DE102013015931A1

DE102013015931A1 - Hochauflösende Scanning-Mikroskopie

Info

Publication number: DE102013015931A1
Application number: DE201310015931
Authority: DE
Inventors: Thomas KALKBRENNER; Ingo Kleppe; Helmut Lippert; Ralf Netz
Original assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Current assignee: Carl Zeiss Microscopy GmbH
Priority date: 2013-09-19
Filing date: 2013-09-19
Publication date: 2015-03-19
Anticipated expiration: 2033-09-20
Also published as: US9470883B2; US20150185454A1; WO2015040127A1; DE102013015931B4

Abstract

Mikroskop zur hochauflösenden Scanning-Mikroskopie einer Probe (2), mit einer Beleuchtungseinrichtung (3) zum Beleuchten der Probe (2), einer Abbildungseinrichtung (4) zum Scannen mindestens eines Punkt- oder Linien-Spots (14) über die Probe (2) und zum Abbilden des Punkt- oder Linien-Spots (14) in ein beugungsbegrenztes, ruhendes Einzelbild (17) unter einem Abbildungsmaßstab in eine Detektionsebene (18), einer Detektoreinrichtung (19) zum Erfassen des Einzelbildes (17) in der Detektionsebene (18) für verschiedene Scanpositionen mit einer Ortauflösung, welche unter Berücksichtigung des Abbildungsmaßstabes in mindestens einer Ausdehnung/Dimension mindestens doppelt so groß ist wie eine Halbwertsbreite des beugungsbegrenzten Einzelbildes (17), einer Auswerteeinrichtung (C) zum Auswerten einer Beugungsstruktur des Einzelbildes (17) für die Scanpositionen aus Daten der Detektoreinrichtung (19) und zum Erzeugen eines Bildes der Probe (17), das eine Auflösung aufweist, die über die Beugungsgrenze gesteigert ist, wobei die Detektoreinrichtung (19) aufweist: ein Detektorarray (24), das Pixel (25) aufweist und größer ist als das Einzelbild (17), und ein nicht-abbildendes Umverteilungselement (20–21; 30–34; 30–35), das dem Detektorarray (24) vorgeordnet ist und die Strahlung aus der Detektionsebene (18) nicht-abbildend auf die Pixel (25) des Detektorarrays (24) verteilt, wobei Amplitude und/oder Phase der durch die Probe beeinflussten Wellenfront durch entsprechende Mittel ortsaufgelöst erfasst wird. Wobei beispielsweise mittels eines Wellenfrontsensors die Beeinflussung der Phase durch die Probe bestimmt wird.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Mikroskop zur hochauflösenden Scanning-Mikroskopie einer Probe, mit einer Beleuchtungseinrichtung zum Beleuchten der Probe, einer Abbildungseinrichtung zum Scannen eines Punkt- oder Linien-Spots über die Probe und zum Abbilden des Punkt- oder Linien-Spots in ein beugungsbegrenztes, ruhendes Einzelbild unter einem Abbildungsmaßstab in eine Detektionsebene, einer Detektoreinrichtung zum Erfassen des Einzelbildes in der Detektionsebene für verschiedene Scanpositionen mit einer Ortauflösung, welche unter Berücksichtigung des Abbildungsmaßstabes mindestens doppelt so groß ist wie eine Halbwertsbreite des beugungsbegrenzten Einzelbildes, einer Auswerteeinrichtung zum Auswerten einer Beugungsstruktur des Einzelbildes für die Scanpositionen aus Daten der Detektoreinrichtung und zum Erzeugen eines Bildes der Probe, das eine Auflösung aufweist, die über die Beugungsgrenze gesteigert ist. Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein Verfahren zur hochauflösenden Scanning-Mikroskopie einer Probe, bei dem die Probe beleuchtet wird, ein scannend über die Probe geführter Punkt- oder Linien-Spot in ein Einzelbild abgebildet wird, wobei der Spot unter einem Abbildungsmaßstab beugungsbegrenzt in das Einzelbild abgebildet wird und das Einzelbild ruhend in einer Detektionsebene liegt, für verschiedene Scanpositionen das Einzelbild mit einer Ortauflösung erfaßt wird, welche unter Berücksichtigung des Abbildungsmaßstabes mindestens doppelt so groß ist wie eine Halbwertsbreite des beugungsbegrenzten Einzelbildes, so daß eine Beugungsstruktur des Einzelbildes erfaßt wird, für jede Scanposition die Beugungsstruktur des Einzelbildes ausgewertet wird und ein Bild der Probe erzeugt wird, das eine Auflösung aufweist, die über die Beugungsgrenze gesteigert ist.
Ein solches Mikroskop bzw. Mikroskopieverfahren ist beispielsweise aus der Veröffentlichung C. Müller und J. Enderlein, Physical Review Letters, 104, 198101 (2010), oder der EP 2317362 A1 bekannt, die auch weitere Nachweise zum Stand der Technik aufführt.
Dieser Ansatz erreicht eine Auflösungserhöhung, indem ein Spot beugungsbegrenzt auf eine Detektionsebene abgebildet wird. Die beugungsbegrenzte Abbildung bildet einen Punkt-Spot als Airy-Scheibe ab. Diese Beugungsscheibe wird in der Detektionsebene so erfaßt, daß ihre Struktur aufgelöst werden kann. Bezogen auf die Abbildungsleistung des Mikroskops erfolgt somit detektorseitig eine Überabtastung. Bei der Abbildung eines Punkt-Spots wird die Form der Airy-Scheibe aufgelöst. Durch geeignete Auswertung der Beugungsstruktur, die in den genannten Schriften geschildert ist und deren Offenbarung diesbezüglich vollumfänglich hier einbezogen sei, erreicht man eine Auflösungssteigerung um den Faktor 2 über die Beugungsgrenze.
Detektionsseitig ist es dabei jedoch unvermeidlich, daß für jeden Punkt, der auf der Probe in dieser Weise abgetastet wird, verglichen mit einem herkömmlichen Laser-Scanning-Mikroskop (nachfolgend auch als LSM abgekürzt) ein Einzelbild mit einem Vielfachen an Bildinformation aufgenommen werden muß. Erfaßt man die Struktur des Einzelbildes des Spots beispielsweise mit 16 Pixeln, hat man pro Spot nicht nur die 16-fache Datenmenge, ein einzelnes Pixel enthält auch im Mittel nur ein 1/16 der Strahlungsintensität, die bei einer üblichen Pinhole-Detektion auf den Detektor eines LSM fallen würde. Da die Strahlungsintensität über die Struktur des Einzelbildes, beispielsweise die Airy-Scheibe, natürlich nicht gleichmäßig verteilt ist, fällt am Rande dieser Struktur tatsächlich sogar noch bedeutend weniger Strahlungsintensität an, als der Mittelwert von 1/n bei n-Pixeln.
Man steht also vor der Aufgabe, detektorseitig Strahlungsmengen hochauflösend erfassen zu können. Herkömmliche CCD-Arrays, die üblicherweise in der Mikroskopie eingesetzt werden, erreichen kein hinreichendes Signal/Rausch-Verhältnis, so daß selbst eine Verlängerung der Bildaufnahmedauer, die per se schon als nachteilig in der Anwendung wäre, nicht weiterhelfen würde. APD-Arrays sind auch mit einem zu hohen Dunkelrauschen behaftet, so daß auch eine Verlängerung der Meßdauer in einem unzureichenden Signal/Rausch-Verhältnis resultieren würde. Gleiches gilt für CMOS-Detektoren, die zudem hinsichtlich der Detektorelementgröße nachteilig sind, da das beugungsbegrenzte Einzelbild des Spots auf zu wenige Pixel fallen würde. Ähnliche Bauraumprobleme bringen PMT-Arrays mit sich; die Pixel sind dort ebenfalls zu groß. Die Bauraumprobleme ruhen insbesondere daher, daß eine Realisierung eines Mikroskops zur Hochauflösung vom Entwicklungsaufwand wie von der Geräteverbreitung nur realisierbar ist, wenn eine Integration in bestehende LSM-Konstruktionen möglich ist. Hier sind jedoch bestimmte Größen des Einzelbildes vorgegeben. Ein flächenmäßig größerer Detektor könnte nur dann eingebracht werden, wenn zusätzlich eine Optik vorgesehen wird, die das Bild noch einmal signifikant, d. h. um mehrere Größenordnungen aufweitet. Eine solche Optik gestaltet sich, will man die beugungsbegrenzte Struktur ohne weitere Abbildungsfehler erhalten, als sehr aufwendig.
Es sind im Stand der Technik andere Verfahren bekannt, welche die geschilderten detektionsseitigen Probleme bei der Hochauflösung vermeiden. So ist beispielsweise in der EP 1157297 B1 ein Verfahren angesprochen, bei dem mittels strukturierter Beleuchtung nicht linearer Prozesse ausgenützt werden. Eine strukturierte Beleuchtung wird in mehreren Dreh- und Ortslagen über die Probe verschoben und die Probe in diesen unterschiedlichen Zuständen auf einen Weitfelddetektor abgebildet, für den die geschilderten Beschränkungen nicht bestehen.
Ein Verfahren, das ohne die geschilderten Detektoreinschränkungen ebenfalls eine Hochauflösung (also eine Auflösung eines Probenbildes jenseits der Beugungsgrenze) erreicht, ist aus der WO 2006127692 und der DE 10 2006 021 317 bekannt. Dieses mit PALM abgekürzte Verfahren verwendet eine Markierungssubstanz, welche mittels eines optischen Aktivierungssignals aktiviert werden kann. Nur im aktivierten Zustand kann die Markierungssubstanz mit Anregungsstrahlung zur Abgabe von bestimmter Fluoreszenzstrahlung angeregt werden; nicht aktivierte Moleküle senden auch nach Einstrahlung von Anregungsstrahlung keine Fluoreszenzstrahlung aus. Die Aktivierungsstrahlung schaltet die Aktivierungssubstanz also in einen Zustand, in dem sie zur Fluoreszenz anregbar ist. Man spricht deshalb allgemein von einem Umschaltsignal. Dieses wird nun so aufgebracht, daß zumindest ein gewisser Anteil der aktivierten Markierungsmoleküle von benachbarten, ebenfalls aktivierten Markierungsmolekülen so beabstandet ist, daß die aktivierten Markierungsmoleküle gemessen an der optischen Auflösung der Mikroskopie getrennt oder nachträglich trennbar sind. Man spricht von Isolierung der aktivierten Moleküle. Für diese isolierten Moleküle ist es einfach, das Zentrum deren auflösungsbegrenzt bedingter Strahlungsverteilung zu ermitteln und somit rechnerisch die Lage der Moleküle mit höherer Genauigkeit zu bestimmen, als es die optische Abbildung eigentlich zuläßt. Zum Abbilden der gesamten Probe benutzt das PALM-Verfahren die Tatsache, daß die Wahrscheinlichkeit, mit der ein Markierungsmolekül durch das Umschaltsignal bei gegebener Intensität des Umschaltsignals aktiviert wird, für alle Markierungsmoleküle gleich ist. Die Intensität des Umschaltsignals wird also so aufgebracht, daß die gewünschte Isolierung erfolgt. Diese Verfahrensschritte werden so lange wiederholt, bis möglichst alle Markierungsmoleküle einmal in einer Teilmenge, die zur Fluoreszenz angeregt wurde, enthalten waren.
Im Rahmen der Erfindung wird der auf der Probe abgetastete Spot ruhend in eine Detektionsebene abgebildet. Die Strahlung aus der Detektionsebene wird dann nicht-abbildend umverteilt und auf das Detektorarray geleitet. Der Begriff „nicht-abbildend” ist dabei auf das in der Detektionsebene vorhandene Einzelbild bezogen. Einzelne Flächenbereiche dieses Einzelbildes können natürlich dennoch gemäß den Abbildungsgesetzen abgebildet werden. Insofern kann zwischen Detektorarray und Umverteilungselement durchaus abbildende Optik liegen. Das in der Detektionsebene vorliegende Einzelbild bleibt jedoch bei der Umverteilung als solches nicht erhalten.
Der Begriff „beugungsbegrenzt” soll nicht auf die Beugungsgrenze gemäß der Abbe'schen Theorie beschränkt sein, sondern auch Fälle erfassen, in denen auf Grund realer Unzulänglichkeiten oder Einschränkungen das theoretische Maximum um 20% verfehlt wird. Auch dann hat das Einzelbild eine Struktur, die hier als Beugungsstruktur bezeichnet wird. Sie wird überabgetastet.
Dieses Prinzip ermöglicht es, ein Detektorarray zu verwenden, das in seiner Größe nicht zum Einzelbild paßt. Das Detektorarray ist vorteilhaft in mindestens einer Ausdehnung größer oder kleiner als das zu erfassende Einzelbild. Unter den Begriff der unterschiedlichen geometrischen Ausbildung fallen sowohl eine unterschiedliche Ausdehnung des Detektorarrays als auch eine Anordnung mit unterschiedlichen Aspektverhältnis bezogen auf Höhe und Breite der Ausdehnung des Einzelbildes in der Detektionsebene. Die Pixel des Detektorarrays können zusätzlich für die erforderliche Auflösung zu groß sein. Auch ist es nun zulässig, daß der Umriß der Pixelanordnung des Detektorarrays grundlegend anders ist, als der Umriß, den das Einzelbild in der Detektionsebene hat. Letztlich hat das Detektorarray erfindungsgemäß eine andere Größe als das Einzelbild in der Detektionsebene. Die Umverteilung im Verfahren bzw. das Umverteilungselement im Mikroskop ermöglichen es, ein Detektorarray zu wählen, ohne die Abmessungseinschränkungen und Pixelgrößeneinschränkungen beachten zu müssen, welche durch das Einzelbild und dessen Größe entstehen. Insbesondere kann als Detektorarray eine Detektorzeile verwendet werden.
Das Bild der Probe entsteht LSM-üblich durch Abtasten der Probe mit dem Spot aus einer Vielzahl von Einzelbildern, die jeweils einem anderen Abtastort, also einer anderen Scanposition, zugeordnet sind.
Das erfindungsgemäße Konzept kann auch in parallelisierter Form für mehrere Spots gleichzeitig durchgeführt werden, wie dies für die Laserscanningmikroskopie bekannt ist. Es werden dann mehrere Spots auf der Probe scannend abgetastet, und die Einzelbilder der mehreren Spots liegen ruhend in der Detektionsebene nebeneinander. Sie werden dann entweder von einem gemeinsamen Umverteilungselement, das flächenmäßig entsprechend groß ist bzw. von mehreren einzelnen Umverteilungselementen umverteilt und dann auf ein entsprechend größeres einzelnes oder mehrere einzelne Detektorarrays geleitet.
Die nachfolgende Beschreibung konzentriert sich exemplarisch auf die Abtastung mit einem einzelnen Punkt-Spot. Dies soll jedoch nicht als Einschränkung verstanden werden, und die erläuterten Merkmale und Grundsätze gelten sinngemäß auch für die parallel Abtastung mehrerer Punkt-Spots wie auch für die Verwendung eines Linienspots. Letzterer ist natürlich nur quer zur Linienerstreckung beugungsbegrenzt, so daß die diesbezüglichen Merkmale dieser Beschreibung dann nur in einer Richtung (quer zur Linienerstreckung) gelten.
Durch das erfindungsgemäße Vorgehen kann das ISM-Verfahren bei zufriedenstellender Geschwindigkeit und mit vertretbarem apparativen Aufwand ausgeführt werden. Die Erfindung eröffnet für ein hochauflösendes Mikroskopieprinzip ein breites Anwendungsfeld, das so bislang nicht gegeben war.
Eine Möglichkeit der Umverteilung bzw. das Umverteilungselement zu realisieren besteht darin, ein Bündel aus Lichtleitfasern zu verwenden. Diese können vorzugsweise als Multimode-Lichtleitfasern ausgeführt werden. Das Bündel hat einen Eingang, der in der Detektionsebene angeordnet ist und in seinem Umriß den Ausdehnungen des beugungsbegrenzten Einzelbildes in der Detektionsebene genügt. Am Ausgang sind die Lichtleitfasern hingegen in der geometrischen Anordnung angeordnet, welche durch das Detektorarray vorgegeben ist, und welche sich von der des Eingangs unterscheidet. Die ausgangsseitigen Enden der Lichtleitfasern können dabei direkt auf die Pixel des Detektorarrays geführt werden. Besonders vorteilhaft ist es, wenn der Ausgang des Bündels in einem Stecker zusammengefaßt ist, der bequem auf eine Detektorzeile, beispielsweise eine APD- oder PMT-Zeile aufgesteckt werden kann.
Für das Verständnis der Erfindung ist es wichtig, zwischen den Pixeln des Detektorarrays und Bildpixeln zu unterscheiden, mit denen das Einzelbild in der Detektionsebene aufgelöst wird. Jedes Bildpixel ist i. d. R. genau einem Pixel des Detektorarrays zugeordnet; hinsichtlich ihrer Anordnung sind die beiden aber unterschiedlich. Kennzeichnend für die Erfindung ist es unter anderem, daß in der Detektionsebene die Strahlung an Bildpixeln aufgenommen wird, welche hinsichtlich ihrer Größe und Anordnung eine Überabtastung des Einzelbildes bewirken. Auf diese Weise wird die Struktur des Einzelbildes aufgelöst, die aufgrund der beugungsbegrenzten Erzeugung des Einzelbildes eine Beugungsstruktur ist. Das Umverteilungselement hat eine Eingangsseite, an der diese Bildpixel vorgesehen sind. Die Eingangsseite liegt in der Detektionsebene. Das Umverteilungselement leitet die Strahlung an jedem Bildpixel zu einem der Pixel des Detektorarrays. Die Zuordnung von Bildpixeln zu Pixeln des Detektorarrays hält die Bildstruktur nicht aufrecht, weshalb die Umverteilung bezogen auf das Einzelbild nicht-abbildend ist. Die Erfindung könnte also auch dadurch charakterisiert werden, daß in einem gattungsgemäßen Mikroskop die Detektoreinrichtung ein nicht-abbildendes Umverteilungselement aufweist, das eine in der Detektionsebene liegende Eingangsseite aufweist, an der die Strahlung mit Bildpixeln aufgenommen wird. Das Umverteilungselement weist weiter eine Ausgangsseite auf, an der die an den Bildpixeln aufgenommene Strahlung Pixeln eines Detektorarrays zugeführt wird, wobei die Strahlung von der Eingangsseite zur Ausgangsseite bezogen auf das Einzelbild nicht-abbildend umverteilt ist. Analog könnte das erfindungsgemäße Verfahren dadurch charakterisiert werden, daß bei einem gattungsgemäßen Verfahren die Strahlung in der Detektionsebene mit Bildpixeln aufgenommen wird, die bezogen auf das Einzelbild nicht-abbildend auf Pixel des Detektorarrays umverteilt werden. Das Detektorarrays unterscheidet sich hinsichtlich Anordnung und/Größe seiner Pixel von der Anordnung und/oder Größe der Bildpixel in der Detektionsebene. Weiter sind die Bildpixel in der Detektionsebene vom Umverteilungselement so bereitgestellt, daß bezogen auf die Beugungsgrenze die Beugungsstruktur des Einzelbildes überabgetastet ist.
Bei hochempfindlichen Detektorarrays ist es bekannt, daß benachbarte Pixel bei hohen Strahlungsintensitätsunterschieden eine Störung durch Übersprechen zeigt. Um solches zu vermeiden, ist eine Weiterbildung bevorzugt, bei der die Lichtleitfasern so vom Eingang zum Ausgang geführt sind, daß am Ausgang benachbarte Lichtleitfasern auch am Eingang benachbart sind. Da das beugungsbegrenzte Einzelbild keine sprungartigen Strahlungsintensitätsänderungen zeigt, stellt eine derartige Ausgestaltung des Umverteilungselementes automatisch sicher, daß nebeneinanderliegende Pixel des Detektorarrays möglichst geringe Strahlungsintensitätsunterschiede erhalten, was das Übersprechen minimiert.
Anstelle einer auf Lichtleitfasern basierten Umverteilung ist es auch möglich, das Umverteilungselement mit einem Spiegel auszurüsten, der unterschiedlich geneigte Spiegelelemente hat. Ein solcher Spiegel kann beispielsweise als Facettenspiegel, DMD oder adaptiver Spiegel ausgestaltet werden, wobei bei den letzten beiden Varianten eine entsprechende Einstellung bzw. Ansteuerung die Neigung der Spiegelelemente sicherstellt. Die Spiegelelemente leiten die Strahlung aus der Detektionsebene auf die Pixel des Detektorarrays, dessen geometrische Ausbildung sich von der der Spiegelelemente unterscheidet.
Die Spiegelelemente stellen wie die Lichtleitfaserenden im Eingang des Lichtleitfaserbündels die Bildpixel hinsichtlich der Auflösung der Beugungsstruktur des Einzelbildes dar. Ihre Größe ist für die Übertastung entscheidend, nicht (mehr) die Pixelgröße des Detektorarrays. Insofern wird hier auch eine Gruppe aus mehreren Einzeldetektoren als Detektorarray verstanden, da diese in ihrer Anordnung immer anders (also größer) als die Bildpixel in der Detektionsebene sind.
Bei LSM werden je nach erwünschter Auflösung unterschiedliche Objektive verwendet. Der Wechsel eines Objektivs verändert die Ausdehnung eines Einzelbildes in der Detektionsebene. Es ist deshalb bevorzugt, der Detektionsebene in Abbildungsrichtung eine Zoomoptik zur Anpassung der Größe des Einzelbildes an die der Detektoreinrichtung vorzuordnen. Eine solche Zoomoptik variiert die Größe des Einzelbildes in einem Prozentbereich deutlich kleiner 100%, ist also sehr viel einfacher auszuführen, als eine Vervielfachung der Größe des Einzelbildes, die eingangs als nachteilig geschildert wurde.
Die Beleuchtung der Probe erfolgt bevorzugt wie in einem üblichen LSM ebenfalls scannend, obwohl dies nicht zwingend ist. Man erreicht dann allerdings die maximale Auflösungssteigerung. Beleuchtet man die Probe scannend, ist es zweckmäßig, daß die Beleuchtungseinrichtung und die Abbildungseinrichtung eine gemeinsame Scaneinrichtung haben, welche einen Beleuchtungsspot über die Probe führt und zugleich den mit dem Beleuchtungsspot zusammenfallenden Spot, an dem die Probe abgebildet wird, in Bezug auf den Detektor wieder descannt, so daß das Einzelbild ruhend in der Detektionsebene ist. Bei einem solchen Aufbau kann man die Zoomoptik in dem gemeinsamen Teil von Beleuchtungs- und Abbildungseinrichtung setzen. Sie erlaubt es dann nicht nur, die Anpassung des Einzelbildes an die Größe des Detektors in der Detektionsebene vorzunehmen, sondern erlaubt auch zusätzlich die verfügbare Beleuchtungsstrahlung ohne Randverluste vollständig in die Objektivpupille, welche sich mit Wahl des Objektives ändern kann, einzukoppeln.
Ein strahlungsintensitätabhängiges Übersprechen zwischen nebeneinanderliegenden Pixeln des Detektorarrays kann, wie bereits eingangs erwähnt, bei Umverteilung mittels Lichtleitfaserbündel durch geeignete Anordnung der Lichtleitfasern im Bündel reduziert werden. Zusätzlich oder alternativ ist es auch möglich, eine Kalibrierung durchzuführen. Dazu wird jede Lichtleitfaser nacheinander mit Strahlung beaufschlagt und das Störsignal in benachbarten Pixeln erfaßt. Auf diese Weise wird eine Kalibriermatrix aufgestellt, mit der bei der späteren Mikroskopie der Probe ein strahlungsintensitätsabhängiges Übersprechen nebeneinanderliegender Pixel korrigiert wird.
Die Auflösung der Beugungsstruktur des Einzelbildes erlaubt es zusätzlich, eine Bewegungsrichtung des Spots zu ermitteln, entlang dieser während des Abtastens der Probe verschoben wird. Diese Bewegungsrichtung ist zwar grundsätzlich aus der Mechanik des Scanners (beispielsweise eines Scanspiegels oder eines beweglichen Probentisches) bekannt, jedoch ergeben sich hier mechanisch bedingte Restungenauigkeiten. Diese können eliminiert werden, indem Signale einzelner Pixel des Detektorarrays mittels Kreuzkorrelation ausgewertet werden. Dabei macht man sich zunutze, daß sich, bezogen nebeneinanderliegende Bildpixel in der Probe aufgrund der beugungsbegrenzten Abbildung des Spots in einem gewissen Maß überlappen, ihre Zentren jedoch nebeneinander liegen. Unterzieht man die Signale solcher Bildpixel einer Kreuzkorrelation, kann man eine Restungenauigkeit, welche aufgrund unvermeidlicher Toleranzen der Scanmechanik verbleibt, reduzieren bzw. vollständig eliminieren.
Neben der erhöhten Auflösung läßt sich über die räumliche und zeitliche Korrelation der Signale aus einer Meßreihe der einzelnen Detektorelemente (die Bildpixeln in der Detektionsebene zugeordnet sind) eine zeitliche Veränderung der Fluoreszenz im vom Spot erfaßten Detektionsvolumen erfassen, z. B. können aus einer zeitlichen Korrelation wie bei der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie Diffusionskoeffizienten bestimmt werden und auch durch das Einbeziehen der räumlichen Korrelation zwischen Bildpixeln gerichtete Diffusion und Diffusionsbarrieren visualisiert werden. Bewegungsabläufe der Fluoreszenzmoleküle sind darüber hinaus auch für Trackinganwendungen von großem Interesse, da dort der Beleuchtungsspot der Bewegung der Fluoreszenzmoleküle folgen soll. Die hier beschriebene Anordnung erlaubt es hochgenau die Bewegungsrichtung schon innerhalb einer Pixelbeichtungszeit zu ermitteln. Es ist deshalb als Weiterbildung bevorzugt, daß Veränderungen in der Probe erfaßt werden, indem bei in der Probe ruhendem Punkt- oder Linien-Spot eine zeitliche Veränderung des beugungsbegrenzten Einzelbildes ermittelt und ausgewertet wird.
Das erfindungsgemäße Vorgehen ermöglicht weiter bei gescannter Beleuchtung die Beleuchtungsverteilung zu modifizieren, beispielsweise mittels eines Phasenfilters. Kann damit sehr einfach das Verfahren realisiert werden, wie es beschrieben ist in Gong et al., Opt. Let., 34, 3508 (2009).
Soweit hier ein Verfahren beschrieben wird, realisiert ein Steuergerät diese Verfahrensschritte im Betrieb des Mikroskops.
Es versteht sich, daß die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen:
1 eine Schemadarstellung eines Laser-Scanning-Mikroskops zur hochauflösenden Mikroskopie,
2 eine vergrößerte Darstellung einer Detektoreinrichtung des Mikroskops der 1;
3 und 4 Draufsichten auf mögliche Ausführungsformen der Detektoreinrichtung 19 in einer Detektionsebene,
5 eine Weiterbildung des Mikroskops der 1 durch eine Zoom-Optik zur Anpassung der Größe des Detektorfelde,
6 eine Abwandlung des Mikroskops der 5 hinsichtlich der Zoom-Optik sowie hinsichtlich einer Weiterbildung zur mehrfarbigen Abbildung,
7 eine Abwandlung des Mikroskops der 1, wobei die Abwandlung die Detektoreinrichtung betrifft, und
8 eine Abwandlung der Detektoreinrichtung 19 der 7.
1 zeigt schematisch ein Laserscanningmikroskop 1, das zum Mikroskopieren einer Probe 2 ausgebildet ist. Das Laserscanningmikroskop (nachfolgend als LSM abgekürzt) 1 wird von einem Steuergerät C gesteuert und umfaßt einen Beleuchtungsstrahlengang 3 sowie einen Abbildungsstrahlengang 4. Der Beleuchtungsstrahlengang beleuchtet einen Spot in der Probe 2, und der Abbildungsstrahlengang 4 bildet diesen Spot beugungsbegrenzt zur Detektion ab. Beleuchtungsstrahlengang 3 und Abbildungsstrahlengang 4 teilen sich eine Vielzahl von Elementen. Dies ist aber ebenso wenig zwingend, wie eine gescannte Spot-Beleuchtung der Probe 2. Diese könnte auch weitfeldbeleuchtet werden.
Die Beleuchtung der Probe 2 erfolgt im LSM 1 mittels eines bereitgestellten Laserstrahls 5, der über einen nicht weiter funktionell erforderlichen Umlenkspiegel 6 und eine Linse 7 auf einen Spiegel 8 eingekoppelt wird. Der Spiegel 8 sorgt dafür, daß der Laserstrahl 5 unter einem Reflexionswinkel auf einen Emissionsfilter 9 fällt. Zur übersichtlicheren Darstellung ist für den Laserstrahl 5 lediglich dessen Hauptachse eingezeichnet.
Nach Reflexion am Emissionsfilter 9 wird der Laserstrahl 5 von einem Scanner 10 zweiachsig abgelenkt und mittels Linsen 11 und 12 durch ein Objektiv 13 in einen Spot 14 in der Probe 2 fokussiert. Der Spot ist dabei in der Darstellung der 1 punktförmig, es ist jedoch auch ein linienförmiger Spot möglich. Im Spot 14 angeregte Fluoreszenzstrahlung wird über das Objektiv 13, die Linsen 11 und 12 wieder zum Scanner 10 gelangt, nachdem in Abbildungsrichtung wiederum ein ruhender Lichtstrahl vorliegt. Dieser fällt durch die Emissionsfilter 9 und 15, welche die Funktion haben, die Fluoreszenzstrahlung im Spot 14 hinsichtlich ihrer Wellenlänge zu selektieren und insbesondere von der Beleuchtungsstrahlung des Laserstrahls 5, die beispielsweise als Anregungsstrahlung dienen kann, zu trennen. Eine Linse 16 sorgt dafür, daß insgesamt der Spot 14 in ein beugungsbegrenztes Bild 17 abgebildet wird, welches in einer Detektionsebene 18 liegt. Die Detektionsebene 18 ist eine konjugierte Ebene zur Ebene, in welcher der Spot 14 in der Probe 2 liegt. Das Bild 17 des Spots 14 wird in der Detektionsebene 18 von einer Detektoreinrichtung 19 aufgenommen, die nachfolgend anhand der 2 bis 4 näher erläutert wird. Wesentlich ist hier, daß die Detektoreinrichtung 19 das beugungsbegrenzte Bild 17 des Spots 14 in der Detektionsebene 18 räumlich auflöst.
Die Intensitätsverteilung des Spots über den Detektionsquerschnitt (Gaussverteilung) in 18 ist als 18a darunter in 1 dargestellt.
Das Steuergerät C steuert alle Komponenten des LSM 1, insbesondere Scanner 10 und Detektoreinrichtung 19. Das Steuergerät nimmt für verschiedene Scanstellungen die Daten jedes einzelnen Bildes 17 auf, analysiert dessen Beugungsstruktur und erzeugt ein hochaufgelöstes Gesamtbild der Probe 2.
Das LSM 1 der 1 ist exemplarisch für einen einzigen Spot, der auf der Probe abgetastet wird, dargestellt. Es kann jedoch zugleich auch zur Abtastung gemäß einem Linien-Spot verwendet werden, der sich beispielsweise senkrecht zur Zeichnungsebene der 1 erstreckt. Auch ist es möglich, das LSM 1 der 1 so auszuführen, daß mehrere nebeneinanderliegende Punkt-Spots in der Probe abgetastet werden. Ihre entsprechenden Einzelbilder 17 liegen dann in der Detektionsebene 18 ebenfalls nebeneinander. Die Detektoreinrichtung 19 ist dann entsprechend ausgestaltet, um die nebeneinanderliegenden Einzelbilder 17 in der Detektionsebene 18 zu erfassen.
Die Detektoreinrichtung 19 ist vergrößert in 2 dargestellt. Sie besteht aus einem Lichtleitfaserbündel 20, welches ein Detektorarray 24 speist. Das Lichtleitfaserbündel 20 ist aus Einzellichtfasern 21 aufgebaut. Die Enden der Lichtleitfasern 21 bilden den Lichtleitfaserbündeleingang 22, der in der Detektionsebene 18 liegt. Die einzelnen Enden der Lichtleitfasern 21 stellen somit Pixel dar, mit denen das beugungsbegrenzte Bild 17 des Spots 14 aufgenommen wird. Da der Spot 14 in der Ausführungsform der 1 exemplarisch ein Punkt-Spot ist, ist das Bild 17 ein Airy-Scheibchen, dessen Ausdehnung innerhalb des Kreises liegt, welcher in den 1 und 2 die Detektionsebene 18 veranschaulicht. Die Ausdehnung des Lichtleitfaserbündeleingangs 22 ist also so groß, daß damit die Ausdehnung der Airy-Scheibe abgedeckt wird. Die einzelnen Lichtleitfasern 21 im Leichtleitfaserbündel 20 sind an ihren Ausgängen in eine andere geometrische Anordnung gebracht, als am Lichtleitfaserbündeleingang 22, nämlich in Form eines längserstreckten Steckers 23, in dem die ausgangsseitigen Enden der Lichtleitfasern 21 nebeneinander liegen. Der Stecker 23 ist passend zur geometrischen Anordnung der Detektorzeile 24 ausgebildet, d. h. jedes ausgangsseitige Ende einer Lichtleitfaser 21 liegt genau vor einem Pixel 25 der Detektorzeile 24.
Die geometrische Ausdehnung des Umverteilungselementes ist ganz grundsätzlich, d. h. unabhängig von seiner Realisierung, die in 4 durch ein Faserbündel erfolgt, eingangsseitig an die Ausdehnung des Einzelbildes (bzw. im Falle mehrerer Punkt-Spots der nebeneinanderliegenden Einzelbilder) angepaßt. Das Umverteilungselement hat die Funktion, aus der Detektionsebene 18 die Strahlung so aufzunehmen, daß gemessen am Abtasttheorem die Intensitätsverteilung des Einzelbildes 17 bezogen auf die Beugungsgrenze überabgetastet wird, das Umverteilungselement hat also in der Detektionsebene 18 liegende Pixel (in der Bauweise der 3 durch die Eingangsenden der Lichtleitfasern gebildet), die mindestens um den Faktor 2 kleiner sind als die kleinste auflösbare Struktur, die sich aus der Beugungsgrenze unter Berücksichtigung des Abbildungsmaßstabes in der Detektionsebene 18 ergibt.
Natürlich ist die Verwendung eines Steckers 23 nur eine von vielen Möglichkeiten, die ausgangsseitigen Enden der Lichtleitfasern 21 vor den Pixeln 25 anzuordnen. Gleichermaßen ist es möglich, andere Verbindungen zu verwenden. Auch können die einzelnen Pixel 25 direkt mit den Lichtleitfasern 21 fusioniert werden. Es ist nicht einmal erforderlich, eine Detektorzeile 24 zu verwenden; stattdessen kann für jedes Pixel 25 ein einzelner Detektor verwendet werden.
Die 3 und 4 zeigen mögliche Ausführungsformen des Lichtleitfaserbündeleingangs 22. Die Lichtleitfasern 21 können am Lichtleitfaserbündeleingang 22 miteinander verschmolzen werden. Hierdurch wird ein höherer Füllfaktor erreicht, d. h. Lücken zwischen den einzelnen Lichtleitfasern 21 am Lichtleitfaserbündeleingang 22 werden minimiert. Das Verschmelzen führ andererseits zu einem gewissen Übersprechen zwischen benachbarten Lichtleitfasern. Möchte man dieses vermeiden, können die Lichtleitfasern geklebt werden. Auch ist eine quadratische Anordnung der Enden der Lichtleitfasern 21 möglich, wie 4 zeigt.
Bevorzugt sind die einzelnen Lichtleitfasern 21 so den einzelnen Pixeln 25 des Detektorarrays 24 zugeordnet, daß am Lichtleitfaserbündeleingang 22 nebeneinander liegende Lichtleitfasern 21 auch am Detektorarray 24 nebeneinander liegen. Durch dieses Vorgehen minimiert man Übersprechen zwischen benachbarten Pixeln 25, das beispielsweise durch Streustrahlung oder in der Signalverarbeitung der einzelnen Pixel 25 auftreten kann. Ist das Detektorarray 24 eine Zeile, kann man die entsprechende Anordnung dadurch erreichen, indem die Reihenfolge der Einzellichtleitfasern auf der Detektorzeile durch eine Spirale festgelegt wird, welche in Draufsicht auf die Detektionsebene 18 die Einzellichtleitfasern nacheinander verbindet.
3 zeigt weiter noch Blindfasern 26, die in den Ecken der Anordnung der Lichtleitfasern 21 am Lichtleitfaserbündeleingang 22 liegen. Diese Blindfasern sind nicht auf Pixel 25 des Detektorarrays geführt. An den Orten der Blindfasern wäre keine für die Auswertung der Signale erforderliche Signalintensität mehr vorhanden. Man kann dadurch die Anzahl der Lichtleitfasern 21 und damit die Anzahl der Pixel 25 in der Detektorzeile 24 oder dem Detektorarray so reduzieren, daß beispielsweise mit 32 Pixeln gearbeitet werden kann. Solche Detektorzeilen 24 sind bereits anderweitig in Laser-Scanning-Mikroskopen im Einsatz, was den Vorteil hat, daß die Signalauswerteelektronik in solchen Laser-Scanning-Mikroskopen nur einmal vorgehalten werden muß und zwischen einer bereits bestehenden Detektorzeile 24 und der durch die Detektoreinrichtung 19 hinzugekommenen weiteren Detektorzeile 24 umgeschaltet wird.
Gemäß 4 werden Lichtleitfasern mit quadratischer Grundform für das Bündel verwendet. Sie haben ebenfalls einen hohen Abdeckungsgrad in der Detektionsebene, sammeln die Strahlung also effizient auf.
5 zeigt eine Weiterbildung des LSM 1 der 1, in dem der Detektionsebene 18 eine Zoomoptik 27 vorgeordnet ist. Die konjugierte Ebene, in welcher bei der Bauweise der 1 die Detektionsebene 18 angeordnet wurde, bildet nun eine Zwischenbildebene 28, aus welcher die Zoomoptik 27 die Strahlung aufnimmt und zur Detektionsebene 18 leitet. Die Zoomoptik 27 erlaubt es, das Bild 17 optimal an die Ausdehnung des Eingangs der Detektoreinrichtung 19 anzupassen.
6 zeigt eine nochmalige Abwandlung des Laser-Scanning-Mikroskops 1 der 1. Zum einen ist hier die Zoomoptik als Zoomoptik 29 so angeordnet, daß sie im Teil des Strahlenganges liegt, der sowohl vom Beleuchtungsstrahlengang 3 als auch vom Abbildungsstrahlengang 4 durchlaufen wird. Man erhält damit den Vorteil, daß nicht nur die Größe des Bildes 17 auf der Eingangsseite der Detektoreinrichtung 19 angepaßt werden kann, es kann auch bezüglich des Abbildungsstrahlenganges 4 die Pupillenfüllung des Objektivs 13 und damit die Ausnutzung des Laserstrahls 5 angepaßt werden.
Zusätzlich ist in 6 das LSM 1 noch zweikanalig ausgebildet, indem dem Emissionsfilter 9 ein Stahlteiler nachgeordnet ist, welcher die Strahlung in zwei getrennte Farbkanäle abtrennt. Die entsprechenden Elemente der Farbkanäle entsprechen jeweils den Elementen, die im LSM 1 der 1 dem Emissionsfilter 9 in Abbildungsrichtung nachgeordnet sind. Die Farbkanäle sind in der Darstellung der 6 durch das Bezugszeichensuffix „a” bzw. „b” unterschieden.
Natürlich ist die Realisierung mit zwei Farbkanälen unabhängig von der Verwendung der Zoomoptik 29. Die Kombination hat jedoch den Vorteil, daß eine Zoomoptik 27, die in beiden Farbkanälen jeweils eigenständig vorgesehen werden müßte und damit doppelt vorhanden wäre, nur einmal erforderlich ist. Selbstverständlich kann jedoch die Zoomoptik 27 auch in der Bauweise gemäß 1 zum Einsatz kommen und das LSM 1 der 6 kann auch ohne Zoomoptik 29 verwirklicht werden.
7 zeigt eine Abwandlung des LSM 1 der 1 hinsichtlich der Detektoreinrichtung 19.
Die Detektoreinrichtung 19 weist nun einen Facettenspiegel 30 auf, der einzelne Facetten 31 trägt. Die Facetten 31 entsprechen hinsichtlich der Auflösung des Bildes 17 den Enden der Lichtleitfasern 21 am Lichtleitfaserbündeleingang 22. Die einzelnen Facetten 31 unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Neigung zur optischen Achse des Strahlungseinfalls. Zusammen mit einer Linse 32 und einem Minilinsenarray 33 sowie einem nur der Strahlfaltung dienenden Umlenkspiegel 34 bildet jede Facette 31 einen Flächenabschnitt des Einzelbildes 17 auf ein Pixel 25 eines Detektorarrays 24 ab. Je nach Orientierung der Facetten 31 kann das Detektorarray 24 dabei bevorzugt ein 2D-Array sein, aber auch eine Detektorzeile ist möglich.
8 zeigt eine Weiterbildung der Detektoreinrichtung 19 der 7, in welcher der Linse 32 noch ein refraktives Element 35 vorgeordnet ist, das die Strahlung besonders gut auf eine Detektorzeile verteilt.
Das Detektorarray 24 kann, wie bereits erwähnt, hinsichtlich seiner Geometrie ohne weitere Einschränkungen gewählt werden. Selbstverständlich muß das Umverteilungselement in der Detektoreinrichtung 19 dann auf das entsprechende Detektorarray angepaßt werden. Die einzelnen Pixel, mit denen das Bild 17 aufgelöst wird, sind letztlich hinsichtlich ihrer Größe nicht mehr durch das Detektorarray 24 vorgegeben, sondern durch das Element, welches die Umverteilung der Strahlung aus der Detektionsebene 18 bewirkt. Bei einer Airy-Scheibe ergibt sich der Durchmesser der Scheibe bei einer beugungsbegrenzten Abbildung gemäß der Formel 1,22 λ/NA, wobei λ die mittlere Wellenlänge der abgebildeten Strahlung und NA die numerische Apertur des Objektivs 13 ist. Die Halbwertsbreite ist dann 0,15 λ/NA. Um die Hochauflösung zu erreichen, genügt es, die Ortsauflösung bei der Detektion doppelt so groß wie die Halbwertsbreite zu gestalten, d. h. die Halbwertsbreite zweimal abzutasten. Ein Facettenelement 31 bzw. ein Ende einer Lichtleitfaser 21 am Lichtleitfaserbündeleingang 22 darf somit maximal halb so groß wie die Halbwertsbreite des beugungsbegrenzten Einzelbildes sein. Dies gilt natürlich unter Berücksichtigung des Abbildungsmaßstabes, den die Optik nach dem Objektiv 13 bewirkt. Im einfachsten Fall würde also ein 4 × 4-Array von Pixeln in der Detektionsebene 18 pro Halbwertsbreite mehr als genügen.
Die Zoomoptik, welche anhand der 5 und 6 erläutert wurde, erlaubt neben einer Anpassung dergestalt, daß die Beugungsverteilung des beugungsbegrenzten Bildes 17 des Spots 14 die Eingangsfläche der Detektoreinrichtung 19 optimal ausfüllt, auch noch eine weitere Betriebsart, wenn nämlich mehr als eine Airy-Scheibe in die Detektionsebene 18 abgebildet wird. Bei einer Messung, bei der mehr als eine Airy-Scheibe auf die Detektoreinrichtung 19 abgebildet wird, wird Licht aus weiteren Tiefenebenen der Probe 2 an den äußeren Pixeln der Detektoreinrichtung 19 detektiert. Im Zuge der Verarbeitung des Bildes erhält man dabei zusätzliche Signalstärke, ohne daß die Tiefenauflösung des LSM 1 beeinträchtigt wäre. Die Zoomoptik 27 bzw. 29 erlaubt es somit, einen Kompromiß zwischen Signal-/Rauschverhältnis des Bildes und Tiefenauflösung einzustellen.
Stand der Technik

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In einem gattungsgemäßen Laser-Scanning-Mikroskop (LSM) wird eine erhöhte Auflösung dadurch erreicht, dass das sogenannte Pinhole (Lochblende) vor dem Detektor auf eine Größe deutlich kleiner als die Beugungsgrenze (≤ Airy/4) reduziert wird. Man spricht dann von einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop. Das „Airy” wird über die ersten Nullstellen eines beugungsbegrenzten Beleuchtungsspots definiert und ist ein etablierter Begriff in der Optikliteratur.
Für den Fall eines gattungsgemäßen Fluoreszenz-LSMs besteht ein entscheidender Nachteil bei der gegenwärtigen Methode zur Erlangung erhöhter Auflösung: Das sehr schlechte Signal-zu-Rausch-Verhältnis aufgrund der wegen fast geschlossenem Pinhole geringen Anzahl detektierter Photonen, die von der Probe kommen, was in der Praxis dazu führt, das keine verbesserte Auflösung erreicht werden kann.
Bei der konfokalen Laser-Scanning-Materialmikroskopie besteht dieser Nachteil nicht. Hier sind im Allgemeinen ausreichend viele Photonen für die Detektion vorhanden. Die optische Transfer-Funktion des Gesamtsystems mit quasi geschlossenem Pinhole besteht in erster Näherung aus der Faltung der Pupillenfunktionen. Bis auf die Stokes-Verschiebung der Fluoreszenz zur Beleuchtung hat die Transferfunktion die Form und Breite der Transferfunktion der Fluoreszenz-Weitfeldmikroskopie. Das bedeutet zwar, dass höhere Objektfrequenzen übertragen werden, aber ihre Gewichtung ist kleiner als die der tieferen Objektfrequenzen.
Es ist nun aber auch möglich, die Auflösung eines Laser-Scanning-Mikroskops bei gleichzeitig besserem Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erhöhen. Dazu muss mit einem größeren Pinhole-Durchmesser (ca. 1 Airy), was eine höhere Anzahl detektierbarer Photonen bedeutet, und mit einer Sub-Airy-ortsaufgelösten Detektion gearbeitet werden. Nach der Bildaufnahme erfolgt eine Umsortierung und Verrechnung der Daten mittels eines speziellen Algorithmus. Dies führt dann zu einer erhöhten Auflösung im Probenbild. Diese Methode, beruhend auf Colin Sheppard, wird in der Literatur auch Akkumulation verschobener Sub-Airy-Detektorwerte genannt [6–10].
Die genannte Methode funktioniert nicht nur mit fluoreszierenden Proben, sie kann auch für die Bildgebung an kohärent wechselwirkenden Materialproben angewendet werden. Hier bietet die Methode kaum Vorteile hinsichtlich des Detektionsphotonenbudgets. Vielmehr besteht der Vorteil darin, dass die Gesamt-Übertragungsfunktion im Wesentlichen durch die Pupillenfunktion mit doppelter Bandbreite gegeben ist. Das heißt, dass die höheren Objektfrequenzen die gleiche Gewichtung wie die tieferen Objektfrequenzen erfahren.
Voraussetzung für die Anwendbarkeit der Methode auf kohärent wechselwirkende Materialproben ist aber, dass sowohl Amplitude als auch Phase mit einer Sub-Airy-Ortsauflösung und mit hoher Sampling-Rate vermessen werden.
Die Ausführung der genannten Methode konnte sich bisher nicht durchsetzten, da es an schnellen (Integrationszeit typ. ≥ 1 μs), geeignet großen, sensitiven und rauscharmen Multi-Element-Detektoranordnungen mit einer entsprechend hohen Anzahl an Detektorelementen (typ. > 30 notwendig) im Sub-mm-Bereich im Laser-Scanning-Mikroskop-Bereich mangelt. Außerdem muss die räumliche Lichtverteilung auf der Detektionseinrichtung sehr genau erfasst werden, was entsprechend Justieraufwand bedeutet und fehleranfällig ist.
Ein PMT-Array bedeutet große Detektor-Elemente, es wären deshalb sehr große Baulängen nötig.
Ein SPAD-Array erreicht im Geiger-Mode keine großen Zählraten, wie sie trotz ortsaufgelöster Sub-Airy Detektion aber auftreten können.
Außerdem können empfindliche Weitfelddetektoren (z. B. CCD oder EMCCD) bei der genannten Methode nicht zur Anwendung kommen. Sie können nicht Full-Frame mit der notwendigen Geschwindigkeit ausgelesen werden. Soll die Methode dennoch mit einem Weitfelddetektor kombiniert werden, so müssen analog zur Strukturierten Weitfeldmikroskopie stehende Beleuchtungsmuster erzeugt werden, was die Anzahl notwendiger Bilder wieder nachteilig erhöht.
Als Aufgabe der Erfindung kann daher angesehen werden, die Nachteile der genannten etablierten lichtmikroskopischen Verfahren mit strukturiertem Beleuchtungslicht zu überwinden.
Ein wesentliches Merkmal der Erfindung ist, dass mit den technisch bevorzugten Ausführungsformen eine erhöhte Auflösung mit gutem Signal-zu-Rausch-Verhältnis und bei Materialproben auch mit einer a priori besseren Gewichtung der höheren Raumfrequenzen erzielt werden kann.
Erfindungsgemässe Lösungen

sind im Folgenden Gegenstände der unabhängigen Patentansprüche. Bevorzugte Weiterbildungen sind Gegenstand der abhängigen Patentansprüche.

Die vorliegende Erfindung betrifft mehrere erfindungsgemässe Verfahren zur räumlichen Messung der komplexen Transmissions- und/oder Reflexionseigenschaften (Amplituden- und Phasenverteilung) einer Mikrostrukturen aufweisenden Probe, beispielsweise einer Materialprobe oder z. B. eines Halbleiter-Chips.
Zur Bestimmung der Phasenfunktion einer Probe kommen im Allgemeinen interferometrische Messmethoden zur Anwendung [11]. Diese Verfahren benötigen jedoch aufwendige optische Anordnungen, die eine hohe interferometrische Systemstabilität gewährleisten müssen. Für die eindeutige Bestimmung der räumlichen Phasenverteilung sind außerdem mehrere Phasenverschiebungen zwischen dem vom Objekt transmittierten bzw. reflektierten Beleuchtungslicht und dem Referenzlicht notwendig.
Geeignete Verfahren im Weitfeld sind im Allgemeinen von störenden Interferenzmustern (Speckle) begleitet oder weisen den Mangel einer direkten optischen Schnittwirkung auf.
Hier zeigen beleuchtungspunktscannende Methoden geeignetere Eigenschaften: Bereits mit einer Pinholegröße von einem Airy ergibt sich eine optische Schnittwirkung, störende Interferenzmuster sind weitaus weniger sichtbar als im Weitfeld.
Aber beleuchtungspunktscannende Methoden zeichnen sich nicht durch hohe Bildaufnahmegeschwindigkeiten aus. Eine Verbesserung in dieser Hinsicht ist durch die Verwendung resonanter Galvo-Scanner gegeben (bis zu 30 frames/s). Bei diesen hohen Scan-Geschwindigkeiten resultieren aber kleine Pixelintegrationszeiten, was die Anwendung von PMT-Arrays oder APD-Arrays erforderlich macht. Im Falle der Materialmikroskopie können mitunter auch einfache Photodiodenarrays (PDAs) zum Einsatz kommen.
PMT-Arrays eignen sich für höhere Photonenströme, die für ein „gutes” Bild mit hohem SNR notwendig sind. PMT-Arrays weisen aber i. a. eine größere Ausdehnung auf, so dass eine geeignete Ausleuchtung mit großen optischen Brennweiten der Fokussieroptik verknüpft ist. Abhilfe können an dieser Stelle Faserbündel [16] leisten, die eine nichtabbildende flexible Umverteilung des Lichtes ermöglichen. Dies ist oben anhand der 1–8 ausführlich dargestellt.
Die Kombination Faserbündel mit einem Array-Detektor ist aber noch nicht ausreichend, um die Methode implementieren zu können. Damit wäre noch nicht die Phasenverteilung zugänglich. Um diese zu erhalten können entweder Wellenfrontsensoren oder interferometrische bzw. holographische Methoden oder sogen. „Phase Retrieval” Methoden eingesetzt werden.
Eine erste vorteilhafte Alternative zur iPhasenmessung stellt die Phasengradienten-Methode nach Shack und Hartmann dar:
http://de.wikipedia.org/wiki/Hartmann-Shack-Sensor
Der Hartmann-Shack-Sensor besteht aus einem zweidimensionalen Linsenarray und einem optischen 2D Detektor (CMOS-bzw. CCD Chip).
Jede der Linsen erzeugt in der Fokusebene ein Bild, das entsprechend der lokalen Neigung der Wellenfront gegenüber einer Referenzposition verschoben ist,
Diese Verschiebung kann durch die ortsempfindlichen Detektoren gemessen werden Durch Analyse der lokalen Ablenkungen der Punkte von ihren Idealpositionen können Aussagen über das lokale Steigungsverhalten der einfallenden Wellenfront getroffen werden. Diese Phaseninformation wird in eine messbare Intensitätsverteilung umgewandelt.
Es wird ein zweidimensionales Linsen-Array mit einem zweidimensionalem Detektor kombiniert. Jede Mikrolinse erzeugt in ihrer Fokalebene einen Spot dessen Lage gegenüber einer Referenzposition je nach Neigung der lokalen Wellenfront verschoben sein kann.
Vor das Faserbündel gemäß der obigen Beschreibung wird erfindungsgemäß ein Mikrolinsen-Array gesetzt, um das Prinzip des Shack-Hartmann-Sensors auf die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie anwenden zu können. Darauf beruht erfindungsgemäß diese bevorzugte Ausführungsform eines ultraschnellen Shack-Hartmann-Sensors für die konfokale Laser-Scanning-Materialmikroskopie.
Eine andere Alternative zur Wellenfrontmessung ist der sogen. „Wavefront Imaging Sensor" welcher von Yang et al. (z. B. Opt. Lett. 37, 199, 2012) entwickelt wurde. Statt eines Linsen-Arrays käme hier ein Apertur-Array zum Einsatz, welches in einem gewissen Abstand auf das Faserbündel aufgebracht werden kann.
Eine ebenfalls weitere Alternative zur Wellenfrontmessung ist das sogen. „Partitioned Aperture Wavefront (PAW)"-Verfahren von Mertz et al. bzw. Iglesias (z. B. Mertz et al., Opt. Lett. 37, 4062, 2012 oder Iglesias, Opt. Lett. 36, 3636, 2011). Hier müsste in der Fourierebene vor der Pinhole-Ebene ein Linsenarray bzw. ein Pyramidenprisma als partitionierendes Element eingebracht werden, welches in der Pinhole-Ebene auf einem Kamera-Array typischerweise 4 jedoch mindestens 3 lateral versetzte Replica-Bilder erzeugt. Da die Replica aufgrund des partitionierenden Elements für aus unterschiedlichen Teilbereichen des Winkelspektrum generiert werden, kann aus der relativen Intensität der Replica auf die Wellenfront und damit auf die Phasen geschlossen werden.
In den Bereich der interferometrischen Sensoren fällt beispielsweise der von der Firma Phasics S. A. angebotene Wellenfrontsensor SID4Bio, dessen Grundprinzip, die „Quadriwave Lateral Shearing"-Interferometrie beispielsweise von Bon et al. erläutert wurde (z. B. Opt. Express 17, 13080, 2009). Hier wird eine schachbrettmusterförmige Maske in die Zwischenbildebene vor den Sensor gebracht und die Interferenz der unterschiedlichen Beugungsordnungen zur Phasenmessung ausgenutzt. Auch eine solche Anordnung ist in einem LSM mit Array-Detektor denkbar. Gleiches gilt für andere vergleichbare interferometrische bzw. holographische Anordnungen, bei denen ebenfalls das Referenzfeld direkt aus Lichtanteilen gewonnen wird, die von der Probe dstammen. Ein Beispiel ist das holographische Lloyd-Mikroskop von Anand et al. (Opt. Lett 37, 5127, 2012).
Verschiedene weitere Beispiele sind in einem Review von G. Popescu beschrieben (Methods in Cell Biology, Vol. 90, 87, 2008).
Eine interferometrische Anordnung, die nicht auf Selbstinterferenz beruht ist beispielsweise von Zhao et al. beschrieben (Appl. Opt. 50, 655, 2010). Hier ist ein Strahlengang mit einem auf einem Referenzspiegel basierenden Interferometer beschrieben. Das Referenzlicht stammt somit nicht von der Probe selber. Durch eine geschickte Anordnung werden 4 unterschiedliche Phasenhübe im Sinne des sogen. „Phase Shifting”-Prinzips parallelvermessen. Alternativ könnte auch der Referenzspiegel axial bewegt werden. Wird das gezeigt Konfokalmikroskop erfindungsgemäß mit mindestens einem Array-Detektor statt mit Punktdetektoren ausgestattet, so ist wiederum die Vermessung der ortsaufgelösten Phase möglich.
Neben Interferometrie bzw. Holographie-Verfahren sowie den Wellenfrontmethoden wie der Shack-Hartmann-Wellenfront-Gradientenmethode gibt es eine weitere vorteilhafte Methode zur Bestimmung der räumlichen Amplituden- und Wellenfrontverteilung. Hierbei handelt es sich um die sogenannte „Phase-Retrieval-Methode”, die typischerweise auf dem Gerchberg-Saxton-Algorithmus beruht [12]. Es gibt im Wesentlichen zwei Ausführungsformen was die Messungen zur Umsetzung der Methode angeht:

a) Die Intensität wird in zwei durch die optische Wellenpropagation miteinander verbundene Ebenen gemessen und anschließende wird die räumliche Wellenfrontverteilung mittels iterativer (Fourier-)Algorithmen [13] berechnet (13).
b) Die Intensität wird mehrfach in nur einer Ebene gemessen, wobei dabei in einer hinsichtlich der Propagationsrichtung vorgeschalteten Ebene geeignete Filterfunktionen zur Anwendung kommen und die räumliche Wellenfrontverteilung wiederum mittels iterativer (Fourier-)Algorithmen berechnet wird [14].

Die genannte Phase-Retrieval-Methode wird wie auch die anderen oben erwähnten Methoden erfindungsgemäß auf ein anhand der 1–8 beschriebenes konfokales Laser-Scanning-Mikroskop angewendet. Hierbei geht es darum, die Wellenfront der Lichtverteilung unterhalb der Beugungsgrenze, d. h. mit Sub-Airy-Auflösung zu vermessen. Dies bedeutet Neuland und stellt eine Abgrenzung zu aktuellen Publikationen dar (z. B. Punktdetektor in konfokalem Mikroskop [15]). Nur wenn die zu jeder Position des beugungsbegrenzten Beleuchtungsspot gehörenden Detektionslichtverteilung mit ortsaufgelöster Sub-Airy-Auflösung (unterhalb des Beugungsgrenze) detektiert wird, kann durch die anschließende Datenumsortierung die kohärente Transfer-Funktion verbreitert (verdoppelt) werden ohne dass die Gewichtung der höheren Raumfrequenzen kleiner als die der tiefen Frequenzen ist. In der Literatur gibt es momentan kein Experiment was dies zeigt [15].
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden in Bezug auf die beigefügten schematischen Figuren beschrieben.
Bezugszeichenliste

41: Lichtquelle
42: Spiegeltreppe mit teildurchlässigen Spiegeln/Farbteilern
43: Akusto-optischer durchstimmbarer Filter (AOTF)
44: Beleuchtungslicht
8,45: Spiegel
46: Kollimationsoptik
47: Zoomoptik
9: Hauptfarbteiler
50: (durchstimmbare) Detektionsoptik
53: Probenlicht
54: Pinhole-Ebene
55: (Neutral-)Strahlteiler
60: (Ultraschneller) Wellenfrontsensor, Sub-Airy ortsauflösende Detektionseinrichtung
60.1: zweiter (Ultraschneller) Wellenfrontsensor, zweite Sub-Airy ortsauflösende Detektionseinrichtung
61: Detektionseinrichtung
61.1: zweite Detektionseinrichtung
62: Detektorelement, Detektor-Pixel
62.1: Detektorelement, Detektor-Pixel der zweiten Detektionseinrichtung
63: Detektionsebene
63.1: zweite Detektionsebene
64: Mikrolinsen-Array
65: Faserbündel
66: Mikrolinsenspot
70: Lichtmikroskop

Erstes Verfahren (Wellenfrontsensor)
Bei der Materialanwendung ist die von der Probe reflektierte oder transmittierte bzw. gestreute Strahlung kohärent,
im Gegensatz zur inkohärenten Fluoreszenzstrahlung bei der Fluoreszenzanwendung. Es wird für die kohärente Probenstrahlung die konkrete Wellenfront Lage und Verzerrung der Wellenfront mit einem Wellenfrontsensor bestimmt und daraus die Phasenlage berechnet.
Es werden hierzu mindestens 3, bevorzugt (wegen der Symmetrie) vier Pixel (= Fasereintrittsflächen) pro Einzellinse verwendet.
Die erzielbare Auflösung insgesamt wird dadurch bei vier Pixeln zwar geringer, jedoch wird das durch die Erfassung der Wellenfrontverteilung wieder ausgeglichen, Gegebenenfalls kann die Anzahl der Einzelsensoren und Fasern erhöht werden.
Durch einen Algorithmus wird aus der lokalen Phase/Amplitude ein hochauflösendes Bild errechnet.
Eine Eichung (Festlegung der Nullpunkte bei ungestörter Wellenfront kann beispielsweise durch einen ebenen Spiegel in der Probenebene oder einer hierzu konjugierten Ebene erfolgen (Nullmessung der Phase).
Eine Korrektur der Phase anhand der ermittelten Werte kann punktweise (pro abgerasterten Bildpunkt des LSM) ober bildweise nach der Aufnahme eines Bildes durch das LSM erfolgen, wobei die punktweise Korrektur schneller sein kann.
9 zeigt eine schematische Darstellung eines (Laser-Scanning-)Lichtmikroskops 70 nach den 1–8 mit Sub-Airy ortsaufgelöste Amplituden- und Phasenmessung unter Verwendung eines ultraschnellen Wellenfrontsensors 60 mit einem Detektorarray 61, 62, 63, Faserbündel 65, Mikrolinsenarray 64 in einer der Pinholeebene des LSM entsprechenden Bildebene 54 die konjugiert zur Probenenbene liegt. Die Probenebene wird über die in 1–8 beschriebenen Elemente sowie eine Detektionsoptik 50 in die Ebene der Mikrolinsen übertragen, deren Foki auf den Eintrittsflächen des Faserebündels 65 liegen.
10a) zeigt die Zuordnung zwischen Mikrolinsen und Lichtleitfasern eines Faserbündels. Eine Mikrolinse 64 fokussiert auf mehrere Fasern (≥4) eines Bündels 65, hier jeweils vier.
10b) zeigt die erfindungsgemäße Ausführungsform eines schnellen Wellenfrontsensors 60 bestehend aus einem Mikrolinsen-Array 64, einem Faserbündel 65 und einer sensitiven, rauscharmen und schnellen Multi-Element-Detektoreinrichtung 61. Das Mikrolinsen-Array 64 fokussiert ortsaufgelöst die Lichtverteilung 53 innerhalb eines Airy-Durchmessers auf das Faserbündel-Array 65. Dabei gehören zu jeder Mikrolinse mehrere Lichtleitfasern (≥3), die eine laterale Lagebestimmung der Fokusposition insbesondere relativ zu einer Referenzposition ermöglichen. Dadurch wird eine Bestimmung des Gradienten der Wellenfront ermöglicht, so dass sich nach mathematischer Integration der ortsaufgelöste Verlauf der Wellen-(Phasen)front über die Lichtverteilung in einer Ausdehnung von ca. einem Airy ergibt. Mittels des Faserbündels 65 erfolgt eine nichtabbildende Umverteilung der Photonen auf eine sensitive, rauscharme und schnelle Multi-Element-Detektoreinrichtung 61. Alternativ kann 64 ein Apertur-Array darstellen.
In 10c sind jeweils 4 Empfänger hinter den Lichtleitfasern dargestellt die jeweils 4 durch eine Mikrolinse beaufschlagten Lichtleitfasereingängen entsprechen. Auf der linken Seite ist eine ideale Lage des Lichtspots 66 der durch eine Mikrolinse des Arrays 64 erzeugt wird, bezüglich der vier Empfänger dargestellt.
Sie entsteht wie oben erwähnt beispielsweise durch Eichung mittels eines ebenen Spiegels.
Die vier Empfänger erhalten durch die mittige Lage von 66 dieselbe Lichtmenge und erzeugen das gleiche Messsignal.
Auf der rechten Seite ist ein verschobener Lichtspot 66 dargestellt.
Die vier Empfänger erhalten unterschiedliche Lichtmengen. Aus den gemessenen Lichtmengen der vier Empfänger kann die Lage des Spots 66 ermittelt werden als Voraussetzung für die Berechnung der Verschiebung der Phasenfront.
In 10e ist ein Wellenfrontsensor nach dem PAW Verfahren (Partitiones Wavefront Imager) nach Mertz et al (s. o.) mit vier off axis Linsen schematisch dargestellt.
Über die Detektionsoptik 50 und eine einstellbare Blende LB in einer Fokusebene 54 zur Begrenzung des Lichtspots, beispielsweise auf etwa ein Airy, geht das Licht mittels einer eine 3f Anordnung (fe Fokallänge der Linsen),
über eine Linse in Ebene 67 und vier PAW Linsen 69 in der Ebene 69 (hier sind von der Seite nur zwei dargestellt) die in einer zur Fourierebene des Objektives optisch konjugierten Ebene angeordnet sind,
von diesen fokussiert in die Ebene 65 der Lichteintrittsflächen, beispielsweise der oben ausführlich beschriebenen Faseranordnung, gelangen wobei von jeder Einzellinse der PAW Linse Fasereintrittsflächen beaufschlagt werden und über diesen zugeordnete Detektoren eine Intensitätsmessung erfolgt um die Deformation der Wellenfront zu ermitteln. Statt der PAW Linsen können in 68 auch die weiter oben schon erwähnten Glaspyramiden eingesetzt werden.
Wird die zuvor genannte erfindungsgemäß bevorzugte Ausführungsform eines ultraschnellen Wellenfrontsensors 60 in einem Laser-Scanning-Mikroskop 70 in eine Detektionsebene 63 oder eine auf diese Ebene nachfolgende Pupillenebene integriert (9) so kann die Sub-Airy Amplituden- und Phasen(Wellen)-verteilung ermittelt werden, was wiederum die Anwendung der Sheppard-Methode ermöglicht, d. h. eine für hohe Ortsfrequenzen bessere Übertragungsfunktion und damit bessere Auflösung ist berechenbar.
Gemäß 9 besteht die gezeigte bevorzugte Ausführungsform eines Laser-Scanning-Mikroskops 70 wie anhand der – ausführlich beschrieben aus einem Beleuchtungsstrahlengang, einer Scan-Einrichtung, einem typischen Mikroskop-System bestehend aus mindestens einer Tubuslinse, bestehend aus mindestens einem Objektiv und einem Probenraum mit Probe, auf die das Beleuchtungslicht gelenkt wird. Nach Wechselwirkung mit der Probe wird das Probenlicht in einem Detektionsstrahlengang geführt um schließlich in den ultraschnellen Wellenfrontsensor 60 einzutreten und detektiert zu werden.
11 zeigt in schematischer Darstellung eines Laser-Scanning-mikroskops 70 mit Sub-Airy ortsaufgelöste Amplituden- und Phasenmessung unter Verwendung eines ultraschnellen Wellenfrontsensors 60. Für die Größenanpassung der Lichtverteilung des Detektionslichts 53 an den ultraschnellen Wellenfrontsensor 60 für eine optimale Sub-Airy-Abtastung befindet sich eine einstellbare Fokussieroptik 50 mit fester Fokuslage im Strahlengang. Insbesondere sollte die Größe/Durchmesser einer einzelnen Faser sollte nicht größer als Airy/3 sein.
12 zeigt eine schematische Darstellung eines (Laser-Scanning-)Lichtmikroskops 70 mit Sub-Airy ortsaufgelöste Amplituden- und Phasenmessung unter Verwendung eines ultraschnellen Wellenfrontsensors 60. Für die Größenanpassung der Lichtverteilung des Detektionslichts 53 an den ultraschnellen Wellenfrontsensor 60 für eine optimale Sub-Airy-Abtastung befindet sich eine Zoom-Optik 47 im gemeinsamen Beleuchtungs- und Detektionsstrahlengang (Pupille).
Ist dies der Fall, so kann hiermit das Objektiv optimal ausgeleuchtet werden und das Detektionslicht behält stets den gleichen Durchmesser vor der Detektionsoptik 50. Die Wellenlängenabhängigkeit der Lichtverteilung in der sogenannten „Pinhole-Ebene” 54, die optisch konjugiert zur erfassten Probenebene liegt, kann kompensiert werden, in dem die Objektivpupille für die kleinste benutzte Beleuchtungswellenlänge optimal bestrahlt und für die größeren Wellenlängen überstrahlt wird, um stets eine gleich große Lichtverteilung in der Pinhole-Ebene 54 auf dem Mikrolinsen-Array 64 zu gewährleisten.
Zweites Verfahren (Phase Retrival):
In einer ersten Ausführung wird ein 50:50 Strahlteiler, der ggf. mit einem Farbteiler zur chromatischen Trennung auswechselbar sein kann eingesetzt um eine Detektion über mindestens zwei im Wesentlichen identische Faserbündel zu realisieren.
Eine der Detektionseinheiten sollte hierbei in der Schärfentiefe des Objektives in der Detektionsebene liegen wegen der korrekten Ortsinformation (Amplitude).
Die beiden durch den Strahlteiler erzeugten Teilstrahlengänge weisen eine Weglängendifferenz auf die einstellbar sein kann.
Während der Abtastung der Probe (Bilderzeugung) sollte die Weglängendifferenz konstant sein, um entsprechende Korrekturen zu vermeiden.
13 zeigt eine technisch bevorzugte Ausführungsform bei der zur Bestimmung der Amplituden- und Phasenverteilung die Phase-Retrieval-Methode zur Anwendung kommt. Die technisch bevorzugte Ausführungsform ist derart gestaltet, dass zur Umsetzung der genannten Methode zwei Sub-Airy ortsauflösende, sensitive, schnelle, faserbasierte Detektionssystems 60 und 60.1 ohne Mikrolinsen-Arrays 65 und 65.1 in zwei unterschiedlichen Ebenen bezüglich der Pinhole-Ebene 64 (Fokusebene) verwendet werden. Eine der beiden Detektionseinrichtungen 60 und 60.1 kann dabei in der Pinhole-Ebene 64 stehen. Unter Verwendung der ortsaufgelöst gemessenen beiden Intensitätsbilder für jede Scan-Position des (beugungsbegrenzten) Beleuchtungsspots kann die räumliche Amplituden- und Wellenfrontverteilung und anschließend das besser aufgelöste Bild von der (Material) Probe berechnet werden.
In einer noch einfacheren Ausführungsform werden 2 oder mehrere Bilder Bilder mit unterschiedlicher Probenposition in axialer Richtung aufgenommen und die beiden sub-Array-aufgelösten Intensitätswerte sind zu verrechnen.
Dies kann mit einer Anordnung gemäß den 1–8 vorteilhaft erfolgen. Weiterhin denkbar sind Ansätze, bei denen zur Erfassung der Defokusinformation chromatische Längsfehler zusammen mit einer spektral-gefilterten Detektion ausgenutzt werden. Zudem gibt es Ansätze, bei denen diffraktive Optiken zum Einsatz kommen, um unterschiedliche Fokusebenen zu realisieren.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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EP 1157297 B1 [0006]
WO 2006127692 [0007]
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Claims

Mikroskop zur hochauflösenden Scanning-Mikroskopie einer Probe (2), mit – einer Beleuchtungseinrichtung (3) zum Beleuchten der Probe (2), – einer Abbildungseinrichtung (4) zum Scannen mindestens eines Punkt- oder Linien-Spots (14) über die Probe (2) und zum Abbilden des Punkt- oder Linien-Spots (14) in ein beugungsbegrenztes, ruhendes Einzelbild (17) unter einem Abbildungsmaßstab in eine Detektionsebene (18), – einer Detektoreinrichtung (19) zum Erfassen des Einzelbildes (17) in der Detektionsebene (18) für verschiedene Scanpositionen mit einer Ortauflösung, welche unter Berücksichtigung des Abbildungsmaßstabes in mindestens einer Ausdehnung/Dimension mindestens doppelt so groß ist wie eine Halbwertsbreite des beugungsbegrenzten Einzelbildes (17), – einer Auswerteeinrichtung (C) zum Auswerten einer Beugungsstruktur des Einzelbildes (17) für die Scanpositionen aus Daten der Detektoreinrichtung (19) und zum Erzeugen eines Bildes der Probe (17), das eine Auflösung aufweist, die über die Beugungsgrenze gesteigert ist, wobei – die Detektoreinrichtung (19) aufweist: – ein Detektorarray (24), das Pixel (25) aufweist und größer ist als das Einzelbild (17), und – ein nicht-abbildendes Umverteilungselement (20–21; 30–34; 30–35), das dem Detektorarray (24) vorgeordnet ist und die Strahlung aus der Detektionsebene (18) nicht-abbildend auf die Pixel (25) des Detektorarrays (24) verteilt.
Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Umverteilungselement ein Bündel (20) aus Lichtleitfasern (21), vorzugsweise aus Multi-Mode Lichtleitfasern, umfaßt, welches einen in der Detektionsebene (18) angeordneten Eingang (22) und einen Ausgang (23) aufweist, an dem die Lichtleitfasern (21) in einer geometrischen Anordnung, welche sich von der des Eingangs (22) unterscheidet, an den Pixeln (25) des Detektorarrays (24) enden.
Mikroskop nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtleitfasern (21) so vom Eingang (22) zum Ausgang (23) laufen, daß am Ausgang (23) benachbarte Lichtleitfasern (21) auch am Eingang (22) benachbart sind, um ein strahlungsintensitätsabhängiges Übersprechen nebeneinanderliegender Pixel (25) zu minimieren.
Mikroskop nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Umverteilungselement einen Spiegel (30) mit unterschiedlich geneigten Spiegelelementen (31), insbesondere einen Facettenspiegel, ein DMD oder einen adaptiven Spiegel, umfaßt, der Strahlung aus der Detektionsebene (18) auf die Pixel (25) des Detektorarrays (24) lenkt, wobei die Pixel (25) des Detektorarrays (25) eine geometrische Anordnung haben, welche sich von der der Spiegelelemente (31) unterscheidet.
Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Abbildungseinrichtung (4) eine der Detektionsebene (18) in Abbildungsrichtung vorgeordnete Zoomoptik (27) zur Anpassung der Größe des Einzelbildes (17) an die der Detektoreinrichtung (19) aufweist.
Mikroskop nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtungseinrichtung (3) und die Abbildungseinrichtung (4) sich eine Scaneinrichtung (10) teilen, so daß die Beleuchtungseinrichtung (3) die Probe (2) mit einem beugungsbegrenzten Punkt- oder Linien-Spot beleuchtet, der mit dem von der Abbildungseinrichtung abgebildeten Spot (14) zusammenfällt, wobei die Zoomoptik (27) so angeordnet ist, daß sie auch Bestandteil der Beleuchtungseinrichtung (3) ist.
Mikroskop nach einem der obigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Detektorarray (24) eine Detektorzeile, bevorzugt eine APD- oder PMT-Zeile ist.
Verfahren zur hochauflösenden Scanning-Mikroskopie einer Probe (2), bei dem – die Probe (2) beleuchtet wird, – mindestens ein scannend über die Probe (2) geführter Punkt- oder Linien-Spot (14) in ein Einzelbild (17) abgebildet wird, wobei der Spot (14) unter einem Abbildungsmaßstab beugungsbegrenzt in das Einzelbild (17) abgebildet wird und das Einzelbild (17) ruhend in einer Detektionsebene (18) liegt, – für verschiedene Scanpositionen das Einzelbild (17) mit einer Ortauflösung erfaßt wird, welche unter Berücksichtigung des Abbildungsmaßstabes mindestens doppelt so groß ist wie eine Halbwertsbreite des beugungsbegrenzten Einzelbildes (17), so daß eine Beugungsstruktur des Einzelbildes (17) erfaßt wird, – für jede Scanposition die Beugungsstruktur des Einzelbildes (17) ausgewertet wird und ein Bild der Probe (2) erzeugt wird, das eine Auflösung aufweist, die über die Beugungsgrenze gesteigert ist, wobei – ein Detektorarray (24) bereitgestellt wird, das Pixel (25) aufweist und größer ist als das Einzelbild (17), und – Strahlung des Einzelbildes aus der Detektionsebene (18) nicht-abbildend auf die Pixel (25) des Detektorarrays (24) umverteilt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Strahlung des Einzelbildes (17) mittels eines Bündels (20) aus Lichtleitfasern (21), vorzugsweise aus Multi-Mode Lichtleitfasern, umverteilt wird, welches einen in der Detektionsebene (18) angeordneten Eingang (22) und einen Ausgang (23) aufweist, an dem die Lichtleitfasern (21) in einer geometrischen Anordnung, welche sich von der des Eingangs (22) unterscheidet, an den Pixeln (25) des Detektorarrays (24) enden.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtleitfasern (21) so vom Eingang (22) zum Ausgang (23) geführt werden, daß am Ausgang (23) benachbarte Lichtleitfasern (21) auch am Eingang (22) benachbart sind, um ein strahlungsintensitätsabhängiges Übersprechen nebeneinanderliegender Pixel (25) zu minimieren.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Bündel (20) aus Lichtleitfasern (21) und das Detektorarray (24) kalibriert werden, indem jede Lichtleitfaser (21) einzeln mit Strahlung beaufschlagt wird, Störsignal in Pixeln (25), die am Ausgang (23) benachbarten Lichtleitfasern (21) zugeordnet sind, erfaßt werden und eine Kalibriermatrix aufgestellt wird, mit der bei Mikroskopie der Probe (2) ein strahlungsintensitätsabhängiges Übersprechen nebeneinanderliegender Pixel (25) korrigiert wird.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Strahlung des Einzelbildes (17) mittels eines Spiegels (30) mit unterschiedlich geneigten Spiegelelementen (31), insbesondere einen Facettenspiegel, ein DMD oder einen adaptiven Spiegel, umverteilt wird, wobei durch den Spiegel (30) die Strahlung aus der Detektionsebene (18) auf die Pixel (25) des Detektorarrays (24) geleitet wird und die Pixel (25) des Detektorarrays (24) eine geometrische Anordnung haben, welche sich von der der Spiegelelemente (31) unterscheidet.
Verfahren nach einem der obigen Verfahrensansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Detektorarray (24) eine Detektorzeile, bevorzugt eine APD- oder PMT-Zeile verwendet wird.
Verfahren nach einem der obigen Verfahrensansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Bewegungsrichtung des Scannens des Punkt- oder Linien-Spots (14) ermittelt wird, indem Signale einzelner Pixel (25) des Detektorarrays (24) mittels Kreuzkorrelation ausgewertet werden.
Verfahren nach einem der obigen Verfahrensansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Veränderungen in der Probe (2) erfaßt werden, indem bei in der Probe (2) ruhendem Punkt- oder Linien-Spot (14) eine zeitliche Veränderung des beugungsbegrenzten Einzelbildes (17) ermittelt und ausgewertet wird.
Verfahren oder Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche wobei Amplitude und/oder Phase der durch die Probe beeinflussten Wellenfront durch Mittel zur Erfassung der Wellenfront ortsaufgelöst erfasst wird.
Verfahren oder Anordnung nach Anspruch 16, wobei mittels eines Wellenfrontsensors die Beeinflussung der Phase durch die Probe bestimmt wird.
Verfahren oder Anordnung nach Anspruch 17, wobei der Wellenfrontsensor ein Shack-Hartmann Sensor ist.
Verfahren oder Anordnung nach Anspruch 17, wobei der Wellenfrontsensor ein WIS-Sensor ist.
Verfahren oder Anordnung nach Anspruch 17, wobei der Wellenfrontsensor ein PAW-Wellenfrontsensor oder Pyramidensensor ist.
Verfahren oder Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 1–16, wobei die Wellenfrontbestimmung über interferometrische oder holographische Verfahren erfolgt.
Verfahren oder Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 1–16, wobei die Wellenfrontbestimmung über ein Phase Retrieval Verfahren erfolgt.
Verfahren oder Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 1–22, wobei vor den Lichteintrittsflächen des Umverteilungselements ein Linsenarray angeordnet ist das pro Linse mehrere, mindestens drei, vorzugsweise 4 Lichteintrittsflächen beaufschlagt.
Verfahren oder Anordnung nach Anspruch 23, wobei mittels den Lichteintrittsflächen zugeordneten Empfängern über die Intensitätsmessung der beaufschlagten Lichteintrittsflächen die Lage des jeweiligen Linsenspots ermittelt wird.
Verfahren oder Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 23 oder 24, wobei durch eine lokale Versetzung der Linsenspots eine Wellenfrontdeformation bestimmt wird.
Verfahren oder Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 23–25, Eichmessung der Lage der Linsenspots ohne Probenbeeinflussung erfolgt, vorzugsweise über einen ebenen Spiegel in der Probenebene.
Verfahren oder Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 1–16, wobei Wellenfrontdeformationen bestimmt werden indem mehrere Bildaufnahmen bzw. Detektionen des Beleuchtungsspots bei in Richtung der optischen Achse versetzter Position der Detektion erfolgen.
Verfahren oder Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 1–16, mit mindestens einem Strahlteiler zur Aufteilung des Detektionslichtes in mindestens zwei Teilstrahlengänge in denen sich jeweils ein Umverteilungselement nach Anspruch 1–15 befindet, die unterschiedliche Weglängen zueinander aufweisen, vorgesehen ist.
Verfahren oder Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 1–16, wobei zur Ermittlung der Wellenfront und Phasenlage Bilder oder Beleuchtungsspots aus unterschiedlichen axialen Ebenen miteinander verglichen werden die durch eine Verschiebung der Probe und/oder der Detektion in axialer Richtung aufgenommen werden.
Verfahren oder Anordnung nach einem der vorangehenden Ansprüche 16–29, mit einer variablen Optik im Detektionsstrahlengang und/oder gemeinsamen Beleuchtungs/Detektionsstrahlengang.