JP2006221190A - 共焦点走査型顕微鏡システム - Google Patents

Abstract

【課題】５０ｎｍレベルの高い空間分解能を備える共焦点走査型顕微鏡システムを提供する。
【解決手段】共焦点走査型顕微鏡システムは、スポット光を照射した観測試料から発する光の２次元光強度分布を２次元光検出器により受光し、各光照射領域毎の２次元光強度分布に基づいて、点像分布関数を種関数とする逆演算により再構成した２次元光強度分布を前記スポット光の各照射位置に対応させて位置をずらしながら重ねて平均化し全観察領域の２次元光強度分布を構成して観測画像を形成する。高い空間分解能が得られ、５０ｎｍレベルの高い空間分解能を有する共焦点走査型顕微鏡システムが提供される。
【選択図】 図１

Description

本発明は、高い空間分解能を有する共焦点走査型顕微鏡システムに関する。

走査型光学顕微鏡は、検体試料の形態や大きさを観察・計測するための汎用的な装置として古くから用いられており、特に、半導体試料や生物試料といった高い分解能やコントラストでの観察が求められる場合には、空間分解能２００ｎｍ程度の共焦点レーザ走査型顕微鏡が広く用いられている。

図７は、従来の共焦点レーザ走査型顕微鏡システムの構成例を説明するための図で、この共焦点レーザ走査型顕微鏡システムは、一般的な走査型光学顕微鏡に用いられる構成の光学系７００とデータ処理系７２０とから構成され、試料ステージ７０１上に観察試料７０２を載置し、光源であるレーザ７０７から射出された光をレンズ７０８、７０９で集光した後にピンホール７１０で所望のスポット径とし、レンズ７１１により平行ビームを形成した後にハーフミラー７１３で下側に光路変換させ、対物レンズ７０３により収束して観察試料７０２上に光照射する。

この光照射により観察試料７０２から発せられる蛍光等は、対物レンズ７０３、ハーフミラー７１３、及び、レンズ７０４によって集光され、ピンホール７０５を通過した後に光検出器である光電子増倍管７０６により光強度が検出される。なお、この光学系７００は試料ステージ７０１をＸＹ平面内で移動可能とするための図示しない駆動機構を備えており、試料ステージ７０１のＸＹ面内での駆動を行ないながら観察を実行することで２次元マッピングデータを得ることが可能となる。

光電子増倍管７０６によって検出された光強度データは、コンピュータを備えるデータ処理系７２０に送られて各観察点毎の蛍光強度値（ｇ_ｘ，ｙ）として逐次記録され、所定の観察領域の２次元マッピングに対応する観測データ行列Ｒ_ｇが形成される。そして、全ての観察点での蛍光強度値のデータ取りこみが終了した時点で観測蛍光強度を表示画面上に表示させ、観測データ行列Ｒ_ｇを表示画像データ行列Ｒ_ｉとして画像を形成することで観察試料７０２の２次元像を再生させている。

なお、試料ステージ７０１をＸＹ面内で移動させることにより２次元マッピングを得る上述の方法に変えて、照射光の光路中にスポット光走査装置７１２を設けることとし、このスポット光走査装置７１２の駆動をデータ処理系７２０から送信される観測点信号と同期させることにより観察試料７０２上の光照射点を変化させて２次元マッピングを得ることとしてもよい。

また、例えば、特許文献１では、輪帯マスクによる回折による分解能の低下を回避することで輪帯状照明による超解像効果を確実に発揮させることが可能な顕微鏡の発明も開示されている。

更に、近年のバイオテクノロジ研究のための高分解能光学顕微鏡開発への要請等に応えるためとして、観察試料の四方から光を照射するようにしてメッシュ状の定在照射光（ｓａｔｎｄｉｎｇ ｗａｖｅ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）を観察試料上に形成し、試料から得られる蛍光イメージを画像処理することにより１００ｎｍの分解能を実現したＨＥＬＭ（ｈａｒｍｏｎｉｃ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｌｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）がＦｒｏｈｎらによって報告されている（非特許文献１）。
特開２００１−９１８４７号公報 ＰＮＡＳ，７２３２−７２３６，Ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．１３（２０００）

しかしながら、従来の構成の共焦点レーザ走査型顕微鏡では、光が照射された試料領域から発せられる信号光の積分強度のみを観察試料からの情報として捉えて画像処理を実行しているために、その空間分解能は試料上に照射される光のスポットサイズによって決定されることとなり、顕微鏡としての空間分解能の向上には自ずと限界があるという問題があった。

また、上述のＨＥＬＭは、メッシュ状の定在照射光を形成するために特殊で複雑な光学系を採用しており、顕微鏡本体が高価となることに加えて僅かな振動や試料（及び試料ホルダ）のドリフトが空間分解能に大きく影響を与えることとなる結果、汎用的な使用の際には簡便性・安定性の点で不充分であるという問題もあった。

本発明は、このような問題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、５０ｎｍレベルの高い空間分解能を有する共焦点走査型顕微鏡システムを提供することにある。

このような目的を達成するため、本発明は、第１の態様として、本発明による共焦点走査型顕微鏡システムは、光源から射出された光をスポット光にして観察試料に照射して該観察試料から発する光を２次元光強度分布として受光する光学系と、受光した光の２次元光強度分布を観察試料画像に画像形成するデータ処理系とで構成された共焦点走査型顕微鏡システムであって、前記光学系は、光源から射出された光をスポット光にして観察試料を２次元的に走査して照射するスポット光走査手段と、前記スポット光を照射した観察領域から発する光を２次元光強度分布として受光する２次元光検出部からの信号により前記スポット光の照射位置の情報と対応づけた２次元光強度分布の２次元画像情報を取得する２次元光検出手段とを備え、前記データ処理系は、前記２次元光検出手段で取得した２次元光強度分布の２次元画像情報を前記観察試料上のスポット光の各照射位置に対応させて記憶する記憶手段と、前記２次元光強度分布の２次元画像情報に基づいて点像分布関数を種関数とする逆演算により再構成した２次元光強度分布を前記スポット光の各照射位置に対応させて位置をずらしながら重ねて平均化し全観察領域の２次元光強度分布を構成する演算手段と、前記演算手段により構成された全観察領域の光強度分布を画像として表示する表示手段とを備えることを特徴とする。

また、第２の態様として、本発明による共焦点走査型顕微鏡システムにおいて、前記演算手段は、前記２次元光検出手段で得た光照射領域毎の２次元光強度分布の各２次元画像情報に点像分布関数によるウイナーインバースフィルタを掛けるデータ処理を行い、信号光強度を補正して２次元光強度分布を再構成することを特徴とする。

また、第３の態様として、本発明による共焦点走査型顕微鏡システムにおいて、前記２次元光検出手段の画素間隔は、該光学系により定まる点像分布関数の遮断空間周波数よりも小さく設定されていることを特徴とする。

また、第４の態様として、本発明による共焦点走査型顕微鏡システムにおいては、前記光学系の光路中に輪帯絞りを備えることを特徴とする。

また、第５の態様として、本発明による共焦点走査型顕微鏡システムにおいて、前記光学系は共焦点光学系であって、前記２次元光検出手段が観察試料の実像面と共役な位置に設けられていることを特徴とする。

また、第６の態様として、本発明による共焦点走査型顕微鏡システムにおいて、前記光学系はパルスレーザを光源として備え、観察試料に含まれる蛍光分子の２光子励起が可能であることを特徴とする。

以上、説明したように、本発明の共焦点走査型顕微鏡システムによれば、スポット光を照射した観測試料から発する光の２次元光強度分布を２次元光検出器により受光し、各光照射領域毎の２次元光強度分布に基づいて、点像分布関数を種関数とする逆演算により再構成した２次元光強度分布を前記スポット光の各照射位置に対応させて位置をずらしながら重ねて平均化し全観察領域の２次元光強度分布を構成して観測画像を形成するので、高い空間分解能が得られ、５０ｎｍレベルの高い空間分解能を有する共焦点走査型顕微鏡システムを提供することができる。

以下に、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。

（システム構成）
図１は、本発明の共焦点走査型顕微鏡システムの構成を説明するための図で、この共焦点走査型顕微鏡システムは、一般的な走査型光学顕微鏡に用いられる構成の光学系１００とデータ処理系１２０とから構成され、試料ステージ１０１上に観察試料１０２を載置し、光源であるレーザ１０６から射出された光をレンズ１０７、１０８で集光した後にピンホール１０９で所望のスポット径とし、レンズ１１０により平行ビームを形成した後にハーフミラー１１２で下側に光路変換させ、対物レンズ１０３により収束して観察試料１０２上に光照射する。なお、用いる光源としては特に制約はないが、通常のレーザ光源の他、数百フェムト秒以下のパルス幅のレーザや、高圧水銀灯やキセノンアークランプ等の各種の高輝度光源であってもよい。

この光照射により観察試料１０２から発せられる蛍光等は、対物レンズ１０３、ハーフミラー１１２、及び、レンズ１０４によって集光されてＣＣＤ等の２次元光検出器１０５により光強度の２次元的分布が検出される。すなわち、図７で示した従来の共焦点レーザ走査型顕微鏡では、観察試料からの光信号のうちの光強度のみを光検出器（光電子増倍管７０６）でモニタしているのに対して、本発明の共焦点走査型顕微鏡システムでは、２次元光検出器１０５により、観察試料上の光スポットサイズに対応する空間的広がりをもったＸＹ平面内での光強度分布がモニタされることとなる。なお、２次元光検出器１０５としては、ＣＣＤの他、フォトダイオードアレイや２次元光電子増倍管等であってもよい。また、後述する理由により、本発明の共焦点走査型顕微鏡システムの光学系では、２次元光検出器１０５の光入射口側にはピンホールを設けずに観察試料１０２からの空間的広がりを有する信号光の全てを２次元光検出器１０５に入射させる構成としている。

光学系１００は試料ステージ１０１をＸＹ平面内で移動可能とするための図示しない駆動機構を備えており、試料ステージ１０１のＸＹ面内での駆動を行ないながら観察を実行することで２次元マッピングデータを得ることが可能となる。なお、試料ステージ１０１をＸＹ面内で移動させることにより２次元マッピングを得る上述の方法に変えて、照射光の光路中にスポット光走査装置１１１を設けることとし、このスポット光走査装置１１１の駆動をデータ処理系１２０から送信される観測点信号と同期させることにより観察試料１０２上の光照射点を変化させて２次元マッピングを得ることとしてもよい。

このようなスポット光の走査方法としては、ピエゾ素子を駆動機構として用いたステージを利用したり、照射光の光路に挿入したガルバノミラーを駆動させたり、或いは、光路中に配置させたミラーをピエゾ素子により駆動させる等の種々の方法が利用可能である。更に、必要に応じて、図１中のレンズ１０７とレンズ１０８の間等の適当な光路位置に輪帯絞りを設けることで空間分解能の最適化を図ることも可能である。

このようにして２次元光検出器１０５によって検出された光強度の空間分布データは、コンピュータを備えるデータ処理系１２０に送られて、各観察点毎の蛍光強度分布ｇ_ｘ，ｙ（ｓ，ｔ）として逐次記録され、所定の観察領域の２次元マッピングに対応する観測画像データ行列Ｒｇが形成される。ここで、蛍光強度分布ｇ_ｘ，ｙ（ｓ，ｔ）は、観測点の座標（ｘ，ｙ）におけるビームスポットに対応する２次元光検出器１０５で検出された観察領域の面内の座標（ｓ，ｔ）の光強度を意味する。全ての観測点での蛍光強度分布データの取りこみが終了した時点で、後述するように、データ解析を実行し、デコンボリューション後の回復画像データ行列Ｒ_ｆに基づいて、試料全体の回復画像を再構成して表示画像データ行列Ｒ_ｉを算出して観察試料１０２の２次元像を再生させる。

図１では、反射型の光学系として構成した共焦点走査型顕微鏡システムについて説明したが、図２に示すように、透過型の共焦点走査型顕微鏡システムとして構成してもよい。なお、図２中の光学系の各構成要素には、図１において説明した構成要素と同じ符号を付している。

（光イメージングの原理）
図３は、本発明の共焦点走査型顕微鏡システムで採用する光イメージングの原理を説明するための図であり、図３（ａ）は、照射光スポット領域に２つの物体が距離ｄ_１〜ｄ_３だけ離れて存在する場合にこれらの物体の各々から得られる光信号強度の空間的分布を説明するための図であり、図３（ｂ）は、このようにして生じる光信号を検出して画像として再構成するプロセスを説明するための図である。

図３（ａ）に示す様に、光照射を受けた物体から得られる信号強度は、空間的に広がりをもつ物体の中心に相当する位置に極大をもち両端にかけて振動しながら漸近的に減少し、本来は物体が存在しないはずの領域にも信号強度を有する「すそ」の部分が存在する。そして、２つの物体間隔を図３（ａ_１）〜図３（ａ_３）のようにｄ_１、ｄ_２、ｄ_３と徐々に狭くしてゆくと、これらの光強度の中心間距離は物体間隔に伴って減少すると共に、上述の光信号の「すそ」の部分の重なりが生じ、この重なり部分では物体間隔に依存してその程度が変化する干渉が生じる。

従来の共焦点型走査光学顕微鏡では、１つの照射光スポットに対応させて得られる１つの光強度情報のみを検出していたため、本来は観察物体が存在しないはずの領域に対応する上述の「すそ」領域の光強度も物体からの光信号として検知されることとなり、これにより顕微鏡像の輪郭の「ぼけ」が生じると共に、顕微鏡の空間分解能を向上させるために重要な情報を含んでいるはずの光信号の「すそ」の重なり部分の干渉の程度は何ら解析の対象とされていなかった。

本発明の共焦点走査型顕微鏡システムでは、光信号の「すそ」の重なり部分の干渉の程度を解析の対象として取り扱うこととし、そのため、本発明の共焦点走査型顕微鏡システムの光学系では、図１により説明したように、２次元光検出器１０５の光入射口側にはピンホールを設けずに、観察試料から発する空間的広がりを有する信号光の全てを２次元光検出器に入射させる構成とされ、その信号光の解析は以下の手順で進められる。

すなわち、試料に光照射がなされると（図３（ｂ_１））、試料から得られる光学顕微鏡の観測画像ｇ（ｘ，ｙ）は、ノイズが無視できる条件下では、点像分布関数ｈ（ｘ，ｙ）とよばれる装置関数が真の試料画像ｆ（ｘ，ｙ）に畳み込み積分（コンボリューション）されたものとして与えられ、観測画像ｇ（ｘ，ｙ）は（式１）で与えられる（図３（ｂ_２））。

従って、点像分布関数ｈ（ｘ，ｙ）を種関数として観測画像ｇ（ｘ，ｙ）に対して逆演算（デコンボリューション）を行なう（図３（ｂ_３））ことにより真の試料画像ｆ（ｘ，ｙ）を推定する（図３（ｂ_４））ことができ、空間分解能（解像度）を向上させることが可能である。ここで、境界条件が不明確であるとデコンボリューション演算の実行により誤差を生じさせる結果となるため、本発明の共焦点走査型顕微鏡システムでは、境界条件の明確化のためにスポット光を照明光として試料の限られた範囲を照射することとしている。

（データ処理の具体的内容）
以下に、本発明の共焦点走査型顕微鏡システムにおける光イメージのデータ処理方法について説明する。

（１．観測画像データの取り込み）
レーザ光が空間的広がりをもつビームスポットとして観察試料に照射されると、光照射位置（ｘ，ｙ）における観察試料からの蛍光や反射光又は透過光（光学系の構成により異なる）が、画素数σ・τ（横 σ画素、縦 τ画素）の２次元光検出器で検出されて画像データｇ_ｘ，ｙ（ｓ，ｔ）（但し、１≦ｓ≦σ、１≦ｔ≦τ）として記録される。これに続いて、スポット光の照射位置をｘ方向に一定の微小距離だけ移動させて次の観測画像データｇ_{ｘ＋１，ｙ}（ｓ，ｔ）を記録する。ここで、ステップサイズ（試料送り）を、スポットサイズと同等以下（数分の１程度）の微小距離とすることにより解像度が向上する。

この手順をＮ回（但し、Ｎ＝（横方向ξ回）×（縦方向ψ回））繰り返して実行することで目的とする観察試料の全面を走査し、（式２）で表記される観測画像データ行列Ｒ_ｇ（ξ・ψの行列）を得る。

（但し、１≦ｘ≦ξ、１≦ｙ≦ψ、１≦ｓ≦σ、１≦ｔ≦τ）
このようにして得られる観測画像データ行列Ｒ_ｇに対してコンピュータを用いた画像処理を実行する。

（２．回復画像データ行列の算出）
観測画像データ行列Ｒ_ｇに含まれる各画像データｇ_ｘ，ｙ（ｓ，ｔ）に対して、点像分布関数を種関数としたデコンボリューションを実行し、真値が回復された回復画像データｆ_ｘ，ｙ（ｓ，ｔ）を算出し、（式３）に示す観測画像データ行列Ｒ_ｇに対応する回復画像データ行列Ｒ_ｆを求める。

（但し、１≦ｘ≦ξ、１≦ｙ≦ψ、１≦ｓ≦σ、１≦ｔ≦τ）

この方法によれば、画像データｇ_ｘ，ｙ（ｓ，ｔ）から回復画像データｆ_ｘ，ｙ（ｓ，ｔ）をデコンボリューション演算で算出する際にスポット光の照射範囲を境界条件として正確に与えることができるために誤差の少ない演算が可能となる。ここで、上述のデコンボリューションはフーリエ面又は実像面のいずれかで実行し、そのアルゴリズムの例としては、観測画像データｇ（ｘ，ｙ）をフーリエ変換Ｇ（ｕ，ｖ）し、これを点像分布関数ｈ（ｘ，ｙ）のフーリエ変換Ｈ（ｕ，ｖ）で割ることで逆変換する方法、ウイナーインバースフィルタＷ（ｕ，ｖ）を用いる方法、ハリスの方法、及び、非線形最適化法等が挙げられる。

これらのデコンボリューションアルゴリズムのうち、観測画像データｇ（ｘ，ｙ）をフーリエ変換Ｇ（ｕ，ｖ）し、これを点像分布関数ｈ（ｘ，ｙ）のフーリエ変換Ｈ（ｕ，ｖ）で割ることで逆変換する方法では、畳み込み定理によりＦ（ｕ，ｖ）（＝Ｇ（ｕ，ｖ）／Ｈ（ｕ，ｖ））を求め、このＦ（ｕ，ｖ）を逆フーリエ変換することで、回復画像データｆ（ｘ，ｙ）を求める。この方法では、Ｈ（ｕ，ｖ）がゼロに近い値をとるときには、Ｆ（ｕ，ｖ）が非常に大きな値となるため、Ｇ（ｕ，ｖ）がノイズを含む場合にはそのノイズが増幅されて満足な回復画像データｆ（ｘ，ｙ）を得ることが難しいという難点がある。

ウイナーインバースフィルタＷ（ｕ，ｖ）を用いる方法では、フィルタ関数は（式４）で与えられる。

ここで、Ｈ^ｔ（ｕ，ｖ）はＨ（ｕ，ｖ）の転置行列、ｃは信号と雑音のパワースペクトル比である。

そして、このＷ（ｕ，ｖ）を基に、Ｆ（ｕ，ｖ）＝Ｇ（ｕ，ｖ）・Ｗ（ｕ，ｖ）によりＦ（ｕ，ｖ）を求め、このＦ（ｕ，ｖ）を逆フーリエ変換することで回復画像データｆ（ｘ，ｙ）を求める。

本発明の共焦点走査型顕微鏡システムの光学系では、試料にスポット光を照射するために観測される画像の範囲がスポット光の照射領域内に限定される。従って、ハリスの超過像法における物体の広がりに対する制約条件が満足され、ハリスの方法によるデコンボリューションが可能である。ハリスの超解像法は、観測画像を計測系の遮断周波数より細かくサンプリングし、シンク関数で内挿した後に逆行列計算を行なって帯域を広げ、この処理により光学系によって劣化した高周波成分が回復可能となって分解能が向上する。

非線形最適化法を用いるデコンボリューションでは、真の輝度値と点像分布関数を畳み込んだ値と測定値の二乗誤差が最小となるように真の輝度値を反復しながら修正する。一般的に、画像の輝度情報は負値となることがないため、これを制約条件として最急降下法あるいは共役勾配法などの最適化手法を用いて真の輝度値を求める。この方法によれば、ノイズによる解の発散が生じないため最も適切な輝度値を求めることができるという大きなメリットがある。

（３．回復画像の再構成）
このようにして得られた回復画像データ行列Ｒ_ｆに含まれる各回復画像データｆ_ｘ，ｙ（ｓ，ｔ）を用いて、（式５）で表記される試料全体の回復画像Ｒ_ｉを再構成する。

（但し、１≦ｍ≦μ、１≦ｎ≦ν、ｉ_ｍ，ｎは回復画像Ｒ_ｉの座標（ｍ，ｎ）に対応する２次元光検出器の画素の輝度値）

回復画像データ行列Ｒｆから試料の全体の回復画像Ｒｉを再構成する方法としては、例えば、回復画像データ行列Ｒｆに含まれる各回復画像データｆ_ｘ，ｙ（ｓ，ｔ）の中央の値を用いる方法と、回復画像データｆ_ｘ，ｙ（ｓ，ｔ）をｘ方向とｙ方向の走査ステップに相当する画素数（Δσ、Δτ）ずつずらして重ねて平均化することにより試料全体の回復画像Ｒ_ｉを得る方法が挙げられる。

このうち、回復画像データ行列Ｒｆに含まれる各回復画像データｆ_ｘ，ｙ（ｓ，ｔ）の中央の値を用いる方法によれば、先ず、回復画像データ行列Ｒ_ｆにおいて、ξ＝μ、ψ?＝ν、ｘ＝ｍ、ｙ＝ｎとおき、回復画像データ行列Ｒ_ｆに含まれる各回復画像データｆ_ｍ，ｎ（ｓ，ｔ）の中央部の画素の輝度値を（式６）のようにｉ_ｍ，ｎとして与える。

このｉ_ｍ，ｎを用いて（式７）のように試料全体の回復画像Ｒ_ｉを得る。

一方、回復画像データｆ_ｘ，ｙ（ｓ，ｔ）をｘ方向とｙ方向の走査ステップに相当する画素数（Δσ、Δτ）ずつずらして重ねて平均化することで試料全体の回復画像Ｒ_ｉを得る方法によれば、試料全体の回復画像Ｒ_ｉは（式８）で定義される。

（但し、１≦m≦μ、１≦n≦ν、ｉ_ｍ，ｎは試料全体の回復画像Ｒ_ｉの座標（ｍ，ｎ）に位置する画素の輝度値）
ここで、試料全体の回復画像Ｒ_ｉの画素数（μ（横方向），ν（縦方向））は、各々、μ＝Δσ・（ξ−１）＋σ、及び、ν＝Δτ・（ψ−１）＋τで与えられる。但し、Δσは横方向の１回の走査ステップに相当する画素数、ξは横方向の走査回数、σは各回復画像データｆ_ｘ，ｙ（ｓ，ｔ）の横方向の画素数、Δτは縦方向の１回の走査ステップに相当する画素数、ψは縦方向の走査回数、そして、τは各回復画像データｆ_ｘ，ｙ（ｓ，ｔ）の縦方向の画素数）である。

以下に、回復画像Ｒ_ｉの座標（ｍ，ｎ）に対応する２次元光検出器の画素の輝度値であるｉ_ｍ，ｎを求めるための具体的な演算手順を、σ／Δσ＝Ｎｓ及びτ／Δτ＝Ｎｔが整数で、かつ、Δσ及びΔτも共に整数（但し、σ及びτは各回復画像データｆ_ｘ，ｙ（ｓ，ｔ）の横及び縦の画素数）の場合を例にして説明する。

先ず、図１に示したように、走査時のステップサイズに相当する画素数（横方向Δσ、縦方向Δτ）ずつずらしながら回復画像を重ねて並べる。このとき、回復画像データｆ_ｘ，ｙ（ｓ，ｔ）を基準にして横方向にＮｓ枚重ねる場合には、例えばｆ_ｘ，ｙ（ｓ，ｔ）の他のＮｓ枚の画像との平均値は（式９）のようになり、

これと同様の方法で、縦方向についてもＮｔ枚の画像を走査ステップサイズずつずらして重ねた場合の平均を考慮に入れると、全体としては（式１０）が得られる。

このようにして、試料全体の回復画像Ｒｉの各座標における輝度値は（式１１）で与えられ、

Ｎｓ≦ｍ≦μ−Ｎｓ、かつ、Ｎｔ≦ｎ≦ν−Ｎｔでは、

（但し、roundup(a/b)はa/bの商を切り上げで求め、mod(a/b)はa/bの剰余を求めることを意味する）となる。

更に、（式１２）をエッジ部分も含めた全ての画像の領域（１≦ｍ≦μ、かつ、１≦ｎ≦ν）で成り立つように拡張すると、（式１３）が得られる。

（但し、min(a,b,c)はa,b,cのうちの最小値を求め、１≦ｓ＜μ、1≦ｔ≦ν、１≦ｘ≦ξかつ１≦ｙ≦ψ以外ではｆ_ｘ，ｙ（ｓ，ｔ）＝０である）

（実施例）
以下に、本発明の共焦点走査型顕微鏡システムの実施例について説明する。

（実施例１）
図４〜６は、本発明の共焦点走査型顕微鏡システムを用いて得られる観測画像の様子を説明するためにコンピュータシミュレーションを用いて得られた図であり、図４は、試料画像から観測画像が得られるまでの各演算過程における画像を説明するための図であり、図５は、試料画像、観測画像、及び、復元画像の各々を比較するための図であり、図６は、観測画像と復元画像の分解能の比較を説明するための図である。

図４には、試料画像（ａ）、試料画像を乗算して得られる画像（ｂ）、点像分布関数（ＰＳＦ）の畳み込み演算を行なって得られる画像（ｃ）、及び、畳み込み画像を加算して得られる観測画像（ｄ）と、スポット光強度分布像（ｅ）、点像分布関数（ＰＳＦ）（ｆ）、及び、ノイズ成分の像（ｇ）が示されており、併せて、これらの各々の画像から得られる信号強度のラインプロファイルも示されている。

図４（ａ）の試料画像は、観察している試料の本来の画像であり、ここでは、２つの方形の点が所定の距離だけ離隔されて配置されている。この試料画像にスポット光の強度分布（図４（ｅ））を掛けることで試料からの蛍光（又は散乱光）強度分布である図４（ｂ）が得られる。

これに、図４（ｆ）に示すＰＳＦで畳み込み演算を実行して図４（ｃ）の畳み込み画像が得られる。この畳み込み画像から分るように、ＰＳＦを畳み込むことにより観察試料である点の周囲にボケが生じ、本来分離しているはずの２つの点の一部が重なり会う。更に、観測画像（図４（ｄ））では、ノイズ成分が重畳されるために画像全体が鈍ることとなる。

図５には、試料画像（図５（ａ））、観測画像（図５（ｂ））、及び、復元画像（図５（ｃ））と、これらの画像に対応する信号強度のラインプロファイルが示されている。なお、この復元画像は、共役勾配法を用いて復元された画像である。図５（ｂ）に示すように、観測画像では、ノイズ成分を多く含む鈍い像となっていることに加え、本来分離している２つの方形の点の像が融合しているのに対して、復元画像では、これらの点が完全に分離され、試料画像に極めて近い像として再現されており、その信号強度分布も本来の分布に近いものとなっている。

図６は、観測試料である２点間の間隔を変化させた場合の、観測画像と復元画像の分解能の比較を実行した結果を説明するための図で、この比較は、図６（ａ）に示すように、各点に対応する位置での信号強度（輝度）Ｐと、２点間の中心に対応する位置の信号強度（輝度）Ｖとの比（試料像再現比率＝Ｖ／Ｐ）を求めている。従って、復元画像において完全に試料画像が復元されていれば、観察試料が存在しない位置での輝度Ｖはゼロとなり、試料像再現比率もゼロとなる。このようにして定義される試料像再現比率を、ノイズが０．１％（図６（ｂ））、１．０％（図６（ｃ））、１０．％（図６（ｄ））の各々の条件下でシミュレーションを実行している。

この結果から分るように、何れのノイズ条件においても試料間隔が１００ｎｍの場合に試料像再現比率がゼロとなっており、この間隔以上の試料間隔であれば完全に試料画像の復元が可能となる。また、復元画像から、２つの点が分離して認識可能な限界である分解能は、０．８以下の試料像再現比率を与える試料間隔で定義され、約４０ｎｍの分解能であると結論される。これに対して、観測画像の分解能は、約９０ｎｍと判断されるから、２倍以上の分解能の向上が実現されていることとなる。

実際の計測では、上述したシミュレーション結果にあたる画像が各試料走査ごとに得られることとなるが、試料走査ステップを充分に精細に設定してこれら画像の積算を行なうことでノイズの低減を図ることが可能であり、空間分解能は更に向上することとなる。

（実施例２）
以下に、２光子励起の共焦点顕微鏡をベースとする本発明の共焦点走査型顕微鏡システムでの光イメージのデータ処理手順について説明する。

光源として１００フェムト秒程度のパルス幅をもつ赤外パルスレーザを使用し、レーザ光を倍率１００の対物レンズで直径２００ｎｍ程度のスポット光にして集光して試料上に照射した。

この光照射により観察試料中の蛍光分子が励起されて蛍光が生じ、これを倍率１０倍のコレクタレンズを介して、単一画素サイズが６．７μｍ×６．７μｍの正方画素からなる２次元光検出器（冷却ＣＣＤ）で検出した。このような光学系では、ＣＣＤ上での蛍光のスポットサイズは直径２００μｍ程度となり、ＣＣＤ上での光スポットは約３０画素×３０画素の範囲に投影されることとなる。このため、６４画素×６４画素の範囲の蛍光輝度を１６ビット精度で記録した。

ここで、スポット光により励起された蛍光分子の蛍光画像行列ｇ_ｘ，ｙ（ｓ，ｔ）を（式１４）のように定義する。

但し、行列の各要素は各画素の輝度値を意味しており、ｓ及びｔは蛍光画像内の画素の座標を意味し、０≦ｓ≦６４、０≦ｔ≦６４である。また、ｘ及びｙはスポット光の照射位置の座標を意味する。

冷却ＣＣＤで記録した蛍光画像行列ｇｘ，ｙ（ｓ，ｔ）は、コンピュータを介してハードディスクに保存した。２次元マッピングのために、５０ｎｍのステップサイズで試料上のスポット光を順次移動させて約５μｍ四方の範囲をスキャンした。その結果、取りこみ画像としては１００枚×１００枚（計１万枚）をハードディスクに記録し、これらの画像を基に観測画像データ行列Ｒ_ｇを（式１５）のように求める。

但し、０≦ｘ≦１００、０≦ｙ≦１００で、（ｘ，ｙ）はスポット光の試料上での照射位置の座標である。
このようにして求めた観測画像データ行列Ｒ_ｇの各要素（蛍光画像行列ｇ_ｘ，ｙ（ｓ，ｔ））の１つ１つに対して非線形最適化法によるデコンボリューション演算を実行して回復画像データｆ_ｘ，ｙ（ｓ，ｔ）を算出し、回復画像データ行列Ｒ_ｆを（式１６）のように算出する。

最後に、この回復画像データ行列Ｒ_ｆを元に試料全体の回復画像Ｒ_ｉを算出する。具体的には、回復画像データ行列の各要素である回復画像データｆ_ｘ，ｙ（ｓ，ｔ）をステップサイズに相当する画素数だけずらして平均を求めることで試料の回復画像Ｒ_ｉを再構成した。なお、この場合の理論上の最小ステップサイズは２次元光検出器の画素の大きさと光学的拡大倍率とで決まり、本実施例の場合には６．７ｎｍ程度となる。

（実施例３）
以下に、透過型の共焦点顕微鏡をベースとする本発明の共焦点走査型顕微鏡システムでの光イメージのデータ処理手順について説明する。

光源から射出された光を、ピンホール及びコンデンサレンズを介して直径２００ｎｍ程度の光スポットとして集光し試料上に照射した。この光スポットに対応する試料からの透過光を対物レンズ及びコレクタレンズを介して画素サイズ６μｍの正方画素を備えるＣＣＤ上に投影した。なお、ＣＣＤ上でのスポットサイズは約２００μｍであり、これは約３４画素×３４画素に相当する。このため、６４×６４画素の範囲を（式１７）のような観測画像行列ｇ_ｘ，ｙ（ｓ，ｔ）として記録した。

但し、行列の各要素は各画素の輝度値を意味し、この場合は透過光の強度値である。また、ｓ及びｔは画素の座標を意味し（０≦ｓ≦６４、０≦ｔ≦６４）、（ｘ，ｙ）は試料上のスポット光照射位置の座標を意味する。

ＣＣＤから読み出された観測画像行列ｇ_ｘ，ｙ（ｓ，ｔ）は専用ＣＰＵへと送られて、観測画像から回復画像を算出するためのデコンボルーション演算と、算出された回復画像を基にした試料全体の回復画像Ｒ_ｉの座標（ｘ，ｙ）における輝度値Ｉ_ｘ，ｙの算出が実行される。なお、Ｉ_ｘ，ｙは、回復画像データｆ_ｘ，ｙ（ｓ，ｔ）の中央部の値を用いてＩ_ｘ，ｙ＝ｆ_ｘ，ｙ（３２，３２）で算出し、このＩ_ｘ，ｙの値をハードディスク上に記録し、光スポットのスキャニングを実行させた。

試料上のスポット光のスキャンは、ｘ及びｙ方向に１〜５ｎｍの精度で駆動させることが可能なピエゾコントローラを備える試料ステージを用い、ステップサイズ１０ｎｍで５μｍ四方の領域をスキャンした。従って、ｘ方向５００点×ｙ方向５００点（計２５００００点）での観測画像が得られ、これを基に回復画像の輝度値を求めて試料全体の回復画像Ｒｉを再構成した。なお、本実施例でヤコビ法による画像再構成を行った場合の理論的な空間分解能は５０ｎｍ程度となる。

本発明の反射型の共焦点走査型顕微鏡システムの構成を説明するための図である。 本発明の透過型の共焦点走査型顕微鏡システムの構成を説明するための図である。 本発明の共焦点走査型顕微鏡システムで採用する光イメージングの原理を説明するための図で、（ａ）は照射光スポット領域に２つの物体が距離ｄ１〜ｄ３だけ離れて存在する場合にこれらの物体の各々から得られる光信号強度の空間的分布を説明するための図であり、（ｂ）は光信号を検出して画像として再構成するプロセスを説明するための図である。 試料画像から観測画像が得られるまでの各演算過程における画像を説明するための図である。 試料画像、観測画像、及び、復元画像の各々を比較するための図である。 観測画像と復元画像の分解能の比較を説明するための図である。 従来の共焦点レーザ走査型顕微鏡システムの構成例を説明するための図である。

符号の説明

１００ 光学系
１０１ 試料ステージ
１０２ 観察試料
１０３ 対物レンズ
１０４、１０７、１０８、１１０ レンズ
１０５ ２次元光検出器
１０６ レーザ
１０９ ピンホール
１１１ スポット光走査装置
１１２ ハーフミラー
１２０ データ処理系

Claims (6)

1. 光源から射出された光をスポット光にして観察試料に照射して該観察試料から発する光を２次元光強度分布として受光する光学系と、受光した光の２次元光強度分布を観察試料画像に画像形成するデータ処理系とで構成された共焦点走査型顕微鏡システムであって、
   前記光学系は、
   光源から射出された光をスポット光にして観察試料を２次元的に走査して照射するスポット光走査手段と、
   前記スポット光を照射した観察領域から発する光を２次元光強度分布として受光する２次元光検出部からの信号により前記スポット光の照射位置の情報と対応づけた２次元光強度分布の２次元画像情報を取得する２次元光検出手段と
   を備え、
   前記データ処理系は、
   前記２次元光検出手段で取得した２次元光強度分布の２次元画像情報を前記観察試料上のスポット光の各照射位置に対応させて記憶する記憶手段と、
   前記２次元光強度分布の２次元画像情報に基づいて点像分布関数を種関数とする逆演算により再構成した２次元光強度分布を前記スポット光の各照射位置に対応させて位置をずらしながら重ねて平均化し全観察領域の２次元光強度分布を構成する演算手段と、
   前記演算手段により構成された全観察領域の光強度分布を画像として表示する表示手段とを備える
   ことを特徴とする共焦点走査型顕微鏡システム。
2. 前記演算手段は、前記２次元光検出手段で得た光照射領域毎の２次元光強度分布の各２次元画像情報に点像分布関数によるウイナーインバースフィルタを掛けるデータ処理を行い、信号光強度を補正して２次元光強度分布を再構成することを特徴とする請求項１に記載の共焦点走査型顕微鏡システム。
3. 前記２次元光検出手段の画素間隔は、該光学系により定まる点像分布関数の遮断空間周波数よりも小さく設定されていることを特徴とする請求項１又は２に記載の共焦点走査型顕微鏡システム。
4. 前記光学系の光路中に輪帯絞りを備えることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の共焦点走査型顕微鏡システム。
5. 前記光学系は共焦点光学系であって、前記２次元光検出手段が観察試料の実像面と共役な位置に設けられていることを特徴とする請求項１乃至４いずれかに記載の共焦点走査型顕微鏡システム。
6. 前記光学系はパルスレーザを光源として備え、観察試料に含まれる蛍光分子の２光子励起が可能であることを特徴とする請求項５に記載の共焦点走査型顕微鏡システム。

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