JP2017173820A - 光シート顕微鏡および光シート顕微鏡を作動するための方法 - Google Patents

Abstract

【課題】画像が高い情報量、高いコントラストを有しつつ、試料面に平行な全体画像の記録を容易にする。【解決手段】光シート６を生成するように構成された第１の光軸Ａ１を有する照明対物レンズ２と、試料面４からの光を検出するように構成された第２の光軸Ａ２を有する検出対物レンズ３とを備える顕微鏡に関する。第１の光軸Ａ１および第２の光軸Ａ２が試料面において交差し、かつそれらが実質的に直角を成すように、照明対物レンズ２および検出対物レンズ３は、互いに対してかつ試料面４に対して配置されている。光軸Ａ１、Ａ２の各々は、試料面４に直交するように指向された基準軸Ｂに対してゼロとは異なる角度を有する。さらに、第３の光軸Ａ３を有する照明光学ユニット９を含む、試料面４の広視野照明のために構成された全体照明装置が設けられている。【選択図】図２ａ−２ｂ

Description

本発明は、光シート顕微鏡および光シート顕微鏡を作動するための方法に関する。

光シート顕微鏡法の主な用途の１つは、例えば１００μｍから数ミリメートルまでの寸法を有する生体などの中規模の試料を画像化することにある。原則として、これらの試料をアガロースに包埋し、ガラスキャピラリー内に配置する。試料を検査するために、ガラスキャピラリーを水で満たされた試料チャンバーに導入し、試料を含むアガロースを毛細管から少し押し出す。試料は、光シートによって照明され、試料から放射された蛍光は、光シートに垂直であり、かつ光シート光学ユニットに対しても垂直である検出対物レンズによってカメラ上に結像される。

従来技術によれば、光シート顕微鏡（ＳＰＩＭレイアウト；単一平面照明顕微鏡（ｓｉｎｇｌｅ ｐｌａｎｅ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ））用の顕微鏡１のレイアウトは、照明対物レンズ２と検出対物レンズ３（以下、ＳＰＩＭ対物レンズとも称される）を含み、これらは、試料面４に対して上から４５°の角度で、かつ互いに対して直角に試料面４上に向って配置される（図１ａ参照）。試料面４に配置された試料５は、例えば、シャーレとして構成された試料ホルダ７の基部上に配置される。試料ホルダ７は、液体８、例えば水で満たされ、２つのＳＰＩＭ対物レンズ２，３は、光シート顕微鏡検査の適用中に液体８に浸漬される。試料面４は、デカルト座標系のＸ軸ＸおよびＹ軸Ｙにまたがる平面ＸＹ内に延在する。第１の光軸Ａ１および第２の光軸Ａ２は、デカルト座標系のＸ軸ＸおよびＺ軸Ｚにまたがる平面ＸＺ内に延在する。

このアプローチは、軸方向の高解像度の利点を提供する。なぜなら、薄い光シート６が照明対物レンズ２によって生成され得るからである。より小さい試料５が、より高い解像度で検査され得る。加えて、厄介なバックグラウンド蛍光が著しく減少し、結果として信号対雑音比が改善される。

先行技術によれば、試料面４および試料ホルダ７に平行な全体画像は、試料ホルダ７の透明基部を通して試料５の下方に配置された広視野対物レンズ２０によって広視野画像が垂直に記録されることによって生成される。２つのＳＰＩＭ対物レンズ２，３が互いに緊密に配置されているので、試料５の透過光照明および透過光の捕捉はここでは不可能である。

標準的な試料容器（例えば、マルチウェルプレート）においてより簡単な試料調製を容易にするために、４５°の形態を維持することは可能であるが、試料ホルダ７の透明基部を介して下方から試料面４に向けて２つのＳＰＩＭ対物レンズ２，３を倒立配置にする必要がある（図１ｂ）。この装置では、光軸Ａ１およびＡ２に対して傾斜し、かつ特別な光学素子を用いることによるカバーガラスの形状を有する試料ホルダ７によって生じる収差を補正する必要がある（特許文献１、特許文献２）。試料面４に配置された試料５は、試料ホルダ７の基部を通過するようにして照明され、試料の励起蛍光が検出される。試料ホルダ７は、例えば、マルチウェルプレート、ペトリ皿および／または物体サポート等を使用することが可能であり、特にハイスループット・スクリーニングの場合の試料の汚染を回避することができる。

正立および倒立の構成の場合に存在する問題は、関心領域が広視野対物レンズによって試料を通して全体画像として画像化されなければならないことである。原則として、正立配置の場合、これは、広視野対物レンズが、例えば緩衝液のような水溶液である数ミリメートルの液体を通って観察しなければならないことを意味する。一例として、マルチウェルプレートが使用される場合には、液面上の個々の凹部に有意なメニスカスが形成され、このメニスカスはレンズ効果を発揮するので、この撮像は、仮にあったとしてもＮＡの非常に小さなものでしか行われないかもしれない。更なる解決策では、広視野対物レンズを位置決めすることができるように、照明対物レンズおよび／または検出対物レンズを移動、ねじり、および／または傾斜させることが行われる。

原則として、コントラスト法は、顕微鏡で低コントラストの物体（例えば位相物体）を視覚化するのに役立ち、かつ、低コントラストの物体は、しばしば蛍光撮像によって補完される。これを使用して、試料、例えば、細胞または組織切片は、それらの全体が透過光において結像され、それらの状態が分析される。

近年、「従来の」方法と同じか、または類似の情報内容を異なる経路を介して供給する、低コントラスト（位相）物体のコントラストを高めるためのさらなる選択肢が開発された。その例として、半瞳コントラスト、傾斜照明、およびＴＩＥ（強度輸送方程式：ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｅｑｕａｔｉｏｎ）が含まれる。

特許文献３には、試料を照明するためのビーム経路および少なくとも１つの検出ビーム経路を含む顕微鏡が開示されている。顕微鏡は、照明ビーム経路内において照明放射線を集束させるための集束ユニットを含む。集束ユニットは、照明ビーム経路の方向に横方向に延在する実質的に２次元の照明領域を画定する。さらに、照明ビーム経路内に境界要素が配置され、境界要素は、照明領域のセクションを選択的に照明するように構成されている。さらに、特許文献３には、顕微鏡法が開示されている。

大部分が透明な試料５の場合、すべてのこれらのコントラスト法は、上述の理由により４５°のＳＰＩＭ装置を有する顕微鏡１に容易に組み込むことができない透過光照明を必要とする。

独国特許出願公開第１０２０１３１０７２９７号明細書 独国特許出願公開第１０２０１３１１２５９６号明細書 国際公開第２０１２／１１０４８８号

本発明は、全体画像が高い情報量、特に高いコントラストを有しつつ、試料面に平行な全体画像の記録を容易にする、光シート顕微鏡法のための選択肢を提案するという目的に基づく。

この目的は、独立請求項１に従う顕微鏡によって、および独立請求項１１による方法によって達成される。有利な構成は、従属請求項に記載された主題である。
顕微鏡は、少なくとも部分的に試料面内で生成または生成可能な光シートを生成するように構成された第１の光軸を有する照明対物レンズと、試料面から到来する光を検出するように構成された第２の光軸を有する検出対物レンズとを備え、照明対物レンズと検出対物レンズとは、第１の光軸と第２の光軸とが試料面内で交差し、かつそれらが直角を成すように互いに対して、かつ試料面に対して配置されている。第１の光軸と第２の光軸の各々は、試料面に直交するように指向された基準軸に対してゼロとは異なる角度を有する。さらに、第３の光軸を有する照明光学ユニットを含む、試料面の広視野照明のために構成された全体照明装置（ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ａｐｐａｒａｔｕｓ）を備える。

本発明によれば、検出対物レンズは、光シートからの光と全体照明装置からの光の両方を検出するために提供され、かつ構成される。
以下、試料面は基準面としての役割を有する。

顕微鏡は、正立顕微鏡として構成されてもよい。さらなる実施形態では、顕微鏡は、倒立顕微鏡として構成されてもよい。
照明光学ユニットの第３の光軸は、検出対物レンズの第２の光軸に対して０°以外の角度に整列されているため、傾斜全体照明または広視野照明（以下、照明と略す）は、照明光学ユニットのビーム経路に導入される必要のあるストップなしに、従来のスタンドおよび装置と変わりなく必然的に行われる。

傾斜照明は、検出対物レンズの光軸と平行に行われる照明の場合よりも強いコントラストで全体画像または広視野画像の記録を容易にする。本発明による顕微鏡に係る照明光学ユニットは、必ずしも必要ではないが、試料ホルダの液体に浸漬される（いわゆる水浸漬）。

むしろ、（空気）コンデンサを用いて空気／水界面を介して試料を照明することができる。これは、プロセスで発生する照明の収差が画像化にとって重要ではないので可能である。

有利な実施形態では、第３の光軸は基準軸と一致する。したがって、照明は、試料面に対して実質的に垂直に行われる。
例えば顕微鏡の幾何学的形状に従って、検出対物レンズの視野に位置する試料の領域が照明されるか、または照明可能となるように、コンデンサが、試料ホルダに対して垂直に配置される。

第１の光軸および第２の光軸は、それらが実質的に直角を成している。有利なことに、直角からの偏差は、最大でも、視野内で発生する検出対物レンズの光軸の方向の角度オフセットが、検出対物レンズの視野の深度が１つ以下である第１の光軸と第２の光軸との偏差を引き起こす程度の大きさである。第１の光軸および第２の光軸のいずれも試料面内にはない。

第１の光軸または第２の光軸は、実質的に９０°を互いに補完する基準軸に対する角度を有する。
本発明による顕微鏡は、全体画像を記録するための追加の広視野対物レンズを必要としないという利点があり、この結果、従来技術による顕微鏡よりも顕微鏡のスペースが少なくて済み、レイアウトが簡単であり、より費用効果的な方法で製造することができる。

全体照明装置の光は、透過光において検出される。
顕微鏡の１つの可能な実施形態では、照明光学ユニットは、コンデンサ、対物レンズ、またはレンズとして構成される。

全体画像の高いコントラストを得るために、顕微鏡の可能な実施形態では拡散傾斜照明を行うことができる。
さらなる実施形態では、検出対物レンズおよび照明光学装置の開口数（ＮＡ）は、これらの開口数（ＮＡ）の重なりおよび開口数の重複領域が存在するように、互いにマッチングされる。一例として、開口数の重なりは、顕微鏡の個々の開口数が実際の位置およびアラインメントにあるものとして表され、かつ／またはシミュレートされることにより、２次元または３次元でグラフィカルに確認され、かつ／または仮想的に描写することができる。共に使用される領域または空間は、開口数の重複領域を表す。

偏光コントラスト、微分干渉コントラスト（ＤＩＣ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ）、またはホフマンコントラストの既知の原理に従った全体画像におけるコントラストを生じさせるために、顕微鏡のさらなる実施形態では、それぞれ１つの偏光子、さらに少なくとも１つの位相板、ホフマン光学ユニット、またはＤＩＣプリズムが、照明光学ユニットのビーム経路および検出対物レンズのビーム経路にそれぞれ配置される。

ホフマン光学ユニットは光学素子であり、ホフマン光学ユニットの配置および相互作用により、ホフマンコントラストを有する試料の画像が得られる。ホフマン変調コントラスト（ＨＭＣ：Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒａｓｔ）顕微鏡法では、顕微鏡は、典型的には、スリットダイアフラムおよび偏光子とともにコンデンサを含む。スリットダイアフラムおよび偏光子は、コンデンサと照明光学ユニットの照明光源との間に配置される。

顕微鏡のさらなる実施形態は、検出対物レンズと照明光学ユニットとの間のディフューザーを含む。一例として、ディフューザーは、１つ以上の静的拡散スクリーンまたは動的拡散スクリーンによって形成される。

拡散照明の利点は、結像光学ユニット、コンデンサ、およびストップを含むケーラー照明のような複雑な光学ユニットの必要がないことである。拡散照明は、多くの照明角度および照明方向の下で実行される。その結果、コヒーレントまたは部分的にコヒーレントな結像の場合の結像の分解能にも影響を及ぼす照明の有効開口数を、ディフューザーを試料面および試料に近づけることによって増加させることができる。

したがって、実効照明ＮＡを、簡単な手段を用いて全体照明光学ユニット、例えば、照明光学ユニットのために名目上指定された値よりも増加させることができる。
さらに、照明の立体角および方向を、例えば、照明されるディフューザーのリングのみまたはリングセグメントによって設定することが可能である。これは、ディフューザー上に直接配置された対応するマスクまたはマスクをディフューザー上に画像形成することによって容易に実行することができる。後者は、位相差顕微鏡法用のマスクを有する従来の透過光コンデンサによってディフューザーを照明することによって達成し得る。有利には、拡散照明は、上述した傾斜照明と組み合わせることができる。

一実施形態では、ディフューザーが、例えば発光ダイオード（ＬＥＤ）またはＯＬＥＤ（有機ＬＥＤ）として、ＬＥＤアレイまたはＯＬＥＤアレイおよび／またはハロゲンランプとして構成される照明光源の直前に配置されてもよい。さらに、ディフューザーが現在の（ケーラー）顕微鏡照明によって照明されるか、または照明可能である。

さらなる可能な実施形態では、拡散照明は、ディフューザーとしての自発光拡散照明光源、例えば、その下流に配置されたすりガラススクリーンを含むＬＥＤおよび／またはＯＬＥＤによって実現される。

さらなる可能な実施形態では、顕微鏡は、全体照明装置のビーム経路内の暗部化要素、例えばマスクを備え、暗視野照明が試料面において生成されるか、または生成可能となるように開口数の重複領域が暗部化要素によって暗くされる。

顕微鏡の更なる実施形態では、マスクが、暗部化要素として全体照明装置または照明光学ユニットの瞳に配置される。
暗視野照明は、ＳＰＩＭ照明対物レンズとして構成され得る照明対物レンズによって行われ得る。透過光照明が基準軸と平行に、例えば上から行われることも可能であり、開口数の重複領域は、例えばマスク、例えば、適切なストップを用いてマスクされるか、またはマスク可能である。

さらなる実施形態では、顕微鏡は、全体照明装置の照明瞳における可動マスクを備え、可動マスクは照明瞳の半分を厳密にカバーするか、または照明瞳をカバー可能にする。
いわゆる半瞳コントラストの方法（メータ、エス（Ｍｅｈｔａ、Ｓ．）他、２００９、Ｏｐｔｉｃｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３４：１９２４−１９２６）は、位相物体の視覚的表現を比較的簡単な方法で容易にする。この目的のために、マスクが照明瞳に導入され、マスクが照明瞳を半分カバーする。その後、透過光画像が記録される。次のステップでは、照明瞳の反対側の半分がカバーされるようにマスクを照明瞳に導入する。もう一度、画像が記録される。マスクが軸方向におけるケーラー照明下で瞳に正確に存在する場合、これはいずれの場合も強度の半分の試料の均一な照明画像をもたらす。しかしながら、試料における位相勾配は、位相勾配に比例する、対物レンズの瞳上の照明瞳の像の横方向変位をもたらす。続いて、得られた２つの部分画像を互いに減算して正規化すると、位相勾配が表現可能となる。

計算によって組み合わされた画像内に強いアーチファクトが生じるので、瞳分割は正確に実行されなければならず、すなわち、マスクは瞳の半分を正確にカバーしなければならず、かつマスクは光軸に沿った方向において瞳の位置に正確に配置されなければならない。

光シート装置の場合、半瞳コントラストの前述の方法は、従来技術から知られている方法では不可能である。照明ビーム経路と検出ビーム経路の両方において、瞳の半カバレッジ（二分割化）の場合に、部分画像間には、常に強い非対称な強度分布が存在する。

しかしながら、この非対称な強度分布は、照明瞳の半カバレッジが、検出対物レンズおよび照明対物レンズの光軸に及ぶ平面内で正確に実行されるならば、回避され得る。
傾斜照明を有する顕微鏡の実施形態では、照明瞳は、照明ビーム経路だけでなく検出ビーム経路においてもカバーされてもよい。

同軸照明が実現されている場合、照明瞳は、同様に照明ビーム経路だけでなく検出ビーム経路においてもカバーされてもよい。ここでは、分割の方向は原理的には何の役にも立たない。

一例として、マスクは、実施形態では可動であり、検出対物レンズの瞳に配置されてもよい。瞳の正確に半分が、可動マスクによってカバーされるか、またはカバー可能である。

目的は、光シート顕微鏡を作動する方法によってさらに達成される。この方法は、試料面と実質的に直交する基準軸に沿った全体照明装置からの光で試料面に位置する試料を照明するステップと、全体照明装置からの光を透過光として第２の光軸と呼称する検出軸を有する検出対物レンズによって検出するステップとを含み、検出対物レンズの第２の光軸は、基準軸に対してゼロとは異なる角度を有する。さらに、方法は、検出対物レンズによって捕捉された全体照明装置からの光に応じて試料または少なくとも試料の領域の全体画像が生成されるステップを含む。さらに、好ましくは、上記のステップと交互に、基準面（試料面）で生成された光シートの光が、全体照明装置の光を捕捉するために検出対物レンズによって捕捉される。ここでは、光シートが試料面内で生成されたものとして見なされるように、光シートは試料面と交差するだけで十分である。

この方法のさらなる構成では、全体画像は、ＴＩＥ（強度輸送方程式）によって生成される。ここでは、いずれの場合にもＴＩＥに必要なＺスタックが存在し、追加の方法ステップを実行する必要がないことが有利である。

画像は、試料および検出対物レンズの焦点が試料面内で、例えばＸ軸の方向に互いに対して移動されつつ記録される。ここでは、試料の画像が記録され、オプションとして各記録位置に保存される。記録された画像は、従来の顕微鏡検査の範囲内でＺ軸に沿って対物レンズまたは試料を変位させることによって生成されるので、通常はＺスタックと呼称される画像スタックを形成するように組み合わされる。この場合、視野が拡大され、かつ焦点が位置している検出対物レンズの像面は、試料面に対して傾斜し、かつ第１の光軸に沿って拡大されている。この点について、図７ａおよび図７ｂならびに図８ａおよび図８ｃならびに関連する説明も参照されたい。

さらなる構成では、方法は、捕捉された平面のＺスタックまたは平面の個々の画像によって、それら平面が第３の光軸および試料面に対して傾斜している場合には平面がＺスタックに変換され、Ｚスタックの平面は、捕捉されたＺスタックによって第３の光軸および試料面に対して傾斜しておらず、互いに対して変位しているＺスタックの個々の平面（スキュー）は、互いに直交するように延伸するＸ軸、Ｙ軸およびＺ軸を有する格子によって仮想的に取り囲まれ、Ｘ軸およびＹ軸は試料面に平行に指向し、Ｚ軸は試料面に対して垂直に指向し、正規化されたＺスタックの平面の間隔は、間隔が捕捉されたＺスタックの横方向分解能の１つに対応して、以下が適用されるように、Ｚ軸の方向において選択される。

Δｘ’＝Δｘ，
Δｙ’＝Δｙ
Δｚ’＝ΔｘまたはΔｙ
続いて、変位していない正規化されたＺスタック（デスキュー）の新規の格子点Ｐ_{ｘ、ｙ、ｚ}が計算され、個々の新規の格子点Ｐ_{ｘ、ｙ、ｚ}における強度が、捕捉されたＺスタックの隣接する格子点Ｐｘ’、ｙ’、ｚ’の３つの重み付けされた補間によって計算される。

仕様Ｘ、ＹおよびＺは、デカルト座標系の軸の方向に関する。
仕様ｘ’、ｙ’およびｚ’は、格子点の個々の座標を表す。仕様ｘ、ｙおよびｚは、変位していない（デスキュー、デスキューされた）格子内の格子点Ｐ_{ｘ’、ｙ’、ｚ’}の座標を示す。

仕様Δｘ、Δｙ、ΔｚおよびΔｘ’、Δｙ’、Δｚ’は、軸Ｘ、Ｙ、Ｚの１つの方向の座標間の差を表す。また、仕様Δｚ’またはΔｚは、Ｚスタックの隣接するＸＹ平面間のＺ軸の方向における間隔を特定し、かつインクリメントとして呼称される。

この方法の変更された構成では、平面のＺスタックが捕捉され、その平面は、捕捉されたＺスタックによって正規化されたＺスタックのＸＹ平面に変換され、互いに関して変位している個々の平面（スキュー）は、互いに直交するように延伸するＸ軸、Ｙ軸およびＺ軸を有する格子によって仮想的に取り囲まれており、Ｘ軸およびＹ軸は試料面に平行に指向し、Ｚ軸は試料面に垂直に指向し、正規化されたＺスタックのＸＹ平面の間隔は、間隔が捕捉されたＺスタックの横方向分解能の１つに対応して、以下が適用されるように、Ｚ軸の方向において選択される。

Δｘ’＝Δｘ
Δｙ’＝Δｙ
Δｚ’＝Δｙ＊ｓｉｎ（α_１）
角度α１は、第１の光軸および第３の光軸によって設けられる。

変位していない正規化されたＺスタック（デスキュー）の新規の格子点Ｐｘ、ｙ、ｚが計算され、個々の新規の格子点Ｐ_{ｘ、ｙ、ｚ}における強度が、捕捉されたＺスタックの隣接する格子点Ｐ_{ｘ’、ｙ’、ｚ’}の３つの重み付けされた補間によって計算される。

捕捉された２つの平面の間のインクリメントが設定されること、または第１のインクリメントΔｚ’でＺスタックが捕捉され、関心領域（ＲＯＩ）が選択され、選択された関心領域が第２のインクリメントΔｚ’で捕捉され、第２のインクリメントΔｚ’は第１のインクリメントΔｚ’より小さく、従って第２のインクリメントΔｚ’によって捕捉された関心領域の分解能は、第１のインクリメントΔｚ’によって捕捉された関心領域よりも高いこと、またはいずれの場合にも基準面に平行な１つのＸＹ平面のみが計算され、かつ表示されることの方法の更なる構成において平面を捕捉する記録速度が設定される。

単一ラインの関心領域がＸ軸またはＹ軸の方向において選択され、単一ラインの関心領域がＺ軸の方向においてＸＹ平面ごとにそれぞれ捕捉されることも可能である。
一例として、個々のＸＹ平面は、前のＸＹ平面に対してΔ＝Δｚ／ｔａｎ（α_１）の値だけずらして描画される。

本発明は、例示的な実施形態および図面に基づいて以下により詳細に説明される。

ａは、先行技術による、試料面の上方の４５°の配置の照明対物レンズおよび検出対物レンズと、試料面の下方の広視野対物レンズとを有する顕微鏡の概略図を示し、ｂは、従来技術による、試料面の下方の倒立した４５°の配置の照明対物レンズおよび検出対物レンズと、試料面の上方の広視野対物レンズとを有する顕微鏡の概略図を示す。 ａは、本発明による第１の例示的な実施形態の顕微鏡の概略図を示し、図２ｂは、本発明による第１の例示的な実施形態の顕微鏡の開口数の概略図を示す。 ａは、本発明による第２の例示的な実施形態のディフューザーを含む顕微鏡の概略図を示し、ｂは、本発明による第２の例示的な実施形態の顕微鏡の開口数の概略図を示す。 ａは、本発明による第３の例示的な実施形態のマスクを含む顕微鏡の概略図を示し、ｂは、本発明による第３の例示的な実施形態の顕微鏡の開口数の概略図を示す。 ５ａは、本発明による第４の例示的な実施形態の顕微鏡の概略図であり、片側マスクを含み、ｂは、本発明による第４の例示的な実施形態の概略的に図示された瞳カバレージを有する顕微鏡の側面における概略図を示す。 本発明による（第５の）例示的な実施形態の象徴化された捕捉領域を有する顕微鏡の概略図を示す。 ａは、本発明による顕微鏡の検出対物レンズの光軸に沿った視野からのＺスタックの概略図を示し、ｂは、試料の横方向におけるＺスタックの概略図を示す。 ａは、変位され捕捉されたＺスタック（スキュー）および仮想格子の概略図を示し、ｂは、第１の変換１の概略図を示し、ｃは、第２の変換２の概略図を示す。

同じ参照符号は、以下の例示的な実施形態および概略図における同じ構成要素を示す。
照明対物レンズ２、検出対物レンズ３、および広視野対物レンズ２０を含む、図１ａに概略的に示されている正立顕微鏡１は、従来技術から知られている。光シートは、照明対物レンズ２によって第１の光軸Ａ１に沿って生成されるか、または生成可能であり、光シートは、試料面４に配置された試料５を検査するのに使用可能である。検出対物レンズ３は、第２の光軸Ａ２を有し、第２の光軸Ａ２に沿って試料面４から到来する光を捕捉することができる。第１の光軸Ａ１と第２の光軸Ａ２とは、互いに直交するように配置され、各々基準面Ｂとしての役割を有する試料面４に対して４５°の角度を有する。

広視野対物レンズ２０は、試料面４に直交するように向けられるとともに、基準軸Ｂとしての役割を有する第３の光軸Ａ３を有する。第１〜第３の光軸Ａ１〜Ａ３は、試料５における光シート６の範囲内で交差する。更に、第１の光軸Ａ１は、基準軸Ｂに対する第１の角度α１を含み、第２の光軸Ａ２は、基準軸Ｂに対する９０°−α１の第２の角度α２を含み、例えば、それぞれ４５°である。

試料５は、液体８が充填された試料ホルダ７内に保持されている。
図１ｂは、照明対物レンズ２および検出対物レンズ３の倒立配置の顕微鏡１を示す概略図であり、照明対物レンズ２と検出対物レンズ３とが試料面４の下に配置され、広視野対物レンズ２０が試料面４の上方に配置されている。ここでも角度α１およびα２は、それぞれ４５°である。

以下の例示的な実施形態は、倒立顕微鏡１に基づいて例示的に例示されており、さらなる実施形態では、正立顕微鏡１として構成されてもよい。
図２ａに概略的に示されている倒立顕微鏡１では、照明対物レンズ２および検出対物レンズ３は４５°の角度α１およびα２で配置されている。

顕微鏡１のさらなる実施形態では、角度α１およびα２は、４５°から外れた角度を有し、角度は互いに実質的に９０°を補完する。
広視野対物レンズ２０（図１ａおよび図１ｂ参照）の代わりに、コンデンサの形態の全体照明装置の照明光学ユニット９が存在し、照明光学ユニットは、基準軸Ｂと一致する第３の光軸Ａ３沿って光を試料面４に伝搬するように構成されている。さらなる実施形態では、コンデンサは、空気コンデンサとして構成される。さらなる実施形態では、照明光学ユニット９は、光学レンズとして構成される。さらなる実施形態では、照明光学ユニット９は照明対物レンズ２０によって形成される。照明目的に加えて、照明光学ユニット９は、試料５を観察および／または撮像するように構成されてもよい。

照明光学ユニット９は、検出対物レンズ３の視野内にある試料５の領域を照明するために使用される。照明光学ユニット９の第３の光軸Ａ３は、第２の光軸Ａ２に対して０°または１８０°以外の角度で配置されているので、通常のスタンドの場合のように、対応するマスクが照明光学ユニット９のビーム経路に導入されることなく傾斜照明が必然的に行われる。

傾斜照明により、検出対物レンズ３を用いて広視野画像をコントラストを強調した全体画像として捕捉することが容易となる。照明光学ユニット９は、必ずしも試料ホルダ７の液体８、例えば水に浸漬（水浸漬）する必要はない。むしろ、試料５は、（空気）コンデンサを用いて空気／液体界面を介して照明され得る。これは、プロセスで発生する照明の収差が画像化にとって重要ではないので可能である。

顕微鏡１の更なる実施形態では、偏光子、ホフマン光学ユニット、および／またはＤＩＣプリズムが、照明光学ユニット９のビーム経路内および検出対物レンズ３のビーム経路内に適切な組み合わせでそれぞれ選択的に配置され、これは、符号１０で示された枠によって概略的に示されている。

図２ｂは、開口コーン、すなわち、照明光学ユニット９の開口数ＮＡ１および検出対物レンズ３の開口数ＮＡ２と、開口数ＮＡ１、ＮＡ２が重なる領域（重複領域）を示す。第１の光軸Ａ１と第２の光軸Ａ２は、互いに平行に延びていない。

照明光学ユニット９の開口数ＮＡ１は、第３の光軸Ａ３に沿った物体側開口角と像側開口角との両方として模式的に描かれている。
開口数を表すこの形式は、以下の例示的な実施形態においても使用される。

拡散スクリーンの形態のディフューザー１２は、照明光学ユニット９と試料５との間の照明光学ユニット９のビーム経路内に配置されている（図３ａ）。ディフューザー１２によって拡散された照明光学ユニット９の光は、破線で示された半円形の楕円によって説明される（図３ｂ）。

開口数ＮＡ１、ＮＡ２およびそれらの相互の重なり合いに応じて、検出対物レンズ３によって、重複領域からの照明光の一部のみが検出可能である。照明対物レンズ２０の開口数ＮＡ１または照明光学ユニット９の開口数ＮＡ１を適合させることによって、重複度合いを設定することが可能である。できるだけ高い解像度を達成するためには、高い開口数ＮＡ１とＮＡ２の両方を照明側と検出側に有して動作することが必要である。しかし、非常に明るい背景の前で小さな変化を検出する必要があるため、ＮＡ１とＮＡ２の強い重複は構造密度の低い試料、例えば単一化された小さな物体の試料では不利益となり得る。

このような不利益は、図４ａに概略的に示されるように、全体照明装置または照明光学ユニット９の瞳内に配置されたマスク１１によって回避され、マスクは、ＮＡ１およびＮＡ２の重複領域を正確に遮断する。

図４ｂにおいて、マスク１１によってマスクされた開口数ＮＡ１の領域はＮＡ１ｍａｓｋで示され、非マスク領域はＮＡ１ｕｎｍａｓｋによって示される。
したがって、マスクは、プロットされた重複領域をブロックする。その場合には、試料５内で拡散した光のみが検出対物レンズ３によって検出される暗視野が実現される。あるいは、マスク１１によって非重複領域が遮蔽されてもよく、その結果、理想的な傾斜照明が得られる。

図５ａに概略的に示された顕微鏡１の第４の例示的な実施形態では、マスク１１は、前述の図における全体照明装置のビーム経路内に配置され、マスクは、全体照明瞳の片側のカバレージをもたらし、上記したように、半瞳コントラストを生成する。

図５ｂは、全体照明装置および照明光学ユニット９のビーム経路におけるカバレージ、および検出対物レンズ３のビーム経路において結果的に生じるマスキングを示す。
上述した例示的な実施形態の各々は、照明源（これ以上詳細には図示せず）、照明対物レンズ２、検出対物レンズ３、および／または照明光学ユニット９を作動させるように構成された制御ユニット１３（図５ａにのみ示す）を備える。さらに、制御ユニット１３は、捕捉された全体画像および／または光シート６の画像を評価するように構成されてもよい。制御ユニット１３は、捕捉された全体画像および／または光シート６の画像をグラフィカルに示すディスプレイに接続されてもよい。

原理的には、本発明による顕微鏡１の実施形態の１つによって、画像取得の様々な選択肢が実現可能である。選択肢のいくつかは、図６の例を使用して説明される。
光シート６の簡略化した図は、検出対物レンズ３の物体面を同時に指定する。第１の走査運動ＳＢ１を介して試料面４の方向に試料走査が行われる。その際に、例示的な方法で実線で示され、かつ簡略化された図解のために矩形として示された試料体が走査される。

別の選択肢では、相対運動は、試料５と光シート６または物体面との間の第２の光軸Ａ２の方向の第２の走査運動ＳＢ２としてもたらされる。その際に、例えば、実破線で示された試料体が走査される。

第３の選択肢は、第３の光軸Ａ３の方向に第３の走査運動ＳＢ３として相対運動を生成することからなり、その範囲内で、点線によって示された試料体が走査される。
さらに、走査運動ＳＢ１、ＳＢ２および／またはＳＢ３の組み合わせも可能である。

走査された試料体は、以下に説明する変換によってＺスタックに変換することができる。
当業者による考察の範囲内の例示的な実施形態の組み合わせが可能である。

本発明による方法は、上述の顕微鏡１の実施形態のうちのいずれか１つによって実施することができる。
この方法の構成は、図面、特に図７ａ、図７ｂおよび図８ａ、図８ｂおよび図８ｃに基づいて以下に説明される。

図７ａは、検出対物レンズ３または検出器（ここには図示せず）の座標系において実現され得るように、かつ表現可能性の理由で概略的に、かつわずかに遠近法的なＺスタックを示す。捕捉された個別画像ＥＢ間のＺ軸Ｚ方向における間隔をΔｚ’とする（以下参照）。

図７ｂは、試料５の座標系におけるＺスタックを、図７ａに関して回転された横方向の図で示す。
図８ａは、例示的かつ概略的な仮想格子を示し、格子のＸ軸ＸおよびＹ軸Ｙは、試料面４に平行に位置し、Ｚ軸Ｚは、試料面４に垂直に調整される。変位したＺスタックを形成する捕捉された個々の画像ＥＢが概略的に示されている。

図８ｂは、以下により詳細に後述する変換１を概略的に示し、図８ｃは、変換２を示す。
個々の画像ＥＢ（図７ａおよび図７ｂ）は、この方法で最初に得られ、個々の画像は、上述した顕微鏡１の実施形態の１つを使用して記録されている。個々の画像ＥＢは、検出対物レンズ３の第２の光軸Ａ２に垂直に（図７ａ）、かつ試料面４に対するα_２の角度で（図７ｂ）整列される。多数の個々の画像ＥＢが記録位置において捕捉され、各記録位置は、それぞれ所定のまたは選択可能なインクリメント（Δｚ’で示される）だけ互いに離間される。試料５をＸ方向Ｘに移動（走査）し、個々の画像ＥＢを各記録位置に記録することにより、この場合には、個々の画像ＥＢが試料面４に対してα_２の角度で整列されるので（図７ｂ）、変位したＺスタックであるＺスタック（３Ｄボリュームスタック）を作成することができる。

Ｚスタックは、Ｚ軸Ｚの方向に連続している一連の個々の画像ＥＢである。これは、好ましい方向のない試料５に対して容易に実行することができる。
試料５は、例えば外部環境および／または実際の環境のために、試料５が空間内に任意の位置および／または範囲を有していない場合、好ましい方向を有する。細胞は、例示的な様式で言及され得、細胞は、基材、例えば、カバースリップ上に横たわっているか、または成長している。基材のために、基材との接触領域に沿った細胞の形状は予め決定され、かつ実質的に平坦な実施形態を有する。したがって、細胞は基材から離れるように指向する好ましい方向を有する。

特に、好ましい方向を有する試料５の場合、例えば、基材としてカバースリップ上で成長する場合には、ユーザには、従来、例えば、レーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ）のように、または回転可能なピンホールアパーチャ（回転ディスク）を使用しているとき、正規化された変位していないＺスタックが設けられている場合に、ユーザにとって有用である。対応するＺスタックの個々の平面は、試料面４（ＸＹ平面）に平行に整列されている。したがって、捕捉されたＺスタックは、適切な変換（デスキュー）によって、ＸＹ平面が試料面４に平行に整列された正規化された変位していないＺスタックに変換されなければならない。これは、例として、以下の２つの変換のうちの１つによって実現される。

変換１（ｘｙｚ補間）
最初に捕捉されたＺスタックは、格子によって取り囲まれており（図８ａ）、格子のＸ軸ＸおよびＹ軸Ｙは試料面４に平行に位置し、Ｚ軸Ｚは試料面４に垂直に調整されている。個々の平面の間隔Δｚ’は、等方性のボクセル寸法を得るために元のＺスタックの横方向分解能に対応するように選択することができる。

Δｘ’＝Δｘ
Δｙ’＝Δｙ
Δｚ’＝ΔｘまたはΔｙ
新しい格子点Ｐ_{ｘ、ｙ、ｚ}における強度の計算は、元の格子の隣接する格子点Ｐ_{ｘ’、ｙ’、ｚ’}の３つの重み付けされた補間によって実行される。補間されるパスは、ＩＰ１、ＩＰ２、ＩＰ３で示される。

変換２（ｙ補間）
最初に捕捉されたＺスタックは、格子によって仮想的に取り囲まれており（図８ａ）、この格子のＸ軸ＸおよびＹ軸Ｙは、試料面４に平行に位置し、Ｚ軸Ｚは、試料面に垂直に調整されている。個々の格子の平面の間隔Δｚ’は、
Δｘ’＝Δｘ
Δｙ’＝Δｙ
Δｚ’＝Δｙ＊ｓｉｎ（α_１）
が適用されるように選択される。新しい格子点Ｐ_{ｘ、ｙ、ｚ}における強度の計算は、元の格子の隣接点Ｐ_{ｘ’、ｙ’、ｚ’}の重み付き補間によって実行される（図８ｃ）。

２つの変換１または変換２のうちの１つが実行された後、変換され、その結果として、試料面４に平行なＸＹ平面を有する正規化されたＺスタックが利用可能となる。
本方法によって達成可能な記録速度は、以下の４つのオプションＡ〜Ｄのうちの１つを介して、またはそれらの組み合わせによってさらに増加させることができる。

Ａ．試料面４に平行な全体画像を生成することの欠点は、完全なＺスタックを記録することが常に必要であることである。結果として、全体画像の生成は、比較的長い期間を必要とすることがある。待ち時間は、２つのＸＹ平面の間のインクリメントΔｚを増加させて少数の画像を記録することによって低減され得る。

Ｂ．代替的に、大量の試料５を低解像度（例えば、タイリングを含む）で記録するために、比較的長い待機時間を受け入れてもよい。その後、ボリューム全体が３Ｄビューアを用いて実質的に観察され、関心領域（ＲＯＩ）が特定される。これに続いて、この関心領域の全体画像は、例えば、ＸＹ平面の間のより小さいインクリメントΔｚで、解像度を高めて記録することができる。

Ｃ．一度に全体のＺスタックを計算する代わりに、１つのみのＸＹ平面が試料面４と平行に計算され、直ちに表示される場合には、この方法の更なる加速が得られる。全ての補間は省略することができる。

Ｄ．代替的に、単一ラインは、検出器、例えばカメラ上の単一ラインのＲＯＩを選択することによって直接読み取ることもできる。Ｚ方向Ｚにおいて多数の大きな個々の画像ＥＢを記録する代わりに、多くのラインがＺ方向Ｚに記録される。これは、完全な個々の画像ＥＢを記録するよりもずっと迅速に実行され得る。

方法ＣおよびＤでは、どの線、したがって試料面４に平行な、どのＸＹ平面が表示されるかを選択することが可能である。表示する場合、各個々のＸＹ平面は、前のＸＹ平面に対してΔ＝Δｚ／ｔａｎ（α_１）だけずらす必要があることに注意する必要がある。

１…顕微鏡
２…照明対物レンズ
２０…広視野対物レンズ
３…検出対物レンズ
４…試料面
５…試料
６…光シート
７…試料ホルダ
８…液体
９…照明光学ユニット
Ｂ…基準軸
１０…偏光子、ホフマン光学ユニット、ＤＩＣプリズム
１１…マスク
１２…ディフューザー
１３…制御ユニット
ＥＢ…個別画像
ＮＡ１…（照明光学ユニット９の）開口数
ＮＡ２…（検出対物レンズ３の）開口数
ＮＡ１ｍａｓｋ…（ＮＡ１の）マスク領域
ＮＡ１ｕｎｍａｓｋ…（ＮＡ１の）マスクされていない領域
Ａ１…第１の光軸
Ａ２…第２の光軸
Ａ３…第３の光軸
ＩＰ１…第１の補間
ＩＰ２…第２の補間
ＩＰ３…第３の補間
α１…（第１の光軸Ａ１と第３の光軸Ａ３との間の）角度
α２…（第２の光軸Ａ２と第３の光軸Ａ３との間）の角度

Claims (15)

1. 顕微鏡（１）であって、
   光シート（６）を生成するように構成された、第１の光軸（Ａ１）を有する照明対物レンズ（２）であって、前記光シート（６）は、少なくとも部分的に試料面（４）において生成されるか、または生成可能である、前記照明対物レンズ（２）と、
   前記試料面（４）から到来する光を検出するように構成された、第２の光軸（Ａ２）を有する検出対物レンズ（３）と
   を備え、
   前記照明対物レンズ（２）および前記検出対物レンズ（３）は、前記第１の光軸（Ａ１）および前記第２の光軸（Ａ２）が試料面（４）内で交差し、かつそれらが実質的に直角を成すように、互いに対して、かつ試料面（４）に対して配置され、
   前記第１の光軸（Ａ１）および前記第２の光軸（Ａ２）の各々は試料面（４）に直交するように指向された基準軸（Ｂ）に対してゼロとは異なる角度を有し、
   第３の光軸（Ａ３）を有する照明光学ユニット（９）を含む、前記試料面（４）の広視野照明のために構成された全体照明装置が設けられ、
   前記検出対物レンズ（３）は、光シート（６）からの光と前記照明光学ユニット（９）からの光の両方を検出するように設けられ、かつ構成される、顕微鏡（１）。
2. 前記照明光学ユニット（９）の第３の光軸（Ａ３）が、実質的に基準軸（Ｂ）に沿って指向されることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡（１）。
3. 前記照明光学ユニット（９）の瞳にマスク（１１）が配置されていることを特徴とする請求項１または２に記載の顕微鏡（１）。
4. 偏光子、ホフマン光学ユニット、および／またはＤＩＣプリズム（１４）が、前記照明光学ユニット（９）のビーム経路および前記検出対物レンズ（３）のビーム経路に配置されていることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の顕微鏡（１）。
5. 前記検出対物レンズ（３）と前記照明光学ユニット（９）との間にディフューザー（１２）が配置されていることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の顕微鏡（１）。
6. 前記ディフューザー（１２）は、下流に配置されたすりガラススクリーンを有するＬＥＤおよび／またはＯＬＥＤとして構成されることを特徴とする請求項５に記載の顕微鏡（１）。
7. 前記照明光学ユニット（９）のビーム経路にマスク（１１）が設けられ、前記マスクは、前記試料面（４）において暗視野照明が生成されるか、または生成可能となるように重複領域を暗くすることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の顕微鏡（１）。
8. 前記照明光学ユニット（９）の瞳に可動マスク（１１）が設けられ、瞳の半分がマスクによって正確にカバーされるか、またはカバー可能であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の顕微鏡（１）。
9. 光シート顕微鏡（１）を作動する方法であって、
   試料面（４）に実質的に直交するように指向された基準軸（Ｂ）に沿って、全体照明装置からの光により試料面（４）に位置する試料（５）を照明するステップと、
   光軸（Ａ２）を有する検出対物レンズ（３）によって前記全体照明装置からの光を透過光として検出するステップであって、前記検出対物レンズ（３）の前記光軸（Ａ２）は、基準軸（Ｂ）に対してゼロとは異なる角度を有する、前記検出するステップと
   を含み、
   前記検出対物レンズ（３）によって捕捉された前記全体照明装置からの光に応じて試料（５）の全体画像が生成され、
   前記全体照明装置の光を捕捉する目的で、試料面（４）で生成された光シート（６）の光が前記検出対物レンズ（３）によって捕捉される、方法。
10. 全体画像は、ＴＩＥ（強度輸送方程式）によって生成されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
11. ＸＹ平面のＺスタックが捕捉され、前記ＸＹ平面は、前記ＸＹ平面が好ましい方向を有する場合、正規化されたＺスタックに変換され、前記正規化されたＺスタックのＸＹ平面は、
    互いに直交するように延伸するＸ軸、Ｙ軸およびＺ軸（Ｘ、Ｙ、Ｚ）を有する格子によって仮想的に取り囲まれている捕捉されたＺスタックによって、好ましい方向を有しておらず、前記Ｘ軸（Ｘ）および前記Ｙ軸（ｙ）は、試料面（４）に対して平行に指向され、前記Ｚ軸（Ｚ）は、試料面（４）に対して垂直に指向され、
    正規化されたＺスタックのＸＹ平面の間隔は、その間隔が捕捉されたＺスタックの横方向分解能の１つに対応して、以下が適用されるように、Ｚ軸（Ｚ）の方向において選択され、
    Δｘ’＝Δｘ、
    Δｙ’＝Δｙおよび
    Δｚ’＝ΔｘまたはΔｙ
    新規の格子点（Ｐ_{ｘ、ｙ、ｚ}）が計算され、
    捕捉されたＺスタックの隣接する（格子）点（Ｐ_{ｘ’、ｙ’、ｚ’}）の３つの重み付き補間によって、個々の新規の格子点（Ｐｘ、ｙ、ｚ）における強度が計算される、請求項９または１０に記載の方法。
12. ＸＹ平面のＺスタックが捕捉され、前記ＸＹ平面は、前記ＸＹ平面が好ましい方向を有する場合、正規化されたＺスタックに変換され、前記正規化されたＺスタックのＸＹ平面は、
    互いに直交して延伸するＸ軸、Ｙ軸、およびＺ軸（Ｘ、Ｙ、Ｚ）を有する格子によって仮想的に取り囲まれている捕捉されたＺスタックによって、好ましい方向を有しておらず、前記Ｘ軸（Ｘ）および前記Ｙ軸（Ｙ）は、試料面に対して平行に指向され、前記Ｚ軸（Ｚ）は、試料面（４）に対して垂直に指向され、
    正規化されたＺスタックのＸＹ平面の間隔は、その間隔が捕捉されたＺスタックの横方向分解能の１つに対応して、以下が適用されるように、Ｚ軸（Ｚ）の方向において選択され、
    Δｘ’＝Δｘ
    Δｙ’＝Δｙ
    Δｚ’＝Δｙ＊ｓｉｎ（α_１）
    第１の光軸（Ａ１）と第３の光軸（Ａ３）とによって角度α_１が設けられ、
    新規の格子点（Ｐ_{ｘ、ｙ、ｚ}）が計算され、
    捕捉されたＺスタックの隣接する（格子）点（Ｐ_{ｘ’、ｙ’、ｚ’}）の３つの重み付き補間によって、個々の新規の格子点（Ｐ_{ｘ、ｙ、ｚ}）における強度が計算される、請求項９または１０に記載の方法。
13. ＸＹ平面の捕捉の記録速度は、
    ａ）捕捉される２つのＸＹ平面の間のインクリメントΔｚ’が設定されるか、
    ｂ）第１のインクリメント（Δｚ’）でＺスタックが捕捉され、関心領域が選択され、選択された関心領域が第２のインクリメント（Δｚ’）で捕捉され、前記第２のインクリメント（Δｚ’）が第１のインクリメント（Δｚ’）よりも大きいか、または
    ｃ）いずれの場合にも試料面（４）に平行な１つのＸＹ平面のみが計算され、表示されることにより
    設定される、請求項９乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 単一ラインの関心領域が、Ｘ軸（Ｘ）またはＹ軸（Ｙ）の方向において選択され、単一ラインの関心領域がＺ軸（Ｚ）の方向においてＸＹ平面ごとにそれぞれ捕捉されることを特徴とする請求項９乃至１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 個々のＸＹ平面が、前のＸＹ平面に対してΔ＝Δｚ’／ｔａｎ（α_１）の値だけずらして描画されることを特徴とする請求項１３に記載の方法、ｃ）の代替、または請求項１４に記載の方法。