JP6491578B2 - シート照明顕微鏡システム、画像処理装置、シート照明顕微鏡法、及び、プログラム - Google Patents

Description

本発明は、シート照明顕微鏡システム、画像処理装置、シート照明顕微鏡法、及び、プログラムの技術に関する。

蛍光顕微鏡の分野では、検出光学系の光軸（ｚ軸）に直交する方向（ｘ軸方向）から観察物体に照明光を照射して、観察物体中に検出光学系の光軸とおよそ直交するシート状の光（以降、光シートと記す）を形成するシート照明技術が知られている。この技術は、観察物体に与えるダメージを抑えることができる、ｚ軸方向に高い解像力を実現できるなどのメリットがあり、近年、注目を集めている。特許文献１、特許文献２、特許文献３には、シート照明技術を利用したシート照明顕微鏡が記載されている。

特表２００６−５０９２４６号公報 特開２０１２−１０８４９１号公報 中国特許出願公開第１０４４０７４３６号明細書

ところで、従来のシート照明顕微鏡では、ｚ軸方向の解像力（以降、ｚ解像力と記す）は光シートのｚ軸方向の厚さ（以降、単に光シートの厚さと記す）に依存し、光シートの厚さが薄いほど高いｚ解像力が得られる。光シートの厚さは、照明光学系の射出側の開口数が高いほど薄くなるため、高いｚ解像力を得るためには、照明光学系は高い開口数を有することが望ましい。一方で、照明光学系が高い開口数を有すると、光シートが形成される照明領域は照明方向（ｘ軸方向）に狭くなってしまう。

従って、特許文献１及び特許文献２に記載されるシート照明顕微鏡などの従来のシート照明顕微鏡を用いて広い視野を高いｚ解像力で観察する場合には、光シートの集光位置を視野内で照明方向に移動させてその後画像を取得するといった処理を何度も繰り返さなければならない。この場合、取得画像枚数が多いため、画像取得に要する時間も長くなってしまう。また、観察物体を照明する時間も長くなるため、褪色が進みやすく、光毒性による影響も大きくなってしまう。

特許文献３に記載のシート照明顕微鏡は、２光子励起蛍光顕微鏡であり、光シートの集光位置を照明方向に高速に移動させることで、照明領域を照明方向に広げることができる。しかしながら、特許文献３に記載のシート照明顕微鏡では、露光期間中に光シートの集光位置が移動するため、露光期間内に生じる照明光量分布がｚ軸方向に広がってしまう。このため、特許文献３に記載のシート照明顕微鏡を１光子励起蛍光観察に適用した場合、高いｚ解像力を得ることが困難である。

以上のような実情を踏まえ、本発明は、１光子励起蛍光観察において高いｚ解像力で広い視野を少ない取得画像枚数で観察するシート照明顕微鏡システム及びシート照明顕微鏡法、並びに、画像の分解能を改善する画像処理装置及びプログラムを提供することを目的とする。

本発明の一態様は、観察方向と直交する照明方向から観察物体に照射した光シートの集光位置が前記照明方向に移動することにより形成される第１の照明光量分布下で前記観察物体の２次元画像を取得する顕微鏡装置と、前記顕微鏡装置で取得された複数の２次元画像から構築される前記観察物体の３次元画像の画像データに対して、前記顕微鏡装置の光学伝達特性に応じて、前記３次元画像が有する空間周波数特性を変更する空間周波数フィルタ処理を行う画像処理装置と、を備えるシート照明顕微鏡システムを提供する。

本発明の別の態様は、観察方向と直交する照明方向から観察物体に照射した光シートの集光位置が前記照明方向に移動することにより形成される第１の照明光量分布下で顕微鏡装置が取得した前記観察物体の複数の２次元画像から構成される前記観察物体の３次元画像の画像データに対して、前記顕微鏡装置の光学伝達特性に応じて、前記３次元画像が有する空間周波数特性を変更する空間周波数フィルタ処理を行う空間周波数フィルタ処理部を備える画像処理装置を提供する。

本発明の更に別の態様は、観察方向と直交する照明方向から観察物体に照射した光シートの集光位置が前記照明方向に移動することにより形成される第１の照明光量分布下で前記観察物体の２次元画像を顕微鏡装置で取得し、前記観察物体を基準とした前記光シートの集光位置を前記観察方向へ移動し、前記２次元画像の取得と前記観察方向への移動を繰り返して得られる複数の２次元画像から構築される前記観察物体の３次元画像の画像データを構築し、前記３次元画像の画像データに対して、前記顕微鏡装置の光学伝達特性に応じて、前記３次元画像が有する空間周波数特性を変更する空間周波数フィルタ処理を行うシート照明顕微鏡法を提供する。

本発明の更に別の態様は、観察方向と直交する照明方向から観察物体に照射した光シートの集光位置が前記照明方向に移動することにより形成される第１の照明光量分布下で顕微鏡装置が取得した前記観察物体の複数の２次元画像から構成される前記観察物体の３次元画像の画像データに対して、前記顕微鏡装置の光学伝達特性に応じて、前記３次元画像が有する空間周波数特性を変更する空間周波数フィルタ処理を行う処理を画像処理装置に実行させるプログラムを提供する。

本発明によれば、１光子励起蛍光観察において高いｚ解像力で広い視野を少ない取得画像枚数で観察するシート照明顕微鏡システム及びシート照明顕微鏡法、並びに、画像の分解能を改善する画像処理装置及びプログラムを提供することができる。

一実態形態に係るシート照明顕微鏡システム１の構成を示した図である。 一実態形態に係る計算装置４０の構成を示した図である。 集光位置が固定されているときの照明強度分布を濃淡で表した図である。 集光位置が複数の位置に移動したときの照明強度分布を濃淡で表した図である。 図２Ａ及び図２Ｂの各断面における照明強度分布を示した図である。 集光位置を移動する照明状態におけるシート照明顕微鏡装置１０の光学伝達特性を説明するための図である。 集光位置を固定した照明状態におけるシート照明顕微鏡装置１０の光学伝達特性を説明するための図である。 空間周波数フィルタの算出方法及び作用について説明するための図である。 実施例１に係るシート照明顕微鏡システム１００の構成を示したｘｚ断面図である。 実施例１に係るシート照明顕微鏡システム１００の構成を示したｘｙ断面図である。 シート照明顕微鏡システム１００で行われる処理の流れを示すフローチャートである。 図７Ａに示す２次元画像取得処理の流れを示すフローチャートである。 図７Ａに示すフィルタ処理の流れを示すフローチャートである。 実施例２に係るシート照明顕微鏡システム２００の構成を示したｘｚ断面図である。 実施例２に係るシート照明顕微鏡システム２００の構成を示したｘｙ断面図である。 実施例３に係るシート照明顕微鏡システム３００の構成を示したｘｚ断面図である。 実施例３に係るシート照明顕微鏡システム３００の構成を示したｘｙ断面図である。 シート照明顕微鏡システム３００で行われる処理の流れを示すフローチャートである。

図１Ａは、本発明の一実態形態に係るシート照明顕微鏡システム１の構成を示した図である。図１Ｂは、図１Ａに示す計算装置４０の構成を示した図である。図１Ａに示すｘｙｚ座標系は、明細書における方向参照の便宜のために定義した直交座標系である。ｘ軸方向は照明光が進行する照明方向であり、ｚ軸方向は観察物体Ｓを観察する観察方向であり、ｙ軸方向は照明方向と観察方向の両方向に直交する方向である。

シート照明顕微鏡システム１は、光シートを観察物体Ｓに照射して観察物体Ｓの２次元画像を取得するシート照明顕微鏡装置１０と、シート照明顕微鏡装置１０から出力される画像信号２に基づいて種々の計算を実行する計算装置４０を備えている。

なお、光シートとは、光の進行方向に直交する２方向の一方に薄いシート状の光をいい、光シートの進行方向に直交する２方向のうちの、光シートを構成する光束の径が小さい方向を厚さ方向、大きい方向を幅方向という。シート照明顕微鏡システム１では、ｚ軸方向が厚さ方向であり、ｙ軸方向が幅方向である。光シートの集光位置とは、厚さ方向について光束径が最も小さくなる位置をいう。観察物体Ｓの高さとは、ある基準位置から観察物体Ｓまでの観察方向に関する距離のことをいう。

シート照明顕微鏡装置１０は、観察物体Ｓの２次元画像（蛍光画像）を取得する蛍光顕微鏡であり、例えば、１光子励起蛍光顕微鏡である。シート照明顕微鏡装置１０は、観察物体Ｓの２次元画像を撮像素子３１の撮像面３２上に形成する顕微鏡本体２０と、撮像素子３１を有し観察物体Ｓの２次元画像を取得する撮像装置３０と、を備えている。

顕微鏡本体２０は、照明光を出射する光源２１と、光源２１から出射した照明光から光シートを観察物体Ｓに形成する照明光学系２４と、観察物体Ｓの２次元画像を撮像面３２に投影する観察光学系２５と、観察物体Ｓを観察方向に移動して観察物体Ｓの高さを変更する観察物体移動装置２６を備えている。

光源２１は、例えば、水銀ランプやキセノンランプなどのランプ光源、レーザー光源、ＬＥＤ（Light Emitting Diode）光源である。照明光学系２４は、観察物体Ｓに、観察方向（ｚ軸方向）と直交する照明方向（ｘ軸方向）から、観察方向に薄い光シートを照射する。照明光学系２４は、光シートの集光位置を照明方向に移動する集光位置縦移動装置２２と、光シートを少なくとも観察方向に集光させる集光光学系２３を備えている。図１Ａには、集光位置縦移動装置２２によって光シートの集光位置が、照明方向に異なる、集光位置Ｃ１、集光位置Ｃ２、集光位置Ｃ３に変化する様子が示されている。

観察光学系２５は、観察光学系２５の光軸ＡＺが照明光学系２４の光軸ＡＸと直交し、観察光学系２５の前側焦点面が照明光学系２４の光軸ＡＸまたはその近傍に位置するように、構成される。これにより、観察物体Ｓ中の光シートが形成される領域の画像を撮像面３２に投影することができる。

観察物体移動装置２６は、例えば、観察物体Ｓが配置されるステージとステージを観察方向に移動する駆動装置からなる。観察物体移動装置２６が観察物体Ｓを移動することで、観察光学系２５の焦点面と照明光学系２４が形成する光シートとの位置関係を変更することなく、観察物体Ｓ中の異なる領域の画像を撮像面３２に投影することができる。

撮像装置３０は、例えば、ＣＣＤ（Charge-Coupled Device）カメラやＣＭＯＳ(Complementary MOS)カメラであり、観察物体Ｓの２次元画像に関するデジタル画像信号（画像信号２）を計算装置４０に出力する。撮像素子３１は、ＣＣＤイメージセンサやＣＭＯＳイメージセンサなどの２次元イメージセンサである。撮像面３２が観察光学系２５の光軸ＡＺと略直交するように、撮像装置３０は配置される。また、撮像面３２は観察光学系２５の前側焦点面と共役な面に位置することが望ましい。

計算装置４０は、シート照明顕微鏡装置１０で取得された画像を処理する画像処理装置であり、例えば、パーソナルコンピュータや画像処理専用のコンピュータである。計算装置４０は、図１Ｂに示すように、画像信号取得部４１と、３次元画像構築部４２と、空間周波数フィルタ処理部４３を備える。

画像信号取得部４１は、撮像装置３０から２次元画像の画像信号２を取得する。３次元画像構築部４２は、画像信号取得部４１で取得した画像信号２に基づいて観察物体Ｓの３次元画像を構築する。この３次元画像は、撮像装置３０で取得した複数の２次元画像から構成される。空間周波数フィルタ処理部４３は、３次元画像構築部４２で構築された３次元画像の画像データに対して、シート照明顕微鏡装置１０の光学伝達特性に応じて、その３次元画像が有する空間周波数特性を変更する空間周波数フィルタ処理を行う。

なお、光学伝達特性とは、情報が光学的にどの程度伝達されるかを示す特性のことである。光学系の光学伝達特性とは、その光学系の結像特性のことであり、点像分布関数（ＰＳＦ：Point Spread Function）や光学伝達関数（ＯＴＦ：Optical Transfer Function）などがその代表例である。顕微鏡装置の光学伝達特性とは、顕微鏡装置で行われる照明を考慮した特性であり、顕微鏡装置が備える観察光学系の光学伝達特性と、照明状態（即ち、露光期間内における照明光量分布）とによって決定される。例えば、ある照明状態における顕微鏡装置の光学伝達特性とは、観察光学系の光学伝達特性とその照明状態とにより決定される光学伝達特性のことである。画像が有する空間周波数特性とは、画像に含まれる空間周波数成分の分布状態のことである。空間周波数特性を変更するとは、空間周波数成分の分布状態を変更することである。

図２Ａは、光シートの集光位置が固定されているときに観察物体Ｓに形成される照明強度分布を濃淡で表した図である。図２Ｂは、光シートの集光位置が複数の位置に移動したときに観察物体Ｓに形成される照明強度分布を濃淡で表した図である。図２Ｃは、図２Ａ及び図２Ｂの各断面（断面Ａ−Ａ’、 断面Ｂ−Ｂ’、 断面Ｃ−Ｃ’、 断面Ｄ−Ｄ’）における照明強度分布を示した図である。以下、光シートの集光位置を移動させる場合と固定した場合とで生じる照明強度分布の差異について、図２Ａから図２Ｃを参照しながら説明する。なお、照明強度分布とは、ある期間中における単位時間当たりの平均的な照明光量の分布をいい、本明細書では、露光期間中における平均的な照明光量分布をいう。図２Ａ及び図２Ｂでは、明るい（白い）ほど、より大きな強度を示している。

光シートの集光位置が固定されている場合には、図２Ａの画像Ｐ１で表されるように、集光位置から離れるほど光シートは観察方向（ｚ軸方向）に広がる。このため、図２Ｃに示すように、観察方向の断面強度分布は、集光位置（断面Ａ−Ａ’）で最も高く急峻なピークを有し、集光位置から離れるほど（断面Ｂ−Ｂ’、 断面Ｃ−Ｃ’）ピークが低くなり、強度分布の広がりも大きくなる。従って、光シートの集光位置を固定した照明では、蛍光物質の励起に十分で且つ照明方向（ｘ軸方向）におよそ均質な照明強度を有する領域（以降、照明領域と記す）は、集光位置の近傍に限られることになる。または、照明領域の照明方向の長さは、光シートを形成する照明光学系の射出側の開口数に依存し、開口数が大きいほど短くなる。

これに対して、光シートの集光位置が照明方向に移動する場合、観察方向の断面強度分布は、照明方向に異なる複数の集光位置での断面強度分布の積算によって得られる。従って、照明方向に平均化されることになるため、図２Ｂの画像Ｐ２で表されるように、観察方向の断面強度分布は断面（照明方向の位置）によらずおよそ同じ形状を有し、その結果、照明方向の広い領域に照明領域が形成される。ただし、図２Ｃに示すように、各断面における断面強度分布（断面Ｄ−Ｄ’）は、光シートの集光位置を固定した場合に比べて広がってしまう。

シート照明顕微鏡システム１では、撮像装置３０の露光期間中に、集光位置縦移動装置２２により光シートの集光位置が照明方向に移動するため、照明範囲が照明方向に拡大する。従って、照明光学系２４が高い開口数を有する場合であっても、広い視野を、光シートの集光位置を固定した場合よりも少ない画像取得枚数で観察することができる。

一方で、シート照明顕微鏡システム１では、非集光位置の照明光が寄与することで、照明光量分布が観察方向に全体的に広がってしまう。このような照明状態では、集光位置の照明光が有する高い空間周波数成分の強度が非集光位置の照明光の影響により相対的に低下するため、シート照明顕微鏡装置１０の光学伝達特性（特にｚ軸方向についての光学伝達特性）が劣化してしまう。

図３は、露光期間中に集光位置を照明方向に移動する照明状態（以降、第１の照明状態と記す）におけるシート照明顕微鏡装置１０の光学伝達特性を説明するための図である。図４は、露光期間中に集光位置を固定した照明状態（以降、第２の照明状態と記す）におけるシート照明顕微鏡装置１０の光学伝達特性を説明するための図である。以下、図３及び図４を参照しながら、第１の照明状態におけるシート照明顕微鏡装置１０の光学伝達特性と、第２の照明状態におけるシート照明顕微鏡装置１０の光学伝達特性との違いについて説明する。

なお、第１の照明状態におけるシート照明顕微鏡装置１０の光学伝達特性とは、露光期間中に集光位置を照明方向に移動することにより形成される第１の照明光量分布下におけるシート照明顕微鏡装置１０の光学伝達特性（第１の光学伝達特性）のことである。また、第２の照明状態におけるシート照明顕微鏡装置１０の光学伝達特性とは、露光期間中に集光位置を一定の位置に維持することにより形成される第２の照明光量分布下におけるシート照明顕微鏡装置１０の光学伝達特性（第２の光学伝達特性）のことである。

第１の照明状態でシート照明顕微鏡装置１０により取得される画像の強度分布
は、式（１）に示すように、観察物体Ｓの関数
と第１の照明状態におけるシート照明顕微鏡装置１０の点像分布関数
とのコンボリューション(*)によって与えられる。点像分布関数
は、第１の照明状態におけるシート照明顕微鏡装置１０の光学伝達特性を示す関数であり、式（２）に示すように、第１の照明状態における照明光量分布
と観察光学系２５の点像強度分布
との積(×)によって与えられる。同様に、第２の照明状態でシート照明顕微鏡装置１０により取得される画像の強度分布
は、式（３）に示すように、観察物体Ｓの関数
と第２の照明状態におけるシート照明顕微鏡装置１０の点像分布関数
とのコンボリューション(*)によって与えられる。点像分布関数
は、第２の照明状態におけるシート照明顕微鏡装置１０の光学伝達特性を示す関数であり、式（４）に示すように、第２の照明状態における照明光量分布
と観察光学系２５の点像強度分布
との積(×)によって与えられる。

また、式（１）から式（４）をフーリエ変換すると、式（１−１）から式（４−１）が導かれる。記号(~)が付与された関数は、元の関数のフーリエ変換である。

図３において、画像Ｐ３は、第１の照明状態における照明光量分布
を濃淡で示した図である。画像Ｐ４は、観察光学系２５の点像強度分布
を濃淡で示した図である。画像Ｐ５は、第１の照明状態におけるシート照明顕微鏡装置１０の点像分布関数
を濃淡で示した図である。図４において、画像Ｐ６は、第２の照明状態における照明光量分布
を濃淡で示した図である。画像Ｐ７は、第２の照明状態におけるシート照明顕微鏡装置１０の点像分布関数
を濃淡で示した図である。なお、図３及び図４では、明るい（白い）ほど、より大きな値を有する。

図３に示すように、点像分布関数
では、点像分布関数
に比べて観察方向（ｚ軸方向）についての光学伝達特性が改善される。しかしながら、図３と図４を比較すると明らかなように、点像分布関数
は、照明光量分布
の影響により観察方向に広がった分布を有し、その結果、点像分布関数
よりも観察方向について劣化した光学伝達特性を示す。つまり、シート照明顕微鏡装置１０は、第１の照明状態と第２の照明状態では、異なる光学伝達特性を示し、第２の照明状態の方が集光位置においては高いｚ解像力を有する。

このため、シート照明顕微鏡装置１０は、撮像装置３０の露光期間中に光シートの集光位置を照明方向に移動させることで、広い視野を少ない画像取得枚数で観察することができるが、シート照明顕微鏡装置１０で得られる画像のｚ軸方向の分解能（以降、ｚ分解能と記す）は十分ではない可能性がある。

そこで、シート照明顕微鏡システム１では、計算装置４０が、シート照明顕微鏡装置１０が第１の照明状態で取得した画像の画像データに対して空間周波数フィルタ処理を行う。空間周波数フィルタ処理は、第２の照明状態で取得される画像のｚ分解能と比較して劣化したｚ分解能を、第２の照明状態で取得される画像のｚ分解能程度に回復する処理である。

図５は、空間周波数フィルタの算出方法及び作用について説明するための図である。以下、図５を参照しながら、空間周波数フィルタ処理によりｚ分解能が回復することについて説明する。

図５において、画像Ｐｋ１は、観察光学系２５の点像強度分布
のフーリエ変換
を濃淡で示した図である。画像Ｐｋ２は、第２の照明状態における照明光量分布
のフーリエ変換
を濃淡で示した図である。画像Ｐ３は、第２の照明状態におけるシート照明顕微鏡装置１０の点像分布関数
のフーリエ変換
を濃淡で示した図である。画像Ｐｋ４は、第１の照明状態における照明光量分布
のフーリエ変換
を濃淡で示した図である。画像Ｐ５は、第１の照明状態におけるシート照明顕微鏡装置１０の点像分布関数
のフーリエ変換
を濃淡で示した図である。画像Ｐ６は、空間周波数フィルタ処理で用いられるフィルタの特性を示した図である。画像Ｐ７は、空間周波数フィルタ処理により得られるシート照明顕微鏡装置１０の点像分布関数
のフーリエ変換
を濃淡で示した図である。

図５に示すように、
は式（４−１）により算出され、
は式（２−１）により算出される。
の比（割り算）を空間周波数フィルタＦ（以降、単にフィルタＦと記す）とすると、フィルタＦと
の積（×）である
は、式（５）に示すように、
に等しくなる。このことは、フィルタＦを用いた空間周波数フィルタ処理によって、第２の照明状態におけるシート照明顕微鏡装置１０の光学伝達特性と同程度の光学特性が得られることを示している。

さらに、式（１−１）と式（５）から、式（６）及び式（７）が導かれる。

式（６）及び式（７）によれば、第１の照明状態で取得される画像にフィルタＦを作用させることで、フィルタＦが作用した画像のｚ分解能を、第２の照明状態で取得される画像と同程度のｚ分解能にまで回復することができる。また、フィルタＦが作用した
は、高いｚ分解能を第２の照明状態で取得される画像よりもｘ軸方向の広い範囲処理にわたって有することになる。

従って、シート照明顕微鏡システム１では、計算装置４０が、第１の照明状態で取得された画像の画像データに対してフィルタＦを作用させる空間周波数フィルタ処理を行うことで、照明範囲全体にわたって高いｚ分解能を有する画像を得ることができる。このため、シート照明顕微鏡システム１によれば、１光子励起蛍光観察において高いｚ解像力で広い視野を少ない取得画像枚数で観察することができる。また、計算装置４０によれば、シート照明顕微鏡装置１０で取得された画像の分解能を改善することができる。

以上では、空間周波数フィルタ処理の例として、空間周波数領域におけるフーリエフィルタ処理を例示したが、フーリエフィルタ処理は、空間領域におけるコンボリューションフィルタ処理で代用してもよい。コンボリューションフィルタ処理では、フーリエフィルタ処理前後に行う画像のフーリエ変換と逆フーリエ変換を省略することができる。このため、画像処理に要する計算量を減らすことが可能であり、計算時間を短縮することができる。また、コンボリューションフィルタでは、観察方向と平行な１次元のコンボリューション核を用いてもよい。コンボリューション核を１次元に制限することで大幅に計算時間を短縮することができる。

シート照明顕微鏡装置１０の第１の光学伝達特性と第２の光学伝達特性の比に基づいて空間周波数フィルタ処理を行う例を示したが、空間周波数フィルタ処理は、シート照明顕微鏡装置１０の第１の光学伝達特性と第２の光学伝達特性に基づいて行われればよい。例えば、
の割り算によりフーリエフィルタの値が発散してしまう場合には、値を所定の最大値に制限したフーリエフィルタを用いてもよい。また、上記の方法で算出したフーリエフィルタ（第１のフーリエフィルタ）に所定の空間周波数を越える空間周波数成分の強度を抑えるためのアポダイゼーションを適用して算出した新たなフーリエフィルタ（第２のフーリエフィルタ）を用いてもよい。アポダイゼーションの適用により高周波領域で顕著なノイズの増幅を抑制することができる。また、第１のフーリエフィルタの等方性を向上させるための球形のマスクを適用し算出される第２のフーリエフィルタを用いてもよい。

以下、本発明の各実施例について具体的に説明する。
［実施例１］

図６Ａ及び図６Ｂは、本実施例に係るシート照明顕微鏡システム１００の構成を示した図であり、図６Ａはｘｚ断面図であり、図６Ｂはｘｙ断面図である。なお、ｘ軸方向、ｙ軸方向、ｚ軸方向の定義は、図１Ａと同様である。

シート照明顕微鏡システム１００は、シート照明顕微鏡装置１１０と、コンピュータ１４０を備えている。シート照明顕微鏡システム１００で観察する観察物体Ｓは、上面が開放され、側面は光学的に透明なガラスで形成された容器Ｈ中で、観察物体Ｓとほぼ等しい屈折率の浸液ＩＭに浸されている。

シート照明顕微鏡装置１１０は、１光子励起蛍光顕微鏡装置であり、顕微鏡本体１２０と撮像装置１３０を備える。シート照明顕微鏡装置１１０は、観察方向と直交する照明方向から観察物体Ｓに照射した光シートの集光位置が照明方向に移動することにより形成される第１の照明光量分布下で、観察物体Ｓの２次元画像を取得する、ように構成されている。

顕微鏡本体１２０は、光源１２１と、照明光学系１２６と、対物レンズ１２７と、結像レンズ１２８と、観察物体移動装置１２９を備えている。照明光学系１２６は、観察物体Ｓに照明方向から光シートを照射する光学系であり、ビームエクスパンダ１２２、シリンドリカルレンズ１２３、屈折力可変素子１２４、集光レンズ１２５を備えている。

光源１２１は、例えば、レーザー光を出射するレーザーである。ビームエクスパンダ１２２は、光源１２１からのレーザー光の光束径を拡大する。シリンドリカルレンズ１２３は、光軸ＡＸに沿った互いに直交する２平面（ｘｙ平面、ｘｚ平面）の一方でのみ屈折力を有するレンズであり、ｘｙ平面で屈折力を有するように配置されている。シリンドリカルレンズ１２３は、集光レンズ１２５の前側焦点面上に、レーザー光を観察方向に伸びる線形状に集光する。

屈折力可変素子１２４は、集光レンズ１２５の前側焦点面又はその近傍に配置された、屈折力を可変することができる光学素子である。高速に集光位置を移動させることができるという点において、例えば、レンズ形状又はレンズ厚を可変することができる液体レンズであることが望ましい。屈折力可変素子１２４は、レーザー光の光束径が小さいｘｙ平面上ではほとんどレーザー光に作用しないが、ｘｚ平面上では屈折力に応じてレーザー光の収斂または発散状態を変更する。シート照明顕微鏡システム１００では、屈折力可変素子１２４の屈折力を変更することで光シートの集光位置が変化するため、屈折力可変素子１２４は、光シートの集光位置を照明方向に移動する集光位置縦移動装置である。なお、図６Ａには、屈折力可変素子１２４の屈折力を第１の屈折力、第２の屈折力、第３の屈折力に変更したときに生じる３つの光束（実線、鎖線、長鎖線）がそれぞれ異なる位置に集光する様子が描かれている。屈折力可変素子１２４の屈折力は、光シートの集光位置が視野内を横断するように、例えば、振動的に変化する。集光レンズ１２５は、屈折力可変素子１２４を通過したレーザー光を、観察方向に薄い光シートに変換して、観察物体Ｓに照射する。

対物レンズ１２７は、浸液ＩＭの屈折率に適合した長作動距離タイプの液浸対物レンズであり、対物レンズ１２７と結像レンズ１２８は、観察物体Ｓの像を撮像装置１３０に投影する観察光学系を構成する。照明光学系１２６と観察光学系は、照明光学系１２６の光軸ＡＸと観察光学系の光軸ＡＺが直交し、観察光学系の前側焦点面と光シートが形成される照明領域とが一致するように、配置される。

観察物体移動装置１２９は、ステージ１２９ｓとステージ駆動装置１２９ｄを備える。ステージ駆動装置１２９ｄは、例えば、ステッピングモータ、圧電素子などを備える。観察物体移動装置１２９は、ステージ１２９ｓを観察方向（ｚ軸方向）に動かすことで、ステージ１２９ｓに置かれた観察物体Ｓを観察方向に移動する。

撮像装置１３０は、例えば、ＣＣＤイメージセンサである撮像素子１３１を有するＣＣＤカメラである。撮像装置１３０は、光シートの集光位置が観察光学系の視野を横断するのに十分な時間、観察物体Ｓからの蛍光を受光して、観察物体Ｓの２次元画像の画像信号をコンピュータ１４０に出力する。また、撮像装置１３０は、コンピュータ１４０の指示に従って観察物体移動装置１２９が観察物体Ｓを一定の間隔で観察方向に移動させる毎に観察物体Ｓの２次元画像を取得することで、観察物体Ｓの高さが異なる複数の状態で取得した複数の２次元画像の画像データをコンピュータ１４０へ出力する。なお、観察物体移動装置１２９は、観察物体Ｓの高さをある高さに設定した状態で光シートの集光位置を移動させることで形成される照明光量分布（第１の照明光量分布）がｚ軸方向に広がっている領域を画像化対象領域とすると、その画像化対象領域全体が画像化されるように、観察物体Ｓを移動させることが望ましい。

コンピュータ１４０は、プロセッサ１４１と記憶装置１４２を備えている。コンピュータ１４０は、複数の２次元画像から構築される観察物体Ｓの３次元画像の画像データに対して、シート照明顕微鏡装置１１０の光学伝達特性に応じて、空間周波数フィルタ処理を行う画像処理装置である。コンピュータ１４０は、プロセッサ１４１が記憶装置１４２に格納されているプログラムを実行することで、図２に示す画像信号取得部４１、３次元画像構築部４２、空間周波数フィルタ処理部４３として機能する。

図７Ａは、シート照明顕微鏡システム１００で行われる処理の流れを示すフローチャートである。図７Ｂは、図７Ａに示す２次元画像取得処理の流れを示すフローチャートであり、図７Ｃは、図７Ａに示すフィルタ処理の流れを示すフローチャートである。以下、図７Ａから図７Ｃを参照しながら、シート照明顕微鏡システム１００で行われる処理について具体的に説明する。

シート照明顕微鏡システム１００は、まず、各種パラメータを設定する（ステップＳ１０）。ここでは、コンピュータ１４０が、利用者から入力された情報に基づいて、空間周波数フィルタの算出に必要なパラメータを設定する。例えば、対物レンズ１２７の開口数（ＮＡ）、光源１２１からのレーザー光の波長、観察物体Ｓの屈折率、撮像素子１３１の画素サイズなどが設定される。

次に、シート照明顕微鏡システム１００は、フーリエフィルタを設定する（ステップＳ２０）。ここでは、コンピュータ１４０は、ステップＳ１０で設定された情報からシート照明顕微鏡装置１１０の光学伝達特性を算出し、算出した光学伝達特性に基づいてフーリエフィルタを算出して設定する。具体的には、シート照明顕微鏡装置１０の第１の光学伝達特性と第２の光学伝達特性とに基づいてフーリエフィルタを算出してもよい。また、コンピュータ１４０は、ステップＳ１０で設定された情報に基づいて、予め記憶装置１４２の設けられたデータベースを検索し、検索の結果、抽出されたフーリエフィルタを設定してもよい。

その後、シート照明顕微鏡システム１００は、観察物体Ｓの位置を初期化し（ステップＳ３０）、観察物体Ｓの高さを所定の高さ範囲内で移動させて、観察物体Ｓの２次元画像の取得を繰り返す（ステップＳ４０からステップＳ６０）。

２次元画像取得処理では（ステップＳ４０）、観察方向と直交する照明方向から観察物体Ｓに照射した光シートの集光位置が照明方向に移動することにより形成される第１の照明光量分布下で、シート照明顕微鏡装置１１０が観察物体Ｓの２次元画像を取得する。より具体的には、シート照明顕微鏡システム１００は、集光位置の走査を開始し（ステップＳ４１）、照明光（レーザー光）の照射を開始し（ステップＳ４２）、観察物体Ｓを撮像する（ステップＳ４３）。ここでは、コンピュータ１４０は、例えば、光源１２１からのレーザー光の発光を開始させ、屈折力可変素子１２４の屈折力を連続的に変化させる。これらの処理に同期して、撮像装置１３０は露光制御を開始し、光シートの集光位置が所定の速度で視野内を横断している期間、画像信号をコンピュータ１４０へ出力する。

集光位置が視野を横断し終わると、シート照明顕微鏡システム１００は、照明光（レーザー光）の照射を終了し（ステップＳ４４）、集光位置の走査を終了して（ステップＳ４５）、２次元画像取得処理を終了する。

シート照明顕微鏡システム１００は、２次元画像取得処理が終了すると、予定した２次元画像の取得が全て完了したか否かを判断する（ステップＳ５０）。完了していない場合には、観察物体移動装置１２９が観察物体Ｓの高さを所定距離だけ変更する（ステップＳ６０）。これは、観察物体Ｓを基準とした光シートの集光位置を観察方向に移動すると言い換えることができる。その後、シート照明顕微鏡装置１１０が再度２次元画像を取得する（ステップＳ４０）。

２次元画像の取得が全て完了すると、シート照明顕微鏡システム１００は、３次元画像を構築する（ステップＳ７０）。ここでは、コンピュータ１４０が、撮像装置１３０が出力した複数の２次元画像から３次元画像を構築する。その後、シート照明顕微鏡システム１００は、ステップＳ７０で構築された三次元画像の画像データに対してフィルタ処理を行う（ステップＳ８０）。ここでは、まず、コンピュータ１４０がステップＳ７０で構築された３次元画像の画像データをフーリエ変換する（ステップＳ８１）。そして、変換後の画像データに対してステップＳ２０で設定したフーリエフィルタを用いてフーリエフィルタ処理を行う（ステップＳ８２）。このフーリエフィルタ処理は、シート照明顕微鏡装置１１０の光学伝達特性に応じて、３次元画像が有する空間周波数特性を変更する空間周波数フィルタ処理である。最後に、コンピュータ１４０は逆フーリエ変換を行って（ステップＳ８３）、３次元画像を再生し、フィルタ処理を終了する。

フィルタ処理が終了すると、シート照明顕微鏡システム１００は、フィルタ処理によってｚ分解能が改善された観察物体Ｓの画像データを記憶装置１４２に格納して（ステップＳ９０）、一連の処理を終了する。

本実施例に係るシート照明顕微鏡システム１００では、撮像装置１３０の露光期間中に光シートの集光位置を照明方向に移動させることで、広い視野を少ない画像取得枚数で観察することができる。また、コンピュータ１４０がシート照明顕微鏡装置１１０の光学伝達特性に基づいて観察物体Ｓの３次元画像の画像データに対して空間周波数フィルタ処理を行うことで、光シートの照明領域全体にわたって高いｚ分解能を有する画像を得ることができる。従って、シート照明顕微鏡システム１００によれば、１光子励起蛍光観察において高いｚ解像力で広い視野を少ない取得画像枚数で観察することができる。また、コンピュータ１４０によれば、シート照明顕微鏡装置１１０で取得された画像の分解能を改善することができる。

また、シート照明顕微鏡システム１００では、取得画像枚数を少なく抑えることができるため、観察物体Ｓの画像を取得する時間を短縮することできる。これにより、照明時間も短縮されるため、観察物体Ｓに与えるダメージを抑えることができる。従って、蛍光物質の褪色の進みを遅らせ、且つ、光毒性による影響を低減することができる。

なお、シート照明顕微鏡システム１００では、フーリエフィルタを用いた空間周波数フィルタ処理を行う例を示したが、コンボリューションフィルタを用いた空間周波数フィルタ処理が行われてもよい。

また、ステップＳ８２のフーリエフィルタ処理では、照明光量分布が実質的に均質なｘｙ平面方向については、計算効率を向上させるためにフィルタを共通化してもよい。また、ｘｙ平面を複数の領域に分割して、各領域について照明状態に応じたフィルタを用いてもよい。
［実施例２］

図８Ａ及び図８Ｂは、本実施例に係るシート照明顕微鏡システム２００の構成を示した図であり、図８Ａはｘｚ断面図であり、図８Ｂはｘｙ断面図である。なお、ｘ軸方向、ｙ軸方向、ｚ軸方向の定義は、図１Ａと同様である。

シート照明顕微鏡システム２００は、シート照明顕微鏡装置１１０の代わりにシート照明顕微鏡装置２１０を備える点が、シート照明顕微鏡システム１００とは異なっている。また、シート照明顕微鏡装置２１０は、顕微鏡本体１２０の代わりに顕微鏡本体２２０を備える点が、シート照明顕微鏡装置１１０とは異なっている。さらに、顕微鏡本体２２０は、照明光学系１２６の代わりに照明光学系２２３を備える点が、顕微鏡本体１２０とは異なっている。

照明光学系２２３は、集光レンズ１２５の前側焦点面またはその近傍に偏向素子２２１を備える点、及び、集光レンズ１２５の近傍に、第２のシリンドリカルレンズとしてシリンドリカルレンズ２２２を備える点が、照明光学系１２６とは異なっている。

偏向素子２２１は、光シートを偏向する偏向装置である。偏向素子２２１は、光シートで観察物体Ｓをｙ軸方向に走査するための装置であり、高速な走査を実現するため、例えば、ガルバノミラーやＡＯＭ（Acoust Optic Modulator）などであることが望ましい。また、光シートの照明光軸の方向を維持するため、偏向素子２２１は、集光レンズ１２５の前側焦点面又はその近傍に配置することが望ましい。なお、図８Ｂには、偏向素子２２１によってｙ軸方向への偏向状態が第１の偏向状態、第２の偏向状態、第３の偏向状態に変化したときに生じる３つの光束（実線、鎖線、長鎖線）が描かれている。

シリンドリカルレンズ２２２は、観察物体Ｓ中における光シートの状態をｘｙ平面内において収斂状態又は発散状態に変換するレンズである。シリンドリカルレンズ２２２は、シリンドリカルレンズ１２３と同様に、ｘｙ平面で屈折力を有するように配置されている。

本実施例に係るシート照明顕微鏡システム２００でも、シート照明顕微鏡システム１００と同様に、１光子励起蛍光観察において高いｚ解像力で広い視野を少ない取得画像枚数で観察することができる。また、偏向素子２２１を備えることで、露光期間中にｙ軸方向により広い照明領域を形成することができる。このため、シート照明顕微鏡システム１００よりも少ない取得画像枚数で広い視野を観察することができる。さらに、光シートを観察方向と直交する方向から照射するシート照明では、観察物体Ｓ中に、光が散乱又は吸収される部分や周辺と屈折率が異なる部分（例えば、泡など）が存在すると、その後方に影ができてしまうことがある。シート照明顕微鏡システム２００では、シリンドリカルレンズ２２２を備えることで、光シートが観察物体Ｓ中でｙ軸方向に収斂又は発散している。このため、光シートをｙ軸方向に移動させる走査を行うことで、泡などの遮光物の後方にも光を導くことができる。従って、シート照明顕微鏡システム２００によれば、シート照明で生じる影を抑制し、目立たなくすることができる。
［実施例３］

図９Ａ及び図９Ｂは、本実施例に係るシート照明顕微鏡システム３００の構成を示した図であり、図９Ａはｘｚ断面図であり、図９Ｂはｘｙ断面図である。なお、ｘ軸方向、ｙ軸方向、ｚ軸方向の定義は、図１Ａと同様である。

シート照明顕微鏡システム３００は、シート照明顕微鏡装置２１０の代わりにシート照明顕微鏡装置３１０を備える点が、シート照明顕微鏡システム２００とは異なっている。また、シート照明顕微鏡装置３１０は、顕微鏡本体２２０の代わりに顕微鏡本体３２０を備える点が、シート照明顕微鏡装置２１０とは異なっている。さらに、顕微鏡本体３２０は、対物レンズ１２７の代わりに対物レンズ３２１を備える点、及び、浸液ＩＭが利用されない点、偏向素子２２１がｙ軸方向に加えてｚ軸方向にも光シートを偏向する点が、顕微鏡本体２２０とは異なっている。

対物レンズ３２１は、長作動距離タイプの乾燥対物レンズであり、対物レンズ３２１と結像レンズ１２８は、観察物体Ｓの像を撮像装置１３０に投影する観察光学系を構成する。

乾燥系対物レンズ（対物レンズ３２１）を備えるシート照明顕微鏡システム１００では、観察物体移動装置１２９で観察物体Ｓを観察方向に移動すると、空気と観察物体Ｓの屈折率差の影響により焦点面が上下する。このため、焦点面と光シートの位置関係も変化してしまう。そこで、シート照明顕微鏡システム３００では、焦点面と光シートの位置関係を維持するため、観察物体Ｓの移動により焦点面が観察方向に移動した距離に合わせて偏向素子２２１が光シートを偏向して観察方向にシフトさせる。このため、偏向素子２２１は、２軸タイプの偏向素子であることが望ましい。なお、図９Ａには、偏向素子２２１によるｚ軸方向への偏向状態が第１の偏向状態、第２の偏向状態、第３の偏向状態に変化したときに生じる３つの光束（実線、鎖線、長鎖線）が描かれている。屈折力可変素子１２４の屈折力により異なる集光位置に集光する様子については省略されている。

図１０は、シート照明顕微鏡システム３００で行われる処理の流れを示すフローチャートである。シート照明顕微鏡システム３００で行われる処理は、ステップＳ３５とステップＳ６５を含む点が、図７Ａに示すシート照明顕微鏡システム１００で行われる処理と異なっている。

シート照明顕微鏡システム３００は、２次元画像取得処理（ステップＳ４０）を開始する前に、照明光軸の高さを初期化する（ステップＳ３５）。ここでは、偏向素子２２１の偏向状態が初期化される。

さらに、シート照明顕微鏡システム３００は、ステップＳ６０で観察物体移動装置１２９が観察物体Ｓの高さを所定距離だけ変更した後に、照明光軸の高さを修正する（ステップＳ６５）。ここでは、偏向素子２２１が、焦点面が観察方向に移動した距離に合わせて光シートを観察方向に偏向する。なお、照明光軸の高さを修正する処理は、観察物体Ｓの移動の前に行われてもよい。

本実施例に係るシート照明顕微鏡システム３００によっても、シート照明顕微鏡システム２００と同様に、１光子励起蛍光観察において高いｚ解像力で広い視野を少ない取得画像枚数で観察することができる。また、シート照明顕微鏡システム１００よりも少ない取得画像枚数で広い視野を観察すること、シート照明で生じる影を抑制し目立たなくすること、ができることについても、シート照明顕微鏡システム２００と同様である。

上述した実施形態及び実施例は、発明の理解を容易にするために具体例を示したものであり、本発明はこれらの実施形態及び実施例に限定されるものではない。シート照明顕微鏡システム、画像処理装置、シート照明顕微鏡法、及び、プログラムは、特許請求の範囲により規定される本発明の思想を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。この明細書で説明される個別の実施例の文脈におけるいくつかの特徴を組み合わせて単一の実施例としてもよい。例えば、実施例２及び実施例３では、偏向素子２２１及びシリンドリカルレンズ２２２を備えるシート照明顕微鏡システムが例示されているが、これらのいずれかのみを備えてもよい。

１、１００、２００、３００ シート照明顕微鏡システム
２ 画像信号
１０、１１０、２１０、３１０ シート照明顕微鏡装置
２０、１２０、２２０、３２０ 顕微鏡本体
２１、１２１ 光源
２２ 集光位置縦移動装置
２３ 集光光学系
２４、１２６、２２３ 照明光学系
２５ 観察光学系
２６、１２９ 観察物体移動装置
３０、１３０ 撮像装置
３１、１３１ 撮像素子
３２ 撮像面
４０ 計算装置
４１ 画像信号取得部
４２ ３次元画像構築部
４３ 空間周波数フィルタ処理部
１２２ ビームエクスパンダ
１２３、２２２ シリンドリカルレンズ
１２４ 屈折力可変素子
１２５ 集光レンズ
１２７、３２１ 対物レンズ
１２８ 結像レンズ
１２９ｓ ステージ
１２９ｄ ステージ駆動装置
１４０ コンピュータ
１４１ プロセッサ
１４２ 記憶装置
２２１ 偏向素子
ＡＸ、ＡＺ 光軸
Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３ 集光位置
Ｈ 容器
ＩＭ 浸液
Ｓ 観察物体

Claims (17)

1. 観察方向と直交する照明方向から観察物体に照射した光シートの集光位置が前記照明方向に移動することにより形成される第１の照明光量分布下で前記観察物体の２次元画像を取得する顕微鏡装置と、
   前記顕微鏡装置で取得された複数の２次元画像から構築される前記観察物体の３次元画像の画像データに対して、前記顕微鏡装置の光学伝達特性に応じて、前記３次元画像が有する空間周波数特性を変更する空間周波数フィルタ処理を行う画像処理装置と、を備える
   ことを特徴とするシート照明顕微鏡システム。
2. 請求項１に記載のシート照明顕微鏡システムにおいて、
   前記画像処理装置は、前記第１の照明光量分布下における前記顕微鏡装置の第１の光学伝達特性と、前記光シートの集光位置が一定の位置に維持されることにより形成される第２の照明光量分布下における前記顕微鏡装置の第２の光学伝達特性とに基づいて、前記３次元画像の画像データに対して、前記空間周波数フィルタを行う
   ことを特徴とするシート照明顕微鏡システム。
3. 請求項２に記載のシート照明顕微鏡システムにおいて、
   前記画像処理装置は、前記第１の光学伝達特性と前記第２の光学伝達特性との比に基づいて、前記３次元画像の画像データに対して、前記空間周波数フィルタ処理を行う
   ことを特徴とするシート照明顕微鏡システム。
4. 請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載のシート照明顕微鏡システムにおいて、
   前記空間周波数フィルタ処理は、前記３次元画像の画像データに対する空間周波数領域におけるフーリエフィルタ処理である
   ことを特徴とするシート照明顕微鏡システム。
5. 請求項４に記載のシート照明顕微鏡システムにおいて、
   前記フーリエフィルタ処理は、前記顕微鏡装置の光学伝達特性に基づいて算出された第１のフーリエフィルタに前記３次元画像の画像データに含まれる所定の空間周波数を越える空間周波数成分の強度を抑えるためのアポダイゼーションを適用して得られる第２のフーリエフィルタを用いる
   ことを特徴とするシート照明顕微鏡システム。
6. 請求項４に記載のシート照明顕微鏡システムにおいて、
   前記フーリエフィルタ処理は、前記顕微鏡装置の光学伝達特性に基づいて算出された第１のフーリエフィルタに等方性を向上させるための球形のマスクを適用して得られる第２のフーリエフィルタを用いる
   ことを特徴とするシート照明顕微鏡システム。
7. 請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載のシート照明顕微鏡システムにおいて、
   前記空間周波数フィルタ処理は、前記３次元画像の画像データに対する空間領域におけるコンボリューションフィルタ処理である
   ことを特徴とするシート照明顕微鏡システム。
8. 請求項７に記載のシート照明顕微鏡システムにおいて、
   前記コンボリューションフィルタ処理は、観察方向と平行な１次元のコンボリューション核を用いる
   ことを特徴とするシート照明顕微鏡システム。
9. 請求項１に記載のシート照明顕微鏡システムにおいて、
   前記顕微鏡装置は、
   前記観察物体の２次元画像を取得する撮像装置と、
   前記撮像装置上に前記観察物体の画像を投影する観察光学系と、
   前記観察物体に前記照明方向から前記光シートを照射する照明光学系と、を備え、
   前記照明光学系は、前記光シートの集光位置を前記照明方向に移動する集光位置縦移動装置を備える
   ことを特徴とするシート照明顕微鏡システム。
10. 請求項９に記載のシート照明顕微鏡システムにおいて、
    前記顕微鏡装置は、さらに、前記観察物体を前記観察方向に移動する観察物体移動装置を備える
    ことを特徴とするシート照明顕微鏡システム。
11. 請求項９に記載のシート照明顕微鏡システムにおいて、
    前記照明光学系は、さらに、前記光シートを偏向する偏向装置を備える
    ことを特徴とするシート照明顕微鏡システム。
12. 観察方向と直交する照明方向から観察物体に照射した光シートの集光位置が前記照明方向に移動することにより形成される第１の照明光量分布下で顕微鏡装置が取得した前記観察物体の複数の２次元画像から構成される前記観察物体の３次元画像の画像データに対して、前記顕微鏡装置の光学伝達特性に応じて、前記３次元画像が有する空間周波数特性を変更する空間周波数フィルタ処理を行う空間周波数フィルタ処理部を備える
    ことを特徴とする画像処理装置。
13. 請求項１２に記載の画像処理装置において、
    前記空間周波数フィルタ処理部は、前記第１の照明光量分布下における前記顕微鏡装置の第１の光学伝達特性と、前記光シートの集光位置が一定の位置に維持されることにより形成される第２の照明光量分布下における前記顕微鏡装置の第２の光学伝達特性とに基づいて、前記３次元画像の画像データに対して、前記空間周波数フィルタ処理を行う
    ことを特徴とする画像処理装置。
14. 観察方向と直交する照明方向から観察物体に照射した光シートの集光位置が前記照明方向に移動することにより形成される第１の照明光量分布下で前記観察物体の２次元画像を顕微鏡装置で取得し、
    前記観察物体を基準とした前記光シートの集光位置を前記観察方向へ移動し、
    前記２次元画像の取得と前記観察方向への移動を繰り返して得られる複数の２次元画像から構築される前記観察物体の３次元画像の画像データを構築し、
    前記３次元画像の画像データに対して、前記顕微鏡装置の光学伝達特性に応じて、前記３次元画像が有する空間周波数特性を変更する空間周波数フィルタ処理を行う
    ことを特徴とするシート照明顕微鏡法。
15. 請求項１４に記載のシート照明顕微鏡法において、
    前記空間周波数フィルタ処理は、前記第１の照明光量分布下における前記顕微鏡装置の第１の光学伝達特性と、前記光シートの集光位置が一定の位置に維持されることにより形成される第２の照明光量分布下における前記顕微鏡装置の第２の光学伝達特性とに基づいて、前記３次元画像の画像データが有する空間周波数特性を変更する処理である
    ことを特徴とするシート照明顕微鏡法。
16. 観察方向と直交する照明方向から観察物体に照射した光シートの集光位置が前記照明方向に移動することにより形成される第１の照明光量分布下で顕微鏡装置が取得した前記観察物体の複数の２次元画像から構成される前記観察物体の３次元画像の画像データに対して、前記顕微鏡装置の光学伝達特性に応じて、前記３次元画像が有する空間周波数特性を変更する空間周波数フィルタ処理を行う
    処理を画像処理装置に実行させることを特徴とするプログラム。
17. 請求項１６に記載のプログラムにおいて、
    前記空間周波数フィルタ処理は、前記第１の照明光量分布下における前記顕微鏡装置の第１の光学伝達特性と、前記光シートの集光位置が一定の位置に維持されることにより形成される第２の照明光量分布下における前記顕微鏡装置の第２の光学伝達特性とに基づいて、前記３次元画像の画像データが有する空間周波数特性を変更する処理である
    ことを特徴とするプログラム。