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Die Erfindung betrifft ein Mikroskop zur Abbildung eines Objekts, das eine Objektebene zur Anordnung des Objekts, einen Abbildungsstrahlengang, einen Beleuchtungsstrahlengang, eine Detektionseinrichtung und eine Steuereinrichtung umfasst. Ferner betrifft die Erfindung ein Mikroskopieverfahren zur Abbildung eines Objekts, welches die folgenden Schritte umfasst: Anordnen des Objekts in einer Objektebene; Abbilden des Objektes mit einer einen Mindest-Durchmesser in der Objektebene festlegenden Auflösung aus der Objektebene in eine Bildebene mit einem Abbildungsstrahlengang.
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Eine solches Verfahren und Mikroskop sind aus der gattungsbildenden
US 2009 / 0 218 527 A1 bekannt. Sie beschreibt ein konfokales Mikroskop zur Abbildung eines Objektes umfassend eine Lichtquelle, die eine zweidimensionale Anordnung von Leuchtdioden umfasst und fähig ist, eine Folge von Beleuchtungsmustern von Beleuchtungslicht zu erzeugen, einen 2D-Lichtdetektor, der zum Erfassen von Licht fähig ist, und ein optisches System.
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Aus LI, Long; [et al.]: Nano-displacement measurement based on virtual pinhole confocal method. In: Measurement Science and Technology, IOP, Bristol, GB, Bd. 24, Nr. 3, 19. Februar 2013 (2013-02-19), Seite 35003 ist es bekannt, benachbarte Detektionspixel in dem Array in einem Abstand zueinander anzuordnen, der kleiner als der Airy- Durchmesser ist. Dies dient der Auflösungsverbesserung, welcher sich auch die Veröffentlichung DE LUCA, Giulia M. R.; [et al.]: Re-scan confocal microscopy: scanning twice für better resolution. In: Biomedical Optics Express, Bd. 4, Nr. 11, 25. Oktober 2013 (2013-10-25), Seite 2644, widmet.
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Bei konfokalen Mikroskopen lässt sich eine Auflösung erreichen, die besser als die durch das Mikroskop festgelegte Beugungsgrenze ist, wenn das Objekt mit einer Schrittweite abgetastet wird, die kleiner als die Beugungsgrenze ist. Beispielhaft sei in diesem Zusammenhang auf die
DE 102010049627 A1 verwiesen. Ferner ist es bekannt, die Scanbewegung zum Beleuchten des Objekts nicht durch mechanische Teile zu realisieren, sondern durch ein Array von Lichtquellen, wie dies beispielsweise in der
DE 102012217967 A1 oder in dem Artikel G. Zheng et al., Microscopy refocusing and dark-field imaging by using a simple LED array, October 15, 2011, Vol. 36, No. 20, Optics Letters beschrieben ist. A. G. York et al., Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy, May 13, 2012, Nature Methods, beschreiben, wie das Signal-zu-Rausch-Verhältnis durch Addition der Signale mehrerer konfokaler Abbildungen verbessert werden kann. A. G. York et al., Instant superresolution imaging in live cells and embryos via analog image processing, October 6, 2013, Nature Methods, beschreiben wie das Auslesen von Detektoren beschleunigt werden kann.
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Darüber hinaus offenbart die
DE 102013001238 A1 ein Verfahren, wie bei einem hochauflösenden Mikroskop der Rechenaufwand zur Auswertung der Signale von der Detektionseinrichtung verringert werden kann. Ein solches Verfahren sei mit Bezug auf
1 erläutert. Dort ist schematisch ein Schnitt durch eine Probe entlang der x-Achse dargestellt. Die Probe umfasst einen fluoreszierenden Probenpunkt 110. Zudem ist ein Beleuchtungsspot 112 dargestellt. Dessen Intensität I ist auf der Ordinate angegeben. Die Abmessungen des Beleuchtungsspots 112 können beugungsbegrenzt sein und sind in der x-Richtung größer als der Probenpunkt 110. Trifft der Beleuchtungsspot 112 den Probenpunkt 110, wird dieser zur Fluoreszenz angeregt und strahlt Probenlicht aus, welches von einer Detektoreinrichtung nachgewiesen werden kann. In
1 ist weiter eine, hier unendlich scharfe, Projektion der Detektoreinrichtung 114 in die Probenebene eingetragen. Die Detektoreinrichtung 114 umfasst mehrere Detektorelemente 116, 118. Diese empfangen nicht nur Probenlicht, das von einem einzigen Punkt der Probe ausgeht. Vielmehr wird auf jedes Detektorelement 116, 118 ein ausgedehnter Empfangsbereich abgebildet, welcher durch die PSF (Point Spread Function, Punktbildverwaschungsfunktion) der Abbildung bestimmt ist. Die PSF für das Detektorelement 118 ist als gestrichelte Kurve 120 dargestellt. Die Abmessungen des Beleuchtungsspots 112 können ebenfalls durch eine PSF einer Punktlichtquelle bestimmt sein. Die von einem bestimmten Detektorelement 118 gemessene Lichtintensität wird nun durch eine Gesamt-PSF bestimmt, welche das Produkt der PSF zum Beleuchtungsspot 112 und der PSF 120 zum Detektorelement 118 ist. Das Maximum der Gesamt-PSF liegt in etwa mittig zwischen dem Beleuchtungsspot 112 und der PSF 120 des jeweiligen Detektorelements 118. Im dargestellten Beispiel empfängt das Detektorelement 118 daher Licht hauptsächlich von einem Ort 122A, der mittig zwischen dem Beleuchtungsspot 112 und der PSF 120 liegt. Hingegen misst das Detektorelement 118 kaum Licht an der Position 122D, obwohl an dieser die zugehörige PSF 120 ihr Maximum hat. Zur Abtastung der Probe wird nun der Beleuchtungsspot von der Position 124D auf beispielweise 124B verschoben. Dies wird vorliegend als Beleuchtungsabtastbewegung bezeichnet. Hierdurch verschiebt sich die Gesamt-PSF des Detektorelements 118. Dieses misst nun nicht mehr Licht von hauptsächlich der Position 122A, sondern von 122B. Dieser Umstand kann zur Auflösungssteigerung genutzt werden. Dazu werden die Detektorelemente zu jeder Position des Beleuchtungsspots 112 ausgelesen. Die dabei gemessenen Probenlichtsignale werden abhängig von der Position des Beleuchtungsspots 112 verschiedenen Probenbereichen zugeordnet. Das heißt, die von ein und demselben Detektorelement gemessenen Probenlichtsignale werden abhängig von der Position des Beleuchtungsspots 112 umsortiert.
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Das Umsortieren ist durch die gebogenen, durchgezogenen Pfeile unterhalb der Querachse veranschaulicht. Demnach wird ein Signal des Detektorelementes 118 dem Ort 122A des Objekts 110 zugeordnet, wenn sich ein Beleuchtungsspot an der Stelle 124D befindet. Analog wird ein Signal des Detektorelementes am Ort 122C bei einem Beleuchtungsspot an der Stelle 124C dem Ort des Objekts 110 zugeordnet. Auch wird ein Signal des Detektorelementes 122B bei einem Beleuchtungsspot an der Stelle 124B dem Ort des Objekts 110 zugeordnet. In dieser Weise kann eine Auflösungsverbesserung erreicht werden. Der apparative Aufwand zum Erreichen dieses Umsortierens ist jedoch hoch. Zudem ist ein Zeitbedarf zum Berechnen des Umsortierens verhältnismäßig groß.
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Die Verbesserung der Auflösung kann auch als stärkere Gewichtung der höheren Raumfrequenzen im Optischen-Transfer-Spektrum eines Single-Spot-Systems beschrieben werden. Weil für die Bilderzeugung die Lichtverteilung innerhalb eines 1-Airy-Pinhole-Durchmessers verwendet wird, können mehr Photonen nachgewiesen werden. Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis ist damit verbessert. Der Probenbereich, aus dem ein bestimmtes Detektorelement die größte Lichtmenge empfängt, hängt, wie mit Bezug auf 1 erläutert, von der Position des Beleuchtungsmusters oder Beleuchtungsspots auf der Probe ab. Durch die Beleuchtungsabtastbewegung wird das Beleuchtungsmuster über die Probe verschoben. Dadurch verschiebt sich auch die Gesamt-PSF und somit der Probenbereich, aus dem ein bestimmtes Detektorelement die größte Lichtmenge empfängt.
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Als ein Vorteil kann durch die Detektionsabtastbewegung erreicht werden, dass ein bestimmtes Detektorelement Licht hauptsächlich aus stets demselben Probenbereich empfängt. Der Ort des Maximums der Gesamt-PSF wird durch die Beleuchtungs- und Detektionsabtastbewegung also möglichst kaum verändert. Hierzu muss die Detektionsabtastbewegung entgegengesetzt zur Beleuchtungsabtastbewegung sein und muss gleichzeitig mit dieser erfolgen. Die Wirkung einer entgegengesetzten Bewegung zwischen der Detektionsabtastbewegung und der Beleuchtungsabtastbewegung sei ebenfalls anhand der 1 erläutert. In der dargestellten Situation empfängt das Detektorelement 118 hauptsächlich Licht aus dem Bereich 122A. Hier hat die Gesamt-PSF ihr Maximum. In der Beleuchtungsabtastbewegung wird sodann der Beleuchtungsspot 112 in Richtung des Pfeils 126 bewegt, beispielsweise bis dessen Maximum an der Position 124C liegt. Gleichzeitig wird in einer Detektionsabtastbewegung der Empfangsbereich des Detektionselements 118 in die entgegengesetzte Richtung bewegt, also in Pfeilrichtung 128. Der Empfangsbereich des Detektionselements 118 kann als Ausdehnung von dessen PSF 120 bis zu den ersten Minima der PSF 120 angesehen werden. Wird diese so weit in Pfeilrichtung 82 bewegt, bis ihr Maximum an der Position 122C liegt, so befindet sich das Maximum der Gesamt-PSF des Detektorelements 118 weiterhin an der Position 122A. Hierdurch kann vorteilhafterweise das zum Stand der Technik beschriebene Umsortieren vermieden werden, bei welchem die Empfangssignale eines bestimmten Detektorelements abhängig von der Position des Beleuchtungsspots verschiedenen Probenpositionen zugeordnet werden.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mikroskop und ein Mikroskopieverfahren bereitzustellen, bei dem die Abbildung des Objekts vereinfacht werden kann.
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Die Aufgabe wird durch das Mikroskop nach Anspruch 1 sowie durch das Mikroskopieverfahren nach Anspruch 9 gelöst. Die abhängigen Ansprüche beschreiben bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung.
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Die Erfindung schafft ein Mikroskop zur Abbildung eines Objekts, das eine Objektebene zur Anordnung des Objekts, einen Abbildungsstrahlengang, einen Beleuchtungsstrahlengang, eine Detektionseinrichtung und eine Steuereinrichtung umfasst. Der Abbildungsstrahlengang bildet das Objekt mit einer einen Mindest-Durchmesser in der Objektebene festlegenden Auflösung aus der Objektebene in eine Bildebene ab. Der Beleuchtungsstrahlengang projiziert Beleuchtungsstrahlung einer Beleuchtungseinrichtung in die Objektebene, wobei die Beleuchtungseinrichtung eine Vielzahl von Lichtquellen aufweist und die Lichtquellen - in die Objektebene projiziert - die Form eines 2D-Arrays haben, wobei benachbarte Lichtquellen in dem Array in einem Abstand zueinander angeordnet sind, der kleiner als der Mindest-Durchmesser ist. Die Detektionseinrichtung weist eine Vielzahl von Detektionspixel auf, wobei die Detektionspixel - in die Objektebene projiziert - die Form des 2D-Arrays haben, wodurch benachbarte Detektionspixel in dem Array in einem Abstand zueinander angeordnet sind, der kleiner als der Mindest-Durchmesser ist. Die Steuereinrichtung steuert die Detektionseinrichtung und die Beleuchtungseinrichtung, wobei die Steuereinrichtung die Lichtquellen in dem Array in mindestens eine erste und eine zweite Gruppe einteilt, wobei jede Gruppe aus zueinander in den Array benachbarten Lichtquellen zusammengesetzt ist und ein Teil des Arrays abdeckt. Die Steuereinrichtung schaltet zu einem Zeitpunkt nur eine Lichtquelle der ersten Gruppe ein und schaltet die Lichtquellen der ersten Gruppe in einer Reihenfolge mit einer Taktung durch, wobei die Lichtquellen der zweiten Gruppe in gleicher Taktung wie die Lichtquellen der ersten Gruppe geschaltet werden. Das Mikroskop zeichnet sich dadurch aus, dass jedem Detektionspixel in dem Array genau eine Lichtquelle zugeordnet ist, wobei die Steuereinrichtung die Detektionseinrichtung mit zur Durchschaltung der Lichtquellen gleicher Taktung ausliest.
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Insbesondere erfolgt das Auslesen derart, dass die Steuereinrichtung für jede Gruppe Signale der Detektionspixel, welche durch einfallende Strahlung des Abbildungsstrahlengangs in einer der Taktung entsprechenden Zeitspanne erzeugt werden, in einer zu der Reihenfolge umgekehrten Abfolge aufsummiert. Bei dem Mikroskop ist jedem Detektionspixel genau eine Lichtquelle zugeordnet, so dass bei der Beleuchtung des Objekts mit einer der Lichtquellen das von dem Objekt reflektierte oder emittierte Licht hauptsächlich von einem entsprechenden Detektionspixel detektiert wird. Durch das Auslesen der Detektionseinrichtung nach jedem Anschalten einer oder mehrerer Lichtquellen, kann erreicht werden, dass eine konfokale Abbildung des Objekts generiert werden kann, ohne dass Teile in dem Mikroskop mechanisch bewegt werden müssen. Somit kann die Aufnahmegeschwindigkeit des Mikroskops erhöht werden, da es nicht länger notwendig ist, Elemente des Mikroskops mechanisch zu bewegen, was bekannterweise die Aufnahmegeschwindigkeit des Mikroskops reduziert.
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Das Mikroskop dient vorzugsweise zur konfokalen Abbildung des Objekts, wobei für die konfokale Abbildung mehrere Pinholes, insbesondere in Form eines Pinhole-Arrays, vorgesehen sein können. Alternativ können die Detektionspixel ein virtuelles Pinhole bereitstellen, so dass keine Pinholeblenden im Abbildungsstrahlengang vorgesehen werden müssen. Auf diese Weise lässt sich der Aufbau des Mikroskops weiter vereinfachen. Das Objekt weist insbesondere fluoreszierende Strukturen, beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffe auf. Insbesondere ist die Strahlung des Beleuchtungsstrahlengangs derart, dass in dem Objekt die Emission von Fluoreszenzlicht angeregt wird. Das Mikroskop weist bevorzugt eine Strahlteilereinrichtung auf, mittels welchem Strahlung des Abbildungsstrahlengangs von Strahlung des Beleuchtungsstrahlengangs getrennt werden kann. Die Detektionseinrichtung ist insbesondere ausgebildet, Strahlung im Wellenlängenbereich des Emissionsspektrums des Fluoreszenzlichts des Objekts zu detektieren.
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Der Abbildungsstrahlengang legt aufgrund seiner Optiken und/oder anderer Elemente einen Mindest-Durchmesser in der Objektebene fest. Vorzugsweise entspricht der Mindest-Durchmesser dem Airy-Durchmesser, mit welchem das Objekt von der Objektebene in die Bildebene abgebildet wird. Die Detektionspixel der Detektionseinrichtung sind in die Objekteebene projiziert in einem 2D-Array angeordnet, wobei der Abbildungsstrahlengang der Detektionspixel derart in die Objektebene projiziert, dass Detektionspixel in der Objektebene einen Abstand haben, der kleiner als der Mindest-Durchmesser, insbesondere kleiner als der Airy-Durchmesser, ist. Somit ist es mit den Detektionspixeln möglich, ein hochauflösendes Bild des Objekts zu erzeugen, wie dies aus dem Stand der Technik bekannt ist. Ein Detektionspixel kann mehrere Pixel oder Elemente umfassen, die jeweils zur Umwandlung von einfallender Strahlung in elektrische Signale ausgebildet sind.
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Die Beleuchtungseinrichtung kann als Display oder Monitor ausgebildet sein, wobei die einzelnen Pixel des Monitors oder des Displays die Lichtquellen bilden. Weiter ist es möglich, dass die Beleuchtungseinrichtung ein Array von Light Emitting Diodes (LED) umfasst, wobei die einzelnen LED den Lichtquellen entsprechen. Der Beleuchtungsstrahlengang weist Optiken und andere Elemente auf, welche die Lichtquellen derart in die Objektebene abbilden, dass der Abstand von zwei Lichtquellen kleiner als der Mindest-Durchmesser, insbesondere kleiner als der Airy-Durchmesser, ist. Die Anordnung der Lichtquellen in der Beleuchtungseinrichtung ist wieder derart, dass die Lichtquellen in der Objektebene ein 2D-Array bilden. Bei dem Mikroskop ist es vorgesehen, dass jedes Detektionspixel genau einer Lichtquelle zugeordnet ist. Insbesondere sind genauso viele Detektionspixel wie Lichtquellen vorgesehen. Vorzugsweise ist das in die Objektebene projizierte Array der Detektionspixel identisch mit dem in die Objektebene projizierte Array der Lichtquellen.
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Die Steuereinrichtung kann beispielsweise ein Mikroprozessor, ein Computer mit entsprechend versehenem Computerprogramm oder ein sonstiger elektrischer Schaltkreis sein. Die Steuereinrichtung ist datentechnisch mit der Detektionseinrichtung verbunden und erzeugt aus den elektrischen Signalen der Detektionspixel ein Bild des Objekts.
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Die Steuereinrichtung teilt die Lichtquellen in dem Array, d.h. in die Objektebene projiziert, in mindestens zwei Gruppen auf; es können jedoch auch drei oder mehr Gruppen vorgesehen sein. Vorzugsweise werden mehrere erste und/oder mehrere zweite Gruppen vorgesehen, wobei jede erste und/oder zweite Gruppe ein Aufnahmespot bildet, so dass eine Multispotbeleuchtung des Objekts realisiert werden kann. Die Anzahl der ersten und/oder zweiten Gruppen geben die Spots der Multispotbeleuchtung ein. Mit einer Gruppe von Lichtquellen soll ein bestimmter Punkt auf der Probe derart beleuchtet werden, dass die Verschiebung der Beleuchtung des Objekts durch Einschalten der verschiedenen Lichtquellen dieser Gruppe kleiner als der Mindest-Durchmesser, insbesondere kleiner als der Airy-Durchmesser, ist. Beispielsweise liegen die Lichtquellen in die Objektebene projiziert aneinander angrenzend, wobei insbesondere die Lichtquellen zweier unterschiedlicher Gruppen in die Objektebene projiziert um mindestens den Mindest-Durchmesser, insbesondere kleiner als der Airy-Durchmesser, voneinander beabstandet sind. Auf diese Weise lässt sich das Übersprechen (Crosstalk) zwischen den einzelnen Beleuchtungsspots verringern oder ganz vermeiden. Die einzelnen Lichtquellen einer Gruppe werden in einer Reihenfolge durchgeschaltet, was z. B. bedeutet, dass nur eine Lichtquelle der jeweiligen Gruppe zu einem Zeitpunkt eingeschaltet ist. Die Reihenfolge des Einschaltens der Gruppe ist beispielsweise derart, dass nacheinander eingeschaltete Lichtquellen zueinander in der Objektebene beabstandet sind. Entsprechende Lichtquellen zweier Gruppen werden vorzugweise gleichzeitig eingeschaltet, d. h. wenn zum Beispiel die Lichtquellen der ersten Gruppen eingeschaltet sind, leuchten alle Lichtquellen der jeweiligen Reihenfolge gleichzeitig. Bevorzugt werden die Lichtquellen derart durchgeschaltet, dass zwei hintereinander eingeschaltete Lichtquellen in dem Array zueinander benachbart sind.
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Die Steuereinrichtung liest die Detektionseinrichtung mit der gleichen Taktung wie das Durchschalten der einzelnen Lichtquellen aus. Insbesondere werden die Detektionspixel der Detektionseinrichtung über eine Zeitspanne in einem Auslesezyklus belichtet, welcher der Taktung entspricht. Die Detektionspixel erzeugen Signale, welche der Intensität der auf das jeweilige Detektionspixel einfallende Strahlung und der Dauer der einfallenden Strahlung entsprechen. Die Signale der einzelnen Detektionspixel werden von der Steuereinrichtung ausgewertet und zwar derart, dass die Signale in einer zu der Reihenfolge der des Einschaltens der Lichtquellen umgekehrten Abfolge ausgewertet werden. Auf diese Weise lässt sich das in der
DE 102013001238 A1 beschriebene Verfahren nachbilden, ohne dass bewegte mechanische Teile von Nöten sind. Dadurch lässt sich ferner die Abbildungsgeschwindigkeit erhöhen.
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Das Auslesen der Detektionseinrichtung kann auf verschiedene Weisen erfolgen. In einer ersten Variante ist es bevorzugt, dass die Steuereinrichtung alle Detektionspixel gleichzeitig ausliest. Beispielsweise können dazu charge-coupled devices (CCD-Sensoren) verwendet werden. In dieser Ausführungsform werden alle Detektionspixel pro Taktung gleichzeitig ausgelesen, nachdem die Lichtquellen der verschiedenen Gruppen ein- und ausgeschaltet wurden. Nach dem Auslesen werden dann die in der Reihenfolge nächsten Lichtquellen der einzelnen Gruppen eingeschaltet. Zum Erzeugen des Bilds des Objekts wertet vorzugsweise die Steuereinrichtung die von den Detektionspixel erzeugten Signale aus, wobei die Signale von der Steuereinrichtung in der zu der Reihenfolge umgekehrten Abfolge umverteilt werden. Es werden somit nur die Signale der Detektionspixel pro Auslesezyklus ausgewertet, welche von den eingeschalteten Lichtquellen Strahlung empfangen. Die Steuereinrichtung führt demnach die aus dem Stand der Technik bekannte Umverteilung und Aufsummierung der Signale entsprechend der Reihenfolge des Ein- und Ausschaltens der Lichtquellen durch. Vorteil dieser Ausführungsform ist, dass bekannte Verfahren zum Auslesen von Detektionseinrichtungen verwendet werden können.
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In dieser Ausführungsform erfolgt das Umverteilen und Aufsummieren der Signale der Detektionspixel durch die Steuereinrichtung. In einer anderen Variante kann das Auswerten der Signale dadurch erreicht werden, dass die Steuereinrichtung für jede Gruppe die Detektionspixel im entsprechenden Teil des Arrays in einer zu der Reihenfolge umgekehrte Abfolge ausliest. Insbesondere liest die Steuereinrichtung für jede Gruppe nur diejenigen Detektionspixel aus, welche in der jeweiligen Taktung den zugeordneten Lichtquellen entsprechen. Dies bedeutet, dass das Auslesen der Detektionspixel derart ausgeführt wird, dass nur diejenigen Detektionspixel pro Taktung ausgelesen werden, welche mit eingeschalteten Lichtquellen in Verbindung stehen. Auf diese Weise erfolgt das Auswerten nicht durch Herausgreifen der Signale, welche der einzelnen eingeschalteten Lichtquellen zugeordnet sind, sondern diese Zuordnung erfolgt dadurch, dass nur die entsprechenden Detektionspixel ausgelesen werden. Auf diese Weise wird der Rechenaufwand deutlich verringert.
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In einer Untervariante dieser Ausführungsform ist bevorzugt, dass die Steuereinrichtung durch einfallende Strahlung des Abbildungsstrahlengangs erzeugte Signale der Detektionspixel ausliest, wobei die Detektionspixel in einer Zeitspanne, bis alle Lichtquellen durchgeschaltet sind, belichtet bleiben. Die Detektionspixel dieser Ausführungsform können beispielsweise active pixel sensors umfassen, welche in CMOS-Technik gefertigt sind. Die Steuereinrichtung muss nunmehr nur noch die Signale der einzelnen Detektionspixel in der entsprechenden Reihenfolge auswerten. Im Vergleich zu der herkömmlichen Varianten zur Bestimmung einer Sub-Airy-Auflösung muss die Steuereinrichtung nun nicht länger die Signale der Detektionspixel pro Auslesezyklus umverteilen, da diese Umverteilung durch die Belichtung der Detektionspixel über verschiedene Auslesezyklen in den Detektionspixel direkt erfolgt. Die Steuereinrichtung muss lediglich die über mehrere Taktungen belichteten Detektionspixel mit Rücksicht auf die Taktung des Durchschaltens der Lichtquellen auslesen. Somit wird der Rechenaufwand reduziert.
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In einer weiteren Untervariante umfasst die Detektionseinrichtung einen CCD-Array-Sensor, wobei die Signale Ladungen sind und die Ladungen in den Detektionspixeln zum Umverteilen verschoben werden. In dieser Variante sind die Signale, die durch die von dem Abbildungsstrahlengang eintreffende Strahlung in den CCD-Sensor erzeugten Ladungen. Die in der
DE 102013001238 A1 beschriebene mechanische Bewegung zum Umverteilen wird hier dadurch realisiert, dass die Ladungen der einzelnen Detektionspixel verschoben werden. Bei herkömmlichen CCD-Sensoren werden die in jedem Detektorpixel akkumulierten Ladungen, welche insbesondere proportional zu auf diesen Detektorpixel eingefallenen Lichtmenge sind, in einer Bauart pro Auslesezyklus in eine Auslesereihe verschoben und dort durch ein Ausleseregister über Strom-Spannungswandler in ein Signal umgewandelt. Diese Sensoren werden Interline-Transfer-CCD-Sensoren (IT-CCD) genannt. Es gibt auch Frame-Transfer-CCD (FT-CCD)-Sensoren, bei welchen die Ladungen zum Auslesen im Gesamten auf einen Ausleseframe verschoben werden. Die Auslesereihen oder Ausleseframes sind bei herkömmlichen CCD-Sensoren derart angeordnet, dass sie während des Auslesens nicht belichtet werden. Bei den im Hinblick auf diese Ausführungsform des Mikroskops verwendeten CCD-Sensoren werden die Ladungen der einzelnen Detektionspixel nicht in unbelichtete Bereiche verschoben, sondern zu einem benachbarten Detektionspixel, der in einer zu der Reihenfolge umgekehrten Abfolge liegt. Durch dieses Verschieben werden Ladungen umverteilt, da die Detektionspixel stets belichtet werden. Ist die Abfolge des Verschiebens beendet, werden vorzugsweise alle Ladungen der Detektionspixel auf einen Ausleseframe bewegt. Das Verschieben der Ladungen erfolgt wie bereits erwähnt in der Taktung des Einschaltens der Lichtquellen.
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Das Verschieben der Ladungen bei CCD-Sensoren kann sehr schnell erfolgen. Beispielsweise kann das gesamte Feld bei einer Multispotbeleuchtung innerhalb von 36,4 µs bei einem Takt von 11 MHz (typischer Wert für Elektron-Multiplying-CCD (EMCCD)) durchgeschoben werden. Der Frametransfer und der Auslesevorgang dauert typischerweise ca. 30 ms, so dass nicht das Verschieben der Ladungen bzw. das Einschalten der Lichtquellen limitierend ist, sondern der Auslesevorgang. Das Auslesen kann beschleunigt werden, wenn nur bestimmte Teile der Detektionseinrichtung zum Auslesen verwendet werden, d.h. manche Detektionspixel nicht zum Auslesen herangezogen werden, was einer Beschneidung der Detektionseinrichtung gleichsteht. Auf diese Weise kann das Auslesen beschleunigt und 30 bis 100 Frames pro Sekunde erzeugt werden, was deutlich schneller ist, als bei herkömmlichen Mikroskopen, bei denen Teile mechanisch bewegt werden sollen.
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In einer alternativen Ausführungsform ist es bevorzugt, dass die Steuereinrichtung zum Auslesen der Detektionseinrichtung pro Taktung nur die der jeweiligen eingeschalteten Lichtquelle zugeordneten Detektionspixel in entsprechenden Teil des Arrays ausliest, wobei die Steuereinrichtung aus Informationen der einzelnen Detektionspixeln abhängig von den eingeschalteten Lichtquellen Beugungsbilder des Objekts berechnet. Dies stellt eine vereinfachte Variante der Ausführungsform dar, bei der alle Detektionspixel pro Taktung ausgelesen werden. Hier liest die Steuereinrichtung nur diejenigen Pixel aus, die für das anschließende Auswerten tatsächlich benötigt werden, somit kann der Ausleseaufwand deutlich reduziert werden und damit die Auslesegeschwindigkeit sowie die Zeit zum Berechnen des Beugungsbilds reduziert werden. Die Detektionspixel dieser Ausführungsform können beispielsweise active pixel sensors umfassen, welche in der CMOS-Technik gefertigt sind.
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Zur Beleuchtung des Objekts mit verschiedenen Farben ist bevorzugt, dass die Beleuchtungseinrichtung, in die Objektebene projiziert, Beleuchtungsstrahlung mit mindestens zwei unterschiedlichen Wellenlängenbereichen erzeugen kann, wobei vorzugweise die Steuereinrichtung die Lichtquelle hinsichtlich der Wellenlängenbereiche derart steuert, dass die Lichtquellen, die Strahlung unterschiedlicher Wellenlängenbereiche aussenden, - in die Objektebene projiziert - ein Abstand aufweisen, der größer als der Mindest-Durchmesser, insbesondere größer als der Airy-Durchmesser, ist. Zur Erzeugung von verschiedenen Wellenlängenbereichen für die Beleuchtung des Objekts kann jedes Detektionspixel ausgebildet sein, Licht in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen zu erzeugen. Alternativ können mehrere Beleuchtungspunkte, wie beispielsweise LEDs, eine Lichtquelle bilden, wobei die von den Beleuchtungspunkten erzeugte Strahlung, in die Objektebene projiziert, einen identischen Bereich mit identischer Intensitätsverteilung beleuchtet. Dazu können beispielsweise die Strahlung der einzelnen Beleuchtungspunkte über eine Strahlteilereinrichtung zusammengeführt werden. Das Einschalten der einzelnen Lichtquellen für jeden Wellenlängenbereich erfolgt wie oben beschreiben. Um ein Übersprechen der Strahlung des Abbildungsstrahlengangs (Crosstalk) zu vermeiden, ist vorgesehen, dass Lichtquellen, die pro Taktung gleichzeitig eingeschaltet werden und Strahlung unterschiedlicher Wellenlängenbereiche aussenden, um mindestens den Mindest-Durchmesser, insbesondere den Airy-Durchmesser, in der Objektebene beabstandet sind. Beispielsweise können Lichtquellen, die pro Taktung eingeschaltet sind und Licht gleichen Wellenlängenbereichs aussenden um zwei Mindest-Durchmesser, insbesondere zwei Airy-Durchmesser, in der Objektebene voneinander beabstandet sind, wobei vorzugsweise in der Objektebene zwischen diesen beiden eingeschalteten Lichtquellen eines Wellenlängenbereichs eine Lichtquelle eingeschaltet ist, die Strahlung eines anderen Wellenlängenbereichs aussendet.
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Der Mindestabstand in der Objektebene von einem Mindest-Durchmesser gilt insbesondere in beide Richtungen des Arrays. In dieser Ausführungsform ist es möglich, eine Multispotbeleuchtung des Objekts mit unterschiedlichen Farben bereitzustellen, bei der Crosstalk zwischen den Farben vermieden werden kann.
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Zur Detektion von verschiedenen Farben kann die Strahlung des Abbildungsstrahlengangs je nach Wellenlängenbereich beispielsweise mit Hilfe eines Strahlteilers aufgeteilt werden und auf unterschiedliche Arrays von Detektionspixel abgebildet werden, welche jeweils zur Detektion des entsprechenden Wellenlängenbereichs ausgebildet sind. In einer anderen Ausführungsform ist bevorzugt, dass jeder Detektionspixel mindestens zwei Farbpixel umfasst, wobei jedem Farbpixel ein unterschiedlicher Farbfilter vorgeordnet ist und wobei vorzugsweise die Steuereinrichtung alle Farbpixels eines Detektionspixel gleichzeitig ausliest. Bei dieser Variante wird das Prinzip einer Beyer-Matrix genutzt. Jedes Detektionspixel weist somit mehrere Subpixel oder Farbpixel auf, welche zur Detektion von Strahlungen unterschiedlicher Wellenlängenbereichen ausgebildet sind. Um Übersprechen (Crosstalk) zu vermeiden, ist jedem Farbpixel in dem Abbildungsstrahlengang ein Farbfilter vorgeordnet, der nur Strahlung des Wellenlängenbereichs durchlässt, der mit Hilfe des jeweiligen Farbpixels detektiert werden soll. Die Farbpixel können identisch sein und Strahlung über einen großen Wellenlängenbereich detektieren, wobei mit Hilfe der Farbfilter eine Aufteilung in die unterschiedlichen Wellenlängenbereichen des Emissionsspektrums eine Aufteilung erfolgt. Alternativ dazu können die Farbpixel ausgebildet sein, den jeweiligen Wellenlängenbereich, dessen Strahlung der Farbfilter transmittiert, mit hoher Sensitivität zu detektieren.
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Werden Fluoreszenzfarbstoffe über einen längeren Zeitraum beleuchtet, steigt die Wahrscheinlichkeit, dass sie sich in einem Triplettzustand befinden und aus diesem heraus fotobleichen. Um dies zu vermeiden, ist es bevorzugt, dass die Steuereinrichtung die einzelnen Lichtquellen in der Reihenfolge mindestens zweimal durchschaltet und jeweils die Detektionseinrichtung ausliest. Somit wird eine längere Beleuchtung des Objekts, um das Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu erhöhen, dadurch erreicht, dass die jeweiligen Lichtquellen nicht länger beleuchtet werden, sondern öfter mit kürzeren Belichtungszeiten durchgeschalten werden. Beispielsweise kann die Frequenz der Beleuchtung im MHz-Bereich liegen. Da bei dem Mikroskop keine bewegten mechanischen Teile vorgesehen sind, ist dies auf einfachere Weise sehr realisierbar, so dass die Gefahr des Fotobleichens bei dem Mikroskop in vorteilhafter Weise vermieden werden kann. Die Steuereinrichtung mittelt insbesondere die Signale der einzelnen Auslesezyklen.
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Die Erfindung schafft ferner ein Mikroskopieverfahren zur Abbildung eines Objekts, welches die folgenden Schritte umfasst: Anordnen des Objekts in einer Objektebene; Abbilden des Objekts mit einer einen Mindest-Durchmesser, insbesondere einen Airy-Durchmesser, in der Objektebene festlegenden Auflösung aus der Objektebene in eine Bildebene mit einem Abbildungsstrahlengang; Projizieren von Beleuchtungsstrahlung einer Beleuchtungseinrichtung in die Objektebene mit einem Beleuchtungsstrahlengang, wobei die Beleuchtungseinrichtung eine Vielzahl von Lichtquellen aufweist und die Lichtquellen - in die Objektebene projiziert - die Form eines 2D-Array haben, wobei benachbarte Lichtquellen in dem Array in einem Abstand zueinander angeordnet sind, der kleiner als der Mindest-Durchmesser ist; Detektieren des Abbildungsstrahlengangs mit einer Detektionseinrichtung, welche eine Vielzahl von Detektionspixel aufweist, wobei die Detektionspixel - in die Objektebene projiziert - die Form des 2D-Array haben, wodurch benachbarte Detektionspixel in dem Array in einem Abstand zueinander angeordnet sind, der kleiner als der Mindest-Durchmesser ist, und wodurch jedes Detektionspixel in dem Array genau einer Lichtquelle zugeordnet ist; Einteilen der Lichtquellen in dem Array in mindestens eine erste und eine zweite Gruppe, wobei jede Gruppe aus zueinander in dem Array benachbarten Lichtquellen zusammengesetzt ist und einen Teil des Arrays abdeckt; Einschalten nur einer Lichtquelle der ersten Gruppe zu einem Zeitpunkt, Durchschalten der Lichtquellen der ersten Gruppe in einer Reihenfolge mit einer Taktung und Schalten der Lichtquellen der zweiten Gruppe in gleicher Taktung wie die Lichtquellen der ersten Gruppe; und Auslesen der Detektionseinrichtung mit zur Durchschaltung der Lichtquellen gleicher Taktung.
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Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Nachfolgend wird die Erfindung beispielsweise anhand der beigefügten Zeichnungen, die auch erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Es zeigen:
- 1 ein aus dem Stand der Technik bekanntes Prinzip der Signalentstehung bei Detektorelementen, deren Abstand zueinander kleiner als ein Mindest-Durchmesser ist;
- 2 eine schematische Darstellung des Aufbaus eines Mikroskops;
- 3a, b Ausführungsformen des in 2 dargestellten Mikroskops;
- 4 eine Darstellung zur Steuerung zum Einschalten von Lichtquellen und Auslesen von Detektionspixeln des in den 2 und 3 dargestellten Mikroskops;
- 5 eine Darstellung, welche das Einschalten der Lichtquellen mit unterschiedlichen Wellenlängenbereichen darstellt;
- 6 eine Darstellung einer Detektionseinrichtung des Mikroskops aus den 2 und 3; und
- 7 eine schematische Darstellung eines Detektionspixel der Detektionseinrichtung.
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Ein Mikroskop 10 dient insbesondere zur konfokalen Abbildung eines Objekts 12 mit einer Auflösung, die unter der Beugungsgrenze der Abbildung des Objekts 12 liegt. Dazu weist das Mikroskop 10 einen Beleuchtungsstrahlengang 14, einen Abbildungsstrahlengang 16, eine Beleuchtungseinrichtung 18, eine Detektionseinrichtung 20 und eine Steuereinrichtung 22 auf.
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Die Beleuchtungseinrichtung 18 weist eine Vielzahl von Lichtquellen 24 und eine Beleuchtungsoptik 26 auf. Die Lichtquellen 24 sind in einem 2D-Array angeordnet und jeweils mit der Steuereinrichtung 22 datentechnisch über eine elektrische Leitung verbunden, so dass die Steuereinrichtung 22 die einzelnen Lichtquellen 24 jeweils ein- und ausschalten kann. Die Lichtquellen 24 sind jeweils ausgebildet Strahlung mit unterschiedlichen Wellenlängenbereichen zu erzeugen. Die Beleuchtungsoptik 26 weist eine Brennweite auf, die mit einem Abstand zwischen der Vielzahl der Lichtquellen 24 und der Beleuchtungsoptik 26 übereinstimmt, so dass die von den Lichtquellen 24 abgegebene Strahlung nach Durchgang durch die Beleuchtungsoptik 26 parallelisiert ist. Die Lichtquellen 24 werden über den Beleuchtungsstrahlengang 14 in eine Objektebene des Mikroskops abgebildet, in der sich das Objekt 12 befindet.
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Der Beleuchtungsstrahlengang 14 weist eine Zoomoptik 28 und ein Objektiv 30 auf. Die Zoomoptik 28 ändert den Vergrößerungsmaßstab der Abbildung der Lichtquellen 24 in die Objektebene des Objekts 12. Das Objektiv 30 fokussiert die Strahlung des Beleuchtungsstrahlengangs 14 in die Objektebene des Objekts 12. Die Lichtquellen 24 sind derart angeordnet, dass diese in die Objektebene projiziert in einem 2D-Array angeordnet sind, wobei der Abstand der in die Objektebene projizierten Lichtquellen 24 kleiner als ein Mindest-Durchmesser, insbesondere kleiner als ein Airy-Durchmesser, ist, der durch den Abbildungsstrahlengang 16 definiert wird.
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Das Objekt 12 enthält Fluoreszenzfarbstoffe, die durch die von den Lichtquellen 24 erzeugte Strahlung angeregt werden. Die Fluoreszenzfarbstoffe in dem Objekt 12 emittieren Fluoreszenzlicht, das über den Abbildungsstrahlengang 16 auf die Detektionseinrichtung 20 abgebildet wird. Der Abbildungsstrahlengang 16 weist das Objektiv 30, die Zoomoptik 28, einen Strahlteiler 32 und einen Emissionsfilter 34 auf. Das Objektiv 30 sammelt die von dem Objekt 12 emittierte Fluoreszenzstrahlung ein, welche über die Zoomoptik 28 auf den Strahlteiler 32 trifft. Der Strahlteiler 32 ist als dichroitischer Spiegel ausgebildet, welcher die Strahlung des Beleuchtungsstrahlengangs 14 passieren lässt und die Strahlung des Abbildungsstrahlengangs 16 reflektiert. Die Strahlung des Abbildungsstrahlengangs 16 wird auf den Emissionsfilter 34 geleitet, welcher ausgebildet ist, Strahlung im Wellenlängenbereich der von den Lichtquellen 24 ausgesandten Strahlung zu blockieren und Strahlung im Spektralbereich des Emissionsspektrums der in dem Objekt 12 vorgesehenen Fluoreszenzfarbstoffe zu transmittieren. Von dem Emissionsfilter 34 gelangt die Strahlung des Abbildungsstrahlengangs 16 zu der Detektionseinrichtung 20.
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Die Detektionseinrichtung 20 weist eine Abbildungsoptik 36 und eine Kamera 38, welche eine Vielzahl von Detektionspixeln 40 umfasst, auf (vgl. 4 und 6). Die Abbildungsoptik 36 fokussiert die parallele Strahlung des Abbildungsstrahlengangs auf die Kamera 38. Projiziert man gedanklich die Detektionspixel 40 über den Abbildungsstrahlengang 16 in die Objektebene des Objekts 12, sind dort die einzelnen Detektionspixel 40 in einem 2D-Array angeordnet. Das Array der auch tatsächlich in die Objektebene projizierten Detektionspixel 40 überlappt identisch mit dem Array der in die Objektebene projizierten Lichtquellen 24. Die Detektionspixel 40 sind jeweils mit der Steuereinrichtung 22 datentechnisch verbunden, so dass die Steuereinrichtung 22 die Detektionspixel 40 einzeln ansteuern und auslesen kann. Die Steuereinrichtung 22 ist z. B. als Mikroprozessor ausgebildet. Die Detektionspixel 40 dienen als virtuelle Pinholes für die konfokale Abbildung des Objekts 12.
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Weitere Ausführungsformen des Mikroskops 10 werden im Zusammenhang mit den 3a und 3b beschrieben. Die Ausführungsformen des Mikroskops gemäß den 3a und 3b stimmen mit dem Mikroskop gemäß 2 bis auf die folgenden Unterschiede überein: Das Mikroskop gemäß 3a weist zusätzlich eine Pinholeeinrichtung 42 auf, die eine erste Pinholelinse 44, ein Pinholearray 46 und eine zweite Pinholelinse 48 umfasst. Die erste Pinholelinse 44 fokussiert die Strahlung des Beleuchtungsstrahlengangs 14 auf das Pinholearray 46, während die zweite Pinholelinse 48 die aus dem Pinholearray 46 austretende Strahlung anschließend parallelisiert. Somit entsprechen die Brennweiten der ersten Pinholelinse 44 und der zweiten Pinholelinse 48 jeweils dem Abstand zwischen dem Pinholearray 46 und der ersten Pinholelinse 44 und der zweiten Pinholelinse 48. Das Pinholearray 46 weist eine Vielzahl von Pinholes auf, welche derart angeordnet sind, dass sie mit dem Array der Lichtquellen 24 und dem Array von Detektionspixel 40 übereinstimmen. Auf diese Weise wird sichergestellt, dass die Projektion von den Lichtquellen 24 in die Objektebene des Objekts 12 mit der Projektion der Detektionspixel 40 in der Objektebene übereinstimmt.
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In 3b ist eine weitere Ausführungsform der Beleuchtungseinrichtung 18 dargestellt. Die Beleuchtungseinrichtung 18 weist die Vielzahl von Lichtquellen 24, ein Mikrolinsenarray 50, ein Beleuchtungspinholearray 52 und die Beleuchtungsoptik 26 auf. Das Mikrolinsenarray 50 weist eine Vielzahl von Mikrolinsen auf, von denen jeweils eine einer der Lichtquellen 24 zugeordnet ist. Die Mikrolinsen des Mikrolinsenarrays 50 fokussieren die aus den Lichtquellen 24 stammende Strahlung in Pinholes des Beleuchtungspinholearray 52. Das Beleuchtungspinholearray 52 stellt punktförmige Beleuchtungsquellen bereit. Somit kann mit Hilfe des Beleuchtungspinholearrays 52 eine Vielzahl von punkförmigen Beleuchtungsquellen erzeugt werden, auch wenn die Lichtquellen 24 eine Ausdehnung besitzen, bei der nicht länger von einer punkförmigen Beleuchtungsquelle ausgegangen werden kann. Die Beleuchtungsoptik 26 weist eine Brennweite auf, die dem Abstand zwischen dem Beleuchtungspinholearray 52 und der Beleuchtungsoptik 26 entspricht, so dass die Strahlung des Beleuchtungsstrahlengangs 14 nach Durchgang durch die Beleuchtungsoptik 26 parallelisiert ist.
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Das mit dem Mikroskop 10 durchgeführte Mikroskopieverfahren wird anhand der 4 und 5 näher erläutert. Die Steuereinrichtung 22 teilt die Vielzahl von Lichtquellen 24 in Gruppen 54a und 54b auf. Der in 4 links oben dargestellte Ausschnitt der Beleuchtungseinrichtung 18 zeigt eine Vergrößerung, in der die einzelnen Lichtquellen 24 sichtbar sind. In dem Ausschnitt sind einhundert Lichtquellen 24 vorgesehen, wobei die mit Ziffern belegten Lichtquellen 24 zwei ersten Gruppen 54a zugeteilt sind und die nicht mit Ziffer vorgesehen sind zwei zweiten Gruppen 54b zugeteilt sind. Die Lichtquellen 24 der mehreren ersten und zweiten Gruppen 54a, 54b werden in der dargestellten Reihenfolge, wie sie durch die Ziffern 1 bis 25 angegeben werden, nacheinander ein- und ausgeschaltet; dabei werden die entsprechenden Lichtquellen 24 der mehreren ersten und zweiten Gruppen gleichzeitig eingeschaltet. In dem in 4 dargestellten Beispiel sind die mit „1“ bezeichneten Lichtquellen 24 gerade eingeschaltet. Wenn diese ausgeschaltet werden, werden alle Lichtquellen 24 eingeschaltet, die mit „2“ bezeichnet sind. Jede zu einem gleichen Zeitpunkt eingeschaltete Lichtquelle 24 bildet einen Beleuchtungsstrahl für eine Multispotbeleuchtung. In dem in 4 gezeigten Beispiel werden achtzehn Lichtquellen 24 gleichzeitig eingeschaltet. Die Lichtquellen 24 werden in der Reihenfolge 1 bis 25 durchgeschaltet, wobei das Ein- und Ausschalten eine Taktung vorgibt. Sind die Lichtquellen 1 bis 25 durchgeschaltet, werden jeweils die Lichtquellen 24 der zweiten Gruppen 54b auf die gleiche Weise durchgeschaltet. Die Lichtquellen 24 einer Gruppe 54a, 54b werden wie zuvor ausgeführt derart in die Objektebene des Objekts 12 abgebildet, dass nacheinander eingeschaltete Lichtquellen einen Abstand aufweisen, der kleiner als der Airy-Durchmesser. insbesondere kleiner als der Airy-Durchmesser, ist. Der Mindest-Durchmesser ist in 4 durch Kreise dargestellt.
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Zum Erstellen des Beugungsbilds mit dem in der
DE 102013001238 A1 beschriebenen Verfahren werden Signale der Detektionspixel 40, welche der Strahlung des Abbildungsstrahlengangs 16 hinsichtlich ihrer Intensität und Dauer entsprechen, entsprechend einer Abfolge, die umgekehrt zu der Reihenfolge des Durchschaltens der Lichtquellen 24 ist, umverteilt. Wie dies in
4 oben rechts dargestellt wird, sind auch die Detektionspixel 40 entsprechend der Lichtquellen 24 in Gruppen 55a, 55b eingeteilt und eine Abfolge des Durchschaltens festgelegt, welche unterschiedlich zu der Reihenfolge der Lichtquellen 24 ist. Wird die Lichtquelle 24, welche mit „1“ bezeichnet wird eingeschaltet, so werden die Signale, die von den mit „1“ bezeichneten Detektionspixel 40 stammen, zur Auswertung herangezogen. Die Umverteilung erfolgt somit in der durch die Zahlen „1“ bis „25“ definierten Reihenfolge und für jeden Spot der Multispotbeleuchtung separat.
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Die Umverteilung der Signale der Detektorpixel 40 kann auf verschiedene Arten erfolgen. In einer Variante werden alle Detektionspixel 40 der Detektionseinrichtung 20 nach jedem Ein- und Ausschalten der Lichtquellen 24 komplett ausgelesen. Die Steuereinrichtung 22 summiert die Signale der Detektionspixel 40 entsprechend der umgekehrten Abfolge der Reihenfolge, wie die Lichtquellen 24 durchgeschaltet werden, auf. In dieser Ausführungsform kann die Kamera 38 einen CCD-Array-Sensor umfassen. In einer alternativen Variante liest die Steuereinrichtung 22 nur diejenigen Detektionspixel 40 aus, die jeweils den entsprechend eingeschalteten Lichtquellen 24 entsprechen. Dabei werden die Detektionspixel 40 kontinuierlich beleuchtet, so dass das Aufsummieren in umgekehrter Abfolge zur Reihenfolge des Durchschaltens der Lichtquellen 24 durch die kontinuierliche Belichtung der Detektionspixel 40 erfolgt.
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In einer weiteren Ausführungsform wie sie in
6 gezeigt ist, wird für die Kamera 38 ein CCD-Array-Sensor verwendet. Die Signale entsprechen dabei der Ladung wie sie durch die durch den Abbildungsstrahlengang 16 geführte Strahlung in den einzelnen Detektionspixel 40 des CCD-Sensors erzeugt werden. Auch hier werden die Detektionspixel 40 so lange kontinuierlich beleuchtet, bis die Lichtquellen 24 einer Gruppe 54a, 54b durchgeschaltet sind. Zum Umverteilen der Signale werden die Ladungen in der Reihenfolge umgekehrter Abfolge verschoben. Dadurch dass die Detektionspixel 40 kontinuierlich der Strahlung des Abbildungsstrahlengangs 16 ausgesetzt sind, findet im Ergebnis die Umverteilung der Signale direkt im Detektionspixel 40 statt, nämlich dadurch, dass die Detektionspixel 40 ständig der Strahlung des Abbildungsstrahlengangs 16 ausgesetzt sind. Die aus der
DE 102013001238 A1 beschriebene mechanische Bewegung der Abbildung wird hier durch das Verschieben der Ladungen ersetzt. Wurden die Ladungen entsprechend dem Durchschalten der Lichtquellen 24 in umgekehrter Reihenfolge verschoben, werden die Ladungen der Detektionspixel 40 auf einem Ausleseframe 56 transferiert und dort liest die Steuereinrichtung 22 die Ladungen aus.
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Die Lichtquellen 24 sind optional dazu ausgebildet, Strahlen in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen zu erzeugen. Dann ist es möglich, gleichzeitig das Objekt 12 mit Strahlung in unterschiedlichen Wellenlängenbereichen zu beleuchten. Ein mögliches Schaltmuster für die Lichtquellen 24 ist in 5 dargestellt. Hierbei sind gleichzeitig eingeschaltete Lichtquellen 24, die in 5 durch die entsprechenden Ziffern dargestellt sind, in die Objektebene projiziert um einen Mindest-Durchmesser beabstandet. Die jeweils gleichzeitig eingeschalteten Lichtquellen 24, die einer anderen eingeschalteten Lichtquelle 24 am nächsten sind, unterscheiden sich im Wellenlängenbereich der ausgesandten Strahlung. Somit alterniert der Wellenlängenbereich der jeweils gleichzeitig eingeschalteten Lichtquellen 24. Dies bedeutet, dass die Lichtquellen 24, die Strahlung im gleichen Wellenlängenbereich aussenden und gleichzeitig eingeschaltet sind, durch eine Lichtquelle 24, die Strahlung in einen anderen Wellenlängenbereich aussendet, voneinander getrennt sind. Dadurch kann das Übersprechen (Crosstalk) minimiert werden, da die entsprechenden Detektionspixel 40 entsprechend ausgelesen werden.
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Zur Detektion von Strahlung in einem breiten Wellenlängenbereich umfassen die Detektionspixel 40 mehrere Farbpixel 58, welche jeweils für einen Teilbereich des durch den Detektionspixel 40 detektierbaren Wellenlängenbereichs ausgebildet sind. Jedem Farbpixel 58 ist ein Farbfilter 60 im Abbildungsstrahlengang 16 vorgeordnet, der nur Strahlung in dem Wellenlängenbereich transmittieren lässt, welcher durch den jeweiligen Farbpixel 58 detektiert werden soll. Die Farbpixel 58 eines Detektionspixels 40 werden stets gleichzeitig ausgelesen.
