WO2018070098A1 - 試料観察装置及び試料観察方法 - Google Patents

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light
planar light
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山本　諭
松原　正典
範和 杉山
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浜松ホトニクス株式会社
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Definitions

  • the present disclosure relates to a sample observation apparatus and a sample observation method.
  • SPIM Selective Plane Illumination Microscopy
  • the tomographic image observation apparatus described in Patent Document 1 discloses the basic principle of SPIM, which irradiates a sample with planar light and applies fluorescence or scattered light generated inside the sample to the imaging surface. Imaging is performed to obtain observation image data inside the sample.
  • a SPIM microscope described in Patent Document 2 can be cited.
  • the observation light from the sample is irradiated by the observation optical system that irradiates the planar light with a certain inclination angle with respect to the arrangement surface of the sample and has an observation axis orthogonal to the irradiation surface of the planar light. Image.
  • an image of the tomographic plane in the observation axis direction can be acquired by one imaging by irradiating the entire surface of the focus surface of the observation optical system with planar light. Therefore, in order to acquire the three-dimensional information of the sample, it is necessary to scan the sample in the observation axis direction and acquire images of a plurality of tomographic planes in the observation axis direction. In such a conventional sample observation apparatus, it is necessary to repeat selection of a tomographic plane for acquiring an image (scanning and stopping of the sample) and image acquisition before acquiring images of all the tomographic planes.
  • Embodiment is aimed at providing a sample observation apparatus and a sample observation method.
  • a sample observation apparatus includes an irradiation optical system that irradiates a sample with planar light, a scanning unit that scans the sample with respect to the irradiation surface of the planar light, and an observation that is inclined with respect to the irradiation surface.
  • An imaging optical system that has an axis and forms observation light generated on the sample by irradiation with planar light, and partial image data corresponding to a part of the optical image formed by the observation light imaged by the imaging optical system
  • an image generation unit that generates observation image data of the sample based on the plurality of partial image data generated by the image acquisition unit.
  • the sample is scanned with respect to the surface light irradiation surface, and the observation axis of the imaging optical system is inclined with respect to the surface light irradiation surface. Therefore, the image acquisition unit can sequentially acquire the partial image data of the tomographic plane in the optical axis direction of the planar light, and the image generation unit acquires the observation image data of the sample based on the plurality of partial image data. Can be generated.
  • the field-of-view selection operation is not required, and it is possible to simultaneously perform the scanning of the sample and the image acquisition, thereby improving the throughput until the observation image data is obtained.
  • the sample may be held by a sample container having a planar light input surface, and the optical axis of the planar light by the irradiation optical system may be arranged so as to be orthogonal to the input surface of the sample container. In this case, it is possible to scan a plurality of samples at once with the sample container. Further, by making the optical axis of the planar light orthogonal to the input surface of the sample container, it is not necessary to correct the position of the partial image data acquired by the image acquisition unit, and the observation image data generation process can be facilitated.
  • the scanning unit may scan the sample in a direction orthogonal to the optical axis of the planar light by the irradiation optical system. In this case, image processing such as position correction of partial image data acquired by the image acquisition unit is not necessary, and observation image data generation processing can be facilitated.
  • the inclination angle of the observation axis of the imaging optical system with respect to the irradiation surface of the planar light may be 10 ° to 80 °. In this range, the resolution of the observation image can be sufficiently secured.
  • the inclination angle of the observation axis of the imaging optical system with respect to the planar light irradiation surface may be 20 ° to 70 °. In this range, the resolution of the observation image can be secured more sufficiently. Moreover, the change of the visual field with respect to the angle change amount of the observation axis can be suppressed, and the stability of the visual field can be ensured.
  • the inclination angle of the observation axis of the imaging optical system with respect to the planar light irradiation surface may be 30 ° to 65 °. In this range, the resolution of the observation image and the stability of the visual field can be more suitably ensured.
  • the image acquisition unit may include a two-dimensional imaging device, and may extract image data corresponding to a part of the optical image of the observation light from the data output from the two-dimensional imaging device as partial image data. .
  • partial image data can be obtained with high accuracy.
  • the image acquisition unit may include a line sensor that captures a part of an optical image by observation light and outputs partial image data. With such a configuration, partial image data can be obtained with high accuracy.
  • the image acquisition unit includes a slit for passing a part of the optical image by the observation light and a photodetector for detecting the optical image that has passed through the slit, and the partial image based on the data output from the photodetector Data may be generated.
  • the image generation unit may generate observation image data of the sample on the surface orthogonal to the optical axis of the planar light based on the plurality of partial image data. Thereby, the cross-sectional image of the sample which suppressed the influence of the background can be obtained as an observation image.
  • sample observation apparatus may further include an analysis unit that analyzes the observation image data and generates an analysis result. Since the observation image data generated by the image generation unit is analyzed by the analysis unit, the analysis throughput can be improved.
  • the sample observation method includes an irradiation step of irradiating the sample with planar light, a scanning step of scanning the sample with respect to the irradiation surface of the planar light, and an inclination with respect to the irradiation surface.
  • an imaging optical system with an observation axis an imaging step for imaging the observation light generated on the sample by irradiation with planar light, and a part of the optical image by the observation light imaged by the imaging optical system
  • an imaging optical system is used in which the sample is scanned with respect to the planar light irradiation surface and the observation axis is inclined with respect to the planar light irradiation surface. Therefore, in the image acquisition step, partial image data of the tomographic plane in the optical axis direction of the planar light can be sequentially acquired. In the image generation step, the observation image data of the sample is based on the plurality of partial image data. Can be generated. In this sample observation method, the visual field selection operation is not necessary, and it is possible to simultaneously perform the scanning of the sample and the image acquisition, so that the throughput until the observation image data is obtained can be improved.
  • the throughput until observation image data is obtained can be improved.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram showing an embodiment of a sample observation apparatus.
  • the sample observation apparatus 1 irradiates the sample S with the planar light L2, and forms an image on at least one of fluorescence, scattered light, and diffuse reflection light generated inside the sample S on the imaging surface.
  • This is an apparatus for acquiring observation image data.
  • a slide scanner that acquires and displays an image of the sample S held on a slide glass, or a plate that acquires image data of the sample S held on a microplate and analyzes the image data
  • the sample observation device 1 includes a light source 2, an irradiation optical system 3, a scanning unit 4, an imaging optical system 5, an image acquisition unit 6, and a computer 7. Yes.
  • sample S to be observed examples include human or animal cells, tissues, organs, animals or plants themselves, plant cells, tissues, and the like.
  • the sample S may be contained in a solution, a gel, or a substance having a refractive index different from that of the sample S.
  • the light source 2 is a light source that outputs the light L1 irradiated to the sample S.
  • Examples of the light source 2 include laser light sources such as laser diodes and solid-state laser light sources.
  • the light source 2 may be a light emitting diode, a super luminescent diode, or a lamp light source.
  • the light L1 output from the light source 2 is guided to the irradiation optical system 3.
  • the irradiation optical system 3 is an optical system that shapes the light L1 output from the light source 2 into a planar light L2 and irradiates the sample S with the shaped planar light L2 along the optical axis P1.
  • the optical axis P1 of the irradiation optical system 3 may be referred to as the optical axis of the planar light L2.
  • the irradiation optical system 3 includes a light shaping element such as a cylindrical lens, an axicon lens, or a spatial light modulator, and is optically coupled to the light source 2.
  • the irradiation optical system 3 may include an objective lens.
  • the surface light L2 formed by the irradiation optical system 3 is irradiated to the sample S.
  • the observation light L3 is generated on the irradiation surface R of the planar light L2.
  • the observation light L3 is at least one of, for example, fluorescence excited by the planar light L2, scattered light of the planar light L2, and diffuse reflection light of the planar light L2.
  • the planar light L2 is preferably thin planar light having a thickness of 2 mm or less in consideration of resolution. Further, when the thickness of the sample S is very small, that is, when observing the sample S having a thickness less than or equal to the Z-direction resolution described later, the thickness of the planar light L2 does not affect the resolution. Accordingly, the planar light L2 having a thickness exceeding 2 mm may be used.
  • the scanning unit 4 is a mechanism that scans the sample S with respect to the irradiation surface R of the planar light L2.
  • the scanning unit 4 includes a moving stage 12 that moves the sample container 11 that holds the sample S.
  • the sample container 11 is, for example, a microplate, a slide glass, a petri dish or the like. In this embodiment, a microplate is illustrated.
  • the sample container 11 includes a plate-like main body 14 in which a plurality of wells 13 in which the sample S is arranged are arranged in a straight line (or a matrix), and a well on one surface side of the main body 14. 13 and a plate-like transparent member 15 provided so as to close one end side.
  • the transparent member 15 has an input surface 15 a for the planar light L ⁇ b> 2 with respect to the sample S disposed in the well 13.
  • the material of the transparent member 15 is not particularly limited as long as it is a member having transparency with respect to the planar light L2, but is, for example, glass, quartz, or synthetic resin.
  • the sample container 11 is disposed with respect to the moving stage 12 so that the input surface 15a is orthogonal to the optical axis P1 of the planar light L2.
  • the other end side of the well 13 is open to the outside.
  • the sample container 11 may be fixed with respect to the moving stage 12.
  • the moving stage 12 scans the sample container 11 in a preset direction in accordance with a control signal from the computer 7.
  • the moving stage 12 scans the sample container 11 in one direction within a plane orthogonal to the optical axis P1 of the planar light L2.
  • the optical axis P1 direction of the planar light L2 is the Z axis
  • the scanning direction of the sample container 11 by the moving stage 12 is the Y axis
  • This direction is referred to as the X axis.
  • the irradiation surface R of the planar light L2 on the sample S is a surface in the XZ plane.
  • the imaging optical system 5 is an optical system that images the observation light L3 generated on the sample S by irradiation with the planar light L2. As shown in FIG. 2, the imaging optical system 5 includes, for example, an objective lens 16 and an imaging lens.
  • the optical axis of the imaging optical system 5 is the observation axis P2 of the observation light L3.
  • the observation axis P2 of the imaging optical system 5 is inclined with an inclination angle ⁇ with respect to the irradiation surface R of the planar light L2 in the sample S.
  • the inclination angle ⁇ also coincides with the angle formed by the optical axis P1 of the planar light L2 toward the sample S and the observation axis P2.
  • the inclination angle ⁇ is 10 ° to 80 °.
  • the inclination angle ⁇ is preferably 20 ° to 70 °. Further, from the viewpoint of improving the resolution of the observed image and the stability of the visual field, the inclination angle ⁇ is more preferably 30 ° to 65 °.
  • the image acquisition unit 6 is a device that acquires a plurality of partial image data corresponding to a part of an optical image formed by the observation light L ⁇ b> 3 imaged by the imaging optical system 5.
  • the image acquisition unit 6 is configured to include an imaging device that captures an optical image by the observation light L3, for example.
  • the imaging device include area image sensors such as a CMOS image sensor and a CCD image sensor. These area image sensors are arranged on the image forming plane by the image forming optical system 5, take an optical image with, for example, a global shutter or a rolling shutter, and output two-dimensional image data to the computer 7.
  • a subarray may be set on the imaging surface of the area image sensor 21.
  • the frame rate can be improved. Therefore, in this case, since only the pixel column 21a included in the subarray can be read, a partial image data can be acquired by capturing a part of the optical image by the observation light L3.
  • all the pixel columns of the area image sensor 21 may be used as readout areas, and a partial image data may be acquired by extracting a part of the two-dimensional image by subsequent image processing. .
  • the line sensor 22 may be used in place of the area image sensor 21, and the image pickup surface itself may be limited to one pixel column to acquire partial image data.
  • a slit 23 that transmits only a part of the observation light L3 is disposed in front of the area image sensor (photodetector) 21, and an image of the pixel row 21a corresponding to the slit 23 is obtained. Data may be acquired as partial image data.
  • a point sensor such as a photomultiplier tube may be used instead of the area image sensor 21.
  • the computer 7 is physically configured to include a memory such as a RAM and a ROM, a processor (arithmetic circuit) such as a CPU, a communication interface, a storage unit such as a hard disk, and a display unit such as a display.
  • Examples of the computer 7 include a personal computer, a cloud server, a smart device (smart phone, tablet terminal, etc.), a microcomputer, and the like.
  • the computer 7 executes a program stored in the memory by a CPU of the computer system, thereby controlling the operations of the light source 2 and the moving stage 12, an image generation unit 8 that generates observation image data of the sample S, and an observation. It functions as an analysis unit 10 that analyzes image data (see FIG. 1).
  • the computer 7 as a controller receives the input of the measurement start operation by the user, and drives the light source 2, the moving stage 12, and the image acquisition unit 6 in synchronization.
  • the computer 7 may control the light source 2 so that the light source 2 continuously outputs the light L ⁇ b> 1 during the movement of the sample S by the moving stage 12, and the light source 2 in accordance with the imaging by the image acquisition unit 6.
  • the ON / OFF of the output of the light L1 may be controlled.
  • the computer 7 may turn on / off the irradiation of the planar light L2 on the sample S by controlling the optical shutter.
  • the computer 7 as the image generation unit 8 generates observation image data of the sample S based on the plurality of partial image data generated by the image acquisition unit 6.
  • the image generation unit 8 generates observation image data of the sample S on a plane (XY plane) orthogonal to the optical axis P1 of the planar light L2, for example, based on the plurality of partial image data output from the image acquisition unit 6. .
  • the image generation unit 8 stores the generated observation image data, displays it on a monitor, and the like according to a predetermined operation by the user.
  • the computer 7 as the analysis unit 10 performs analysis based on the observation image data generated by the image generation unit 8 and generates an analysis result.
  • the analysis unit 10 stores the generated analysis result, displays it on a monitor, and the like according to a predetermined operation by the user. Note that the observation image data generated by the image generation unit may not be displayed on the monitor or the like, and only the analysis result generated by the analysis unit 10 may be displayed on the monitor or the like. [Sample observation method]
  • FIG. 4 is a flowchart showing an example of a sample observation method using the sample observation apparatus.
  • this sample observation method includes an irradiation step (step S01), a scanning step (step S02), an imaging step (step S03), an image acquisition step (step S04), and an image generation step (step S05). And an analysis step (step S06).
  • the sample S is irradiated with the planar light L2.
  • the light source 2 is driven based on a control signal from the computer 7, and the light L 1 is output from the light source 2.
  • the light L1 output from the light source 2 is shaped by the irradiation optical system 3 to become planar light L2, and is irradiated onto the sample S.
  • the sample S is scanned with respect to the irradiation surface R of the planar light L2.
  • the moving stage 12 is driven in synchronization with the driving of the light source 2 based on a control signal from the computer 7.
  • the sample container 11 is linearly driven at a constant speed in the Y-axis direction, and the sample S in the well 13 is scanned with respect to the irradiation surface R of the planar light L2.
  • the imaging optical system 5 having the observation axis P2 inclined with respect to the irradiation surface R is used, and the observation light L3 generated on the sample S by the irradiation of the planar light L2 is imaged by the image acquisition unit 6.
  • the image is formed on the surface.
  • a plurality of partial image data corresponding to a part of the optical image by the observation light L3 imaged by the imaging optical system 5 is acquired.
  • the partial image data is sequentially output from the image acquisition unit 6 to the image generation unit 8.
  • observation image data of the sample S is generated based on a plurality of partial image data.
  • the irradiation surface R of the planar light L2 on the sample S is a surface in the XZ plane, and the irradiation surface R with respect to the sample S is in the Y-axis direction. Scanned. Therefore, as shown in FIG. 5A, the image generation unit 8 accumulates three-dimensional information of the sample S by acquiring a plurality of XZ cross-sectional image data 31 that are partial image data in the Y-axis direction. . In the image generation unit 8, data is reconstructed using a plurality of XZ cross-sectional images. For example, as shown in FIG. 5B, XY having an arbitrary thickness at an arbitrary position in the Z-axis direction on the sample S. A cross-sectional image is generated as observation image data 32 with reduced background.
  • the observation image data is analyzed by the analysis unit 10 and an analysis result is generated.
  • the sample S and reagent are placed in the sample container 11 and observation image data is acquired.
  • the analysis part 10 evaluates a reagent based on observation image data, and produces
  • the sample observation apparatus 100 has an observation axis P2 orthogonal to the irradiation surface R of the planar light L2, as shown in FIG.
  • an image of a tomographic plane orthogonal to the direction of the observation axis P2 in the sample S can be acquired by one imaging by irradiating the entire surface of the focus surface of the observation optical system with the planar light L2. Therefore, in order to acquire the three-dimensional information of the sample S, it is necessary to scan the sample S in the direction of the observation axis P2 and acquire images of a plurality of tomographic planes orthogonal to the direction of the observation axis P2.
  • the selection of tomographic planes for acquiring images is performed before images of all tomographic planes are acquired.
  • image acquisition had to be repeated.
  • the imaging visual field is selected by moving the stage in a direction different from the observation axis direction. Operation was necessary.
  • the image acquisition unit 6 acquires an image while scanning the sample S with respect to the irradiation surface R of the planar light L2. Further, the observation axis P2 of the imaging optical system 5 is inclined with respect to the irradiation surface R of the planar light L2. Therefore, the image acquisition unit 6 can sequentially acquire the partial image data of the tomographic plane in the optical axis P1 direction (Z-axis direction) of the planar light L2, and the image generation unit 8 has a plurality of partial image data.
  • the observation image data 32 of the sample S can be generated based on the above.
  • this sample observation apparatus 1 As shown in FIG. 7B, it is possible to sequentially acquire images while scanning the sample S.
  • a time loss occurs due to the influence of inertia or the like every time the moving stage 12 is driven and stopped.
  • the sample observation apparatus 1 the number of times the moving stage 12 is driven and stopped is reduced, and the scanning operation of the sample S and the image acquisition are simultaneously performed, thereby improving the throughput until the observation image data 32 is obtained. It is done.
  • the sample S is held by the sample container 11 having the input surface 15a of the planar light L2, and the optical axis P1 of the planar light L2 by the irradiation optical system 3 is set. It arrange
  • the scanning unit 4 scans the sample S in a direction (Y-axis direction) orthogonal to the optical axis P1 (Z-axis direction) of the planar light L2 by the irradiation optical system 3. Thereby, image processing such as position correction of the partial image data acquired by the image acquisition unit 6 becomes unnecessary, and the generation processing of observation image data can be facilitated.
  • the inclination angle ⁇ of the observation axis P2 of the imaging optical system 5 with respect to the irradiation surface R of the planar light L2 in the sample S is 10 ° to 80 °, preferably 20 ° to 70 °.
  • the angle is preferably 30 ° to 65 °. This point will be considered below.
  • FIG. 8 is a diagram illustrating a calculation example of the visual field in the sample observation apparatus.
  • the imaging optical system is located in the medium A having the refractive index n1
  • the irradiation surface of the planar light is located in the medium B having the refractive index n2.
  • the field A in the imaging optical system is V
  • the irradiation surface is V ′
  • the tilt angle of the observation axis with respect to the irradiation surface is ⁇
  • the refraction angle at the boundary surface between the media A and B is ⁇ ′
  • the medium A at the tilt angle ⁇ of the field V When the distance at the interface between the medium B and the medium B is L, the following equations (1) to (3) hold. (Equation 1)
  • V ′ L / tan ⁇ ′ (3)
  • FIG. 9 is a diagram showing the relationship between the tilt angle of the observation axis and the resolution.
  • the horizontal axis is the tilt angle ⁇ of the observation axis
  • the vertical axis is the relative value V ′ / V of the visual field.
  • the inclination angle ⁇ at which the resolution in the Z direction is maximum tends to decrease as the difference between the refractive index n1 and the refractive index n2 increases.
  • the inclination angle ⁇ at which the resolution in the Z direction is maximized is in the range of about 47 ° to about 57 °.
  • the refractive index n2 is 1.33 (water)
  • the inclination angle ⁇ at which the Z-direction resolution is maximized is estimated to be approximately 52 °.
  • the refractive index n2 is 1.53 (glass)
  • the inclination angle ⁇ at which the Z-direction resolution is maximized is estimated to be about 48 °.
  • FIG. 10 is a diagram illustrating the relationship between the tilt angle of the observation axis and the stability of the visual field.
  • the horizontal axis is the tilt angle ⁇ of the observation axis
  • the vertical axis is the stability of the visual field.
  • the stability is expressed as a ratio of a difference value between V ′ / V at the inclination angle ⁇ + 1 and V ′ / V at the inclination angle ⁇ 1 with respect to V ′ / V at the inclination angle ⁇ , and the following formula (4) Is calculated based on It can be evaluated that the closer the stability is to 0%, the smaller the change in the visual field with respect to the change in the tilt angle, and the more stable the visual field.
  • the stability when the refractive index n1 of the medium A is 1 (air) and the refractive index n2 of the medium B is changed from 1.0 to 2.0 in increments of 0.1.
  • the degree is plotted. (Equation 4)
  • FIG. 11 is a diagram showing the relationship between the tilt angle of the observation axis and the transmittance of observation light from the sample.
  • the horizontal axis is the tilt angle ⁇ of the observation axis
  • the left vertical axis is the relative value of the visual field
  • the right vertical axis is the transmittance.
  • the refractive index n1 of the medium A is 1 (air)
  • the refractive index n2 of the medium B is 1.53 (glass)
  • the refractive index n3 of the medium C is 1. .33 (water)
  • the transmittance value is the product of the transmittances of the interfaces of the media B and C and the interfaces of the media A and B.
  • FIG. 11 plots the P wave transmittance, the S wave transmittance, and the angle dependency of the average of these. Further, in FIG. 11, the relative values of the visual field in the medium C are also plotted.
  • the transmittance of the observation light from the sample to the imaging optical system can be changed by changing the inclination angle ⁇ of the observation axis. It can be seen that a transmittance of at least 50% or more can be obtained when the inclination angle ⁇ is in the range of 80 ° or less. It can also be seen that a transmittance of at least 60% is obtained when the tilt angle ⁇ is 70 ° or less, and a transmittance of at least 75% is obtained when the tilt angle ⁇ is 65 ° or less.
  • the Z-direction resolution of the sample is required, for example, the value of V ′ / V, which is the relative value of the visual field, is 3 or less, the stability is less than 5%, and the transmittance of the observation light It is preferable to select the inclination angle ⁇ from a range of 30 ° to 65 ° so that (average value of P wave and S wave) is 75% or more.
  • the inclination angle ⁇ may be appropriately selected from the range of 10 ° to 80 °, and 10 ° to 30 ° from the viewpoint of securing the field of view per pixel. Alternatively, it is preferable to select from a range of 65 ° to 80 °.
  • the sample observation apparatus and the sample observation method are not limited to the above embodiment.
  • the optical axis P1 of the planar light L2 and the input surface 15a of the sample container 11 do not necessarily have to be orthogonal to each other.
  • the optical axis P1 of the planar light L2 and the scanning direction of the sample S by the scanning unit 4 are: It does not necessarily have to be orthogonal.
  • the transparent member 15 is provided so as to block the one end side of the well 13 in the sample container 11, and the planar light L2 is input from the input surface 15a of the transparent member 15.
  • a configuration in which the planar light L2 is input from the other end of 13 is also possible.
  • the sample container 11 may be held on a solid substance such as a gel, and the sample S is moved by flowing a fluid such as a sheath liquid into the transparent container as in a flow cytometer. May be.
  • a sheath liquid containing a liquid containing a specimen that is the sample S flows through the flow cell. Thereby, since the specimen moves while being aligned, the flow cell can be positioned as the scanning unit.
  • a plurality of pairs of the imaging optical system 5 and the image acquisition unit 6 may be arranged.
  • the observation range can be expanded, and observation light L3 having a plurality of different wavelengths can be observed.
  • a plurality of image acquisition units 6 may be arranged for one imaging optical system 5, and one image acquisition unit 6 may be arranged for a plurality of imaging optical systems 5.
  • the plurality of image acquisition units 6 may combine different types of photodetectors or imaging devices.
  • the light source 2 may be composed of a plurality of light sources that output light having different wavelengths. In this case, the sample S can be irradiated with excitation light having different wavelengths.
  • a prism may be arranged in the imaging optical system 5 to reduce astigmatism.
  • a prism 41 may be arranged on the rear side of the objective lens 16 (between the objective lens 16 and the image acquisition unit 6).
  • the imaging surface of the imaging device in the image acquisition unit 6 may be inclined with respect to the observation axis P2.
  • a dichroic mirror or a prism may be disposed between the imaging optical system 5 and the image acquisition unit 6 to perform wavelength separation of the observation light L3.
  • the image acquisition unit 6 may acquire image data of different types of observation light L3.
  • at least two types of observation light can be targeted among the fluorescence excited by the planar light L2, the scattered light of the planar light L2, and the diffuse reflected light of the planar light L2.

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Abstract

試料観察装置１は、試料Ｓに面状光Ｌ２を照射する照射光学系３と、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して試料Ｓを走査する走査部４と、照射面Ｒに対して傾斜する観察軸Ｐ２を有し、面状光Ｌ２の照射によって試料Ｓで発生した観察光Ｌ３を結像する結像光学系５と、結像光学系５によって結像された観察光Ｌ３による光像の一部に対応する部分画像データを複数取得する画像取得部６と、画像取得部６によって生成された複数の部分画像データに基づいて試料Ｓの観察画像データを生成する画像生成部８と、を備える。

Description

試料観察装置及び試料観察方法
　本開示は、試料観察装置及び試料観察方法に関する。
　細胞などの３次元立体構造を持つ試料の内部を観察する手法の一つとして、ＳＰＩＭ（Selective Plane Illumination Microscopy）が知られている。例えば特許文献１に記載の断層像観察装置は、ＳＰＩＭの基本的な原理を開示したものであり、面状光を試料に照射し、試料の内部で発生した蛍光又は散乱光を結像面に結像させて試料内部の観察画像データを取得する。
　面状光を用いた他の試料観察装置としては、例えば特許文献２に記載のＳＰＩＭ顕微鏡が挙げられる。この従来のＳＰＩＭ顕微鏡では、試料の配置面に対して一定の傾斜角をもって面状光を照射し、面状光の照射面に対して直交する観察軸を有する観察光学系によって試料からの観察光を撮像する。
特開昭６２－１８０２４１号公報 特開２０１４－２０２９６７号公報
　上述した特許文献２に記載の試料観察装置では、観察光学系のフォーカス面の全面に面状光を照射することで、１回の撮像によって観察軸方向の断層面の画像を取得し得る。したがって、試料の３次元情報を取得するためには、観察軸方向に試料を走査し、観察軸方向の複数断層面の画像を取得する必要があった。このような従来の試料観察装置では、全ての断層面の画像を取得するまでに、画像を取得する断層面の選択（試料の走査及び停止）と画像取得とを繰り返す必要があった。また、観察対象が存在する領域が撮像領域よりも広い場合には、観察軸方向の断面画像を取得する動作に加え、観察軸方向とは異なる方向へステージを移動して撮像視野を選択する動作などが必要となっていた。このため、観察画像データを得るまでに時間を要することが課題となっていた。
　実施形態は、試料観察装置及び試料観察方法を提供することを目的とする。
　実施形態の一側面に係る試料観察装置は、試料に面状光を照射する照射光学系と、面状光の照射面に対して試料を走査する走査部と、照射面に対して傾斜する観察軸を有し、面状光の照射によって試料で発生した観察光を結像する結像光学系と、結像光学系によって結像された観察光による光像の一部に対応する部分画像データを複数取得する画像取得部と、画像取得部によって生成された複数の部分画像データに基づいて試料の観察画像データを生成する画像生成部と、を備える。
　この試料観察装置では、面状光の照射面に対して試料が走査され、また、面状光の照射面に対し、結像光学系の観察軸が傾斜している。このため、画像取得部では、面状光の光軸方向における断層面の部分画像データを順次取得することが可能となり、画像生成部では、複数の部分画像データに基づいて、試料の観察画像データを生成できる。この試料観察装置では、視野選択動作が不要となり、試料の走査と画像取得とを同時進行することが可能となるため、観察画像データを得るまでのスループットの向上が図られる。
　また、試料は、面状光の入力面を有する試料容器によって保持され、照射光学系による面状光の光軸は、試料容器の入力面に対して直交するように配置されていてもよい。この場合、試料容器によって複数の試料を一度に走査することが可能となる。また、面状光の光軸を試料容器の入力面に対して直交させることで、画像取得部で取得した部分画像データの位置補正などが不要となり、観察画像データの生成処理を容易化できる。
　また、走査部は、照射光学系による面状光の光軸に対して直交する方向に試料を走査してもよい。この場合、画像取得部で取得した部分画像データの位置補正などの画像処理が不要となり、観察画像データの生成処理を容易化できる。
　また、面状光の照射面に対する結像光学系の観察軸の傾斜角度は、１０°～８０°となっていてもよい。この範囲では、観察画像の解像度を十分に確保できる。
　また、面状光の照射面に対する結像光学系の観察軸の傾斜角度は、２０°～７０°となっていてもよい。この範囲では、観察画像の解像度を一層十分に確保できる。また、観察軸の角度変化量に対する視野の変化を抑えることができ、視野の安定度を確保できる。
　また、面状光の照射面に対する結像光学系の観察軸の傾斜角度は、３０°～６５°となっていてもよい。この範囲では、観察画像の解像度及び視野の安定度を一層好適に確保できる。
　また、画像取得部は、二次元撮像装置を含んで構成され、二次元撮像装置から出力されたデータから観察光の光像の一部に対応する画像データを部分画像データとして抽出してもよい。このような構成により、部分画像データを精度良く取得できる。
　また、画像取得部は、観察光による光像の一部を撮像し、部分画像データを出力するラインセンサを含んでいてもよい。このような構成により、部分画像データを精度良く取得できる。
　また、画像取得部は、観察光による光像の一部を通過させるスリットと、スリットを通過した光像を検出する光検出器とを含み、光検出器から出力されたデータに基づいて部分画像データを生成してもよい。このような構成により、部分画像データを精度良く取得できる。
　また、画像生成部は、複数の部分画像データに基づいて、面状光の光軸に直交する面における試料の観察画像データを生成してもよい。これにより、バックグラウンドの影響を抑えた試料の断面画像を観察画像として得ることができる。
　また、試料観察装置は、観察画像データを解析し、解析結果を生成する解析部を更に備えていてもよい。画像生成部によって生成された観察画像データを解析部で解析するため、解析のスループットも向上させることができる。
　また、実施形態の一側面に係る試料観察方法は、試料に面状光を照射する照射ステップと、面状光の照射面に対して試料を走査する走査ステップと、照射面に対して傾斜する観察軸を有する結像光学系を用い、面状光の照射によって試料で発生した観察光を結像する結像ステップと、結像光学系によって結像された観察光による光像の一部に対応する部分画像データを複数取得する画像取得ステップと、複数の部分画像データに基づいて試料の観察画像データを生成する画像生成ステップと、を備える。
　この試料観察方法では、面状光の照射面に対して試料が走査され、また、面状光の照射面に対して観察軸が傾斜している結像光学系を用いる。このため、画像取得ステップでは、面状光の光軸方向における断層面の部分画像データを順次取得することが可能となり、画像生成ステップでは、複数の部分画像データに基づいて、試料の観察画像データを生成できる。この試料観察方法では、視野選択動作が不要となり、試料の走査と画像取得とを同時進行することが可能となるため、観察画像データを得るまでのスループットの向上が図られる。
　この試料観察装置及び試料観察方法によれば、観察画像データを得るまでのスループットの向上が図られる。
試料観察装置の一実施形態を示す概略構成図である。 試料の近傍を示す要部拡大図である。 画像取得部の一例を示す図である。 試料観察装置を用いた試料観察方法の一例を示すフローチャートである。 画像生成部による観察画像データの生成の一例を示す図である。 比較例における画像取得の様子を示す図である。 実施例における画像取得の様子を示す図である。 試料観察装置における視野の算出例を示す図である。 観察軸の傾斜角度と解像度との関係を示す図である。 観察軸の傾斜角度と視野の安定度との関係を示す図である。 観察軸の傾斜角度と試料からの観察光の透過率との関係を示す図である。 結像光学系の変形例を示す図である。
　以下、図面を参照しながら、試料観察装置及び試料観察方法の好適な実施形態について詳細に説明する。
［試料観察装置の構成］
　図１は、試料観察装置の一実施形態を示す概略構成図である。この試料観察装置１は、面状光Ｌ２を試料Ｓに照射し、試料Ｓの内部で発生した蛍光、散乱光、拡散反射光の少なくとも一つを結像面に結像させて試料Ｓ内部の観察画像データを取得する装置である。この種の試料観察装置１としては、スライドガラスに保持される試料Ｓの画像を取得し表示するスライドスキャナ、あるいはマイクロプレートに保持される試料Ｓの画像データを取得し、画像データを解析するプレートリーダなどがある。試料観察装置１は、図１に示すように、光源２と、照射光学系３と、走査部４と、結像光学系５と、画像取得部６と、コンピュータ７とを備えて構成されている。
　観察対象となる試料Ｓとしては、例えばヒト或いは動物の細胞、組織、臓器、動物或いは植物自体、植物の細胞、組織などが挙げられる。また、試料Ｓは、溶液、ゲル、或いは試料Ｓとは屈折率の異なる物質に含まれていてもよい。
　光源２は、試料Ｓに照射される光Ｌ１を出力する光源である。光源２としては、例えばレーザダイオード、固体レーザ光源といったレーザ光源が挙げられる。また、光源２は、発光ダイオード、スーパールミネッセントダイオード、ランプ系光源であってもよい。光源２から出力された光Ｌ１は、照射光学系３に導光される。
　照射光学系３は、光源２から出力された光Ｌ１を面状光Ｌ２に整形し、整形された面状光Ｌ２を光軸Ｐ１に沿って試料Ｓに照射する光学系である。以下の説明では、照射光学系３の光軸Ｐ１を面状光Ｌ２の光軸という場合もある。照射光学系３は、例えばシリンドリカルレンズ、アキシコンレンズ、或いは空間光変調器などの光整形素子を含んで構成され、光源２に対して光学的に結合されている。照射光学系３は、対物レンズを含んで構成されていてもよい。照射光学系３によって形成された面状光Ｌ２は、試料Ｓに照射される。面状光Ｌ２が照射された試料Ｓでは、面状光Ｌ２の照射面Ｒにおいて観察光Ｌ３が発生する。観察光Ｌ３は、例えば面状光Ｌ２によって励起された蛍光、面状光Ｌ２の散乱光、面状光Ｌ２の拡散反射光の少なくとも一つである。
　試料Ｓの厚さ方向に観察を行う場合、分解能を考慮して、面状光Ｌ２は、厚さ２ｍｍ以下の薄い面状光であることが好ましい。また、試料Ｓの厚さが非常に小さい場合、すなわち、後述するＺ方向解像度以下の厚さの試料Ｓを観察する場合には、面状光Ｌ２の厚さは分解能に影響しない。したがって、厚さ２ｍｍを超える面状光Ｌ２を用いてもよい。
　走査部４は、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して試料Ｓを走査する機構である。本実施形態では、走査部４は、試料Ｓを保持する試料容器１１を移動させる移動ステージ１２によって構成されている。試料容器１１は、例えばマイクロプレート、スライドガラス、シャーレ等である。本実施形態では、マイクロプレートを例示する。試料容器１１は、図２に示すように、試料Ｓが配置される複数のウェル１３が一直線状（或いはマトリクス状）に配列された板状の本体部１４と、本体部１４の一面側においてウェル１３の一端側を塞ぐように設けられた板状の透明部材１５とを有している。
　ウェル１３内への試料Ｓの配置にあたっては、ウェル１３内が水などの媒体で充填されていてもよい。透明部材１５は、ウェル１３内に配置された試料Ｓに対する面状光Ｌ２の入力面１５ａを有している。透明部材１５の材質は、面状光Ｌ２に対する透明性を有する部材であれば特に限定はされないが、例えばガラス、石英、或いは合成樹脂である。試料容器１１は、入力面１５ａが面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と直交するように移動ステージ１２に対して配置されている。なお、ウェル１３の他端側は、外部に開放された状態となっている。試料容器１１は、移動ステージ１２に対して固定されていてもよい。
　移動ステージ１２は、図１に示すように、コンピュータ７からの制御信号に従い、予め設定された方向に試料容器１１を走査する。本実施形態では、移動ステージ１２は、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と直交する平面内の一方向に試料容器１１を走査する。以下の説明では、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１方向をＺ軸、移動ステージ１２による試料容器１１の走査方向をＹ軸、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と直交する平面内においてＹ軸に直交する方向をＸ軸と称する。試料Ｓに対する面状光Ｌ２の照射面Ｒは、ＸＺ平面内の面となる。
　結像光学系５は、面状光Ｌ２の照射によって試料Ｓで発生した観察光Ｌ３を結像する光学系である。結像光学系５は、図２に示すように、例えば対物レンズ１６及び結像レンズ等を含んで構成されている。結像光学系５の光軸は、観察光Ｌ３の観察軸Ｐ２となっている。この結像光学系５の観察軸Ｐ２は、試料Ｓにおける面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して傾斜角度θをもって傾斜している。傾斜角度θは、試料Ｓに向かう面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と観察軸Ｐ２とがなす角とも一致する。傾斜角度θは、１０°～８０°となっている。観察画像の解像度を向上させる観点から、傾斜角度θは、２０°～７０°であることが好ましい。また、観察画像の解像度の向上及び視野の安定性の観点から、傾斜角度θは、３０°～６５°であることが更に好ましい。
　画像取得部６は、図１に示すように、結像光学系５によって結像された観察光Ｌ３による光像の一部に対応する部分画像データを複数取得する装置である。画像取得部６は、例えば観察光Ｌ３による光像を撮像する撮像装置を含んで構成されている。撮像装置としては、例えばＣＭＯＳイメージセンサ、ＣＣＤイメージセンサといったエリアイメージセンサが挙げられる。これらのエリアイメージセンサは、結像光学系５による結像面に配置され、例えばグローバルシャッタ或いはローリングシャッタによって光像を撮像し、二次元画像のデータをコンピュータ７に出力する。
　観察光Ｌ３による光像の部分画像データの取得方法については、種々の態様を採り得る。例えば図３（Ａ）に示すように、エリアイメージセンサ２１の撮像面においてサブアレイを設定してもよい。エリアイメージセンサにおけるサブアレイ読み出しでは、全画素列のうち、設定された画素列のみを読み出すことができ、フレームレートを向上させることができる。したがって、この場合、サブアレイに含まれる画素列２１ａのみを読み出すことができるので、観察光Ｌ３による光像の一部を撮像して部分画像データを取得できる。また、図３（Ｂ）に示すように、エリアイメージセンサ２１の全ての画素列を読み出しエリアとし、その後の画像処理によって二次元画像の一部を抽出して部分画像データを取得してもよい。
　さらに、図３（Ｃ）に示すように、エリアイメージセンサ２１に代えてラインセンサ２２を用い、撮像面自体を一の画素列に限定して部分画像データを取得してもよい。また、図３（Ｄ）に示すように、観察光Ｌ３の一部のみを透過させるスリット２３をエリアイメージセンサ（光検出器）２１の前面に配置し、スリット２３に対応する画素列２１ａの画像データを部分画像データとして取得してもよい。また、スリット２３を用いる場合、エリアイメージセンサ２１に代えて光電子増倍管などのポイントセンサを用いてもよい。
　コンピュータ７は、物理的には、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリ、及びＣＰＵ等のプロセッサ（演算回路）、通信インターフェイス、ハードディスク等の格納部、ディスプレイ等の表示部を備えて構成されている。かかるコンピュータ７としては、例えばパーソナルコンピュータ、クラウドサーバ、スマートデバイス（スマートフォン、タブレット端末など）、マイクロコンピュータなどが挙げられる。コンピュータ７は、メモリに格納されるプログラムをコンピュータシステムのＣＰＵで実行することにより、光源２及び移動ステージ１２の動作を制御するコントローラ、試料Ｓの観察画像データを生成する画像生成部８、及び観察画像データを解析する解析部１０として機能する（図１参照）。
　コントローラとしてのコンピュータ７は、ユーザによる測定開始の操作の入力を受け、光源２、移動ステージ１２、及び画像取得部６を同期させて駆動する。この場合、コンピュータ７は、移動ステージ１２による試料Ｓの移動中、光源２が光Ｌ１を連続的に出力するように光源２を制御してもよく、画像取得部６による撮像に合わせて光源２による光Ｌ１の出力のＯＮ／ＯＦＦを制御してもよい。また、照射光学系３が光シャッタ（不図示）を備えている場合、コンピュータ７は、当該光シャッタの制御によって試料Ｓへの面状光Ｌ２の照射をＯＮ／ＯＦＦさせてもよい。
　また、画像生成部８としてのコンピュータ７は、画像取得部６によって生成された複数の部分画像データに基づいて試料Ｓの観察画像データを生成する。画像生成部８は、画像取得部６から出力された複数の部分画像データに基づいて、例えば面状光Ｌ２の光軸Ｐ１に直交する面（ＸＹ面）における試料Ｓの観察画像データを生成する。画像生成部８は、ユーザによる所定の操作に従って、生成した観察画像データの格納、モニタ等への表示等を実行する。
　解析部１０としてのコンピュータ７は、画像生成部８によって生成された観察画像データに基づいて解析を実行し、解析結果を生成する。解析部１０は、ユーザによる所定の操作に従って、生成した解析結果の格納、モニタ等への表示等を実行する。なお、画像生成部によって生成された観察画像データのモニタ等への表示は行わず、解析部１０によって生成された解析結果のみをモニタ等に表示してもよい。
［試料観察方法］
　図４は、試料観察装置を用いた試料観察方法の一例を示すフローチャートである。同図に示すように、この試料観察方法は、照射ステップ（ステップＳ０１）、走査ステップ（ステップＳ０２）、結像ステップ（ステップＳ０３）、画像取得ステップ（ステップＳ０４）、画像生成ステップ（ステップＳ０５）、及び解析ステップ（ステップＳ０６）を備えている。
　照射ステップＳ０１では、試料Ｓに面状光Ｌ２を照射する。ユーザによって測定開始の操作が入力されると、コンピュータ７からの制御信号に基づいて光源２が駆動し、光源２から光Ｌ１が出力される。光源２から出力された光Ｌ１は、照射光学系３によって整形されて面状光Ｌ２となり、試料Ｓに照射される。
　走査ステップＳ０２では、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して試料Ｓを走査する。ユーザによって測定開始の操作が入力されると、コンピュータ７からの制御信号に基づいて、光源２の駆動と同期して移動ステージ１２が駆動する。これにより、試料容器１１がＹ軸方向に一定の速度で直線的に駆動し、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対してウェル１３内の試料Ｓが走査される。
　結像ステップＳ０３では、照射面Ｒに対して傾斜する観察軸Ｐ２を有する結像光学系５を用い、面状光Ｌ２の照射によって試料Ｓで発生した観察光Ｌ３を画像取得部６の結像面に対して結像する。画像取得ステップＳ０４では、結像光学系５によって結像された観察光Ｌ３による光像の一部に対応する部分画像データを複数取得する。部分画像データは、画像取得部６から画像生成部８に順次出力される。
　画像生成ステップＳ０５では、複数の部分画像データに基づいて試料Ｓの観察画像データを生成する。本実施形態では、図１及び図２に示したように、試料Ｓに対する面状光Ｌ２の照射面Ｒは、ＸＺ平面内の面であり、試料Ｓに対して照射面ＲがＹ軸方向に走査される。したがって、画像生成部８には、図５（Ａ）に示すように、部分画像データであるＸＺ断面画像データ３１をＹ軸方向に複数取得することによって、試料Ｓの３次元情報が蓄積される。画像生成部８では、複数のＸＺ断面画像を用いてデータが再構築され、例えば図５（Ｂ）に示すように、試料ＳにおけるＺ軸方向の任意の位置において任意の厚さを持ったＸＹ断面画像が、バックグラウンドを抑えた観察画像データ３２として生成される。
　解析ステップＳ０６では、解析部１０によって観察画像データを解析し、解析結果を生成する。例えば創薬スクリーニングでは、試料容器１１に試料Ｓ及び試薬を入れ、観察画像データを取得する。そして、解析部１０は、観察画像データに基づいて試薬を評価し、評価データを解析結果として生成する。
［作用効果］
　比較例に係る試料観察装置１００は、図６（Ａ）に示すように、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して直交する観察軸Ｐ２を有している。この試料観察装置１００では、観察光学系のフォーカス面の全面に面状光Ｌ２を照射することで、１回の撮像によって試料Ｓにおける観察軸Ｐ２方向に直交する断層面の画像を取得し得る。したがって、試料Ｓの３次元情報を取得するためには、観察軸Ｐ２方向に試料Ｓを走査し、観察軸Ｐ２方向に直交する複数の断層面の画像を取得する必要があった。このような比較例に係る試料観察装置１００では、図６（Ｂ）に示すように、全ての断層面の画像を取得するまでに、画像を取得する断層面の選択（試料Ｓの走査及び停止）と画像取得とを繰り返す必要があった。また、観察対象が存在する領域が撮像よりも広い場合には、観察軸Ｐ２方向の断面画像を取得する動作に加え、観察軸方向とは異なる方向へステージを移動することにより撮像視野を選択する動作などが必要となっていた。
　これに対し、実施例に係る試料観察装置１では、図７（Ａ）に示すように、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して試料Ｓを走査しながら画像取得部６によって画像取得を行い、また、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対し、結像光学系５の観察軸Ｐ２が傾斜している。このため、画像取得部６では、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１方向（Ｚ軸方向）における断層面の部分画像データを順次取得することが可能となり、画像生成部８では、複数の部分画像データに基づいて、試料Ｓの観察画像データ３２を生成できる。
　この試料観察装置１では、図７（Ｂ）に示すように、試料Ｓを走査させながら画像取得を順次行うことが可能となる。比較例に係る試料観察装置１００の動作では、移動ステージ１２の駆動及び停止の際の度に、慣性の影響等により時間的なロスが生じる。一方、試料観察装置１では、移動ステージ１２の駆動及び停止の回数を削減し、試料Ｓの走査動作と画像取得とを同時進行することで、観察画像データ３２を得るまでのスループットの向上が図られる。
　また、試料観察装置１では、図２に示したように、試料Ｓが面状光Ｌ２の入力面１５ａを有する試料容器１１によって保持され、照射光学系３による面状光Ｌ２の光軸Ｐ１が試料容器１１の入力面１５ａに対して直交するように配置されている。さらに、試料観察装置１では、照射光学系３による面状光Ｌ２の光軸Ｐ１（Ｚ軸方向）に対して直交する方向（Ｙ軸方向）に走査部４が試料Ｓを走査する。これにより、画像取得部６で取得した部分画像データの位置補正などの画像処理が不要となり、観察画像データの生成処理を容易化できる。
　また、試料観察装置１では、試料Ｓにおける面状光Ｌ２の照射面Ｒに対する結像光学系５の観察軸Ｐ２の傾斜角度θが１０°～８０°、好ましくは、２０°～７０°、より好ましくは３０°～６５°となっている。以下、この点について考察する。
　図８は、試料観察装置における視野の算出例を示す図である。同図に示す例では、結像光学系が屈折率ｎ１の媒質Ａ中に位置し、面状光の照射面が屈折率ｎ２の媒質Ｂ中に位置している。結像光学系における視野をＶ、照射面をＶ’、照射面に対する観察軸の傾斜角度をθ、媒質Ａ，Ｂの境界面での屈折角をθ’、視野Ｖの傾斜角度θにおける媒質Ａと媒質Ｂの界面での距離をＬとした場合、以下の式（１）～（３）が成り立つ。
（数１）
　Ｌ＝Ｖ／ｃｏｓθ　…（１）
（数２）
　ｓｉｎθ’＝（ｎ１／ｎ２）ｓｉｎθ　…（２）
（数３）
　Ｖ’＝Ｌ／ｔａｎθ’　…（３）
　図９は、観察軸の傾斜角度と解像度との関係を示す図である。同図では、横軸を観察軸の傾斜角度θとし、縦軸を視野の相対値Ｖ’／Ｖとしている。そして、媒質Ａの屈折率ｎ１を１（空気）とし、媒質Ｂの屈折率ｎ２を１．０から２．０まで０．１刻みで変化させたときのＶ’／Ｖの値を傾斜角度θに対してプロットしたものである。Ｖ’／Ｖの値が小さいほど試料の深さ方向の解像度（以下、「Ｚ方向解像度」と称す）が高く、大きいほどＺ方向解像度が低いことを示している。
　図９に示す結果から、媒質Ａの屈折率ｎ１と媒質Ｂの屈折率ｎ２とが等しい場合には、傾斜角度θに対してＶ’／Ｖの値が反比例していることが分かる。また、媒質Ａの屈折率ｎ１と媒質Ｂの屈折率ｎ２とが異なる場合には、傾斜角度θに対してＶ’／Ｖの値が放物線を描くことが分かる。この結果から、試料の配置空間の屈折率、結像光学系の配置空間の屈折率、及び観察軸の傾斜角度θによってＺ方向解像度をコントロールできることが分かる。そして、傾斜角度θが１０°～８０°の範囲では、傾斜角度θが１０°未満及び８０°を超える範囲に比べて良好なＺ方向解像度が得られることが分かる。
　また、図９に示す結果から、Ｚ方向解像度が最大となる傾斜角度θは、屈折率ｎ１と屈折率ｎ２との差が大きくなるにつれて小さく傾向があることが分かる。屈折率ｎ２が１．１～２．０の範囲では、Ｚ方向解像度が最大となる傾斜角度θは、約４７°～約５７°の範囲となる。例えば屈折率ｎ２が１．３３（水）の場合、Ｚ方向解像度が最大となる傾斜角度θは、およそ５２°と見積もられる。また、例えば屈折率ｎ２が１．５３（ガラス）の場合、Ｚ方向解像度が最大となる傾斜角度θは、およそ４８°と見積もられる。
　図１０は、観察軸の傾斜角度と視野の安定度との関係を示す図である。同図では、横軸を観察軸の傾斜角度θとし、縦軸を視野の安定度としている。安定度は、傾斜角度θでのＶ’／Ｖに対する傾斜角度θ＋１でのＶ’／Ｖと傾斜角度θ－１でのＶ’／Ｖとの差分値の割合で表され、下記式（４）に基づいて算出される。安定度が０％に近い程、傾斜角度の変化に対する視野の変化が小さく、視野が安定していると評価できる。この図１０では、図９と同様に、媒質Ａの屈折率ｎ１を１（空気）とし、媒質Ｂの屈折率ｎ２を１．０から２．０まで０．１刻みで変化させたときの安定度がプロットされている。
（数４）
　安定度（％）＝（（Ｖ’／Ｖ）θ＋１－（Ｖ’／Ｖ）θ－１）／（Ｖ’／Ｖ）θ　…（４）
　図１０に示す結果から、傾斜角度θが１０°未満及び８０°を超える範囲では、安定度が±２０％を超えており、視野のコントロールが困難であることが分かる。一方、傾斜角度θが１０°～８０°の範囲では、安定度が±２０％以下となり、視野のコントロールが可能となる。さらに、傾斜角度θが２０°～７０どの範囲では、安定度が±１０％以下となり、視野のコントロールが容易となる。
　図１１は、観察軸の傾斜角度と試料からの観察光の透過率との関係を示す図である。同図では、横軸を観察軸の傾斜角度θとし、左側の縦軸を視野の相対値、右側の縦軸を透過率としている。この図１１では、試料容器における試料の保持状態を考慮し、媒質Ａの屈折率ｎ１を１（空気）、媒質Ｂの屈折率ｎ２を１．５３（ガラス）、媒質Ｃの屈折率ｎ３を１．３３（水）とし、透過率の値は、媒質Ｂ，Ｃの界面及び媒質Ａ，Ｂの界面の透過率の積としている。図１１には、Ｐ波の透過率、Ｓ波の透過率、及びこれらの平均値の角度依存性がプロットされている。また、図１１には、媒質Ｃにおける視野の相対値が併せてプロットされている。
　図１１に示す結果から、観察軸の傾斜角度θを変化させることで、試料から結像光学系に至る観察光の透過率が可変となることが分かる。傾斜角度θが８０°以下の範囲では、少なくとも５０％以上の透過率が得られることが分かる。また、傾斜角度θが７０°以下の範囲では、少なくとも６０％以上の透過率が得られ、傾斜角度θが６５°以下の範囲では、少なくとも７５％以上の透過率が得られることが分かる。
　以上の結果から、試料のＺ方向解像度が要求される場合には、例えば視野の相対値であるＶ’／Ｖの値が３以下であり、安定度が５％未満、かつ観察光の透過率（Ｐ波及びＳ波の平均値）が７５％以上となるように、傾斜角度θを３０°～６５°の範囲から選択することが好適である。また、試料のＺ方向解像度が要求されない場合には、傾斜角度θを１０°～８０°の範囲から適宜選択すればよく、１画素当たりの視野の範囲を確保する観点から、１０°～３０°若しくは６５°～８０°の範囲から選択することが好適である。
　試料観察装置及び試料観察方法は、上記実施形態に限られるものではない。例えば面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と試料容器１１の入力面１５ａとは、必ずしも直交していなくてもよく、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１と走査部４による試料Ｓの走査方向とは、必ずしも直交していなくてもよい。
　また、例えば上記実施形態では、試料容器１１においてウェル１３の一端側を塞ぐように透明部材１５が設けられており、透明部材１５の入力面１５ａから面状光Ｌ２を入力させているが、ウェル１３の他端側から面状光Ｌ２を入力させる構成としてもよい。この場合、屈折率が異なる媒質の界面の数が少なくなり、観察光Ｌ３の屈折回数を減らすことが可能となる。さらに、試料容器１１に代えて、ゲル等の固形物に試料Ｓを保持してもよく、フローサイトメーターのように、透明容器内にシース液等の流体を流して試料Ｓを移動させるようにしてもよい。フローサイトメーターの場合、フローセルにより、試料Ｓである検体を含有する液が含まれたシース液が流れる。これにより、検体が整列しながら移動するため、フローセルを走査部と位置付けることができる。
　また、結像光学系５及び画像取得部６を複数対配置してもよい。この場合、観察範囲を拡大できるほか、複数の異なる波長の観察光Ｌ３を観察することが可能となる。また、一つの結像光学系５に対して複数の画像取得部６を配置してもよく、複数の結像光学系５に対して一つの画像取得部６を配置してもよい。複数の画像取得部６は、異なる種類の光検出器あるいは撮像装置を組み合わせてもよい。光源２は、波長の異なる光を出力する複数の光源によって構成されてもよい。この場合、波長の異なる励起光を試料Ｓに照射することができる。
　また、非点収差の緩和のため、結像光学系５にプリズムを配置してもよい。この場合、例えば図１２に示すように、対物レンズ１６の後段側（対物レンズ１６と画像取得部６との間）にプリズム４１を配置してもよい。デフォーカス対策のため、観察軸Ｐ２に対して画像取得部６における撮像装置の撮像面を傾斜させてもよい。この他、例えば結像光学系５と画像取得部６との間にダイクロイックミラー或いはプリズムを配置して観察光Ｌ３の波長分離を行う構成としてもよい。
　また、上述したように、観察光Ｌ３としては、面状光Ｌ２によって励起された蛍光、面状光Ｌ２の散乱光、或いは面状光Ｌ２の拡散反射光などが考えられる。このため、画像取得部６は、異なる種類の観察光Ｌ３の画像データを取得してもよい。この場合、面状光Ｌ２によって励起された蛍光、面状光Ｌ２の散乱光、面状光Ｌ２の拡散反射光のうち、少なくとも２つの種類の観察光を対象にすることができる。
　１…試料観察装置、３…照射光学系、４…走査部、５…結像光学系、６…画像取得部、８…画像生成部、１０…解析部、１１…試料容器、１５ａ…入力面、２１…エリアイメージセンサ（撮像装置）、２２…ラインセンサ、２３…スリット、３１…部分画像データ、３２…観察画像データ、Ｌ２…面状光、Ｌ３…観察光、Ｐ２…観察軸、Ｒ…照射面、Ｓ…試料、θ…傾斜角度。

Claims (12)

  1. 　試料に面状光を照射する照射光学系と、
    　前記面状光の照射面に対して前記試料を走査する走査部と、
    　前記照射面に対して傾斜する観察軸を有し、前記面状光の照射によって前記試料で発生した観察光を結像する結像光学系と、
    　前記結像光学系によって結像された前記観察光による光像の一部に対応する部分画像データを複数取得する画像取得部と、
    　前記画像取得部によって生成された複数の部分画像データに基づいて前記試料の観察画像データを生成する画像生成部と、を備えた試料観察装置。
  2. 　前記試料は、前記面状光の入力面を有する試料容器によって保持され、
    　前記照射光学系による前記面状光の光軸は、前記試料容器の前記入力面に対して直交するように配置されている請求項１記載の試料観察装置。
  3. 　前記走査部は、前記照射光学系による前記面状光の光軸に対して直交する方向に前記試料を走査する請求項１又は２記載の試料観察装置。
  4. 　前記面状光の照射面に対する前記結像光学系の前記観察軸の傾斜角度は、１０°～８０°となっている請求項１～３のいずれか一項記載の試料観察装置。
  5. 　前記面状光の照射面に対する前記結像光学系の前記観察軸の傾斜角度は、２０°～７０°となっている請求項１～４のいずれか一項記載の試料観察装置。
  6. 　前記面状光の照射面に対する前記結像光学系の前記観察軸の傾斜角度は、３０°～６５°となっている請求項１～５のいずれか一項記載の試料観察装置。
  7. 　前記画像取得部は、二次元撮像装置を含み、前記二次元撮像装置から出力されたデータから前記観察光の光像の一部に対応する画像データを前記部分画像データとして抽出する請求項１～６のいずれか一項記載の試料観察装置。
  8. 　前記画像取得部は、前記観察光による光像の一部を撮像し、前記部分画像データを出力するラインセンサを含む請求項１～６のいずれか一項記載の試料観察装置。
  9. 　前記画像取得部は、前記観察光による光像の一部を通過させるスリットと、前記スリットを通過した光像を検出する光検出器とを含み、前記光検出器から出力されたデータに基づいて前記部分画像データを生成する請求項１～６のいずれか一項記載の試料観察装置。
  10. 　前記画像生成部は、前記複数の部分画像データに基づいて、前記面状光の光軸に直交する面における前記試料の観察画像データを生成する請求項１～９のいずれか一項記載の試料観察装置。
  11. 　前記観察画像データを解析し、解析結果を生成する解析部を更に備える請求項１～１０のいずれか一項記載の試料観察装置。
  12. 　試料に面状光を照射する照射ステップと、
    　前記面状光の照射面に対して前記試料を走査する走査ステップと、
    　前記照射面に対して傾斜する観察軸を有する結像光学系を用い、前記面状光の照射によって前記試料で発生した観察光を結像する結像ステップと、
    　前記結像光学系によって結像された前記観察光による光像の一部に対応する部分画像データを複数取得する画像取得ステップと、
    　前記複数の部分画像データに基づいて前記試料の観察画像データを生成する画像生成ステップと、を備えた試料観察方法。
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