JP7007227B2 - 試料観察装置及び試料観察方法 - Google Patents

Description

本発明は、試料観察装置及び試料観察方法に関する。

細胞などの３次元立体構造を持つ試料の内部を観察する手法の一つとして、ＳＰＩＭ（Selective Plane Illumination Microscopy）が知られている。例えば特許文献１に記載の断層像観察装置は、ＳＰＩＭの基本的な原理を開示したものであり、面状光を試料に照射し、試料の内部で発生した蛍光又は散乱光を結像面に結像させて試料内部の観察画像データを取得する。

面状光を用いた他の試料観察装置としては、例えば特許文献２に記載のＳＰＩＭ顕微鏡が挙げられる。この従来のＳＰＩＭ顕微鏡では、試料の配置面に対して一定の傾斜角をもって面状光を照射し、面状光の照射面に対して直交する観察軸を有する観察光学系によって試料からの観察光を撮像する。

特開昭６２－１８０２４１号公報 特開２０１４－２０２９６７号公報

しかしながら、上述した特許文献２のように、照射光学系と観察光学系とをそれぞれ試料の配置面に対して傾斜させつつ、照射光学系と観察光学系とを直交に維持する構成では、観察画像データの構成にあたって、得られた画像データを実空間上の３次元データに変換することが難しいという問題があった。

本発明は、上記課題の解決のためになされたものであり、得られた画像データを実空間上の３次元データに容易に変換できる試料観察装置及び試料観察方法を提供することを目的とする。

本発明の一側面に係る試料観察装置は、試料に面状光を照射する照射光学系と、面状光の照射面を通過するように試料を走査面内の一方向に走査する走査部と、面状光の照射によって試料で発生した観察光を結像する結像光学系と、二次元に配列された複数の画素を有し、結像光学系によって結像された観察光の光像に対応する画像データを複数取得する画像取得部と、画像取得部によって取得された複数の画像データに基づいて試料の観察画像データを生成する画像生成部と、を備え、照射光学系の光軸と走査面の法線とがなす角度をθ１とし、結像光学系の光軸と走査面の法線とがなす角度をθ２とした場合に、θ１及びθ２がいずれも８０°以下であり、かつθ１及びθ２の和が１００°以上であり、画像取得部において、第ｎ画素の画像取得領域に対し、第（ｎ＋１）画素の画像取得領域が１フレームの露光時間における試料の走査量に応じて試料の走査方向にずれている。

この試料観察装置では、試料の走査面に対して結像光学系の光軸が傾斜している。このため、画像取得部では、面状光の光軸方向における断層面の画像データを順次取得することができ、高いスループットで画像データを得ることが可能となる。また、画像取得部では、隣り合う画素での画像取得領域が１フレームの露光時間における試料の走査量に応じてずれている。したがって、各画像データの位置関係の補正が簡単なものとなり、観察画像データの構成にあたって、各画像データを実空間上の３次元データに容易に変換することが可能となる。

試料観察装置では、θ１及びθ２がいずれも７０°以下であり、かつθ１及びθ２の和が１１０°以上であってもよい。この範囲では、デフォーカスの影響を一層好適に低減することができる。

試料観察装置は、面状光の入力面及び観察光の出力面となる面を走査面として有する試料容器を更に備えていてもよい。このような試料容器を用いることにより、複数の試料を安定して走査することが可能となる。

試料観察装置は、観察画像データを解析し、解析結果を生成する解析部を更に備えていてもよい。この場合、画像生成部によって生成された観察画像データを解析部で解析するため、解析のスループットも向上させることができる。

また、本発明の一側面に係る試料観察方法は、照射光学系を用いて試料に面状光を照射する照射ステップと、面状光の照射面を通過するように試料を走査面内の一方向に走査する走査ステップと、結像光学系を用いて面状光の照射によって試料で発生した観察光を結像する結像ステップと、二次元に配列された複数の画素を有するイメージセンサを用いて、結像ステップによって結像された観察光の光像に対応する画像データを複数取得する画像取得ステップと、複数の画像データに基づいて試料の観察画像データを生成する画像生成ステップと、を備え、照射光学系の光軸と走査面の法線とがなす角度をθ１とし、結像光学系の光軸と走査面の法線とがなす角度をθ２とした場合に、θ１及びθ２をいずれも８０°以下とし、かつθ１及びθ２の和を１００°以上とし、画像取得ステップにおいて、第ｎ画素の画像取得領域に対し、第（ｎ＋１）画素の画像取得領域を１フレームの露光時間における試料の走査量に応じて試料の走査方向にずらす。

この試料観察方法では、試料の走査面に対して結像光学系の光軸を傾斜させる。このため、画像取得ステップでは、面状光の光軸方向における断層面の画像データを順次取得することができ、高いスループットで画像データを得ることが可能となる。また、画像取得ステップでは、隣り合う画素での画像取得領域が１フレームの露光時間における試料の走査量に応じてずらす。したがって、各画像データの位置関係の補正が簡単なものとなり、観察画像データの構成にあたって、各画像データを実空間上の３次元データに容易に変換することが可能となる。

この試料観察装置及び試料観察方法によれば、得られた画像データを実空間上の３次元データに容易に変換できる。

試料観察装置の一実施形態を示す概略構成図である。 試料の近傍を示す要部拡大図である。 画像生成部による観察画像データの生成の一例を示す図である。 試料観察装置を用いた試料観察方法の一例を示すフローチャートである。 走査面に対する面状光の傾斜角度及び観察光の傾斜角度の範囲を示す図である。 傾斜角度と透過率との関係を示す図である。 画像取得部での画像取得の様子を示す概略図である。 画像データの位置補正の様子を示す概略図である。 一の画素の画像取得領域と視野の関係を示す図である。 面状光及び観察光の傾斜角度と視野の関係を示す図である。

以下、図面を参照しながら、本発明の一側面に係る試料観察装置の好適な実施形態について詳細に説明する。

図１は、試料観察装置の一実施形態を示す概略構成図である。この試料観察装置１は、面状光Ｌ２を試料Ｓに照射し、試料Ｓの内部で発生した観察光（例えば蛍光又は散乱光など）を結像面に結像させて試料Ｓ内部の観察画像データを取得する装置である。この種の試料観察装置１としては、スライドガラスに保持される試料Ｓの画像を取得し表示するスライドスキャナ、あるいはマイクロプレートに保持される試料Ｓの画像データを取得し、画像データを解析するプレートリーダなどがある。試料観察装置１は、図１に示すように、光源２と、照射光学系３と、走査部４と、結像光学系５と、画像取得部６と、コンピュータ７とを備えて構成されている。

観察対象となる試料Ｓとしては、例えばヒト或いは動物の細胞、組織、臓器、動物或いは植物自体、植物の細胞、組織などが挙げられる。試料Ｓは、溶液、ゲル、或いは試料Ｓとは屈折率の異なる物質に含まれていてもよい。

光源２は、試料Ｓに照射される光Ｌ１を出力する光源である。光源２としては、例えばレーザダイオード、固体レーザ光源といったレーザ光源が挙げられる。また、光源２は、発光ダイオード、スーパールミネッセントダイオード、ランプ系光源であってもよい。光源２から出力された光Ｌ１は、照射光学系３に導光される。

照射光学系３は、光源２から出力された光Ｌ１を面状光Ｌ２に整形し、整形された面状光Ｌ２を光軸Ｐ１に沿って試料Ｓに照射する光学系である。本実施形態では、照射光学系３の光軸Ｐ１は、面状光Ｌ２の光軸と一致している。照射光学系３は、例えばシリンドリカルレンズ、アキシコンレンズ、或いは空間光変調器などの光整形素子を含んで構成され、光源２に対して光学的に結合されている。照射光学系３は、対物レンズを含んで構成されていてもよい。照射光学系３によって形成された面状光Ｌ２は、試料Ｓに照射される。面状光Ｌ２が照射された試料Ｓでは、面状光Ｌ２の照射面Ｒにおいて観察光Ｌ３が発生する。観察光Ｌ３は、例えば面状光Ｌ２によって励起された蛍光、面状光Ｌ２の散乱光、或いは面状光Ｌ２の拡散反射光である。

試料Ｓの厚さ方向に観察を行う場合、分解能を考慮して、面状光Ｌ２は、厚さ２ｍｍ以下の薄い面状光であることが好ましい。また、試料Ｓの厚さが非常に小さい場合、すなわち、後述するＺ軸方向の解像度以下の厚さの試料Ｓを観察する場合には、面状光Ｌ２の厚さは分解能に影響しない。したがって、この場合には厚さ２ｍｍを超える面状光Ｌ２を用いてもよい。

走査部４は、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して試料Ｓを走査する機構である。本実施形態では、走査部４は、試料Ｓを保持する試料容器１１を移動させる移動ステージ１２によって構成されている。試料容器１１は、例えばマイクロプレート、スライドガラス、シャーレ等であり、面状光Ｌ２及び観察光Ｌ３に対して透明性を有している。本実施形態では、マイクロプレートを例示する。試料容器１１は、図２に示すように、試料Ｓが配置される複数のウェル１３が一直線状（或いはマトリクス状）に配列された板状の本体部１４と、本体部１４の一面側においてウェル１３の一端側を塞ぐように設けられた板状の透明部材１５とを有している。

ウェル１３内への試料Ｓの配置にあたっては、ウェル１３内が水などの媒体で充填されていてもよい。透明部材１５は、ウェル１３内に配置された試料Ｓに対する面状光Ｌ２の入力面、及び面状光Ｌ２の照射によって試料Ｓで発生した観察光Ｌ３の出力面となる底面１５ａを有している。この底面１５ａは、試料Ｓが走査部４で走査される際の走査面Ｋを構成している。本実施形態では、走査面Ｋの法線Ｐ３に対し、照射光学系３の光軸Ｐ１が角度θ１をもって傾斜している。透明部材１５の材質は、面状光Ｌ２に対する透明性を有する部材であれば特に限定はされないが、例えばガラス、石英、或いは合成樹脂である。なお、ウェル１３の他端側は、外部に開放された状態となっている。試料容器１１は、移動ステージ１２に対して固定されていてもよい。

移動ステージ１２は、図１に示すように、コンピュータ７からの制御信号に従い、予め設定された方向に試料容器１１を走査する。移動ステージ１２は、照射光学系３の光軸Ｐ１と交差する平面内の一方向に試料容器１１を走査する。以下の説明では、移動ステージ１２による試料Ｓの走査方向をＹ軸、透明部材１５上の試料Ｓの幅方向をＸ軸、透明部材１５上の試料Ｓの深さ方向をＺ軸と称する。また、照射光学系３の光軸Ｐ１に沿う方向をＺ’軸と称する。Ｘ軸は、照射光学系３の光軸Ｐ１と直交する平面内においてＹ軸に直交する軸である。Ｚ軸は、走査面Ｋの法線Ｐ３方向と一致する軸である。試料Ｓに対する面状光Ｌ２の照射面Ｒは、ＸＺ’平面内の面となる。

結像光学系５は、面状光Ｌ２の照射によって試料Ｓで発生した観察光Ｌ３を結像する光学系である。結像光学系５は、図２に示すように、例えば対物レンズ１６及び結像レンズ等を含んで構成されている。結像光学系５の光軸Ｐ２は、観察光Ｌ３の観察軸となっている。本実施形態では、走査面Ｋの法線Ｐ３に対し、結像光学系５の光軸Ｐ２が角度θ２をもって傾斜している。

画像取得部６は、図１に示すように、結像光学系５によって結像された観察光Ｌ３による光像に対応する画像データを複数取得する。画像取得部６は、例えば観察光Ｌ３による光像を撮像する撮像装置を含んで構成されている。撮像装置としては、例えばＣＭＯＳイメージセンサ、ＣＣＤイメージセンサといったエリアイメージセンサが挙げられる。これらのエリアイメージセンサは、結像光学系５による結像面に配置され、例えばグローバルシャッタ或いはローリングシャッタによって光像を撮像し、二次元画像のデータをコンピュータ７に出力する。

コンピュータ７は、物理的には、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のメモリ、及びＣＰＵ等のプロセッサ（演算回路）、通信インターフェイス、ハードディスク等の格納部、ディスプレイ等の表示部を備えて構成されている。かかるコンピュータ７としては、例えばパーソナルコンピュータ、クラウドサーバ、スマートデバイス（スマートフォン、タブレット端末など）などが挙げられる。コンピュータ７は、メモリに格納されるプログラムをコンピュータシステムのＣＰＵで実行することにより、光源２及び移動ステージ１２の動作を制御するコントローラ、試料Ｓの観察画像データを生成する画像生成部８、及び観察画像データを解析する解析部１０として機能する。

コントローラとしてのコンピュータ７は、ユーザによる測定開始の操作の入力を受け、光源２、移動ステージ１２、及び画像取得部６を同期させて駆動する。この場合、コンピュータ７は、移動ステージ１２による試料Ｓの移動中、光源２が光Ｌ１を連続的に出力するように光源２を制御してもよく、画像取得部６による撮像に合わせて光源２による光Ｌ１の出力のＯＮ／ＯＦＦを制御してもよい。また、照射光学系３が光シャッタ（不図示）を備えている場合、コンピュータ７は、当該光シャッタの制御によって試料Ｓへの面状光Ｌ２の照射をＯＮ／ＯＦＦさせてもよい。

また、画像生成部８としてのコンピュータ７は、画像取得部６によって生成された複数の画像データに基づいて試料Ｓの観察画像データを生成する。画像生成部８は、例えば画像取得部６から出力された複数の画像データに基づいて試料Ｓの３次元データを構成し、観察画像データを生成する。画像生成部８は、ユーザによる所定の操作に従って、生成した観察画像データの格納、モニタ等への表示等を実行する。

図１及び図２に示したように、試料Ｓに対する面状光の照射面Ｒは、ＸＺ’平面内の面であり、試料Ｓに対して照射面ＲがＹ軸方向に走査される。したがって、図３（ａ）に示すように、画像生成部８には、試料ＳのＸＺ’断面に相当する画像データ３１がＹ軸方向に複数取得されることにより、試料Ｓの３次元情報が蓄積される。画像生成部８では、これらの画像データ３１を用いてデータが再構成され、例えば図３（ｂ）に示すように、試料ＳにおけるＺ軸方向の任意の位置において任意の厚さを持ったＸＹ断面画像が、バックグラウンドを抑えた観察画像データ３２として生成される。なお、画像生成部８は、画像データ３１を用いてデータの再構成を行うにあたり、ＸＹＺの３次元画像データを観察画像データ３２として生成してもよい。

解析部１０としてのコンピュータ７は、画像生成部８によって生成された観察画像データ３２に基づいて解析を実行し、解析結果を生成する。解析部１０は、ユーザによる所定の操作に従って、生成した解析結果の格納、モニタ等への表示等を実行する。なお、画像生成部８によって生成された観察画像データ３２のモニタ等への表示は行わず、解析部１０によって生成された解析結果のみをモニタ等に表示してもよい。

図４は、試料観察装置１を用いた試料観察方法の一例を示すフローチャートである。同図に示すように、この試料観察方法は、照射ステップ（ステップＳ０１）、走査ステップ（ステップＳ０２）、結像ステップ（ステップＳ０３）、画像取得ステップ（ステップＳ０４）、画像生成ステップ（ステップＳ０５）、及び解析ステップ（ステップＳ０６）を備えている。

照射ステップＳ０１では、試料Ｓに面状光Ｌ２を照射する。ユーザによって測定開始の操作が入力されると、コンピュータ７からの制御信号に基づいて光源２が駆動し、光源２から光Ｌ１が出力される。光源２から出力された光Ｌ１は、照射光学系３によって整形されて面状光Ｌ２となり、試料Ｓに照射される。

走査ステップＳ０２では、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対して試料Ｓを走査する。ユーザによって測定開始の操作が入力されると、コンピュータ７からの制御信号に基づいて、光源２の駆動と同期して移動ステージ１２が駆動する。これにより、試料容器１１がＹ軸方向に一定の速度で直線的に駆動し、面状光Ｌ２の照射面Ｒに対してウェル１３内の試料Ｓが走査される。

結像ステップＳ０３では、照射面Ｒに対して傾斜する観察軸Ｐ２を有する結像光学系５を用い、面状光Ｌ２の照射によって試料Ｓで発生した観察光Ｌ３を画像取得部６の結像面に対して結像する。画像取得ステップＳ０４では、結像光学系５によって結像された観察光Ｌ３による光像に対応する画像データを複数取得する。画像データは、画像取得部６から画像生成部８に順次出力される。

画像生成ステップＳ０５では、複数の画像データに基づいて試料Ｓの観察画像データを生成する。本実施形態では、図１及び図２に示したように、照射光学系３の光軸は、走査面Ｋの法線に対して角度θ１だけ傾いており、試料Ｓに対して照射面ＲがＹ軸方向に走査される。したがって、画像生成部８には、図３（ａ）に示したように、画像データ３１をＹ軸方向に複数取得することによって、試料Ｓの３次元情報が蓄積される。画像生成部８では、複数の画像データ３１を用いてデータが再構成され、例えば図３（ｂ）に示すように、試料ＳにおけるＺ軸方向の任意の位置において任意の厚さを持ったＸＹ画像データ或いはＸＹＺの３次元画像データが試料Ｓの観察画像データ３２として生成される。

解析ステップＳ０６では、解析部１０によって観察画像データ３２を解析し、解析結果を生成する。例えば創薬スクリーニングでは、試料容器１１に試料Ｓ及び試薬を入れ、観察画像データ３２を取得する。そして、解析部１０は、観察画像データ３２に基づいて試薬を評価し、評価データを解析結果として生成する。

次に、上述した試料観察装置１の光学系の構成及び観察画像データ３２の生成について、更に詳細に説明する。

試料観察装置１では、図２に示したように、走査面Ｋの法線Ｐ３に対し、照射光学系３の光軸Ｐ１が角度θ１をもって傾斜しており、結像光学系５の光軸Ｐ２が角度θ２をもって傾斜している。試料観察装置１では、１）θ１及びθ２がいずれも８０°以下となっており、かつθ１及びθ２の和が１００°以上となっている。また、２）θ１及びθ２がいずれも７０°以下となっており、かつθ１及びθ２の和が１１０°以上となっていてもよい。１）及び２）を満たす範囲を図５に示す。同図では、１）を満たす範囲が領域Ａで示され、２）を満たす範囲が領域Ｂで示されている。

θ１及びθ２の上限値は、例えば試料容器１１の透明部材１５に対する面状光Ｌ２及び観察光Ｌ３の透過率に基づいて決定されている。図６は、傾斜角度と透過率との関係を示す図である。同図では、横軸を傾斜角度θとし、縦軸を透過率としている。この図６では、試料容器１１における試料Ｓの具体的な保持状態を考慮し、媒質Ａの屈折率ｎ１を１（空気）、媒質Ｂの屈折率ｎ２を１．５３（ガラス）、媒質Ｃの屈折率ｎ３を１．３３（水）としている。また、試料容器１１の透明部材１５に対する面状光Ｌ２及び観察光Ｌ３の透過率の値を、媒質Ｂ，Ｃの界面及び媒質Ａ，Ｂの界面の透過率の積により算出している。図６には、Ｐ波の透過率、Ｓ波の透過率、及びこれらの平均値の角度依存性がプロットされている。

図６に示す結果から、傾斜角度θを変化させることで、試料容器１１での面状光Ｌ２及び観察光Ｌ３の透過率が可変となることが分かる。傾斜角度θが８０°以下の範囲では、少なくとも５０％以上の透過率が得られることが分かる。また、傾斜角度θが７０°以下の範囲では、少なくとも６０％以上の透過率が得られることが分かる。したがって、上記θ１及びθ２の上限値を８０°以下、好ましくは７０°以下とすることが好適である。

また、図７は、画像取得部６での画像取得の様子を示す概略図である。同図の例では、画像取得部６における第ｎ画素、第（ｎ＋１）画素、第（ｎ＋２）画素の３つの画素が、第ｍフレーム、第（ｍ＋１）フレーム、第（ｍ＋２）フレームの３つの期間にわたって撮像する様子を示している。各画素は、走査部４によってＹ軸方向に走査される試料ＳのＸＺ’断面の一部の光像を各フレームにおいて順次撮像する。

画像取得部６では、図７のハッチング表記部分に示すように、第ｍフレームにおいて、第ｎ画素の画像取得領域Ｆ_ｎ，ｍに対し、第（ｎ＋１）画素の画像取得領域Ｆ_{ｎ＋１，ｍ}が１フレームの露光時間における試料Ｓの走査量Ｖに応じて試料Ｓの走査方向（Ｙ軸方向）にずれている。同様に、第ｍフレームにおいて、第（ｎ＋１）画素の画像取得領域Ｆ_{ｎ＋１，ｍ}に対し、第（ｎ＋２）画素の画像取得領域Ｆ_{ｎ＋２，ｍ}が１フレームの露光時間における試料Ｓの走査量Ｖに応じて試料Ｓの走査方向（Ｙ軸方向）にずれている。このような関係を満たすためには、照射光学系３の光軸Ｐ１と走査面Ｋの法線Ｐ３とがなす角度θ１及び結像光学系５の光軸Ｐ２と走査面Ｋの法線Ｐ３とがなす角度θ２に応じて、１フレームの露光時間における試料Ｓの走査量Ｖを設定すればよい。また、１フレームの露光時間における試料Ｓの走査量Ｖに応じて、角度θ１及び角度θ２の少なくとも一方を設定してもよい。

上記関係を満たす場合、図７のドット表記部分に示すように、第ｍフレームの第（ｎ＋２）画素での画像取得領域Ｆ_{ｎ，ｍ＋２}、第（ｍ＋１）フレームの第（ｎ＋１）画素での画像取得領域Ｆ_{ｎ＋１，ｍ＋１}、及び第（ｍ＋２）フレームの第ｎ画素での画像取得領域Ｆ_{ｎ，ｍ＋２}は、Ｚ軸方向に隣り合うこととなる。このため、画像生成部８においてデータを再構成せずに観察画像データ３２を生成すると、図８（ａ）に示すように、各画像データ３１が実空間上のＸＹＺ’画像データとなり、観察しにくい画像データが生成されることとなる。そこで、画像生成部８において各画素の画像データ３１を用いてデータを再構成する際、図８（ｂ）に示すように、画像生成部８においてＺ軸方向にｎピクセル離れた画像データ３１をＹ軸方向についてもｎピクセル離れた画像データ３１として補正を実行する。これにより、各画像データ３１が実空間上のＸＹＺ画像データとなり、各画像データ３１を実空間上の３次元データに容易に変換することが可能となる。

図９は、一の画素の画像取得領域と視野の関係を示す図である。図９に示すように、一の画素におけるＺ軸方向の解像度Ｚ_ｒｅｓｏは、下記式（１）で表される。式（１）中のＶ’と走査量Ｖとの間には、式（２）の関係が成り立つ。

また、図１０は、面状光及び観察光の傾斜角度と視野の関係を示す図である。同図に示す例では、結像光学系５が屈折率ｎ１の媒質Ａ中に位置し、面状光Ｌ２の照射面Ｒが屈折率ｎ２の媒質Ｂ中に位置するものとする。ここでは、結像光学系５の視野Ｖを上述した１フレームの露光時間における試料Ｓの走査量Ｖと一致させている。結像光学系５の視野Ｖは、画素サイズと結像倍率によって定まる。これに合致するように１フレームの露光時間と走査部４による試料容器１１の走査速度とを調整することにより、視野Ｖを１フレームの露光時間における試料Ｓの走査量Ｖと一致させることができる。視野Ｖの媒質Ａと媒質Ｂの界面での距離をＬとした場合、以下の式（３）～（８）の関係が成り立つ。

図２に示したθ１及びθ２の範囲の中からθ１及びθ２の組み合わせを選択する場合には、例えば以下の３つの条件を考慮する。
１）θ_ｄｉｆｆの値が小さい程、デフォーカスの影響が低減される。
２）Ｚ_ｒｅｓоの値が小さい程、観察画像データにおけるＺ軸方向の解像度が向上する。
３）Ｖ’のＹ軸方向の成分がＶと一致すると、Ｚ軸方向に隣り合う画素の画像取得領域がＹ軸方向についても隣り合い、各画像データの位置関係の補正が簡単となる。

以上説明したように、試料観察装置１では、試料Ｓの走査面Ｋに対して結像光学系５の光軸Ｐ２が傾斜している。このため、画像取得部６では、面状光Ｌ２の光軸Ｐ１方向における断層面の画像データ３１を順次取得することができ、高いスループットで画像データ３１を得ることが可能となる。また、画像取得部６では、隣り合う画素での画像取得領域Ｆが１フレームの露光時間における試料Ｓの走査量Ｖに応じてずれている。したがって、各画像データ３１の位置関係の補正が簡単なものとなり、観察画像データ３２の構成にあたって、各画像データ３１を実空間上の３次元データに容易に変換することが可能となる。

さらに、試料観察装置１では、走査面Ｋに対する照射光学系３の光軸Ｐ１が上記θ１，θ２の条件を満たす範囲で傾斜することで、デフォーカスの影響の低減が図られ、観察画像データ３２の深さ方向の解像度を十分に向上できる。θ１及びθ２がいずれも７０°以下であり、かつθ１及びθ２の和が１１０°以上である場合には、デフォーカスの影響を一層好適に低減することができる。

また、試料観察装置１は、面状光Ｌ２の入力面及び観察光Ｌ３の出力面となる面を走査面Ｋとして有する試料容器１１を備えている。このような試料容器１１を用いることにより、複数の試料Ｓを安定して走査することが可能となる。

また、試料観察装置１は、観察画像データ３２を解析し、解析結果を生成する解析部１０を備えている。これにより、画像生成部８によって生成された観察画像データ３２を解析部１０で解析できるため、解析のスループットも向上させることができる。

本発明は、上記実施形態に限られるものではない。例えば上記実施形態では、試料容器１１においてウェル１３の一端側を塞ぐように透明部材１５が設けられているが、試料容器１１に代えて、ゲル等の固形物に試料Ｓを保持してもよい。また、フローサイトメーターのように、透明容器内に水等の流体を流して試料Ｓを移動させるようにしてもよい。

また、結像光学系５及び画像取得部６を複数対配置してもよい。この場合、観察範囲を拡大できるほか、複数の異なる波長の観察光Ｌ３を観察することが可能となる。また、結像光学系５に対して複数の画像取得部６を配置してもよく、複数の結像光学系５に対して画像取得部６を配置してもよい。複数の画像取得部６は、異なる種類の光検出器あるいは撮像装置を組み合わせてもよい。光源２は、波長の異なる光を出力する複数の光源によって構成されてもよい。この場合、波長の異なる励起光を試料Ｓに照射することができる。

また、非点収差の緩和のため、結像光学系５にプリズムを配置してもよい。この場合、例えば対物レンズ１６の後段側（対物レンズ１６と画像取得部６との間）にプリズムを配置してもよい。デフォーカス対策のため、結像光学系５の光軸Ｐ２に対して画像取得部６における撮像装置の撮像面を傾斜させてもよい。この他、例えば結像光学系５と画像取得部６との間にダイクロイックミラー或いはプリズムを配置して観察光Ｌ３の波長分離を行う構成としてもよい。

１…試料観察装置、３…照射光学系、５…結像光学系、６…画像取得部、８…画像生成部、１０…解析部、１１…試料容器、３１…画像データ、３２…観察画像データ、Ｆ…画像取得領域、Ｋ…走査面、Ｌ２…面状光、Ｌ３…観察光、Ｒ…照射面、Ｐ１…照射光学系の光軸、Ｐ２…結像光学系の光軸、Ｐ３…走査面の法線、Ｓ…試料、Ｖ…走査量。

Claims (5)

1. 試料に面状光を照射する照射光学系と、
   前記面状光の照射面を通過するように前記試料を走査面内の一方向に走査する走査部と、
   前記面状光の照射によって前記試料で発生した観察光を結像する結像光学系と、
   二次元に配列された複数の画素を有し、前記結像光学系によって結像された前記観察光の光像に対応する画像データを複数取得する画像取得部と、
   前記画像取得部によって取得された複数の前記画像データに基づいて前記試料の観察画像データを生成する画像生成部と、を備え、
   前記照射光学系の光軸と前記走査面の法線とがなす角度をθ１とし、前記結像光学系の光軸と前記走査面の法線とがなす角度をθ２とした場合に、θ１及びθ２がいずれも８０°以下であり、かつθ１及びθ２の和が１００°以上であり、
   前記画像取得部において、第ｎ画素の画像取得領域に対し、第（ｎ＋１）画素の画像取得領域が１フレームの露光時間における前記試料の走査量に応じて前記試料の走査方向にずれている試料観察装置。
2. θ１及びθ２がいずれも７０°以下であり、かつθ１及びθ２の和が１１０°以上である請求項１記載の試料観察装置。
3. 前記面状光の入力面及び前記観察光の出力面となる面を前記走査面として有する試料容器を更に備えた請求項１又は記載の試料観察装置。
4. 前記観察画像データを解析し、解析結果を生成する解析部を更に備えた請求項１～３のいずれか一項記載の試料観察装置。
5. 照射光学系を用いて試料に面状光を照射する照射ステップと、
   前記面状光の照射面を通過するように前記試料を走査面内の一方向に走査する走査ステップと、
   結像光学系を用いて前記面状光の照射によって前記試料で発生した観察光を結像する結像ステップと、
   二次元に配列された複数の画素を有するイメージセンサを用いて、前記結像ステップによって結像された前記観察光の光像に対応する画像データを複数取得する画像取得ステップと、
   前記複数の画像データに基づいて前記試料の観察画像データを生成する画像生成ステップと、を備え、
   前記照射光学系の光軸と前記走査面の法線とがなす角度をθ１とし、前記結像光学系の光軸と前記走査面の法線とがなす角度をθ２とした場合に、θ１及びθ２をいずれも８０°以下とし、かつθ１及びθ２の和を１００°以上とし、
   前記画像取得ステップにおいて、第ｎ画素の画像取得領域に対し、第（ｎ＋１）画素の画像取得領域を１フレームの露光時間における前記試料の走査量に応じて前記試料の走査方向にずらす試料観察方法。

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