JP2015007809A - 分解能の向上した顕微鏡法および顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】照明された試料を検出する際の顕微鏡の分解能を向上させる方法、およびこの方法を実施するための顕微鏡を提供すること。
【解決手段】本方法では、第１の位置において、照明パターン（Ｉ）が、好ましくはほぼ顕微鏡の達成可能な光学的分解能程度またはそれ以上の分解能で試料（Ｐ）上に形成され、検出と照明パターン（Ｉ）との間で少なくとも１回、顕微鏡の分解能限界より小さいステップで、有利には照明方向に対して垂直に、照明パターンの第１の位置から少なくとも１つの第２の位置への相対的変位が試料上で行われ、第１の位置でも第２の位置でも検出および検出信号の記憶が行われる。
【選択図】図１

Description

本発明は、分解能の向上した顕微鏡法および顕微鏡に関し、特に、照明された試料を検出する際の顕微鏡の分解能を向上させる方法、およびこの方法を実施するための顕微鏡に関する。

生物試料を検査するための光学顕微鏡の古典的適用分野は、蛍光顕微鏡である。ここでは特定の色素（いわゆる燐光体または蛍光体）が、試料、例えば細胞部分を特異的にマーキングするために使用される。試料は、述べたように励起放射である照明放射により照明され、これによって励起されたルミネセンス放射が適切な検出器によって検出される。通例そのために顕微鏡には、ダイクロイックビームスプリッタがブロックフィルタと組み合わせて設けられており、これらはルミネセンス放射を励起放射から分離し、別個に観察することを可能にする。この措置によって、異なって着色された個別の細胞部分を顕微鏡で表示することが可能になる。もちろん試料の複数の部分を、試料の種々の構造に特異的に堆積する複数の異なる色素により同時に着色することもできる。この方法を、多重ルミネセンスと称する。それ自体が発光する試料、すなわち色素添加なしで発光する試料を測定することもできる。

ここでルミネセンスとは、一般的には燐光および蛍光に対する上位概念として理解され、したがって両方の過程を含む。ここで蛍光について述べるとしても、それは代表として示したものであり、限定的に理解すべきではない。

試料検査のために、レーザ走査顕微鏡（ＬＳＭと略称もされる）を使用することも知られている。このレーザ走査顕微鏡は、３次元照明された像から、共焦点検出機構（この場合、共焦点ＬＳＭと呼ぶ）により、または非線形の試料相互作用（いわゆる多光子顕微鏡）により、対物レンズの焦点面にある平面だけを結像する。光学的切片が得られ、複数の光学的切片を試料の種々異なる深さで記録することにより、続いて適切なデータ処理装置を用いて、種々異なる光学的切片から統合された試料の３次元像を生成することができる。したがってレーザ走査顕微鏡は、厚い試料の検査に適する。

もちろん蛍光顕微鏡とレーザ走査顕微鏡を組み合わせて使用することもでき、この場合はルミネセンス試料がＬＳＭによって深さの種々異なる平面に結像される。
特許文献１には、「オーバーサンプリング」により分解能を向上させる試みが記載されている。これによっては顕微鏡の回折限界より低い格別に改善された分解能は得られない。

基本的に光学顕微鏡の光学的分解能は、またＬＳＭの光学的分解能も、物理的法則により回折制限されている。この限界内で最適の分解能を達成するために、特別の照明構造、例えば４Ｐｉ構成（４Ｐｉ−Ａｎｏｒｄｎｕｎｇ）または定在波場を有する構成が公知である。これによりとりわけ軸方向の分解能が、古典的なＬＳＭに比べて格段に改善される。非線形の間引き法によって、分解能を回折制限された共焦点ＬＳＭに比べ最大１０倍に向上させることができる。このような方法は、例えば特許文献２に記載されている。間引き法に対しては種々のアプローチが公知であり、例えば特許文献３、特許文献４または特許文献５に記載されている。

別の高分解能の顕微鏡法が特許文献６に記載されており、ここでは周期的構造を備える対象物が走査される。
分解能を向上させるための別の類似の方法が、特許文献７に記載されている。そこでは構造化された照明によって、非線形のプロセスが利用される。ここで非線形性として前記刊行物は、蛍光の飽和を挙げている。この方法は、構造化された照明によって、光学システムの伝達関数に対する対象空間スペクトルの変位を実現することを要求する。具体的には、スペクトル変位とは、対象物空間周波数Ｖ０が空間周波数Ｖ０−Ｖｍにおいて伝達されることを意味し、Ｖｍは構造化された照明の周波数である。システムにより伝達可能な最大空間周波数が与えられると、これにより、変位周波数Ｖｍだけ伝達関数の最大周波数より高い対象物の空間周波数の転移が可能になる。このアプローチは、像形成のための再構築アルゴリズムと、１つの像に対して複数の記録の使用を必要とする。この方法においても、必要とされる構造化された照明が試料ボリューム全体を通過するので、試料が検出焦点の外の領域で不要に放射の負荷を受けることが欠点とみなされる。その他、この方法は現在の所、厚い試料には使用することができない。なぜなら、焦点外で励起された蛍光がバックグランド信号としてともに検出器に達し、したがって検出される放射のダイナミックレンジを劇的に低下させるからである。

レーザ走査顕微鏡とは無関係に、回折限界を超える分解能を達成する方法が、特許文献８および特許文献９から公知である。このＰＡＬＭ（Ｐｈｏｔｏ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｌｉｇｈｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：光活性化光学顕微鏡）と略称される方法は、光活性信号によって活性化することのできるマーキング物質を使用する。活性化状態でだけ、マーキング物質は、所定の蛍光放射を放出するために励起放射によって励起することができる。マーキング物質の非活性化分子は、励起放射の照射後も蛍光放射を放出しないか、または少なくとも目立った蛍光放射を放出しない。したがって活性化放射は、マーキング物質を蛍光発光のために励起可能な状態に切り替える。別の活性化、例えば熱による活性化も可能である。したがってこれを一般的に切替信号と呼ぶ。ＰＡＬＭ法では、少なくともある割合の活性化されたマーキング物質分子が、隣接する活性化分子から、顕微鏡の光学的分解能で測定して分離されるだけ、または後から分離できるだけ離隔されるように、切替信号が印加される。したがって活性化分子は、少なくとも十分に分離される。ルミネセンス放射の記録後、この分離された分子について、その分解能制限に起因する放射分布の中心が求められ、そこから計算で分子の位置が、光学的結像により本来可能なよりも高精度で決定される。回折分布の重心を計算で決定することにより分解能を向上させることを、英語の専門書では「スーパーレゾリューション」とも称している。これには、試料中で活性化マーキング分子の少なくともいくつかが、ルミネセンス放射が検出される際の光学的分解能によって区別可能であること、すなわち分離されていることが必要である。その場合、このような分子について、向上した分解能でその位置を指示することができる。

個々のマーキング分子を分離するために、ＰＡＬＭ法は、マーキング分子が所与の強度の切替信号の受信後、例えば活性化放射の光子の受光後に活性化される確率が、すべての分子について等しいという事実を利用する。したがって、切替信号の強度、すなわち試料の単位面積に当たる光子の数を介して、試料の所与の面積範囲に存在するマーキング分子が活性化する確率を、光学的分解能の範囲内で区別可能なマーキング分子だけが蛍光放射を放出する十分な領域が存在するように、小さくすることができる。切替信号の強度、例えば光子密度を適切に選択することにより、可能な限り光学的分解能に関して分離されているマーキング分子だけが活性化され、続いて蛍光放射を送出することが達成される。次にこの分離された分子について、計算で、回折に起因する強度分布の重心、すなわちマーキング分子の位置がより高い分解能で求められる。試料全体を結像するために、活性化放射の取り込みと、その後の励起および蛍光放射結像により、できるだけすべてのマーキング分子が一度は部分量に含まれ、結像の分解能の範囲内で分離されるまで、部分量のマーキング分子の分離が繰り返される。

その際、ＰＡＬＭ法は、活性化のためにも、励起のためにも高い位置分解能が不要であるという利点を有する。その代わりに、活性化も励起も広視野照明で行うことができる。
結局の所、マーキング分子は、活性化放射の強度を適切に選択することによって統計的に部分量で活性化される。したがって、すべてのマーキング分子の位置が計算により、例えば回折限界を上回る分解能で決定できる、試料の全体像を生成するには、多数の個別像を評価しなければならない。個別像は最高で１００００個になることがある。その結果、大きなデータ量が処理され、それに対応して測定に長時間かかる。全体像を記録するのに既に数分が必要であり、これは実質的に使用するカメラの読み出し速度によって決まる。個別像における分子の位置決定は、例えば非特許文献１に記載されているように、コストのかかる計算手順によって行われる。すべての個別像を処理し、高分解能の全体像、すなわちマーキング分子の位置が回折限界を上回る分解能で示される１つの像に統合するのに、典型的には１〜２時間かかる。

高分解能法についての別の刊行物は、非特許文献２であり、ＳＡＸ（Ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｅｘｉｔａｔｉｏｎ：飽和励起）顕微鏡については、非特許文献３、非特許文献４がある。

従来技術による高分解能法は種々の欠点を有する。ＳＴＥＤ法については、色素が入手可能かどうかと、高いレーザ強度が必要なことである。ＲＥＳＯＬＦＴ／ＧＳＤでは、多数の切り替えサイクルが必要である。ＰＡＬ−Ｍ／ＳＴＯＲＭは、像形成速度が低速である。ＳＡＸでは色素が強く退色する。

米国特許第５０４３５７０号明細書 米国特許第５８６６９１１号明細書 独国特許第４４１６５５８号明細書 米国特許第６６３３４３２号明細書 独国特許出願公開第１０３２５４６０号明細書 米国特許第５８６７６０４号明細書 欧州特許第１１５７２９７号明細書 国際公開第２００６／１２７６９２号パンフレット 独国特許第１０２００６０２１３１７号明細書

イグナーら（Ｅｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．），Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｓ．３２８５−３２９０，Ｂａｎｄ９３，２００７年１１月 ヘル、エス ダブリュ（Ｈｅｌｌ．Ｓ．Ｗ．）、（２００７）："Ｆａｒ−Ｆｉｅｌｄ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｎａｎｏｓｃｏｐｙ"，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１６，１１５３−１１５８ フジタら（Ｆｕｊｉｔａ ｅｔ ａｌ．），Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．，２００７年 ヤマナカら（Ｙａｍａｎａｋａ ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔ．，２００８年

本発明は、独立請求項による顕微鏡の回折限界より低い顕微鏡分解能を達成する方法および装置を記述する。好ましい改善形態は従属請求項の対象である。本発明は、個別の分子からなる試料よりも複雑な試料に対しても高分解能な像を形成する方法を記述する。その際、本発明によれば、グレー分布の空間的変化を利用する。

この方法は、以下の主要な工程からなる。
ａ．達成可能な光学的分解能を上回る精度で、検出用照明（照明パターン）を変位させる。
ｂ．変位中に、照明パターンのそれぞれ特定の変位位置に対応する複数の像を、達成可能な最高の光学的分解能で記録する。
ｃ．個々の記録の検出された信号、例えば蛍光信号から高分解能の像を計算する。
ｄ．非線形励起と対応する蛍光マーカーとを使用することにより、分解能をさらに改善することができる。

本発明の根本思想を示し、２つの蛍光発光する対象物ｆ１、ｆ２を、試料内の例示的試料領域Ｐｒに示す図である。 本発明の可能な１実施形態を示す図である。 照明変調用のグリッドを備える本発明の広視野実施形態を示す図である。 検出の非デスキャン抑制を示す図である。 デスキャンされた結像が平面検出器上で行われる、図２と同様の機構を示す図である。

本発明の根本思想が、レーザ走査顕微鏡の照明スポットにより図１ａ〜ｄに示されている。レーザ走査顕微鏡（ＬＳＭ）の走査野が、適切な手段（テーブルの変位、第２のスキャナ）による変位によって、試料の上をどのように移動されるかが分かる。図２も参照のこと。Ｌ１は、規定の走査ラスタで試料の上を移動される、ＬＳＭの光スポットである。その際、試料の像を生成するために、例えば点光線の個々の位置にそれぞれ検出値が割り当てられる。光学的結像の回折限界のため、個々の走査点は最小間隔（例えば２０ｎｍ）を有する。例として２つの蛍光発光する対象物ｆ１、ｆ２が、試料内の例示的試料領域Ｐｒに示されている。図１ａではｆ１、ｆ２は検出されない。なぜなら走査領域Ｌが、ｆ１、ｆ２の配置された試料領域Ｐｒの外にあるからである。図１ｂでは、（ＬＳＭによって形成される照明ラスタの）走査野が、分解能限界より小さいある量、例えば１０〜２０ｎｍだけ変位されることにより、対象物ｆ１がレーザスポットＬの検出範囲内となり、検出信号を送出する。図１ｃでは、Ｌ１のさらなる変位によって、ｆ２の検出信号が発生する。図１ｄでは、対象物ｆ１、ｆ２がＬにより再び検出されなくなる。図１には、それぞれ照明強度Ｂｉと検出強度Ｄｉの分布も示されている。個々の対象物の信号を信号の展開によって分離／再構築するための計算方法については、後でさらに述べる。照明スポットは、例えばＬＳＭでは、顕微鏡の回折制限された分解能よりも高精度で調整することができるので、照明ラスタを検出に対して相対的に変位させることによって分解能を高めることができる。

図２には、本発明の可能な１実施形態が示されている。この実施形態はレーザ走査顕微鏡からなり、その基本原理は何度も、例えば独国特許第１９７０２７５３号明細書に詳細に記載されている。しかしこの場合、本発明によれば、照明光ＢＬが、第１のスキャナＳＣ１、レンズＬ、偏向ミラーＳＰ１および半透過ミラーＳＰ２を介して、（ＬＳＭのＸ／Ｙスキャナの）第２のスキャナＳＣ２の方向に導かれ、このスキャナから走査光学系ＳＣＯ、チューブレンズＴＬおよび対物レンズＯを介して試料Ｐ上に合焦される。試料光は、帰路では、ＳＣ２、ＳＰ２、フィルタＦ、ピンホール光学系ＰＯおよびピンホールＰＨを介して共焦点検出用の検出器ＤＥに達する。高速のスキャナＳＣ２（ＬＳＭ）を低速のスキャナＳＣ１と組み合わせるのが有利である。

スキャナＳＣ１は、ＬＳＤＭの照明ラスタを、図１に関して既に示したように検出に対して変位させる。スキャナＳＣ１の各ステップで、試料がＳＣ２によりラスタ走査される。これによりガウス形の照明関数（図１）が低速で試料の上を、検出に対して相対的に変位される。変位およびそれぞれの像記録は、例えば１０ｎｍ刻みで行われる。個別位置の数は、達成すべき分解能次第である。走査野を変位させるためのスキャナＳＣ１の代わりに、試料を高精度の試料台によって低速で変位させることもできる。

複数の共焦点検出器を同時に使用し、１つが常に励起によって動作し（標準共焦点）、他の検出器はそれとは独立に共焦点で試料を見るようにするのも特に有利である。その利点は、一方ではすべての蛍光光が利用されることであり、他方ではＳＮ比が改善されることである。ＳＮ比の改善も、同じ照明について複数の測定点が検出されるので、同様に評価に入り込むことができる。図３には、照明変調用のグリッドを備える本発明の広視野実施形態が示されている。グリッドの代わりに、光学的に作用するアナログ光パターンまたは干渉パターンを使用することもできる。試料Ｐは、ライングリッドＧと対物レンズＯを介して、広視野で（図示しない光源により）照明される。照明光と検出光を分離するために、ビームスプリッタＳＴが設けられている。試料光は、フィルタＦ、交換可能なチューブレンズＴＬ、およびＣＣＤ受光器ＤＥを介し、位置分解されて検出される。ライングリッドＧにより照明ラインが試料の上に形成される。グリッドを試料に対して変位させることにより、例えばグリッドを変位させる圧電駆動部ＰＺを用いて、照明ラインによって表されるほぼ定常な走査野が高精度で変位される。その際、変位の大きさは、試料上の個々の照明ラインの間隔より小さい。既知のグリッド変調によって設定される変調照明光線が、グリッド変位により、図１と同様の関係で検出変調され、高分解能の像を計算することができる。図４は、検出の非デスキャン抑制を示す。そこでは、レーザ光が試料上を走査しながら、ダイクロイックミラーＦｄを介して、検出機構の方向に移動される。この検出機構は、ここでは好ましくはダイクロイックミラーＦｄ１の透過経路および反射経路中に２つの検出器ＣＣＤ１とＣＣＤ２を備え、２つの検出器は、例えば異なる波長を検出することができる。ＣＣＤ１とＣＣＤ２からなる機構が、ｚ方向分解能（光軸の方向）を高めるために異なるＺ平面にあることも考えられ、有利である。

走査野と、検出器ＣＣＤ１とＣＣＤ２上の対応する信号とを、上に述べたようにわずかな大きさだけ変位させることによって、本発明により分解能を高めることができる。この変位は、例えば光軸ｚに対して垂直なＸ方向に沿って、検出をわずかだけ変位させることによって行うことができるが、例えば試料の変位によって、または図２に関して説明したように第２のスキャナによって行うこともできる。

図５は、デスキャンされた結像が、ＣＣＤ受光器またはＰＭＴアレイまたはＡＰＤまたはＣＭＯＳアレイのような平面検出器上で行われる、図２と同様の機構を示す。走査顕微鏡のピンホールは、ここでは、特定の検出器ピクセルだけを読み出すことで置き換えることができる。各検出器ユニットは擬似共焦点で検出する。上記別の実施形態で必要な検出のための変位は、ここでは好ましくは隣接する検出器素子（ピクセル）を入れ替えるという意味での「変位」によってシミュレートされる。その際、検出器ピクセルを適切に切り替えることにより、上記の実施形態に対応する検出に対する変位を、直接の機械的運動を生成する必要なしに調整することができる。ピクセルのずれにより、有利には検出野の変位が照明野に作用する。これは、図４のような非デスキャン検出においても必要な変更を加えれば可能であり、有利には例えばさらなる移動、例えば試料の移動の代わりに行われる。分解能向上のための前提は、もちろん（顕微鏡の結像光学系の結像縮尺を考慮して）、検出器の個所における有効ピクセルサイズが、ＰＳＦの半値幅の約数、例えば四分の一にすぎないことである。

図５に関して説明した実施形態５は、まとめると以下の基本的利点を有する。
１．回折制限された点は、側方にすべての空間方向で「変調／構造化」を示すので、ＬＳＭの走査モードを（ｘ方向およびｙ方向で）維持することができ、それでも近似的に等方性の分解能向上を達成することができる。照明を走査する際に、点状の構造化によって、照明は、すべての空間方向で増大し、再び減少する。この方法は、少なくとも３つの空間方向を必要とする構造化された照明と比較すると有利である。したがって、ピンポイントスキャナを使用する別の機構においても速度上の利点が得られる。
２．回折制限されたそれぞれの点は、可能な最高の空間周波数と可能な最強の変調を既に含んでいる。
３．アレイ検出器は、各検出器サブユニット（ピクセル）が共焦点で検出するように構成されている。これにより共焦点のバックグランド抑制の他に、共焦点ＬＳＭを超える側方分解能向上が得られる。
４．アレイ検出器は、検出スポット上の励起の、通常は必要である付加的な走査を平行して読み出す。
垂直（Ｚ）分解能の向上
本発明の高分解能は、同様にして、公知のようにＺスタックで試料を走査する際に、付加的にＺ方向に変位させることによって焦点面と照明面の間に間隔を形成し、そのつどそれを検出することによって、垂直（ｚ）方向にも達成することができる。例えば図２において、Ｚ方向に変位可能なレンズ（チューブレンズＴＬについて概略的にｚ方向の矢印で示されている）を設けて、例えば圧電対物レンズによりＺ方向に調整される焦点を、Ｚスタックの周囲で記録するために、像記録の際に個々のＺ位置の間の中間位置にもってくるようにすることができる。

ラインスキャナの場合、図２および３と同様に試料または走査野を変位させることによって、本発明を実施することもできる。ラインスキャナは、共焦点性を維持しながら格段に高速の像記録により、格別の利点を提供する。ラスタ走査された検出像が試料の上でそれぞれ本発明に従って移動される、パターンを高速に試料の上で移動させるためのさらなる適用例も本発明の範囲内に含まれ、照明に空間光変調器／ＤＭＤを使用することも同様である。

原理を一般化すると、拡がりが回折限界より小さい試料情報を再構築するための以下の方法が得られる。
基本的考察：
各ピクセルにおける強度は以下の形で表わすことができる。

ここでｃ（ｘ）は蛍光体の濃度であり、Ｈは検出の「点広がり関数」であり、Ｉ（ｘ）は位置ｘにおける照明強度であり、これは「走査顕微鏡」の場合、照明の「点広がり関数」を表す。

ピクセル形のカメラ検出器の場合には、積分がリーマン和に移行する。
次に励起スポットまたは励起パターンが、ｘ方向に沿って高精度で試料の上を移動される場合、次の方程式系が得られる。

ただし、ｎは種々の照明調整に対する指標であり、ｊは検出器（カメラ）ピクセルに対する指標である。照明パターンＩは、「点広がり関数」Ｈとしてもよく知られているので、高度に一致する方程式系を、例えば擬似逆行列（「ペンローズ・ムーアの逆行列」）によって解くことは、「ツァイスの非混合（ｕｎｍｉｘｉｎｇ）」アルゴリズムと同様に比較的簡単に可能である。オーバーサンプリングされた領域のＳＮ比は、可能な分解能を制限する。「レーザ走査」顕微鏡はこの点で理想的である。なぜならスポットが本質的に回折限界に達するからである。必要な反復回数が小さくなる。一般的に、変調の深さにたとえられる反復回数は、最善の分解能向上を達成するために、測定ごとに信号対ノイズ比に関して最適化することができる。

分解能向上は、「スキャン」方向でのみ得られることに注意すべきである。構造化照明法と同様に、試料を少なくとも３つの方向でスキャンすることにより、測定データから像情報をより高い分解能で再構築することが可能となる。
数学形式：
一次元像は、次の積分によって与えられる。

ここでＯ（ｘ）は対象物を表し、Ｅ（ｘ）は励起プロフィル（ｐは位相、または種々異なる「スキャン」における励起プロフィルのオフセット）であり、Ｈ（ｘ）は検出の「点広がり関数」（ＰＳＦ）である。
フーリエ空間における測定信号の表現
Ｄ（ｘ，ｐ）をｘ座標に関してまたはｐ座標に関してフーリエ変換することができる。構造化照明
Ｄ（ｘ，ｐ）をｘに関してフーリエ変換すると、次式が得られる。

位置空間における積Ａがフーリエ空間で畳み込まれる。

または

Ｅ^ｆ（ω，ｐ）の離散表現は、フーリエ空間では次のように見える。

したがって最終的に次式が得られる。

励起プロフィルが単純な指数変数として変化する場合、次式が成立する。

次いで、式（１）から次式が得られる。

式（２）は数学的に、構造化された照明のための古典的概念を体現する。ここでＥ^ｆ（ω，ｐ）は検出帯域を規定し、検出ＯＴＦ Ｈ^ｆ（ω）は帯域の重みを設定する。
走査照明
Ｄ（ｘ，ｐ）をｐに関してフーリエ変換すると、次式が得られる。

位置空間における積Ａがフーリエ空間で畳み込まれる。

または

Ｈ^ｆ（ｘ，ω）はフーリエ空間では、周波数成分の離散列として表すことができる。

検出される像の式は次のようになる。

式（１）と比較すると、式（３）では励起と検出が交換されている。

単純な指数励起の場合は

３つの周波数が信号に寄与する。しかし検出−ＯＴＦ Ｈ^ｆ（ｘ，ω）は、周波数の（ほぼ）連続なスペクトルからなるので、ω_ｇの和と、Ｈ^ｆ（ｘ，ω）においてノイズから区別される最高の周波数成分とから得られるすべての周波数が、信号に寄与する。
位置空間（カメラ）：
ＣＣＤピクセルで検出される信号は次のとおりである。

位置ｘ_ｋおよびｘ_ｋ＋Δｘで検出される２つのピクセルを考察する。

再構築すべき対象物Ｏ（ｘ）として、できるだけ均等に分布する点ｈｉ，ｉ＝１，．．．，ｍを考察する。

ここでO（ｘ）はディラック・デルタ関数であり、ａ_ｉは再構築すべき像信号である。所
与のモデルにおいて、「オーバーサンプリング」をｍ／２で量子化することができる。式（４）により、検出されるピクセルＤ（ｘ_ｋ，ｐ）およびＤ（ｘ_ｋ＋Δｘ，ｐ）は下記の形をとる。

さらに、励起プロフィルがコサインであり、ＰＳＦ Ｈ（ｘ）がガウスプロフィルである場合、次式が得られる。

ただし

標準偏差σはσ＝０．２１λ／ＮＡで近似的に記述することができる。ここで、λは放射波長、ＮＡは開口数である。２組の線形代数方程式（５）を、未知数ａ_０およびａ_１について解くことができる。式（５）はさらに励起プロフィルの位相をパラメータとすることに注意すべきである。したがって種々のｐについて、より線形に独立な式を生成することができる。これは方程式セット（５）の情報内容を高め、最終的には分解能の改善された、より正確な再構築をもたらす。この方程式系は最終的に行列の形式で記述することができる。

Ｄ＝ＳＡ
ここで

ｎは走査の回数である。

行列Ｄの要素は測定された値である。すなわちこれらの要素はある程度の誤差ΔＤを有する。
この誤差は解Ａに伝達され、したがってＡにも誤差ΔＡがある。

Ａの誤差は、知られているように、Ｄの誤差と次のように結合される

ここで

は行列Ｓの調整係数であり、｜｜．｜｜は行列のノルムである。

調整係数が大きいほど、系は入力データの誤差に関して耐性が小さくなる。調整係数を推定する可能性は、行列Ｓの特異値を使用することによって得られる。

ここでＳ_ｍａｘ（Ｓ）およびＳ_ｍｉｎ（Ｓ）は、Ｓの最大および最小特異値である。

したがって調整係数は、高分解能情報をどの程度よく再現できるかという尺度である。導き出された式から、分解能の改善が２つのファクタの相互作用に依存していることが明らかである。
１．通常のデコンボリューションと同様にＳ／Ｎ比に依存する。すなわち上記の方程式はノイズのため、場合により、もはや線形で独立なものと認められず、したがって解に寄与することができない。この解は一義性を失う。
２．「照明ｐｆｓ」の傾き。変調が大きいほど、方程式系の解に寄与することのできる線形で独立な情報がより早く得られる。

分解能の改善は、共焦点分解能の少なくとも２倍であるべきである。なぜならこの走査照明の周波数は、構造化された照明と同様に分解能限界を超えて変位するからである。しかし光により対物レンズを通して試料内に結像可能な最高周波数はちょうど回折制限されているので、上と同様に、また構造化された照明の場合とも同様に導き出された係数２が得られる。ただしここでは、構造化された照明の場合のように広視野顕微鏡の分解能ではなく、共焦点分解能が出発点である。

第１の実験は、９０ｎｍ未満の分解能を示した。
変調された照明：
記述の方法（励起を検出に重ねて走査する）は、ＰＳＦが低下するため、励起と検出の重なりが小さい場合には、測定される強度が小さく、したがってＳＮ比も小さいという欠点が検出側にも励起側にもある。例えばレーザ強度がＡＯＴＦより高くなるように照明を変調し、またはレーザを直接変調し、またパルス照明の場合にはパルス速度もしくは高さを適合させ、または照明時間等を適合させることにより照明を変調すると、この効果を完全に除去し、これらデータ点に対するＳＮ比を格段に改善することができる。ここでは制御回路における強度変化または変調を、最適の検出信号を達成するための調整可能な制御量ｇで表すことができる。

とりわけ魅力的なのは、信号雑音比ＳＮＲを過程全体で一定に維持するか、さらには、励起と検出の重なりの小さい領域では、展開（上記の線形方程式系を解くこと）を決定的に改善し、それにより像の分解能を改善するために、ＳＮ比を高めることである。重なりの小さい像点に対する方程式系は、検出される大抵の点が照明されておらず、したがって寄与がゼロであるので小さい。したがって、この強度を正確に測定するほど、少数の未知数しかもたないこの小さな方程式系をうまく解くことができる。一般的に定式化すると、この変調は、ＳＮ比の改善により、線形に独立な測定情報を実際に利用し、ノイズ中で失われないようにすることを可能にする。

この考察から、この技術をＤＩＭ（直接照明顕微鏡またはＣＬＥＭ）と組み合わせると特に有利であることがわかる。なぜならここでは、前もって調整された最適のＳＮ比が、照明の調節によって点ごとに達成できるからである。

さらに、以下の非線形方法との組合せも考えられ、有利である。
１．ＳＴＥＤ／ＲＥＳＯＬＦＴ、なぜならそこではＰＳＦは、２−３倍またはそれ以上に急峻であり、したがって生じる分解能の向上が既にそれで充分だからである。
２．光活性化可能色素の使用、なぜならここでは活性化と蛍光励起のＰＳＦが乗算され、したがって有効ＰＳＦがより急峻になるからである。
３．色素等の飽和など、非線形に構造化された照明に対しても使用できるすべての方法（アール．ハインツマン（Ｒ．Ｈｅｉｎｔｚｍａｎｎ）、ティー．エム．ジョビン（Ｔ．Ｍ．Ｊｏｖｉｎ）およびシー．クレーマー（Ｃ．Ｃｒｅｍｅｒ）、Ｓａｔｕｒａｔｅｄ Ｐａｔｔｅｒｎｅｄ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ−Ａ ｃｏｎｃｅｐｔ
ｆｏｒ ｏｐｔｉｃａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ．Ｊ．Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．Ａ．１９（８）：１５９９−１６０９，２００２）。
４．多光子顕微鏡（欧州特許第５００７１７号明細書）。

本発明の可能で有利な驚くべき実装は、完全性を要求しない。
中間像中における絞りの移動：
この方法は簡単な系においても機能し、そこでは照明側において中間像中で絞りを移動することにより同じ方法を適用することができる。ここでは照明の縁部が照明の重みとして用いられ、展開に利用される。鮮明な縁部を備える広視野照明は、最も広義には照明の構造化である。
−さらに、この方法を（蛍光のない）反射に使用するのが特に有利である。なぜなら通常、ＳＮ比は反射における方が格段に良好だからである（例えば物質顕微鏡におけるスポット走査）。
スピニングディスク
この方法をスピニングディスク構造に使用することも有利である。ここではディスクによってのみ照明され、カメラ上でピンホールなしで検出される。共焦点性は、ソフトウエアおよび／またはカメラ上での像処理（仮想ピンホール）によって行うことができる。ここで検出のための走査および試料における精度は、ディスクの製造に入り込む可能性がある。このことは極めて有利であり、差引計算のエラー源が回避される。
ＳＰＩＭ
ＳＰＩＭ技術は、例えば独国特許出願公開第１０２５７４２３号明細書、国際公開第２００４／０５３０５５８号パンフレットに記載されている。本発明の方法を使用すると、ＳＰＩＭの場合、シート光の走査の際に、軸方向における分解能利得がされる。分解能向上は側方では、例えばシート光の構造化によって行われ、その位相が走査されながら試料中を移動される。ＳＰＩＭのあらゆる典型的な利点に加えて、分解能の向上が得られる。

ＣＡＲＳ，ＳＨＧ，ＲＡＭＡＮ：蛍光および励起の線形性は決してこの方法の前提ではなく、ＣＡＲＳ、第２高調波発生、または誘導ラマン（ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ＲＡＭＡＮ）のような方法についても、同様の利点が得られる。

Ｉ・・・照明パターン、Ｐ・・・試料、ＢＬ・・・照明光、ＤＥ・・・検出器

Claims (13)

1. 照明された試料を検出する際の顕微鏡の分解能を向上させる方法であって、
   第１の位置において、照明パターンが、好ましくはほぼ顕微鏡の達成可能な光学的分解能程度またはそれ以上の分解能で試料上に形成され、
   検出と照明パターンとの間に少なくとも１回、顕微鏡の分解能限界より小さいステップ幅で、有利には照明方向に対して垂直に、照明パターンの第１の位置から少なくとも１つの第２の位置へ、試料上で相対的に変位され、第１の位置でも第２の位置でも検出および検出信号の記憶が行われる、方法。
2. 照明された試料を検出する際の顕微鏡の分解能を向上させる方法であって、
   変調された照明野、好ましくは照明パターン、試料上の少なくとも１つの回折制限された点が形成され、これが試料および検出の少なくとも一方に対して相対的に変位され、該変位のステップ幅が、顕微鏡の分解能限界より小さく、好ましくは分解能限界の半分より小さく、検出信号がそのつど記憶される、方法。
3. 記憶された検出信号の差引計算によって、高分解能の像が形成される、請求項１または２に記載の方法。
4. 相対的変位は、顕微鏡の光軸に対して垂直方向、および光軸方向のうちの少なくとも一つの方向に行われ、顕微鏡の光軸に対して垂直方向の相対的変位は、水平方向分解能を向上させるためのものであり、光軸方向の相対的変位は、垂直方向分解能を向上させるためのものである、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
5. 検出器上の各像点における信号強度Ｄが
   であり、ｃ（ｘ）は蛍光体の濃度分布、Ｈは検出の「点広がり関数」、ｌ（ｘ）はｘに依存する照明強度分布であり、
   ｘはベクトル（ｘ，ｙ）であり、
   励起スポットまたは励起パターンが１つの方向（例えばｘ）に沿って試料の上を移動され、
   照明調整のための位置１，２，．．．．ｎについて、および検出器（カメラ）ピクセルに対する指標ｊについて、それぞれ強度
   が決定され、
   得られる方程式系が、ｃについて少なくとも近似的に解かれる、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
6. 照明パターンが、試料の点状または線状のラスタ走査、および点ラスタまたは線ラスタの形成によって生成される、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
7. 試料の広視野照明が行われ、照明パターンが、グリッド投影、または光分布の投影、または有孔ディスクの投影によって生成される、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
8. 相対的変位は、
   試料の変位、走査野の変位、読み出される検出器エレメントの変位、およびグリッドもしくは照明パターンの変位のうちの少なくとも一つによって行われるものである、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法。
9. 顕微鏡機構を介して試料上に達する照明光と、試料光を検出するための検出ユニットとからなる、特に請求項１乃至８のいずれか一項に記載の顕微鏡であって、
   変調された照明野、好ましくは照明パターン、試料上の少なくとも１つの点を形成するための手段が設けられており、該手段は、照明された試料部分、および検出された試料部分の少なくとも一方との間にそれぞれ間隔を有し、該間隔が好ましくはほぼ顕微鏡の達成可能な光学的分解能程度またはそれを超えており、
   試料および検出の少なくとも一方と照明パターンとの間で、試料の照明パターンの第１の位置から少なくとも１つの第２の位置への相対的変位を形成するための手段が設けられており、該手段は、該間隔よりも小さい大きさの相対的変位を形成し、
   検出ユニット内に、第１の位置および少なくとも第２の位置において検出信号を検出し、記憶するための検出および記憶手段が設けられている、顕微鏡。
10. 好ましくは請求項５記載の方法に従って、記憶された検出信号を差引計算し、高分解能の像を形成するための手段、およびソフトウエアの少なくとも一方が設けられている、請求項９記載の顕微鏡。
11. 照明がラスタ化されたレーザ走査顕微鏡であり、好ましくはスポット走査またはライン走査する、請求項９または１０に記載の顕微鏡。
12. 好ましくはグリッドまたは投影された強度分布またはニポーディスクを介して照明が構造化された広視野顕微鏡である、請求項９乃至１１のいずれか一項に記載の顕微鏡。
13. 前記相対的変位を形成するための手段が、
    試料を変位させるための手段、走査野を変位させるための手段、読み出される検出器エレメントの変位を生成するための手段、およびグリッドまたは照明パターンを変位させるための手段のうちの少なくとも一つである、請求項９乃至１２のいずれか一項に記載の顕微鏡。