出为光片；
样品台，其构造为用于将样品支撑在样品平面中，并且用于接收沿着不与所述样品平面平行的照射方向的所述光片；
物镜，其构造为用于接收来自所述样品的检测光；
微透镜阵列，其构造为用于接收来自所述物镜的所述检测光；以及
光检测器，其构造为用于接收来自所述微透镜阵列的所述检测光，并且测量所述检测光的光场参数。
2.根据权利要求1所述的光场显微镜，其中，所述光源构造为用于生成具有下述波长的所述照射光：所述波长对于从所述样品诱发荧光检测光有效。
3.根据权利要求1所述的光场显微镜，其中，所述光源构造为用于生成多个照射光束，并且所述光场聚焦装置构造为用于将所述多个照射光束输出为多个光片。
4.根据权利要求1所述的光场显微镜，其中，所述光片聚焦装置选自由柱面透镜以及包括一个或多个狭缝的光圈组成的群组。
5.根据权利要求1所述的光场显微镜，包括光学器件，所述光学器件构造为用于限定从所述光源到所述样品的照射光路的至少一部分，并且用于限定从所述样品到所述光检测器的检测光路的至少一部分。
6.根据权利要求5所述的光场显微镜，其中，所述光学器件包括二向色镜，所述二向色镜构造为用于接收所述光片并将所述光片朝向所述样品反射，并且用于接收所述检测光并且朝向所述光检测器透射所述检测光。
7.根据权利要求5所述的光场显微镜，其中，所述物镜位于所述照射光路和所述检测光路两者中。
8.根据权利要求5所述的光场显微镜，其中，所述光学器件包括可移动反射镜，所述可移动反射镜构造为用于调整所述照射方向相对于所述样品平面的角度。
9.根据权利要求8所述的光场显微镜，其中，所述可移动反射镜位于所述物镜的光瞳处。
10.根据权利要求1所述的光场显微镜，其中，所述样品台构造为用于平移所述样品平面中的所述样品，或用于相对于所述光片旋转所述样品平面，或者用于前述两者。
11.根据权利要求1所述的光场显微镜，其中，所述样品台构造为用于支撑样品容器的阵列。
12.根据权利要求1所述的光场显微镜，其中，所述微透镜阵列位于像平面处。
13.根据权利要求1所述的光场显微镜，其中，所述光检测器位于距所述微透镜阵列的距离等于所述微透镜阵列的小透镜的一倍焦距的位置处。
14.根据权利要求1所述的光场显微镜，其中，所述光检测器位于与所述微透镜阵列相距一定距离处，使得所述光场显微镜具有伽利略构造。
15.根据权利要求1所述的光场显微镜，其中，所述光检测器位于与所述微透镜阵列相距一定距离处，使得所述光场显微镜具有开普勒构造。
16.根据权利要求1所述的光场显微镜，包括在所述物镜与所述微透镜阵列之间的镜筒透镜。
17.根据权利要求16所述的光场显微镜，其中所述微透镜阵列的f值与由所述镜筒透镜的光瞳直径和焦距限定的成像光学器件的f值匹配。
18.根据权利要求1所述的光场显微镜，包括计算装置，所述计算装置构造为用于处理从所述光检测器接收的光场数据。
19.根据权利要求18所述的光场显微镜，其中，所述计算装置构造为用于从所述光场数据生成三维图像。
20.一种用于从样品获取光场图像的方法，所述方法包括：
将所述样品支撑在物镜的焦平面中；
生成照射光；
将所述照射光聚焦为光片；
通过将所述光片沿不与所述样品平面平行的照射方向引导至所述样品来辐照所述样品，其中，响应于所述辐照，所述样品发射检测光；
引导所述检测光通过微透镜阵列到达光检测器；以及
在所述光检测器处测量所述检测光的光场参数。
21.根据权利要求20所述的方法，包括基于测得的光场参数来生成所述样品的三维图像。
22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述样品具有沿所述照射方向的厚度，并且所述方法还包括在不沿所述照射方向扫描所述样品的情况下，基于测得的光场参数生成所述样品的三维图像。
23.根据权利要求20所述的方法，其中，所述照射方向相对于所述样品平面在45至135度的范围内。
24.根据权利要求20所述的方法，包括调整所述照射方向相对于所述样品平面的角度。
25.根据权利要求20所述的方法，包括沿所述样品平面扫描所述样品。
26.根据权利要求20所述的方法，包括在测量光场参数的同时将所述样品支撑在容器中。
27.根据权利要求20所述的方法，其中，辐照所述样品包括将所述照射光从二向色镜朝向所述样品反射，并且引导所述检测光包括使所述检测光透过所述二向色镜。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110687670A (zh) * 2019-10-16 2020-01-14 西湖大学 平铺光片显微镜及其使用方法
CN110836892A (zh) * 2019-11-26 2020-02-25 清华大学 衍射超分辨显微成像方法及系统
CN112684600A (zh) * 2019-10-19 2021-04-20 美国赛库莱特生物有限公司 用于定位在流体通道的内表面上的结构的显微镜
CN113412441A (zh) * 2019-02-01 2021-09-17 分子装置(奥地利)有限公司 光场成像系统的校准
CN113768472A (zh) * 2021-11-10 2021-12-10 华中科技大学 一种具有荧光标记的三维图像获取装置及方法

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3028616A1 (fr) * 2014-11-13 2016-05-20 Commissariat Energie Atomique Procede d'analyse comprenant la determination d'une position d'une particule biologique.
CN109074674B (zh) 2016-02-26 2023-10-24 南加州大学 具有选择性体积照射和光场检测的优化容积成像
US10876970B2 (en) * 2016-04-12 2020-12-29 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Light-sheet microscope with parallelized 3D image acquisition
CN106990519B (zh) * 2017-05-12 2024-09-24 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 结构光照明显微成像系统
JP6932036B2 (ja) * 2017-07-31 2021-09-08 シスメックス株式会社 細胞撮像方法、細胞撮像装置、粒子撮像方法および粒子撮像装置
WO2019148008A1 (en) * 2018-01-26 2019-08-01 University Of Washington Apparatuses and methods for multi-direction digital scanned light sheet microscopy
JP7298993B2 (ja) * 2018-04-09 2023-06-27 浜松ホトニクス株式会社 試料観察装置及び試料観察方法
WO2020150239A1 (en) 2019-01-14 2020-07-23 University Of Washington Apparatuses, systems and methods for solid immersion meniscus lenses
WO2020161826A1 (ja) * 2019-02-06 2020-08-13 オリンパス株式会社 撮像装置
WO2021166069A1 (ja) * 2020-02-18 2021-08-26 オリンパス株式会社 ライトシート顕微鏡、制御方法、及び、プログラム
EP3929567A1 (en) * 2020-06-25 2021-12-29 Leica Microsystems CMS GmbH Method and device for optically examining a biological sample
DE102020128524A1 (de) * 2020-10-29 2022-05-05 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Lichtblattmikroskop und Verfahren der Lichtblattmikroskopie
JP7206020B2 (ja) * 2020-11-17 2023-01-17 マシンビジョンライティング株式会社 画像観察装置及びその照明光学系
KR102469852B1 (ko) * 2020-11-20 2022-11-22 충북대학교 산학협력단 집적 영상 현미경의 조명계 시스템
CN113552100B (zh) * 2021-06-23 2024-07-02 河海大学常州校区 一种自动化荧光切片显微成像平台及其操作方法
JPWO2023007827A1 (zh) * 2021-07-26 2023-02-02
CN114280766A (zh) * 2021-12-24 2022-04-05 哈尔滨工业大学 基于梯度折射率透镜的七目微型三维显微成像装置和方法
CN117631249B (zh) * 2024-01-18 2024-05-24 清华大学 线扫共聚焦扫描光场显微成像装置及方法
CN118333914B (zh) * 2024-06-05 2024-09-03 浙江荷湖科技有限公司 一种高动态范围的光场数据白图像校正方法、系统及介质

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8315476B1 (en) * 2009-01-20 2012-11-20 Adobe Systems Incorporated Super-resolution with the focused plenoptic camera
US20140126046A1 (en) * 2011-03-04 2014-05-08 The Government of the America, as represented by the Secretary, Department of Health Optomechanical module for converting a microscope to provide selective plane illumination microscopy
DE102014102215A1 (de) * 2014-02-20 2015-08-20 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Verfahren und Anordnung zur Lichtblattmikroskopie
WO2016071033A1 (de) * 2014-11-06 2016-05-12 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Verfahren zur erzeugung eines bildes einer probe

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7936392B2 (en) 2004-10-01 2011-05-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Imaging arrangements and methods therefor
DE102005027077C5 (de) 2004-11-04 2021-01-28 Leica Microsystems Cms Gmbh Lichtscheibenmikroskop
WO2010014244A2 (en) 2008-07-30 2010-02-04 The Regents Of The University Of California, San Francisco Multidirectional selective plane illumination microscopy
EP2244484B1 (en) 2009-04-22 2012-03-28 Raytrix GmbH Digital imaging method for synthesizing an image using data recorded with a plenoptic camera
DE102009044987A1 (de) 2009-09-24 2011-03-31 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Mikroskop
US10051240B2 (en) * 2010-06-14 2018-08-14 Howard Hughes Medical Institute Structured plane illumination microscopy
DE102010044013A1 (de) * 2010-11-16 2012-05-16 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Tiefenauflösungsgesteigerte Mikroskopie
DE102013211426A1 (de) * 2013-06-18 2014-12-18 Leica Microsystems Cms Gmbh Verfahren und optische Vorrichtung zum mikroskopischen Untersuchen einer Vielzahl von Proben
US10539772B2 (en) * 2013-10-09 2020-01-21 Howard Hughes Medical Institute Multiview light-sheet microscopy
JP2015135463A (ja) * 2013-12-19 2015-07-27 オリンパス株式会社 顕微鏡装置、及び、顕微鏡システム
JP6253400B2 (ja) * 2013-12-26 2017-12-27 オリンパス株式会社 画像形成方法、及び、画像形成装置
US20160041099A1 (en) * 2014-08-06 2016-02-11 University Of Oregon Light sheet fluorescence and differential interference contrast microscope
JP6555803B2 (ja) * 2015-06-09 2019-08-07 オリンパス株式会社 シート照明顕微鏡、及び、シート照明顕微鏡の照明方法
JP6491578B2 (ja) * 2015-09-07 2019-03-27 オリンパス株式会社 シート照明顕微鏡システム、画像処理装置、シート照明顕微鏡法、及び、プログラム
JP7109423B2 (ja) * 2016-08-15 2022-07-29 ライカ マイクロシステムズ シーエムエス ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ライトシート顕微鏡

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8315476B1 (en) * 2009-01-20 2012-11-20 Adobe Systems Incorporated Super-resolution with the focused plenoptic camera
US20140126046A1 (en) * 2011-03-04 2014-05-08 The Government of the America, as represented by the Secretary, Department of Health Optomechanical module for converting a microscope to provide selective plane illumination microscopy
DE102014102215A1 (de) * 2014-02-20 2015-08-20 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Verfahren und Anordnung zur Lichtblattmikroskopie
WO2016071033A1 (de) * 2014-11-06 2016-05-12 Carl Zeiss Microscopy Gmbh Verfahren zur erzeugung eines bildes einer probe

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113412441A (zh) * 2019-02-01 2021-09-17 分子装置(奥地利)有限公司 光场成像系统的校准
US12080029B2 (en) 2019-02-01 2024-09-03 Molecular Devices (Austria) GmbH Calibration of a light-field imaging system
CN113412441B (zh) * 2019-02-01 2024-09-24 分子装置(奥地利)有限公司 光场成像系统的校准
CN110687670A (zh) * 2019-10-16 2020-01-14 西湖大学 平铺光片显微镜及其使用方法
CN112684600A (zh) * 2019-10-19 2021-04-20 美国赛库莱特生物有限公司 用于定位在流体通道的内表面上的结构的显微镜
CN112684600B (zh) * 2019-10-19 2022-06-03 美国赛库莱特生物有限公司 用于定位在流体通道的内表面上的结构的显微镜
CN110836892A (zh) * 2019-11-26 2020-02-25 清华大学 衍射超分辨显微成像方法及系统
CN110836892B (zh) * 2019-11-26 2021-06-11 清华大学 衍射超分辨显微成像方法及系统
CN113768472A (zh) * 2021-11-10 2021-12-10 华中科技大学 一种具有荧光标记的三维图像获取装置及方法

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