WO2005038441A1 - ３次元分析装置 - Google Patents

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WO2005038441A1
WO2005038441A1 PCT/JP2004/014105 JP2004014105W WO2005038441A1 WO 2005038441 A1 WO2005038441 A1 WO 2005038441A1 JP 2004014105 W JP2004014105 W JP 2004014105W WO 2005038441 A1 WO2005038441 A1 WO 2005038441A1
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light
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sample
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PCT/JP2004/014105
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Yoshinori Iketaki
Masaaki Fujii
Takeshi Watanabe
Takashige Omatsu
Kimihisa Yamamoto
Toshio Suzuki
Original Assignee
Japan Science And Technology Agency
Olympus Corporation
Nippon Roper Co., Ltd.
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
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    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
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    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G01N2021/6419—Excitation at two or more wavelengths

Definitions

  • the present invention particularly limits the observation region of a stained sample three-dimensionally, and analyzes a physical quantity related to the size and number of molecules in the sample based on a light response generated from the observation region. It relates to a three-dimensional analyzer.
  • Non-Patent Document 1 As an analysis method used in this kind of three-dimensional analyzer, for example, Masataka Kaneshiro, "Detection of DNA by Fluorescence Correlation Spectroscopy", Journal of the Japan Society of Precision Engineering, vol. 65, No. 2, 1999, p. 175-180 (hereinafter referred to as Non-Patent Document 1) is known as a fluorescence correlation method.
  • This fluorescence correlation method is a method that has been used for a long time in the analysis of diffusion motion of particles such as Brownian motion.For example, as shown in the principle diagram in FIG.
  • the fluorescence intensity in the observation area irradiated with the laser beam is measured for a long time, a fluorescence correlation function between the magnitude of fluorescence fluctuation and time is calculated, and the fluorescence correlation function is calculated based on the fluorescence correlation function. It analyzes physical quantities related to the size and number of molecules. Here, assuming that the number of fluorescent molecules in the observation area is N, the fluorescence intensity is proportional to N, so if the magnitude of fluctuation is expressed by SZN, it becomes (1ZN) 1/2 .
  • Fluctuation of fluorescence by the fluorescence correlation method is generally a force measured by an output current f (t) of a photomultiplier tube that receives fluorescence.
  • the f (t) is an extremely large diameter of a laser beam. Absent In this case, it is proportional to the amount of fluorescence.
  • the fluorescence correlation function is nothing less than obtaining a time-related correlation function for this f (t). If this is G ( ⁇ ), the fluorescence correlation function G ( ⁇ ) is given by the following equation (2). At this time, when the laser beam intensity is close to a Gaussian distribution, it can be simply expressed as in the following equation (3).
  • the fluorescence correlation method is a physical quantity that can provide the translational diffusion coefficient of a fluorescent molecule.
  • 1S Basically, any quantity of thermodynamic quantity that gives fluorescence fluctuations is measured by the same principle. Can be.
  • the laser beam is traversed by the flow of fluorescent molecules, fluctuations in fluorescence can be observed.
  • the speed of the molecule can be observed as fluctuation. In other words, the progress of the chemical reaction can be known in real time.
  • the rotational motion of a molecule can also be measured.
  • the number of molecules existing in the observation region can be directly measured from the intensity of the fluorescence correlation function G ( ⁇ ).
  • the fluctuation f (t) within a specific measurement time at which the expected fluctuation phenomenon is completed is measured, and Equation (2) is used from the measured f (t).
  • the mainstream is to use a CW (continuous light source) argon laser or krypton laser as the excitation light source to perform fluorescence correlation analysis of the dye molecules.
  • Fig. 15 shows a typical conventional system for performing fluorescence correlation analysis.
  • an argon laser 51 is used as an excitation light source, and the laser beam is transmitted through a beam splitter 52, and then focused and irradiated on a sample solution 54 containing fluorescent molecules by a lens 53.
  • the fluorescence from the sample solution 54 is collimated by a lens 53, reflected by a beam splitter 52, and collected by a lens 55, and the collected fluorescence is passed through a pinhole 56 to form a photomultiplier.
  • the detector 57 such as CCD, etc.
  • the output is amplified by the preamplifier 58, it is converted into digital data by analog Z digital (A / D) conversion and taken into the computing device 60, which also has the power of a computer, where the correlation function ⁇ ( ⁇ ) is calculated. I have.
  • the fluorescence correlation method is based on detecting fluctuations, it is desirable that the amount of fluorescent molecules existing in the observation region be as small as possible and one if possible.
  • the lower limit of the light irradiation region that induces the fluorescence is limited by the numerical aperture ⁇ ⁇ ⁇ of the lens 53 and the wavelength of light from the following equation (4). This is called the diffraction limit. Therefore, as the absolute amount of fluorescent molecules increases, it is necessary to narrow the light irradiation area in order to correspondingly reduce the number of fluorescent molecules crossing the observation area.
  • the focused diameter W of the laser beam is It is at most 436 nm.
  • the thickness of the solution sample 54 is basically the same as the depth direction of the light. Therefore, in actual measurement sites, it is required that the concentration of the fluorescent molecules in the solution sample 54 to be analyzed be extremely diluted, which is a major limitation of the practicality.
  • a pinhole 56 is generally installed at the confocal position so as to cut off the fluorescent light emitted in an area other than the focal plane! /
  • the resolution in the depth direction remains at only several / zm.
  • the positioning of the pinhole 56 is delicate, and the fluorescence of the measurement target is often cut.
  • the conventional system as shown in FIG. Cannot easily apply the fluorescence correlation method and cannot expect a high three-dimensional spatial resolution.
  • an object of the present invention made in view of a powerful situation is that even in a test solution containing a high concentration of photoresponsive molecules, the observation area is limited three-dimensionally and the correlation of photoresponse is determined.
  • An object of the present invention is to provide a three-dimensional analyzer that can accurately calculate a function.
  • the invention of a three-dimensional analyzer according to claim 1 that achieves the above object includes a first light source that generates a first light;
  • a second light source that generates a second light having a different wavelength from the first light
  • Calculating means for calculating a correlation function in the time domain of the response light based on the output of the light receiving means to analyze a desired physical quantity of the sample;
  • the invention according to claim 2 is the three-dimensional analyzer according to claim 1, wherein the sample includes molecules having at least three electronic states including a ground state.
  • the first light has a wavelength that causes the molecule to transition from a ground state to a first electronically excited state
  • the second light has a wavelength that causes the molecule to transition from the first electronically excited state to a second electronic state having a higher energy level.
  • the invention according to claim 3 is the three-dimensional analyzer according to claim 2, wherein the wavelength of the second light is in a stimulated emission wavelength band of the sample.
  • the invention according to claim 4 is the three-dimensional analyzer according to claim 2 or 3, wherein the wavelength of the second light is such that both the first light and the second light are irradiated. In a wavelength region that suppresses the generation of the response light in a spatial region.
  • the invention according to claim 5 is characterized in that, in the three-dimensional analyzer according to any one of claims 114, the response light is fluorescence.
  • the invention according to claim 6 provides the three-dimensional analysis device according to any one of claims 115. And a first irradiation intensity adjustment unit and a second irradiation intensity adjustment unit for independently adjusting the irradiation intensity of the first light and the irradiation intensity of the second light on the sample. Is what you do.
  • the invention according to claim 7 is the three-dimensional analysis device according to any one of claims 116, wherein at least the second light is coherent light. is there.
  • the invention according to claim 8 is the three-dimensional analysis device according to any one of claims 117, characterized in that the three-dimensional analyzer has a spatial modulation means for spatially modulating the second light. That is what you do.
  • the invention according to claim 9 is the three-dimensional analyzer according to claim 8, wherein the spatial modulation means is a spatial phase modulation means.
  • the invention according to claim 10 is the three-dimensional analyzer according to claim 9, wherein the spatial phase modulating means is spatially discontinuous (2m + l) ⁇ with respect to the second light. (Where m is an integer).
  • An eleventh aspect of the present invention is the three-dimensional analyzer according to the tenth aspect, wherein the spatial phase modulator has a phase plate force.
  • a twelfth aspect of the present invention is the three-dimensional analyzer according to the eleventh aspect, wherein the phase distribution region has an optical thin film for generating the phase difference on an optical substrate. is there.
  • the invention according to claim 13 is the three-dimensional analysis apparatus according to claim 11, wherein the phase distribution region has an etching region for generating the phase difference on an optical substrate. is there.
  • the invention according to claim 14 is the three-dimensional analyzer according to claim 12 or 13, wherein the phase distribution region has at least three concentric regions, and the adjacent region has the (2m + 1) A phase difference of ⁇ is generated.
  • the invention according to claim 15 is the three-dimensional analysis apparatus according to claim 12 or 13, wherein the phase distribution region also has two concentric region forces.
  • the invention according to claim 16 is the three-dimensional analyzer according to claim 15, wherein a radius of the inner region of the two regions is 3 ⁇ 4 ⁇ , and Light of light The bundle radius is 2 1/2 'r.
  • the invention according to claim 17 is characterized in that, in the three-dimensional analyzer according to claim 16, the center of the inner region and the center of curvature of the light beam diameter of the second light are matched. It does.
  • the invention according to claim 18 is the three-dimensional analyzer according to any one of claims 117, wherein the wavelength of the second light is obtained, and the numerical aperture of the optical system is NA.
  • the apparatus has a positioning mechanism for positioning a focal point of the first light and the second light by the optical system on the sample with an accuracy of 0.2 ⁇ ⁇ .
  • the invention according to claim 19 is the three-dimensional analyzer according to any one of claims 118, wherein the first light and the second light are applied to the sample by the optical system. And a two-dimensional scanning means for performing two-dimensional scanning in a plane orthogonal to the optical axis.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram showing an electronic structure of a valence orbit of molecules constituting a sample.
  • FIG. 2 is a conceptual diagram showing a first excited state of the molecule of FIG. 1.
  • FIG. 3 is a conceptual diagram showing the same first excited state force returning to the ground state.
  • FIG. 4 is a conceptual diagram showing the same second excited state.
  • FIG. 5 is a conceptual diagram showing the same second excited state force returning to the ground state.
  • FIG. 6 is a conceptual diagram for explaining a double resonance absorption process in a molecule.
  • FIG. 7 is a diagram showing a configuration of an example of a phase plate that can be used in the three-dimensional analyzer according to the present invention.
  • FIG. 8 is a diagram showing a configuration of another example of a phase plate that can be used in the same manner.
  • FIG. 9 is a diagram for explaining a light-converging pattern when receiving phase modulation.
  • FIG. 10 is a view showing a simulation result of an intensity distribution near a focal point of light phase-modulated by the phase plate shown in FIG. 8.
  • FIG. 11 is a diagram showing a schematic configuration of a three-dimensional analyzer according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 is a plan view and a cross-sectional view showing a configuration of the phase plate shown in FIG.
  • FIG. 13 is a diagram for explaining the principle of the fluorescence correlation method.
  • FIG. 14 is a diagram showing an example of the fluctuation of the fluorescence intensity by the same fluorescence correlation method.
  • FIG. 15 is a diagram showing a schematic configuration of a conventional fluorescence correlation analysis system.
  • the three-dimensional analyzer according to the present embodiment irradiates a molecule having three quantum states including a ground state with two lights having different wavelengths to induce a double resonance absorption process. Based on the induced fluorescence suppression effect!
  • Fig. 1 shows the electronic structure of the valence orbital of a molecule.
  • SO state ground state
  • Fig. 2 first electron excited state shown in Fig. 2
  • S1 state the first electron excited state shown in Fig. 2
  • S2 state the second electronically excited state
  • S2 state the second electronically excited state Due to this excited state, many molecules do not emit fluorescence as shown in FIG. 5, and the excitation energy is given to the external medium as heat and returns to the SO state.
  • FIG. 6 shows a conceptual diagram of the double resonance absorption process as in Fig. 5.
  • the horizontal axis X shows the spread of spatial distance, and the spatial area A1 irradiated with light of wavelength ⁇ 2 and the wavelength The light of ⁇ 2 is not irradiated!
  • the spatial region AO is shown.
  • wavelength ⁇ 1 and wavelength ⁇ 2 are spatially superposed, and the fluorescent region is suppressed by irradiation with light of wavelength ⁇ 2.
  • the fluorescent area can be narrower than the diffraction limit determined by the numerical aperture and wavelength of the condenser lens, and the spatial resolution can be substantially improved (hereinafter, referred to as Light of wavelength ⁇ 1 is called pump light, and light of wavelength 2 is called erase light). Therefore, by utilizing this principle, a super-resolution microscope using a double resonance absorption process exceeding the diffraction limit, such as a fluorescence microscope, can be realized.
  • phase plate 1 for spatially modulating the erase light as shown in FIG. A method using 1 is known.
  • the phase plate 1 is formed by depositing, on an optical substrate, an optical thin film that has been adjusted so that the phase of erase light that has passed at a position symmetrical to the optical axis is inverted. That is, there are four independent regions 2a-2d around the optical axis, and the phases of these regions 2a-2d are made to differ from each other by a quarter with respect to the wavelength of the erase light. If the light passing through the phase plate 1 is collected, the electric field is canceled on the optical axis, so that hollow erase light can be generated.
  • the above-described super-resolution microscopy technology is applied to eliminate fluorescence in a selected spatial region, thereby measuring fluorescence emitted only from a three-dimensionally limited observation region. And its fluorescence correlation function.
  • the phase plate 1 shown in FIG. 7 is a force for controlling the phase so that the light intensity always becomes zero on the optical axis of the erase light.
  • the phase of light in the circular region 6 with a radius r (r ⁇ R) concentric with the pupil centered on the optical axis is changed by (2m + l) ⁇
  • the condensing pattern can be calculated using the coordinate system shown in FIG. Is given by the following equation (5).
  • ⁇ ( ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ ) - ⁇ ) 2 + ⁇ y - ⁇ ) 2 + (z- f - ⁇ ⁇ 2 + y 2 + ( ⁇ - f) 2
  • f represents the focal length of the optical system
  • point (X, y, z) represents an observation point
  • (6, ⁇ , r?) Represents an integration variable.
  • the integration range has a numerical aperture NA corresponding to the entire optical system pupil plane.
  • the region where the fluorescence of the molecule can be observed is limited to the above-mentioned very small space region due to the fluorescence suppression effect. become. Furthermore, as disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-100102, by optimizing the intensity of the erase light, the region where the fluorescence suppression effect works can be further narrowed than ⁇ ⁇ , so that the substantial observation region can be For example, it is possible to further reduce the size to about 1/6 of the area where the erase light does not hit, and to form an extremely small observation area that is two orders of magnitude smaller in volume.
  • the present inventors have conducted various experimental studies to appropriately control the spatial area of the erase light as described above, and to superimpose the erase light and the pump light at the focal point of the condenser lens to emit fluorescent light. They found that the area could be limited to a very small space area, and if such a method of irradiating the erase light and the pump light was introduced into the fluorescence correlation method, the behavior of one molecule in the observation area, which was a very small three-dimensional space, could be accurately determined The present inventors have found that the analysis can be performed well and have led to the present invention.
  • the three-dimensional analyzer according to the present invention even for a solution having a high concentration, one-molecule analysis that was impossible by the conventional method can be performed. Also force, the observation area by optimization of the light intensity of Iresu light can also be analyzed in the further small space than 1. 0 X 10- 14 cm 3.
  • the three-dimensional analyzer according to the present invention by irradiating the erase light and the pump light, three-dimensional resolution including the optical axis direction can be obtained. It is not necessary to use a small-diameter spatial filter to obtain the image, and only a large-diameter spatial filter that avoids stray light needs to be placed in front of the detector. This makes it very easy to adjust the optical system.
  • FIG. 11 shows a schematic configuration of a three-dimensional analyzer.
  • the three-dimensional analyzer mainly has four independent units of a light source unit 10, a scan unit 20, a microscope unit 30, and an arithmetic unit 40. are doing.
  • a case where a biological sample stained with rhodamine 6G is analyzed will be described as an example.
  • Rhodamine 6G has an absorption band that is excited from the ground state (SO) to the first electronically excited state (S1) near the wavelength of 530 nm, and has a first electron excitation band in the wavelength band of 600 nm to 650 nm. It has been confirmed that the state (S1) has a double resonance absorption band that is excited to the second electronically excited state (S2) having a higher energy level (for example, E. Sahar and
  • an LD-pumped mode-locked Nd: YAG laser 11 which is a coherent light source that generates pump light having a wavelength of 532 nm (second harmonic) as a first light source is provided in the light source unit 10.
  • a continuous-wave Kr laser 12 which is a coherent light source that generates erase light having a wavelength of 647.lnm, is provided as a second light source.
  • the light source unit 10 includes a rotating ND filter 13 as first irradiation intensity adjusting means for adjusting the light intensity of the pump light, and a rotating ND filter 13 as second irradiation intensity adjusting means for adjusting the intensity of the erase light.
  • An ND filter 14, an iris 15 for adjusting the beam diameter of the erase light, a phase plate 16 as spatial phase modulation means for spatially modulating the erase light, and a beam combiner 17 for coaxially merging the pump light and the erase light. are provided.
  • the erase light is continuously oscillated from the Kr laser 12, and is incident on the beam compina 17 through the rotary ND filter 14, the iris 15 and the phase plate 16, and the LD-excited mode lock is performed.
  • the Nd: YAG laser 11 oscillates a pulse of pump light, passes through a rotating ND filter 13 and enters a beam combiner 17 .Then, the pump light and the erase light are coaxially combined by a beam combiner 17 to form a scan unit 20. Out.
  • the phase plate 16 spatially modulates the erase so as to form a three-dimensional area where the erase light does not hit near the focal point of the objective lens of the microscope unit 30 described later. 12
  • a phase including a circular etching region 16b with a radius of 1.76 mm and a depth of 718 nm formed by etching is formed on an optically polished quartz substrate 16a. It has a distribution area.
  • the circular etching area 16 Specifically, b is formed so that the quartz substrate 16a is eroded by a chemical etching method so as to have an optical path length difference of ⁇ 2.
  • the phase distribution region is formed on the phase plate 16 in this manner, the refractive index of the quartz substrate 16a with respect to the erase light having a wavelength of 647. lnm is 1.46, and thus the erase light passing through the circular etching region 16b is used. Has a phase difference of ⁇ with respect to the erase light passing through the other regions. Therefore, if the erase light transmitted through the phase plate 16 is condensed on the biological sample 35 stained with rhodamine 6G by the objective lens 32 of the microscope unit 30 to be described later, only the vicinity of the focal point becomes three-dimensional due to the interference effect near the focal point. Erased light having a light intensity of zero is obtained, which can stop the fluorescence of rhodamine 6G.
  • the scanning unit 20 is provided with a half mirror 21, Ganolevano mirrors 22 and 23 as two-dimensional scanning means, a projection lens 24, a pinhorn 25, notch finolators 26 and 27, and a photomultiplier tube 28 as a light receiving means.
  • the pump light and the erase light from the light source unit 10 are transmitted through the half mirror 21, then emitted to the microscope unit 30 through the galvanomirrors 22 and 23, and the fluorescence detected by the microscope unit 30 is After being reflected by the half mirror 21 via the galvanometer mirrors 23 and 22, the light is received by the photomultiplier tube 28 via the projection lens 24, the pinhole 25, and the notch filters 26 and 27.
  • the pinhole 25 is arranged at a confocal point with respect to an objective lens 32 of the microscope unit 30 described later, and functions as a spatial filter. This means that it also generates a force other than the sample 35 set in the microscope unit 30, such as cutting the fluorescence and scattered light from the optical system to increase the SZN of the measurement, and at the same time, at a specific depth in the sample 35. It has an optical sectioning function to select only emitted fluorescent light, that is, a tomographic function using light.
  • the notch filters 26 and 27 serve to remove pump light and erase light mixed in the fluorescence.
  • the microscope unit 30 is a so-called ordinary fluorescence microscope, and includes a half mirror 31, an objective lens 32, a positioning stage 33, and an eyepiece lens 34.
  • the microscope unit 30 receives the pump light and the erase light from the scan unit 20 by using a half mirror. After being reflected by 31, it is focused by an objective lens 32 that constitutes a focusing optical system onto a sample 35 mounted on a positioning stage 34, and As a result, the fluorescence emitted from the sample 35 is reflected by the half mirror 31 via the objective lens 32 and emitted to the scan unit 20, and the fluorescence transmitted through the half mirror 31 is guided to the eyepiece 34 constituting the observation means. Constitute.
  • the arithmetic unit 40 includes a preamplifier 41, an analog Z digital (AZD) converter 42, a personal computer (PC) 43 as an arithmetic means, and a timer 44, and a photomultiplier tube 28 of the scan unit 20.
  • the AZD converter 42 After being amplified by the preamplifier 41, the AZD converter 42 converts the signal into a digital signal and stores it in the PC 43.
  • the sampling timing of the AZD conversion by the AZD converter 42 is controlled by the timer 44 based on the pulse oscillation cycle signal of the pump light by the LD-excited mode-locked Nd: YAG laser 11 and the reference clock signal of the PC 43.
  • the beam diameter of the erase light transmitted through the phase plate 16 is adjusted by the iris 15 so as to be 5 mm, which is 21/2 times the diameter of the circular etching region 16b of the phase plate 16, and By aligning the optical axis of the erase light with the center of the circular etching region 16b, the intensity of the erase light at the focal point of the objective lens 32 is completely canceled by the interference effect.
  • the diameter is approximately 460 nm in the focal plane, near the focal plane, and substantially in the optical axis direction.
  • the positioning stage 34 on which the sample 35 is mounted must be at least in the optical axis direction. It is configured to have an accuracy of 0.2 0 ⁇ ⁇ or more.
  • the positional resolution in the optical axis direction is approximately 90 nm, and therefore, the resolution is higher than 90 nm. It is configured to have a degree.
  • the positioning stage 34 is, for example, a three-dimensional inchworm stage using a piezoelectric element, ie, a piezo element as a drive source. Etc. If a piezoelectric element is used as a drive source in this way, positioning accuracy up to 10 nm can be realized by computer control using an encoder.
  • the irradiation position of the pump light and the erase light on the sample 35 by the objective lens 32 is set to a desired position by the galvanometer mirrors 22, 23 and the positioning stage 34.
  • the sample lens 35 is continuously irradiated with erase light and the pump light is intermittently irradiated with the objective lens 32 in this state, and the fluorescence intensity signal obtained from the photomultiplier tube 28 when the pump light is irradiated is obtained.
  • the PC 43 uses the fluorescence correlation function G ( ⁇ ), And a desired physical quantity such as the molecular weight of the measured molecule and the diffusion coefficient based on the fluorescence correlation function G ( ⁇ ).
  • the fluorescence observation region can be three-dimensionally limited to a very small region, and thus the case where sample 35 contains a high concentration of measurement molecules is used. Also, the fluorescence correlation function can be accurately calculated, and the desired physical quantity can be analyzed with high accuracy.
  • the three-dimensional analyzer since the three-dimensional analyzer according to the present embodiment has galvanomirrors 22 and 23 for two-dimensional scanning, pump light and erase light are applied on sample 35 by these galvanomirrors 22 and 23.
  • a two-dimensional fluorescence image of the sample 35 can be obtained as an advanced microscope, and the pump light and erase light are two-dimensionally scanned while the sample 35 is sequentially moved in the optical axis direction by the positioning stage 34.
  • a three-dimensional fluorescence image of the sample 35 can be obtained.
  • a fluorescence correlation function at each measurement point of a two-dimensional fluorescence image or a three-dimensional fluorescence image can also be calculated, a much richer amount of information can be obtained than with a conventional fluorescence microscope.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiment, but can be variously modified or changed.
  • the phase plate 16 shown in FIG. 11 is not limited to etching, but may be configured to give a phase difference of (2m + 1) ⁇ by a vapor deposition method.
  • Futsudani Magnesium (MgF) has a refractive index of 1.38 with respect to the wavelength of erase light.
  • This magnesium fluoride is deposited on a glass substrate having a refractive index of 1.46 with a thickness of 760 nm, for example.
  • the phase plate 16 may be a phase plate having two concentric circular regions as a phase distribution region, or may have three or more concentric circular regions and be adjacent to each other. It is better to use ones whose regions are configured to generate different phase differences of (2m + l) ⁇ .
  • the spatial phase modulating means is not limited to a phase plate, and may be constituted by, for example, a liquid crystal type spatial light modulator.
  • a spatial phase modulating means for example, a deformable mirror (
  • the observation area can be three-dimensionally limited by spatially modulating the erase light with a spatial modulation means such as a deformable mirror.
  • the present invention is not limited to the analysis of a sample by a fluorescence correlation function, but can be effectively applied to the analysis of a sample by a correlation function of response light other than fluorescence, for example, phosphorescence, depending on a stain substance. it can.
  • the first light and the second light having different wavelengths are at least partially spatially overlapped and condensed and irradiated on the sample, so that the photoactive region of the sample is three-dimensionally limited. Then, by calculating the correlation function of the response light generated in the photoactive region and analyzing the desired physical quantity of the sample, even a test solution containing a high concentration of photoresponsive molecules can be analyzed. In addition, the correlation function of the optical response can be accurately calculated, and a desired physical quantity can be analyzed with high accuracy.

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Abstract

　第１の光を発生する第１光源１１と、第１の光とは波長の異なる第２の光を発生する第２光源１２と、第１の光および第２の光を少なくとも一部分空間的に重ね合わせて試料３５に集光照射して、試料３５における光活性領域を３次元的に限定する光学系（１６，１７，２１，２２，２３，３１，３２）と、光活性領域で発生する応答光を受光する受光手段２８と、受光手段２８の出力に基づいて応答光の時間領域における相関関数を演算して、試料３５の所望の物理量を分析する演算手段４３と、を有する。

Description

3次元分析装置
技術分野
[0001] 本発明は、特に染色した試料の観測領域を 3次元的に限定して、その観測領域か ら発生する光応答に基づいて試料中の分子の大きさや数に関連する物理量を分析 する 3次元分析装置に関するものである。
背景技術
[0002] この種の 3次元分析装置で採用される分析法として、例えば、金城政孝， 「蛍光相 関分光法による DNAの検出」，精密工学会誌， vol. 65, No. 2, 1999, p. 175—1 80 (以下、非特許文献 1という）に開示されているような蛍光相関法が知られている。 この蛍光相関法は、ブラウン運動などの粒子の拡散運動に関する解析に古くから用 いられてきた方法で、例えば図 13に原理図を示すように、希薄な蛍光分子の溶液に 励起光として細 、レーザビームを照射し、そのレーザビームが照射される観測領域に おける蛍光強度を長時間測定して、蛍光の揺らぎの大きさと時間との蛍光相関関数 を算出し、その蛍光相関関数に基づいて蛍光分子の大きさや数に関連する物理量 を分析するものである。ここで、観測領域に入っている蛍光分子数を Nとすると、蛍光 強度は Nに比例するので、揺らぎの大きさを SZNで表現すると、（1ZN) 1/2となる。
[0003] かかる蛍光相関法において、物理量である蛍光相関関数が 1Z2に減少する時間 、すなわち相関時間を τ 0とすると、 τ 0は下記の（1)式で表わされる。なお、（1)式 において、 Dは蛍光分子の並進拡散係数であり、 Wはレーザビームの動径方向の強 度分布関数がガウス分布であるときのビーム半径である。この τ 0は、物理的には、 蛍光分子が拡散によってレーザビームを横切る時間に相当する。
[0004] [数 1] て 0 = ■ · · ( 1 )
4D
[0005] 蛍光相関法による蛍光の揺らぎは、一般には、蛍光を受光する光電子増倍管の出 力電流 f (t)によって測定する力 その f (t)は、レーザビームの径が極端に大きくない 場合には蛍光量に比例する。蛍光相関関数は、この f (t)について、時間に関する相 関関数を求めることに他ならず、これを G ( τ )とすると、蛍光相関関数 G ( τ )は下記 の（2)式で与えられ、その際に、レーザビーム強度がガウス分布に近いときは、下記 の（3)式のように簡略ィ匕して表現できる。
[0006] [数 2]
Figure imgf000004_0001
G(T) = ( 3 )
N l + τ τη
[0007] 蛍光相関法は、前述したように蛍光分子の並進拡散係数が得られる物理量である 1S 基本的は蛍光の揺らぎを与える熱力学量であれば、どんな量でも同じ原理で測 定することができる。一例として、蛍光分子の流動によってレーザビームを横切れば、 蛍光の揺らぎを観測することができる。また、化学反応などで蛍光分子が他の分子と 結合することで、分子の速度を揺らぎとして観測することができる。すなわち、化学反 応の進行をリアルタイムで知ることができる。また、偏光解析をすることで、分子の回 転運動も測定することができる。
[0008] さらに、蛍光相関関数 G ( τ )の強度から、観測領域に存在する分子数も直接測定 することができる。具体的には、図 14に示すように、期待する揺らぎ現象が完結する ような特定の計測時間内の揺らぎ f (t)を測定し、その測定した f (t)より式 (2)を用い て相関関数を求める。この際、励起光源としては、一般には CW (連続光源）のァルゴ ンレーザやクリプトンレーザを用いて、色素分子の蛍光相関分析を行うのが主流であ る。図 15に蛍光相関分析を行う従来の代表的なシステムを示す。
[0009] 図 15に示すシステムでは、励起光源としてアルゴンレーザ 51を用い、そのレーザビ ームをビームスプリッタ 52を透過させた後、レンズ 53により蛍光分子を含有した試料 溶液 54に集光照射している。また、試料溶液 54での蛍光は、レンズ 53でコリメートし た後、ビームスプリッタ 52で反射させてレンズ 55により集光し、その集光された蛍光 をピンホール 56を通過させて光電子増倍管や CCDなどの検出器 57で受光し、その 出力をプリアンプ 58で増幅された後、アナログ Zデジタル (A/D)変 でデジ タルデータに変換してコンピュータ等力もなる演算装置 60に取り込み、ここで相関関 数 Ο ( τ )を計算している。
[0010] なお、図 15に示したシステムと同様のシステムは、非特許文献 1にも開示されてい る。
[0011] し力しながら、本発明者らによる種々の実験検討によると、前述した蛍光相関分析 を行う従来のシステムにあっては、実用上、以下に説明するような改良すべき点があ ることが判明した。
[0012] すなわち、蛍光相関法は揺らぎを検出することを基礎とするので、観測領域に存在 する蛍光分子の量はできるだけ少なぐ可能であれば 1分子であることが望ましい。し かし、蛍光を誘起する光照射領域は、下記の (4)式からレンズ 53の開口数 ΝΑと光 の波長えとにより下限が限定される。これは、回折限界と呼ばれるものである。したが つて、蛍光分子の絶対量が多くなると、それに対応して観測領域内を横切る蛍光分 子数を少なくするために、光照射領域を狭くする必要がある。
[0013] [数 3]
W= 1 - 2 2丄 · · ·（4 )
N A
[0014] このため、図 15において、例えばレンズ 53として NA= 1. 4の油浸レンズを用い、 励起光としてえ = 500nmのレーザビームを用いても、そのレーザビームの集光径 W は、せいぜい 436nmである。さらに、光の深さ方向に関しては、基本的には溶液試 料 54の厚みそのものになる。したがって、実際の計測の現場では、分析する溶液試 料 54における蛍光分子の濃度を極めて希薄にすることが要求され、これが実用性の 大きな制限となっている。
[0015] なお、光の深さ方向の観測領域を制限するために、一般には共焦点位置にピンホ ール 56を設置して、焦点面以外の領域で発光した蛍光をカットするようにして!/、る。 しかし、これでも深さ方向の分解能は数/ z m程度にとどまつている。また、ピンホール 56の位置合わせは微妙であり、測定対象の蛍光もカットされてしまうことが多い。
[0016] 以上の理由から、図 15に示したような従来のシステムでは、高濃度の溶液に対して は蛍光相関法を適用しにくぐしかも高い 3次元的な空間分解能も期待できない。
[0017] したがって、力かる事情に鑑みてなされた本発明の目的は、高濃度の光応答分子 を含有する被検溶液であっても、観測領域を 3次元的に限定して光応答の相関関数 を的確に算出できる 3次元分析装置を提供することにある。
発明の開示
[0018] 上記目的を達成する請求項 1に係る 3次元分析装置の発明は、第 1の光を発生す る第 1光源と、
上記第 1の光とは波長の異なる第 2の光を発生する第 2光源と、
上記第 1の光および第 2の光を少なくとも一部分空間的に重ね合わせて試料に集 光照射して、上記試料における光活性領域を 3次元的に限定する光学系と、 上記光活性領域で発生する応答光を受光する受光手段と、
上記受光手段の出力に基づいて上記応答光の時間領域における相関関数を演算 して、上記試料の所望の物理量を分析する演算手段と、
を有することを特徴とするものである。
[0019] 請求項 2に係る発明は、請求項 1に記載の 3次元分析装置において、上記試料は、 少なくとも基底状態を含む 3つの電子状態を有する分子を含むものであり、
上記第 1の光は、上記分子を基底状態から第 1電子励起状態へ遷移させる波長で あり、
上記第 2の光は、上記分子を第 1電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第 2の電子状態へ遷移させる波長であることを特徴とするものである。
[0020] 請求項 3に係る発明は、請求項 2に記載の 3次元分析装置において、上記第 2の光 の波長は、上記試料の誘導放出波長帯域にあることを特徴とするものである。
[0021] 請求項 4に係る発明は、請求項 2または 3に記載の 3次元分析装置において、上記 第 2の光の波長は、上記第 1の光と上記第 2の光とがともに照射される空間領域にお ける上記応答光の発生を抑制する波長領域にあることを特徴とするものである。
[0022] 請求項 5に係る発明は、請求項 1一 4のいずれか一項に記載の 3次元分析装置に ぉ 、て、上記応答光が蛍光であることを特徴とするものである。
[0023] 請求項 6に係る発明は、請求項 1一 5のいずれか一項に記載の 3次元分析装置に おいて、上記試料への上記第 1の光の照射強度および第 2の光の照射強度を独立し て調整する第 1の照射強度調整手段および第 2の照射強度調整手段を有することを 特徴とするものである。
[0024] 請求項 7に係る発明は、請求項 1一 6のいずれか一項に記載の 3次元分析装置に おいて、少なくとも上記第 2の光はコヒーレント光であることを特徴とするものである。
[0025] 請求項 8に係る発明は、請求項 1一 7のいずれか一項に記載の 3次元分析装置に おいて、上記第 2の光を空間変調する空間変調手段を有することを特徴とするもので ある。
[0026] 請求項 9に係る発明は、請求項 8に記載の 3次元分析装置において、上記空間変 調手段は空間位相変調手段力 なることを特徴とするものである。
[0027] 請求項 10に係る発明は、請求項 9に記載の 3次元分析装置において、上記空間位 相変調手段は、上記第 2の光に対して空間的に不連続な（2m+ l) πの位相差 (た だし、 mは整数)を発生させる位相分布領域を有することを特徴とするものである。
[0028] 請求項 11に係る発明は、請求項 10に記載の 3次元分析装置において、上記空間 位相変調手段は位相板力もなることを特徴とするものである。
[0029] 請求項 12に係る発明は、請求項 11に記載の 3次元分析装置において、上記位相 分布領域は、光学基板上に上記位相差を発生させる光学薄膜を有することを特徴と するものである。
[0030] 請求項 13に係る発明は、請求項 11に記載の 3次元分析装置において、上記位相 分布領域は、光学基板上に上記位相差を発生させるエッチング領域を有することを 特徴とするものである。
[0031] 請求項 14に係る発明は、請求項 12または 13に記載の 3次元分析装置において、 上記位相分布領域は、少なくとも 3つの同心円状の領域を有し、かつ隣接する領域 が上記（2m+ 1) πの異なる位相差を発生させることを特徴とするものである。
[0032] 請求項 15に係る発明は、請求項 12または 13に記載の 3次元分析装置において、 上記位相分布領域は、 2つの同心円状の領域力もなることを特徴とするものである。
[0033] 請求項 16に係る発明は、請求項 15に記載の 3次元分析装置において、上記 2つ の領域のうちの内側の領域の半径 ¾τとするとき、該位相板を透過する第 2の光の光 束半径が、 21/2 'rであることを特徴とするものである。
[0034] 請求項 17に係る発明は、請求項 16に記載の 3次元分析装置において、上記内側 の領域の中心と上記第 2の光の光束径の曲率中心とを一致させたことを特徴とするも のである。
[0035] 請求項 18に係る発明は、請求項 1一 17のいずれか一項に記載の 3次元分析装置 において、上記第 2の光の波長をえ、上記光学系の開口数を NAとするとき、 0. 2· λ ΖΝΑの精度で、上記光学系による上記第 1の光および第 2の光の上記試料への 集光点を位置決めする位置決め機構を有することを特徴とするものである。
[0036] 請求項 19に係る発明は、請求項 1一 18のいずれか一項に記載の 3次元分析装置 において、上記第 1の光および第 2の光を上記試料に対して、上記光学系の光軸と 直交する平面内で 2次元的に走査する 2次元走査手段を有することを特徴とするもの である。
図面の簡単な説明
[0037] [図 1]試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示す概念図である。
[図 2]図 1の分子の第 1励起状態を示す概念図である。
[図 3]同じぐ第 1励起状態力 基底状態に戻る様子を示す概念図である。
[図 4]同じぐ第 2励起状態を示す概念図である。
[図 5]同じぐ第 2励起状態力 基底状態に戻る様子を示す概念図である。
[図 6]分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
[図 7]本発明に係る 3次元分析装置に使用可能な位相板の一例の構成を示す図であ る。
[図 8]同じぐ使用可能な位相板の他の例の構成を示す図である。
[図 9]位相変調を受けたときの集光パターンを説明するための図である。
[図 10]図 8に示した位相板で位相変調された光の焦点付近における強度分布のシミ ユレーシヨン結果を示す図である。
[図 11]本発明の一実施の形態に係る 3次元分析装置の概略構成を示す図である。
[図 12]図 11に示す位相板の構成を示す平面図および断面図である。
[図 13]蛍光相関法の原理を説明するための図である。 [図 14]同じぐ蛍光相関法による蛍光強度の揺らぎの一例を示す図である。
[図 15]従来の蛍光相関分析システムの概略構成を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0038] 以下、本発明による 3次元分析装置の実施の形態について説明する。
[0039] 本実施の形態による 3次元分析装置は、基底状態を含む 3つ量子状態を有する分 子に波長の異なる 2つの光を照射して 2重共鳴吸収過程を誘導し、その結果として誘 起される蛍光抑制効果を基礎として!ヽる。
[0040] 先ず、上記の蛍光抑制効果につ!、て説明する。図 1は分子の価電子軌道の電子 構造を示すもので、先ず、図 1に示す基底状態 (SO状態)の分子に波長 λ 1の光を 照射して、図 2に示す第 1電子励起状態 (S1状態）に励起する。この励起状態により 、通常分子は蛍光あるいは燐光を発光して、図 3に示すように基底状態に戻る。しか し、別の波長え 2の光により同様に励起すると、図 4に示すように第 2電子励起状態（ S2状態）となる。この励起状態により、図 5に示すように多くの分子は蛍光を出さず、 励起エネルギーを外界の媒質に熱として与えて SO状態に戻る。
[0041] 最近では、この二重共鳴吸収過程による蛍光抑制効果を用いて回折限界を越える 高い空間分解をもつ蛍光顕微鏡も提案されている（例えば、特開 2001— 100102号 公報参照)。
[0042] 上述したような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる 。図 6は、図 5と同じく二重共鳴吸収過程の概念図を示すもので、横軸 Xは空間的距 離の広がりを示すもので、波長 λ 2の光が照射された空間領域 A1と波長 λ 2の光が 照射されな!ヽ空間領域 AOとが示されて ヽる。
[0043] 図 6において、空間領域 AOでは波長 λ 1の光励起により SI状態の分子が多数生 成され、その際に空間領域 AOからは波長え 3で発光する蛍光が見られる。しかし、 空間領域 A1では波長え 2の光を照射したため、 S1状態の分子が即座にほとんど高 位の S2状態に励起され、 S1状態の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾つ かの分子により確認されている。これにより、波長え 3の蛍光は完全になくなり、し力も 、 S2状態力もの蛍光はもともとないので、空間領域 A1では完全に蛍光自体が抑制さ れ (蛍光抑制効果)、空間領域 AOのみ蛍光が発することになる。 [0044] このことは、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持って 、る。 すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡などでは、レーザ光を集光レンズによりマイク 口ビームに集光して試料上を走査するが、その際、マイクロビームのサイズは集光レ ンズの開口数と波長で決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期 待できない。
[0045] ところ力 図 6の場合には、波長 λ 1と波長 λ 2との 2種類の光を空間的に上手く重 ね合わせて、波長 λ 2の光の照射により蛍光領域を抑制することで、例えば波長 λ 1 の光の照射領域に着目すると、蛍光領域は集光レンズの開口数と波長で決まる回折 限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる (以下、波長 λ 1の光をポンプ光、波長え 2の光をィレース光と呼ぶ）。したがって、この原理を利 用することで、回折限界を越える二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡、例えば 蛍光顕微鏡が実現可能となる。
[0046] 図 6に示したように、ィレース光を照射領域と非照射領域とを持つように都合よく集 光するためには、例えば、図 7に示すようなィレース光空間変調用の位相板 1を用い る方法が知られている。この位相板 1は、光学基板上に、光軸対称の位置で通過した ィレース光の位相が反転するように調整された光学薄膜を蒸着して構成したものであ る。すなわち、光軸の周りに独立した 4つの領域 2a— 2dを有し、これらの領域 2a— 2 dの位相をィレース光の波長に対して 4分 1ずつ異ならせている。この位相板 1を通過 した光を集光すれば、光軸上で電場が相殺されるので、中空状のィレース光を生成 することができる。
[0047] 本実施の形態では、上記の超解像顕微鏡技術を応用し、選択した空間領域の蛍 光を消去することで、 3次元的に限定された観測領域からのみ発する蛍光を計測して 、その蛍光相関関数を求める。
[0048] 図 7に示した位相板 1は、ィレース光の光軸上で光強度が常にゼロになるように位 相を制御するものである力 このような位相板 1に代えて、図 8に示すように、半径尺の 光学系の瞳内で、光軸を中心とする瞳と同心円状の半径 r (rく R)の円形領域 6の光 の位相を（2m+ l) πだけ変化させる位相板 5を用いて、ィレース光を透過させること により、集光点の領域のみィレース光が当たらないようにすることもできる。ここで、 m は任意の整数である。なお、位相差は、通常、エッチング加工あるいは薄膜蒸着によ り発生させることができる。
[0049] 一般に、集光レンズに入射する波長 λの光が、 ί( ξ , ζ , η )の位相変調を受けたと きの集光パターンは、図 9の座標系用いると、波動光学の理論を用いて下記の（5)式 で与えられる。
[0050] [数 4]
I(x,y,z) = (5)
Figure imgf000011_0001
ただし、
ν(χ,γ,ζ,ξ,ζ,η) = - ξ)2 + {y -ζ)2 +(z- f -^χ2 + y2 +(ζ - f)2
[0051] 上記（5)式において、 fは光学系の焦点距離、点 (X, y, z)は観測点、 (6, ζ , r?) は積分変数を示す。また、積分範囲は、光学系瞳面の全体に対応する開口数 NA ある。特に、ィレース光の瞳面（ ξ , ζ )において、図 8に示したような位相分布を与え れば、（5)式は空間変調を受けたときの集光パターンを与えることになる。具体的に は、瞳の半径を Rとすれば、 ξ 2+ ζ 2く r2の領域では、（2m+l) πの位相差を与え 、 r2≤ ξ 2+ ζ 2<R2の領域では位相差を与えない。この場合、相対的な位相差が問 題なので、 ξ 2+ ζ 2<r2の領域では位相差を与えず、 r2≤ ξ 2+ ζ 2く R2の領域では 士（2m+l) πの位相差を与える場合でも、状況は全く同等である。
[0052] ここで、一様の強度分布のィレース光を、半径 Rで図 8に示した位相板 5に入射させ て、その透過光を集光レンズで集光する場合には、 R=21/2'rとすると、焦点（0, 0, 0)の近傍におけるィレース光の強度がゼロとなる。なぜなら、図 8において、内側の 円形領域 6と外側の輪帯領域 7との面積が同じになり、し力も互いの位相が反転して いるので、全ての光が 1点に集まる焦点では、ィレース光の強度が完全にゼロとなる。
[0053] これに対して、焦点から多少でも外れた位置では、ィレース光の強度は増大する。
具体的に、（5)式を用いて焦点付近の強度分布をシミュレーションすると、図 10に示 すようになる。すなわち、 λΖΝΑを単位として、 X— y平面内（焦点面内）でほぼ λΖ ΝΑ、 χ— z平面内または y— z平面内（光軸方向）で 0.2Χ λΖΝΑの回転楕円体状の 光強度が無い領域が出現する。
[0054] 例えば、ィレース光の波長 λを 500nm、集光レンズの開口数 NAを 1. 4とすれば、 X— y平面内でほぼ 357nm、 x— z平面内または y— z平面内でほぼ 72nmの大きさを有 し、体積がほぼ 5. 9 X 10— 15cm3の光の届力ない回転楕円体状力もなる極微小空間 領域を形成することができる。
[0055] したがって、このような空間領域をもつィレース光にポンプ光を焦点で重ね合わせ れば、分子の蛍光が観測できる領域は、蛍光抑制効果により上記の極微小空間領 域に限定されることになる。さらに、特開 2001— 100102号公報に開示されているよ うに、ィレース光強度を最適化すれば、蛍光抑制効果が働く領域を λ ΖΝΑよりもさら に狭くできるので、実質上の観測領域を、例えばィレース光が当たらない領域の 6分 1程度まで更に微小化でき、体積的に更に二桁小さい極微小観測領域を形成するこ とがでさる。
[0056] 本発明者らは、種々の実験検討により、以上のようにィレース光の空間領域を適切 に制御して、ィレース光とポンプ光とを集光レンズの焦点で重ね合わせれば蛍光発 光領域を極微小空間領域に限定できることを見出し、このようなィレース光とポンプ光 とを照射する方法を蛍光相関法に導入すれば、極微小の立体空間である観測領域 における 1分子の挙動を精度良く解析できることを見出して本発明に至ったものであ る。
[0057] したがって、本発明に係る 3次元分析装置によれば、濃度の濃い溶液であっても、 従来法で不可能であった 1分子分析が可能となる。し力も、ィレース光の光強度の最 適化により観測領域を、 1. 0 X 10— 14cm3よりも更に微小な空間にして解析することも できる。特に、本発明に係る 3次元分析装置では、ィレース光とポンプ光とを照射する ことによって、光軸方向も含む 3次元分解能が得られるので、従来のシステムとは異 なり光軸方向の空間分解能を得るための径の小さい空間フィルタを必要とせず、迷 光を避ける程度の径の大きい空間フィルタを検出器の手前に配置するだけで済み、 光学系の調整が非常に容易となる。
[0058] 次に、本実施の形態に係る 3次元分析装置について、図 11および図 12を参照して 説明する。 [0059] 図 11は 3次元分析装置の概略構成示すもので、この 3次元分析装置は、主として、 光源ユニット 10、スキャンユニット 20、顕微鏡ユニット 30および演算ユニット 40の独 立した 4つのユニットを有している。以下、ローダミン 6Gで染色された生体試料を分 析する場合を例にとって説明する。
[0060] なお、ローダミン 6Gは、波長 530nm近傍に基底状態（SO)から第 1電子励起状態（ S1)に励起される吸収帯があり、また、波長 600nm— 650nmの帯域に第 1電子励 起状態 (S1)から、よりエネルギー準位の高い第 2電子励起状態 (S2)に励起される 二重共鳴吸収帯域が存在することが確認されている（例えば、 E.Sahar and
D .Treves : IEEE, J . Quantum Electron., QE- 13,692(1977)参照）。
[0061] このため、本実施の形態では、光源ユニット 10に、第 1の光源として波長 532nm (2 倍高調波）のポンプ光を発生するコヒーレント光源である LD励起型モードロック Nd： YAGレーザ 11と、第 2の光源として波長 647. lnmのィレース光を発生するコヒーレ ント光源である連続発振型の Krレーザ 12とを設ける。また、光源ユニット 10には、ポ ンプ光の光強度を調整する第 1の照射強度調整手段である回転 NDフィルタ 13と、ィ レース光の強度を調整する第 2の照射強度調整手段である回転 NDフィルタ 14と、ィ レース光のビーム径を調整するアイリス 15と、ィレース光を空間変調する空間位相変 調手段である位相板 16と、ポンプ光およびィレース光を同軸上に融合するビームコ ンバイナ 17とを設ける。
[0062] この光源ユニット 10では、 Krレーザ 12からィレース光を連続発振させて、回転 ND フィルタ 14、アイリス 15および位相板 16を経てビームコンパイナ 17に入射させると共 に、 LD励起型モードロック Nd:YAGレーザ 11からポンプ光をパルス発振させて、回 転 NDフィルタ 13を経てビームコンバイナ 17に入射させ、これらポンプ光とィレース 光とをビームコンパイナ 17で同軸上に合成してスキャンユニット 20に出射させる。
[0063] ここで、位相板 16は、後述する顕微鏡ユニット 30の対物レンズの焦点近傍で、 3次 元的にィレース光の当たらない領域を形成するようにィレースを空間変調するもので 、例えば図 12 (a)および (b)に平面図および断面図を示すように、光学研磨された石 英基板 16aに、エッチングにより形成した半径 1. 76mm,深さ 718nmの円形エッチ ング領域 16bを含む位相分布領域を有して構成する。なお、円形エッチング領域 16 bは、具体的には、化学エッチング法により石英基板 16aを浸蝕して λ Ζ2の光路長 差を持たせるように形成する。
[0064] このように位相板 16に位相分布領域を形成すれば、波長 647. lnmのィレース光 に対する石英基板 16aの屈折率は 1. 46であるので、円形エッチング領域 16bを通 過するィレース光は、それ以外の領域を通過するィレース光に対して πの位相差を 持つこと〖こなる。したがって、この位相板 16を透過したィレース光を後述する顕微鏡 ユニット 30の対物レンズ 32によりローダミン 6Gで染色された生体試料 35に集光すれ ば、焦点近傍において、干渉効果により焦点近傍領域のみ 3次元的に光強度がゼロ となるィレース光が得られ、これによりローダミン 6Gの蛍光を止めることができる。
[0065] スキャンユニット 20には、ハーフミラー 21、 2次元走査手段であるガノレバノミラー 22 および 23、投影レンズ 24、ピンホーノレ 25、ノッチフイノレタ 26および 27、受光手段で ある光電子増倍管 28を設け、このスキャンユニット 20において、光源ユニット 10から のポンプ光およびィレース光を、ハーフミラー 21を透過させた後、ガルバノミラー 22 および 23を経て顕微鏡ユニット 30に出射させると共に、顕微鏡ユニット 30で検出さ れる蛍光を、ガルバノミラー 23および 22を経てハーフミラー 21で反射させた後、投 影レンズ 24、ピンホール 25、ノッチフィルタ 26および 27を経て光電子増倍管 28で受 光する。
[0066] ここで、ピンホール 25は、後述する顕微鏡ユニット 30の対物レンズ 32に対して共焦 点位置に配置されており、空間フィルタとして機能する。これは、顕微鏡ユニット 30に セットされる試料 35以外力も発する、例えば光学系からの蛍光や散乱光をカットして 測定の SZNを高める作用をなすのと同時に、試料 35内の特定の深さ部分力 発光 した蛍光のみを選別するオプティカルセクショニング機能、すなわち光による断層撮 影機能をもつ。また、ノッチフィルタ 26および 27は、蛍光に混入したポンプ光および ィレース光を除去する役目をする。
[0067] 顕微鏡ユニット 30は、いわゆる通常の蛍光顕微鏡で、ハーフミラー 31、対物レンズ 32、位置決めステージ 33および接眼レンズ 34を有しており、スキャンユニット 20から のポンプ光およびィレース光を、ハーフミラー 31で反射させた後、集光光学系を構 成する対物レンズ 32により位置決めステージ 34に搭載された試料 35に集光させ、こ れにより試料 35から発する蛍光を、対物レンズ 32を経てハーフミラー 31で反射させ てスキャンユニット 20に出射させると共に、ハーフミラー 31を透過した蛍光を観察手 段を構成する接眼レンズ 34に導くように構成する。
[0068] 演算ユニット 40は、プリアンプ 41、アナログ Zデジタル (AZD)変換器 42、演算手 段であるパーソナルコンピュータ（PC) 43およびタイマ 44とを有し、スキャンユニット 2 0の光電子増倍管 28からの蛍光強度信号をプリアンプ 41で増幅した後、 AZD変換 器 42でデジタル信号に変換して PC43に格納するように構成する。なお、 AZD変換 器 42による AZD変換のサンプリングタイミングは、 LD励起型モードロック Nd： YAG レーザ 11によるポンプ光のパルス発振周期信号と PC43の基準クロック信号とに基 づ 、てタイマ 44により制御する。
[0069] 上記構成において、位相板 16を透過するィレース光のビーム直径は、位相板 16の 円形エッチング領域 16bの直径の 21/2倍である 5mmとなるようにアイリス 15で調整 すると共に、ィレース光の光軸と円形エッチング領域 16bの中心とを一致させて、対 物レンズ 32の焦点においてィレース光の強度を干渉効果により完全に相殺するよう にする。これにより、例えば、対物レンズ 32として有効瞳径（直径） 5mm、開口数 1. 4 の油侵レンズを用いた場合、焦点近傍に、焦点面内で直径がほぼ 460nm、光軸方 向にほぼ 90nmの扁平な回転楕円体状のィレース光の届力ない微小空間領域を形 成することができ、立体的な空間分解能を得ることができる。これは、 1. 0 X 10— 14cm 3という微小空間領域に対応する。また、ポンプ光およびィレース光の強度は、回転 N Dフィルタ 13および 14により最適化し、これにより蛍光抑制効果を効果的に誘起させ て、さらに立体的な空間分解能を向上させるようにする。
[0070] また、ポンプ光の照射によって試料 35から発する蛍光の観測領域は、光軸方向に 0. 2 X λ ΖΝΑの分解能を有するので、試料 35を搭載する位置決めステージ 34は 、少なくとも光軸方向に 0. 2 Χ λ ΖΝΑ以上の精度を有するように構成する。例えば 、対物レンズ 32として、上記のように有効瞳径 5mm、開口数 1. 4の油侵レンズを用 いた場合には、光軸方向の位置分解能がほぼ 90nmとなるので、 90nmよりも高い精 度を有するように構成する。このため、本実施の形態では、位置決めステージ 34を、 例えば圧電素子すなわちピエゾ素子を駆動源に用いた 3次元インチワームステージ 等で構成する。このように圧電素子を駆動源に用いれば、エンコーダを併用したコン ピュータ制御により lOnmまでの位置決め精度を実現することができる。
[0071] このようにして、本実施の形態では、対物レンズ 32による試料 35へのポンプ光およ びィレース光の照射位置を、ガルバノミラー 22, 23および位置決めステージ 34によ り所望の位置に位置決めし、その状態で対物レンズ 32により試料 35にィレース光を 連続的に照射すると共にポンプ光を間欠的に照射して、ポンプ光を照射したときに 光電子増倍管 28から得られる蛍光強度信号をプリアンプ 41を経て AZD変 で順次デジタル信号に変換して PC43に時系列的に格納し、その格納された蛍光強 度信号に基づいて、 PC43により上記 (5)式に従って蛍光相関関数 G ( τ )を演算す ると共に、その蛍光相関関数 G ( τ )に基づいて計測分子の分子量や拡散係数等の 所望の物理量を演算する。
[0072] 以上のように、本実施の形態によれば、蛍光観測領域を 3次元的に極微小領域に 限定することができるので、試料 35が高濃度の計測分子を含有する場合であっても 、蛍光相関関数を的確に算出でき、所望の物理量を高精度で分析することができる
[0073] また、本実施の形態の 3次元分析装置は、 2次元走査用のガルバノミラー 22および 23を有しているので、これらガルバノミラー 22および 23により試料 35上でポンプ光 およびィレース光を 2次元走査することにより、高度な顕微鏡として試料 35の 2次元 蛍光像を得ることができると共に、位置決めステージ 34により試料 35を光軸方向に 順次移動させながら、ポンプ光およびィレース光を 2次元走査することにより、試料 3 5の 3次元蛍光像を得ることもできる。しかも、 2次元蛍光像あるいは 3次元蛍光像の 各測定点における蛍光相関関数も算出できるので、従来の蛍光顕微鏡よりも格段に 豊富な情報量を得ることができる。
[0074] なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなぐ幾多の変形また は変更が可能である。例えば、図 11に示した位相板 16は、エッチングに限らず、蒸 着法により（2m+ l) πの位相差を与えるように構成することもできる。例えば、フツイ匕 マグネシウム（MgF )は、ィレース光の波長に対して、 1. 38の屈折率を有するので、
2
このフッ化マグネシウムを、例えば屈折率 1. 46のガラス基板上に 760nmの厚さで蒸 着して、 m=0に相当する π分の位相差を与えるように構成したり、あるいは 2280η mの厚さで蒸着して、 m= 1に相当する 3 π分の位相差を与えるように構成したりする ことができる。また、位相板 16は、図 7に示したように、位相分布領域として同心円状 の 2つの領域を有するものを用いることもできるし、 3つ以上の同心円状の領域を有し 、かつ隣接する領域が（2m+ l) πの異なる位相差を発生させるように構成したもの を用いることちでさる。
[0075] さらに、空間位相変調手段は、位相板に限らず、例えば液晶型光空間変調器によ り構成することもできるし、このような空間位相変調手段に代えて、例えばデフォーマ ラブルミラー (可変形状鏡)のような空間変調手段によりィレース光を空間変調して観 測領域を 3次元的に限定することもできる。
[0076] また、本発明は、蛍光相関関数による試料の分析に限らず、染色物質に応じて蛍 光以外の応答光、例えば燐光等の相関関数による試料の分析にも有効に適用する ことができる。
産業上の利用可能性
[0077] 本発明によれば、波長の異なる第 1の光および第 2の光を少なくとも一部分空間的 に重ね合わせて試料に集光照射することにより、試料の光活性領域を 3次元的に限 定して、その光活性領域で発生する応答光の相関関数を演算して、試料の所望の 物理量を分析するようにしたので、高濃度の光応答分子を含有する被検溶液であつ ても、光応答の相関関数を的確に算出でき、所望の物理量を高精度で分析すること が可能となる。

Claims

請求の範囲
[1] 第 1の光を発生する第 1光源と、
上記第 1の光とは波長の異なる第 2の光を発生する第 2光源と、
上記第 1の光および第 2の光を少なくとも一部分空間的に重ね合わせて試料に集 光照射して、上記試料における光活性領域を 3次元的に限定する光学系と、 上記光活性領域で発生する応答光を受光する受光手段と、
上記受光手段の出力に基づいて上記応答光の時間領域における相関関数を演算 して、上記試料の所望の物理量を分析する演算手段と、
を有することを特徴とする 3次元分析装置。
[2] 上記試料は、少なくとも基底状態を含む 3つの電子状態を有する分子を含むもので あり、
上記第 1の光は、上記分子を基底状態から第 1電子励起状態へ遷移させる波長で あり、
上記第 2の光は、上記分子を第 1電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第 2の電子状態へ遷移させる波長であることを特徴とする請求項 1に記載の 3次元分析 装置。
[3] 上記第 2の光の波長は、上記試料の誘導放出波長帯域にあることを特徴とする請 求項 2に記載の 3次元分析装置。
[4] 上記第 2の光の波長は、上記第 1の光と上記第 2の光とがともに照射される空間領 域における上記応答光の発生を抑制する波長領域にあることを特徴とする請求項 2 または 3に記載の 3次元分析装置。
[5] 上記応答光が蛍光であることを特徴とする請求項 1一 4のいずれか一項に記載の 3 次元分析装置。
[6] 上記試料への上記第 1の光の照射強度および第 2の光の照射強度を独立して調 整する第 1の照射強度調整手段および第 2の照射強度調整手段を有することを特徴 とする請求項 1一 5のいずれか一項に記載の 3次元分析装置。
[7] 少なくとも上記第 2の光はコヒーレント光であることを特徴とする請求項 1一 6のいず れか一項に記載の 3次元分析装置。
[8] 上記第 2の光を空間変調する空間変調手段を有することを特徴とする請求項 1一 7 の!、ずれか一項に記載の 3次元分析装置。
[9] 上記空間変調手段は空間位相変調手段からなることを特徴とする請求項 8に記載 の 3次元分析装置。
[10] 上記空間位相変調手段は、上記第 2の光に対して空間的に不連続な（2m+ 1) π の位相差 (ただし、 mは整数)を発生させる位相分布領域を有することを特徴とする請 求項 9に記載の 3次元分析装置。
[11] 上記空間位相変調手段は位相板力もなることを特徴とする請求項 10に記載の 3次 元分析装置。
[12] 上記位相分布領域は、光学基板上に上記位相差を発生させる光学薄膜を有する ことを特徴とする請求項 11に記載の 3次元分析装置。
[13] 上記位相分布領域は、光学基板上に上記位相差を発生させるエッチング領域を有 することを特徴とする請求項 11に記載の 3次元分析装置。
[14] 上記位相分布領域は、少なくとも 3つの同心円状の領域を有し、かつ隣接する領域 が上記（2m+ l) πの異なる位相差を発生させることを特徴とする請求項 12または 1
3に記載の 3次元分析装置。
[15] 上記位相分布領域は、 2つの同心円状の領域力もなることを特徴とする請求項 12 または 13に記載の 3次元分析装置。
[16] 上記 2つの領域のうちの内側の領域の半径を rとするとき、該位相板を透過する第 2 の光の光束半径が、 21/2'rであることを特徴とする請求項 15に記載の 3次元分析装 置。
[17] 上記内側の領域の中心と上記第 2の光の光束径の曲率中心とを一致させたことを 特徴とする請求項 16に記載の 3次元分析装置。
[18] 上記第 2の光の波長をえ、上記光学系の開口数を NAとするとき、 0. 2· λ ΖΝΑの 精度で、上記光学系による上記第 1の光および第 2の光の上記試料への集光点を位 置決めする位置決め機構を有することを特徴とする請求項 1一 17のいずれか一項に 記載の 3次元分析装置。
[19] 上記第 1の光および第 2の光を上記試料に対して、上記光学系の光軸と直交する 平面内で 2次元的に走査する 2次元走査手段を有することを特徴とする請求項 1一 1 8の 、ずれか一項に記載の 3次元分析装置。
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