JP2004239660A - 顕微鏡 - Google Patents
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Abstract
【課題】特にイレース光に対して波面の乱れを除去して完全な中空形状をもつビームに整形でき、極限に近い超解像性を誘起して空間分解能を向上できる顕微鏡を提供する。
【解決手段】少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料５６に対して、上記分子を基底状態から第１電子励起状態に励起するための第１の光、または上記分子を第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起するための第２の光を所定のビーム形状に空間位相変調して、これら第１の光および第２の光を一部分重ね合わせて集光し、試料５６からの発光を検出するようにした顕微鏡において、上記第１の光の光路中および／または上記第２の光の光路中に波面補償手段６１を設け、該波面補償手段６１により上記第１の光および／または上記第２の光に生じる波面収差を除去する。
【選択図】 図５
【解決手段】少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料５６に対して、上記分子を基底状態から第１電子励起状態に励起するための第１の光、または上記分子を第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起するための第２の光を所定のビーム形状に空間位相変調して、これら第１の光および第２の光を一部分重ね合わせて集光し、試料５６からの発光を検出するようにした顕微鏡において、上記第１の光の光路中および／または上記第２の光の光路中に波面補償手段６１を設け、該波面補償手段６１により上記第１の光および／または上記第２の光に生じる波面収差を除去する。
【選択図】 図５
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、顕微鏡、特に染色した試料を機能性の高いレーザ光源からの複数の波長の光により照明して、高い空間分解能を得る高性能かつ高機能の新しい光学顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザ技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、更に高機能の顕微鏡システムが開発されている。
【０００３】
このような背景の中、複数波長の光で試料を照明することにより発する二重共鳴吸収過程を用いて、得られる画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可能にした高機能な顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
この顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定の分子を選択して、特定の光学遷移に起因する吸収および蛍光を観測するものである。この原理について、図１１〜図１４を参照して説明する。図１１は、試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示すもので、先ず、図１１に示す基底状態（Ｓ０状態）の分子がもつ価電子軌道の電子を波長λ１の光により励起して、図１２に示す第１電子励起状態（Ｓ１状態）とする。次に、別の波長λ２の光により同様に励起して、図１３に示す第２電子励起状態（Ｓ２状態）とする。この励起状態により、分子は蛍光あるいは燐光を発光して、図１４に示すように基底状態に戻る。
【０００５】
二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、図１２の吸収過程や図１４の蛍光や燐光の発光を用いて、吸収像や発光像を観察する。この顕微鏡法では、最初にレーザ光等により共鳴波長λ１の光で図１２のように試料を構成する分子をＳ１状態に励起させるが、この際、単位体積内でのＳ１状態の分子数は、照射する光の強度が増加するに従って増加する。
【０００６】
ここで、線吸収係数は、分子一個当りの吸収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられるので、図１３のような励起過程においては、続いて照射する共鳴波長λ２に対する線吸収係数は、最初に照射した波長λ１の光の強度に依存することになる。すなわち、波長λ２に対する線吸収係数は、波長λ１の光の強度で制御できることになる。このことは、波長λ１および波長λ２の２波長の光で試料を照射し、波長λ２による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長λ１の光で完全に制御できることを示している。
【０００７】
また、図１３の励起状態での蛍光または燐光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強度はＳ１状態にある分子数に比例する。したがって、蛍光顕微鏡として利用する場合にも画像コントラストの制御が可能となる。
【０００８】
さらに、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、上記の画像コントラストの制御のみならず、化学分析も可能にする。すなわち、図１１に示される最外殻価電子軌道は、各々の分子に固有なエネルギー準位を持つので、波長λ１は分子によって異なることになり、同時に波長λ２も分子固有のものとなる。
【０００９】
ここで、従来の単一波長で照明する場合でも、ある程度特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが可能であるが、一般にはいくつかの分子における吸収帯の波長領域は重複するので、試料の化学組成の正確な同定までは不可能である。
【００１０】
これに対し、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、波長λ１および波長λ２の２波長により吸収あるいは発光する分子を限定するので、従来法よりも正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルをもつ光のみが強く吸収されるので、波長λ１および波長λ２の偏光方向を決めて吸収または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配向方向の同定まで可能となる。
【００１１】
また、最近では、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を越える高い空間分解能をもつ蛍光顕微鏡も提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【００１２】
図１５は、分子における二重共鳴吸収過程の概念図で、基底状態Ｓ０の分子が、波長λ１の光で第１電子励起状態であるＳ１に励起され、更に波長λ２の光で第２電子励起状態であるＳ２に励起されている様子を示している。なお、図１５はある種の分子のＳ２からの蛍光が極めて弱いことを示している。
【００１３】
図１５に示すような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図１６は、図１５と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸のＸ軸は空間的距離の広がりを表わし、波長λ２の光を照射した空間領域Ａ１と波長λ２の光が照射されない空間領域Ａ０とを示している。
【００１４】
図１６において、空間領域Ａ０では波長λ１の光の励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、その際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見られる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光を照射したため、Ｓ１状態の分子のほとんどが即座に高位のＳ２状態に励起されて、Ｓ１状態の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾つかの分子により確認されている。これにより、空間領域Ａ１では、波長λ３の蛍光は完全になくなり、しかもＳ２状態からの蛍光はもともとないので、空間領域Ａ１では完全に蛍光自体が抑制され（蛍光抑制効果）、空間領域Ａ０からのみ蛍光が発することになる。
【００１５】
このことは、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持っている。すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡等では、レーザ光を集光レンズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走査するが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。
【００１６】
ところが、図１６の場合には、波長λ１と波長λ２との２種類の光を空間的に上手く重ね合わせて、波長λ２の光の照射により蛍光領域を抑制することで、例えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光領域を集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる。したがって、この原理を利用することで、回折限界を越える二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡、例えば蛍光顕微鏡を実現することが可能となる。
【００１７】
さらに、波長λ１と波長λ２との２つの光の照射タイミングを工夫することで、Ｓ／Ｎを改善でき、かつ蛍光抑制を効果的に起す条件も提案されており、これにより超解像性をより効果的に発現することも可能である（例えば、特許文献３参照）。
【００１８】
このような超解像顕微鏡法の具体例として、蛍光ラベラー分子をＳ０状態からＳ１状態へ励起する波長λ１の光（特にレーザ光）をポンプ光とし、Ｓ１状態からＳ２状態へ励起する波長λ２の光をイレース光として、図１７に示すように、光源８１からポンプ光を、光源８２からイレース光をそれぞれ放射させ、ポンプ光はダイクロイックミラー８３で反射させた後、集光光学系８４により試料８５上に集光させ、イレース光は位相板８６で中空ビーム化した後、ダイクロイックミラー８３を透過させてポンプ光と空間的に重ね合わせて集光光学系８４により試料８５上に集光させるようにしたものが提案されている（例えば、特許文献４参照）。
【００１９】
この顕微鏡によると、イレース光の強度がゼロとなる光軸近傍以外の蛍光は抑制されるので、結果的にポンプ光の広がりより狭い領域（Δ＜０．６１・λ１／ＮＡ、ＮＡは集光光学系８４の開口数）に存在する蛍光ラベラー分子のみが観察されることになり、結果的に超解像性が発現することになる。なお、イレース光を中空ビーム化する位相板８６は、例えば、図１８に示すように、光軸に対して点対称な位置で位相差πを与えるように構成したものや、液晶面を用いた光空間変調器、あるいはミラー自身の形状を波長オーダーで制御するデフォーマブルミラーを用いることができる。
【００２０】
【特許文献１】
特開平８−１８４５５２号公報
【特許文献２】
特開２００１−１００１０２号公報
【特許文献３】
特開平１１−９５１２０号公報
【特許文献４】
特開２００１−２７２３４５号公報
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、本発明者らによる種々の実験検討によると、従来提案されている超解像蛍光顕微鏡にあっては、以下に説明するような改良すべき点があることが判明した。
【００２２】
以下、超解像蛍光顕微鏡を図１９に示すように構成した場合を例にとって説明する。図１９に示す超解像蛍光顕微鏡は、上記の特許文献２に開示されているもので、ローダミン６Ｇで染色された試料１００を観察するものである。この顕微鏡では、モードロック型のＮｄ：ＹＡＧレーザ１０１から出射される波長１０６４ｎｍのレーザ光をベータ硼酸バリウム（ＢＢＯ）結晶からなる波長変換素子１０２により２倍高調波の波長５３２ｎｍのレーザ光に波長変換し、このレーザ光をハーフミラー１０３で透過光と反射光との二光路に分岐して、その透過光をポンプ光としてダイクロイックミラー１０４および１０５を順次透過させた後、対物レンズ１０６により二次元移動ステージ１０７上に載置された試料１００に集光させるようにしている。
【００２３】
また、ハーフミラー１０３での反射光は、反射ミラー１０８で反射させた後、Ｂａ（ＮＯ３）２ 結晶からなるラマンシフタ１０９で波長５９９ｎｍのレーザ光に波長変換し、このレーザ光をイレース光として反射ミラー１１０で反射させた後、位相板１１１により中空ビームに整形し、さらにダイクロイックミラー１０４によりポンプ光と同軸上に揃えて、ダイクロイックミラー１０５を経て対物レンズ１０６により試料１００に集光させるようにしている。
【００２４】
一方、試料１００からの蛍光は、対物レンズ１０６を経てダイクロイックミラー１０５で反射させた後、蛍光集光レンズ１１２、シャープカットフィルタ１１３およびピンホール１１４を経てフォトマル１１５で受光するようになっている。なお、試料１００に投射されるポンプ光およびイレース光は、フォトマル１１６で受光され、その出力に基づいてＮｄ：ＹＡＧレーザ１０１から出射されるレーザ光の強度が一定となるようにフィードバック制御されるようになっている。
【００２５】
このような構成の超解像蛍光顕微鏡においては、イレース光のビーム形状によって超解像性の発現精度が大きく影響される。すなわち、理想的な中空ビームが形成されないと、逆に空間分解能が低下したり、蛍光信号が低下してＳ／Ｎが低下したりすることが懸念される。
【００２６】
ここで、整形による中空ビームの形状精度は、位相変調技術すなわち波面制御技術の精度に依存する。例えば、イレース光の波面が何らかの原因で乱れると、中空ビームの形状が崩れ、光軸中央部で電場強度の相殺が不完全となって電場強度が残存することになる。このため、この状態でポンプ光とイレース光とを重ね合わせて試料に集光すると、光軸中央部でも蛍光強度が抑制されて、空間分解能が低下するのみならず、Ｓ／Ｎが低下することになる。
【００２７】
この波面の乱れの原因となるものは、種々考えられるが、例えば、レーザ光自身の波面の歪み、レーザ光が通過する各光学素子の形状精度誤差やアライメント誤差等がある。
【００２８】
したがって、かかる点に鑑みてなされた本発明の目的は、特にイレース光に対して上記原因による波面の乱れを除去して完全な中空形状をもつビームに整形でき、これにより極限に近い超解像性を誘起して空間分解能を向上できる顕微鏡を提供することにある。
【００２９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成する請求項１に係る発明は、少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から第１電子励起状態に励起するための第１の光、または上記分子を上記第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起するための第２の光を所定のビーム形状に空間位相変調して、これら第１の光および第２の光を一部分重ね合わせて集光し、上記試料からの発光を検出するようにした顕微鏡において、
上記第１の光の光路中および／または上記第２の光の光路中に波面補償手段を設け、
該波面補償手段により上記第１の光および／または上記第２の光に生じる波面収差を除去するよう構成したことを特徴とするものである。
【００３０】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の顕微鏡において、上記波面補償手段は、光空間変調器を有することを特徴とするものである。
【００３１】
請求項３に係る発明は、請求項２に記載の顕微鏡において、上記第１の光および／または上記第２の光の空間位相分布を計測する空間位相分布計測手段を設け、該空間位相分布計測手段で計測した空間位相分布に基づいて上記光空間変調器により上記第１の光および／または上記第２の光を空間変調するよう構成したことを特徴とするものである。
【００３２】
請求項４に係る発明は、請求項３に記載の顕微鏡において、上記空間位相分布計測手段で計測した空間位相分布に基づいて波面補償データを生成して、上記光空間変調器による上記第１の光および／または上記第２の光の空間変調をフィードバック制御する制御手段を設けたことを特徴とするものである。
【００３３】
請求項５に係る発明は、請求項２，３または４に記載の顕微鏡において、上記光空間変調器により、上記第１の光または第２の光を上記所定のビーム形状に空間位相変調するよう構成したことを特徴とするものである。
【００３４】
先ず、本発明の原理について説明する。本発明では、顕微鏡の光源光学系で発生する波面収差による波面の乱れを波面補償法により除去して上記課題を解決する。このため、本発明の好適一実施の形態では、波面補償手段として、波面を補償制御できる光空間変調器を導入する。この光空間変調器は、回折面の各点への入射光に対して人為的に位相差を与えて入射光を光空間変調するための光学機器で、顕微鏡の光学系で発生する波面の乱れを計測し、そのデータをもとに光空間変調器で波面補償することにより、超解像顕微鏡の分解能を極限まで高めることが可能となる。
【００３５】
このような光空間変調器としては、波面制御の観点から位相制御型光空間変調器を用いるのが好ましい。その一例として、複屈折制御型の液晶を有し、この液晶に印加する電圧を制御することにより液晶の傾き状態を変化させて屈折率を変化させ、これにより入射した光の位相を２次元的に制御して波面を補正するようにした複屈折制御型（ＥＣＢモード）のものを用いることができる（例えば、特開平６−５１３４０号公報参照）。
【００３６】
図１は、かかる光空間変調器の概略構成を示す断面図である。この光空間変調器１は、対向する２枚のガラス基板２，３の内側表面にそれぞれ透明電極（ＩＴＯ）４，５を形成し、これらＩＴＯ４，５を有するガラス基板２，３の間に、光導電層としてのアモルファスシリコン（α−Ｓｉ）層６、遮光層７、誘電体多層膜ミラー８、および配向膜９，１０とスペーサ１１とで挟まれた平行配向の液晶層１２を配置した多層構造を有している。なお、ガラス基板２，３の外側表面にはそれぞれ反射防止膜１３，１４が形成されている。
【００３７】
かかる光空間変調器１は、ＩＴＯ４，５間にバイアス電圧を印加した状態で、ガラス基板２側から書き込み光を入射させ、ガラス基板３側から読み出し光を入射させて、その読み出し光を液晶層１２を経て誘電体多層膜ミラー８で反射させ、更に液晶層１２を経てガラス基板３から出射させるようにして使用される。
【００３８】
このように、ガラス基板２側から書き込み光を入射させると、α−Ｓｉ層６の抵抗またはインピーダンスが書き込み光の入射強度に応じて低下するので、ＩＴＯ４，５を介して液晶層１２に印加される電圧は、書き込み光の強度に応じて変化し、それに応じて液晶分子の傾き状態、すなわち屈折率が変化して読み出し光の光路長が変化し、読み出し光が変調される。
【００３９】
図１に示した光空間変調器１は、光アドレス型と呼ばれるタイプのもので、各部において書き込み光強度によって読み出し光の位相制御を行うものである。この光空間変調器１を用いて読み出し光の位相を２次元的に制御するには、例えば図２に示すように、光空間変調器１と、書き込み用電気信号発生器２１、液晶ディスプレイ（ＬＣＴＶ）２２、照明光源２３、コリメータレンズ２４、および結像レンズ２５とにより光空間変調装置２６を構成して、図示しないコンピュータで計算して作成した波面補償データであるコンピュータ合成ホログラム（ＣＧＨ）を、書き込み用電気信号発生器２１でビデオ信号に変換してＬＣＴＶ２２に表示し、このＬＣＴＶ２２を照明光源２３によりコリメータレンズ２４を介して照明して、その表示画像を結像レンズ２５により光空間変調器１に書き込み光として結像するようにすればよい（例えば、特開２０００−１００５８号公報参照）。
【００４０】
このようにすれば、ＣＧＨが再生されて、読み出し光が変調を受けるので、読み出し光を２次元的に位相制御でき、波面を補正することができる。
【００４１】
ここで、コンピュータで作成するＣＧＨは、補正対象波面を実際に検出し、その検出した波面に基づいて作成すればよい。例えば、図３に示すように、レーザ光源３１からのレーザ光を空間フィルタ３２を経てコリメータレンズ３３で平行光にしたのち、対物レンズ３４で試料３５に集光させる光学系の場合には、コリメータレンズ３３からのレーザ光を光空間変調装置２６の光空間変調器で反射させて対物レンズ３４に導くようにすると共に、光空間変調器への入射光路あるいは出射光路（図３では入射光路）にハーフミラー３６を配置してレーザ光を分岐し、その分岐されたレーザ光を、例えばシャックハルトマンセンサ等の波面検出器３７で受光して波面を計測する。
【００４２】
波面検出器３７で検出した波面情報はコンピュータ３８に供給し、ここで入力波面情報に基づいて所望の波面を得るためのＣＧＨ（波面補償データ）を計算して、その計算したＣＧＨを光空間変調装置２６に供給し、ここで図２で説明したようにビデオ信号に変換してＬＣＴＶに表示して、その表示画像を光空間変調装置２６の光空間変調器に書き込み光として結像させることにより、光空間変調器によるレーザ光の空間変調をフィードバック制御する。
【００４３】
例えば、均一な波面のレーザ光を得る場合において、波面検出器３７で検出された波面が図４（ａ）に示す形状のときは、その検出された波面とは逆の形状の図４（ｂ）に示す波面を光空間変調器にて形成することにより、図４（ｃ）に示すような均一な出力波面を得るようにする。
【００４４】
なお、波面補償手段は、図１に示したような光アドレス型の光空間変調器に限らず、ＬＣＴＶ等の電気アドレス型光空間変調器を用いたり、光路中に位相板や他の光空間変調器等を配置して、その出力面にホログラム等の手法により波面補正パターンを形成したりすることもできる。また、一つの光空間変調器で、波面補正のパターンとホログラム等のパターンとを重ね合わせたものを位相パターンとして形成することにより、上記と同様に所望の波面を得ることもできる。
【００４５】
上述したような光空間変調器を、超解像顕微鏡の光源光学系に挿入して、光源からのコヒーレント光が試料に到達するまでに発生する波面収差を除去することにより、イレース光として理想的な中空ビームを形成でき、その結果として極限に近い超解像性を誘起でき、空間分解能を向上することが可能となる。
【００４６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明による顕微鏡の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００４７】
図５は、本発明の第１実施の形態における顕微鏡の光学系の要部構成を示す図である。本実施の形態の顕微鏡は、ポンプ光およびイレース光をともに空間変調して超解像性を発現させて空間分解能を向上させたレーザ走査型の超解像蛍光顕微鏡を示すものである。以下、ローダミン６Ｇで染色された生体試料を観察する場合を例にとって説明する。
【００４８】
ローダミン６Ｇは、波長５３０ｎｍ近傍に基底状態（Ｓ０）から第１電子励起状態（Ｓ１）に励起される吸収帯があり、また、波長６００ｎｍ近傍に第１電子励起状態（Ｓ１）から、よりエネルギー準位の高い電子励起状態に励起される二重共鳴吸収帯域が存在することが確認されている（例えば、Ｅ．Ｓａｈａｒ ａｎｄ Ｄ．Ｔｒｅｖｅｓ：ＩＥＥＥ，Ｊ．Ｑｕａｎｔｕｍ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ．，ＱＥ−１３，６９２（１９７７）参照）。
【００４９】
そこで、本実施の形態では、光源として一台のＮｄ：ＹＡＧパルスレーザ５１を用い、その２倍高調波（５３２ｎｍ）をビームスプリッタ５２でコヒーレントな２光束に分岐し、その一方の光束をポンプ光（第１の光）としてビームコンバイナ５３およびハーフミラー５４で反射させて対物レンズ５５により試料５６に集光させる。
【００５０】
また、ビームスプリッタ５２で分岐された他方の光束は、Ｂａ（ＮＯ３）２結晶からなるラマンシフタ５７に入射させ、このラマンシフタ５７から出射される波長５９９ｎｍのコヒーレントな誘導ラマン光をイレース光（第２の光）として用いる。
【００５１】
ラマンシフタ５７から出射されるイレース光は、ミラー５８およびポンプ光との照射タイミングを合わせる遅延光学系５９を経て図１８に示した構成の位相板６０に入射させて中空ビームに空間位相変調する。この中空ビーム化されたイレース光は、波面補償手段としての図２に示した構成の光空間変調装置６１の空間位相変調器に入射させ、ここで回折されるイレース光をビームサンプラ６２を経てビームコンバイナ５３に入射させることによりポンプ光と同軸上に合成して、ハーフミラー５４および対物レンズ５５を経て試料５６に集光させる。なお、光空間変調装置６１を構成する空間位相変調器は、例えば図１に示した複屈折制御型の液晶を有する位相制御型光空間変調器を用いる。
【００５２】
試料５６は、試料移動ステージ６３上に載置し、この試料移動ステージ６３を二次元駆動することで、ポンプ光およびイレース光により試料５６を二次元走査する。
【００５３】
一方、上記のポンプ光およびイレース光の照射により試料５６から発する蛍光は、対物レンズ５５を経た後、ハーフミラー５４を透過させ、さらにハーフミラー６４で反射させて、レンズ６５によりピンホール６６の中央に集光させ、さらにレンズ６７によりフォトマル６８に入射させて検出する。ここで、ピンホール６６は共焦点位置に配置されており、空間フィルタとして機能する。これは、試料５６以外から発する、例えば光学系からの蛍光や散乱光をカットして測定のＳ／Ｎを高める作用をなすのと同時に、試料５６内の特定の深さの断層像の信号のみを選び出すオプティカルセクショニングの機能をもつ。
【００５４】
また、ハーフミラー６４を通過した蛍光は、結像レンズ６９を有するＣＣＤカメラ７０により結像して蛍光スポット像を直接観察できるようにし、対物レンズ５５のピント合わせ等に利用する。
【００５５】
本実施の形態では、位相板６０で中空ビーム化されたイレース光の一部をビームサンプラ６２で取り出して、その空間位相分布を波面測定器７１により計測する。
【００５６】
波面測定器７１は、例えば、２次元ＣＣＤと、その受光面の前方に配置された２次元マイクロレンズアレイとを有し、２次元マイクロレンズアレイにより入射光の瞳面を分割してマイクロレンズ毎にＣＣＤ受光面に集光するようにしたシャックハルトマン型のもの（例えば、仏国：Ｉｍａｇｉｎｅ Ｏｐｔｉｃ社製のＨＡＳＯＩＩ）を用いる。
【００５７】
この波面測定器７１は、瞳面内で均一の位相分布をもった波面が入射した場合には、マイクロレンズアレイにより分割された各瞳面を通過する光は、全く同じ条件でＣＣＤ受光面に集光し、瞳面内で均一でない位相分布をもった波面が入射した場合には、空間的に位置ずれを生じて集光するのを利用して、その位置ずれを位相のずれに変換して瞳面における位相分布に関するデータを出力するようになっている。
【００５８】
波面測定器７１でのイレース光の空間位相分布の計測結果は、制御コンピュータ７２に供給し、ここで計測結果に基づいてイレース光の波面の乱れを補償するための波面補償データを演算する。この波面補償データは、光空間変調装置６１に供給して、図２で説明したように光空間変調器に波面補償データに基づく波面補償パターンを結像させて液晶回折面に屈折率分布を与え、これにより光学系でのイレース光の波面収差を除去するようにイレース光を空間変調する。
【００５９】
なお、光空間変調装置６１によるイレース光の空間変調は、イレース光が理想的な中空ビームになるまで、波面測定器７１での計測結果をフィードバックして制御する。
【００６０】
このように、本実施の形態では、位相板６０で中空ビーム化されたイレース光の空間位相分布を波面測定器７１で測定し、その測定結果に基づいて波面の乱れを補償するように光空間変調装置６１によりイレース光を空間変調するようにしたので、イレース光を完全な中空形状にビーム整形することができる。したがって、極限に近い超解像性を誘起でき、空間分解能を向上することができる。
【００６１】
図６は、本発明の第２実施の形態における顕微鏡の光学系の要部構成を示す図である。本実施の形態の顕微鏡は、図５に示した構成において、光空間変調装置６１にイレース光を中空ビーム化する機能をも持たせて、位相板６０を省略したものである。
【００６２】
ここで、仮に、イレース光の波面が完全に均一であれば、イレース光の波長に対して図１８に示したような位相分布を光空間変調装置６１を構成する光空間変調器の液晶回折面に与えることにより、イレース光を理想的な中空ビームに整形することができる。また、光空間変調器に入射するイレース光の波面が乱れていても、波面測定器７１でその波面の乱れを測定して制御コンピュータ７２により波面補償データを演算し、その波面補償データを図１８の位相分布に重畳して光空間変調装置６１に供給すれば、中空ビーム整形と波面補償とを同時に行うことができる。
【００６３】
このため、本実施の形態では、光空間変調装置６１を構成する光空間変調器の液晶回折面に図１８で示したような位相パターンを書き込んで、イレース光を中空ビームとして回折させる。図７は、この際に光空間変調器に結像させる書き込み光（バックライト光）の空間強度分布を示すもので、バックライト光は液晶回折面の中央点を周回するように線形的かつ連続的に光強度分布が増加しており、一番強度が高い光書き込み領域でイレース光波長の入射光に対して２πの位相差を有している。
【００６４】
ところが、単に、光空間変調装置６１でイレース光を中空ビーム化しただけでは、試料５６に集光されるイレース光のビーム形状は、例えば図８に拡大して示すように、中空化しているものの光強度が不均一で、しかも光軸対称とはならない。これは、Ｎｄ：ＹＡＧパルスレーザ５１から出射されるレーザ光の波面の不均一性、ラマンシフタ５７で発生する波面収差、その他、光路に存在する光学素子で発生する位相ずれ等による。
【００６５】
そこで、本実施の形態では、波面測定器７１でイレース光の波面を測定して制御コンピュータ７２により波面補償データを演算し、その波面補償データを中空ビーム化するための位相分布データに重畳して光空間変調装置６１に供給することにより、中空ビーム整形と波面補償とを同時に行う。
【００６６】
このようにすれば、光空間変調装置６１を構成する光空間変調器には、イレース光を中空ビーム化するための図９（ａ）に示す空間強度分布と、波面測定器７１での測定結果に基づいてイレース光の波面を補償するための例えば図９（ｂ）に示す空間強度分布とが重畳された、図９（ｃ）に示すような空間強度分布のバックライト光が書き込まれ、これにより試料５６に集光されるイレース光を、図１０に拡大して示すように、完全に光軸対称で均一な中空ビームとすることができる。
【００６７】
したがって、本実施の形態においても、第１実施の形態と同様に、極限に近い超解像性を誘起でき、空間分解能を向上することができる。しかも、本実施の形態では、位相板を用いることなく、光空間変調装置６１によりイレース光の中空ビーム整形と波面補償とを行うようにしたので、第１実施の形態におけるよりも部品点数を削減でき、その分、コストダウンを図ることができる。
【００６８】
なお、本発明は上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、上記実施の形態では、一つのＮｄ：ＹＡＧパルスレーザ５１を用いてポンプ光とイレース光とを得るようにしたが、ポンプ光を放射する光源とイレース光を放射する光源とを独立して設けることもできる。
【００６９】
また、上記実施の形態ではイレース光を波面補償するように構成したが、ポンプ光の光路に例えば光空間変調器を配置してポンプ光を波面補償するように構成したり、イレース光の光路とポンプ光の光路とに例えば光空間変調器をそれぞれ配置してイレース光およびポンプ光の双方を波面補償するように構成したりすることもできる。
【００７０】
【発明の効果】
本発明によれば、少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から第１電子励起状態に励起するための第１の光、または上記分子を第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起するための第２の光を所定のビーム形状に空間位相変調して、これら第１の光および第２の光を一部分重ね合わせて集光するようにした顕微鏡において、第１の光の光路中および／または第２の光の光路中に波面補償手段を設けて波面収差を除去するようにしたので、特に超解像顕微鏡においては、イレース光を波面の乱のない完全な中空形状にビーム整形でき、これにより極限に近い超解像性を誘起して空間分解能を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る顕微鏡で用いる光空間光変調器の一例の概略構成を示す断面図である。
【図２】図１に示す光空間変調器を有する光空間変調装置の構成を示す図である。
【図３】図２に示す光空間変調装置の使用態様を説明するための図である。
【図４】図３に示す構成での波面補償原理を説明するための図である。
【図５】本発明の第１実施の形態を示す超解像顕微鏡の概略構成図である。
【図６】同じく、第２実施の形態を示す超解像顕微鏡の概略構成図である。
【図７】図６に示す構成において、イレース光を中空ビーム化する際の光空間変調装置における書き込み光の空間強度分布を示す図である。
【図８】図６に示す構成において、光空間変調装置によりイレース光の中空ビーム化のみを行った場合のイレース光の集光ビーム形状および光強度分布を拡大して示す図である。
【図９】第２実施の形態による光空間変調装置での書き込み光の空間強度分布を説明するための図である。
【図１０】第２実施の形態でのイレース光の集光ビーム形状および光強度分布を拡大して示す図である。
【図１１】試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示す概念図である。
【図１２】図１１の分子の第１励起状態を示す概念図である。
【図１３】同じく、第２励起状態を示す概念図である。
【図１４】同じく、第２励起状態から基底状態に戻る状態を示す概念図である。
【図１５】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１６】同じく、二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１７】従来の超解像顕微鏡の一例の構成を示す図である。
【図１８】図１７に示す位相板の構成を示す平面図である。
【図１９】従来の超解像顕微鏡の他の例の構成を示す図である。
【符号の説明】
１ 光空間変調器
２，３ ガラス基板
４，５ 透明電極
６ アモルファスシリコン（α−Ｓｉ）層
７ 遮光層
８ 誘電体多層膜ミラー
９，１０ 配向膜
１１ スペーサ
１２ 液晶層
１３，１４ 反射防止膜
５１ Ｎｄ：ＹＡＧパルスレーザ
５２ ビームスプリッタ
５３ ビームコンバイナ
５４ ハーフミラー
５５ 対物レンズ
５６ 試料
５７ ラマンシフタ
５８ ミラー
５９ 遅延光学系
６０ 位相板
６１ 光空間変調装置
６２ ビームサンプラ
６３ 試料移動ステージ
６４ ハーフミラー
６５ レンズ
６６ ピンホール
６７ レンズ
６８ フォトマル
６９ 結像レンズ
７０ ＣＣＤカメラ
７１ 波面測定器
７２ 制御コンピュータ
【発明の属する技術分野】
本発明は、顕微鏡、特に染色した試料を機能性の高いレーザ光源からの複数の波長の光により照明して、高い空間分解能を得る高性能かつ高機能の新しい光学顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
光学顕微鏡の技術は古く、種々のタイプの顕微鏡が開発されてきた。また、近年では、レーザ技術および電子画像技術をはじめとする周辺技術の進歩により、更に高機能の顕微鏡システムが開発されている。
【０００３】
このような背景の中、複数波長の光で試料を照明することにより発する二重共鳴吸収過程を用いて、得られる画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可能にした高機能な顕微鏡が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００４】
この顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて特定の分子を選択して、特定の光学遷移に起因する吸収および蛍光を観測するものである。この原理について、図１１〜図１４を参照して説明する。図１１は、試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示すもので、先ず、図１１に示す基底状態（Ｓ０状態）の分子がもつ価電子軌道の電子を波長λ１の光により励起して、図１２に示す第１電子励起状態（Ｓ１状態）とする。次に、別の波長λ２の光により同様に励起して、図１３に示す第２電子励起状態（Ｓ２状態）とする。この励起状態により、分子は蛍光あるいは燐光を発光して、図１４に示すように基底状態に戻る。
【０００５】
二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、図１２の吸収過程や図１４の蛍光や燐光の発光を用いて、吸収像や発光像を観察する。この顕微鏡法では、最初にレーザ光等により共鳴波長λ１の光で図１２のように試料を構成する分子をＳ１状態に励起させるが、この際、単位体積内でのＳ１状態の分子数は、照射する光の強度が増加するに従って増加する。
【０００６】
ここで、線吸収係数は、分子一個当りの吸収断面積と単位体積当たりの分子数との積で与えられるので、図１３のような励起過程においては、続いて照射する共鳴波長λ２に対する線吸収係数は、最初に照射した波長λ１の光の強度に依存することになる。すなわち、波長λ２に対する線吸収係数は、波長λ１の光の強度で制御できることになる。このことは、波長λ１および波長λ２の２波長の光で試料を照射し、波長λ２による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは波長λ１の光で完全に制御できることを示している。
【０００７】
また、図１３の励起状態での蛍光または燐光による脱励起過程が可能である場合には、その発光強度はＳ１状態にある分子数に比例する。したがって、蛍光顕微鏡として利用する場合にも画像コントラストの制御が可能となる。
【０００８】
さらに、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、上記の画像コントラストの制御のみならず、化学分析も可能にする。すなわち、図１１に示される最外殻価電子軌道は、各々の分子に固有なエネルギー準位を持つので、波長λ１は分子によって異なることになり、同時に波長λ２も分子固有のものとなる。
【０００９】
ここで、従来の単一波長で照明する場合でも、ある程度特定の分子の吸収像あるいは蛍光像を観察することが可能であるが、一般にはいくつかの分子における吸収帯の波長領域は重複するので、試料の化学組成の正確な同定までは不可能である。
【００１０】
これに対し、二重共鳴吸収過程を用いた顕微鏡法では、波長λ１および波長λ２の２波長により吸収あるいは発光する分子を限定するので、従来法よりも正確な試料の化学組成の同定が可能となる。また、価電子を励起する場合、分子軸に対して特定の電場ベクトルをもつ光のみが強く吸収されるので、波長λ１および波長λ２の偏光方向を決めて吸収または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配向方向の同定まで可能となる。
【００１１】
また、最近では、二重共鳴吸収過程を用いて回折限界を越える高い空間分解能をもつ蛍光顕微鏡も提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【００１２】
図１５は、分子における二重共鳴吸収過程の概念図で、基底状態Ｓ０の分子が、波長λ１の光で第１電子励起状態であるＳ１に励起され、更に波長λ２の光で第２電子励起状態であるＳ２に励起されている様子を示している。なお、図１５はある種の分子のＳ２からの蛍光が極めて弱いことを示している。
【００１３】
図１５に示すような光学的性質を持つ分子の場合には、極めて興味深い現象が起きる。図１６は、図１５と同じく二重共鳴吸収過程の概念図で、横軸のＸ軸は空間的距離の広がりを表わし、波長λ２の光を照射した空間領域Ａ１と波長λ２の光が照射されない空間領域Ａ０とを示している。
【００１４】
図１６において、空間領域Ａ０では波長λ１の光の励起によりＳ１状態の分子が多数生成され、その際に空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見られる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光を照射したため、Ｓ１状態の分子のほとんどが即座に高位のＳ２状態に励起されて、Ｓ１状態の分子は存在しなくなる。このような現象は、幾つかの分子により確認されている。これにより、空間領域Ａ１では、波長λ３の蛍光は完全になくなり、しかもＳ２状態からの蛍光はもともとないので、空間領域Ａ１では完全に蛍光自体が抑制され（蛍光抑制効果）、空間領域Ａ０からのみ蛍光が発することになる。
【００１５】
このことは、顕微鏡の応用分野から考察すると、極めて重要な意味を持っている。すなわち、従来の走査型レーザ顕微鏡等では、レーザ光を集光レンズによりマイクロビームに集光して観察試料上を走査するが、その際のマイクロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界となり、原理的にそれ以上の空間分解能は期待できない。
【００１６】
ところが、図１６の場合には、波長λ１と波長λ２との２種類の光を空間的に上手く重ね合わせて、波長λ２の光の照射により蛍光領域を抑制することで、例えば波長λ１の光の照射領域に着目すると、蛍光領域を集光レンズの開口数と波長とで決まる回折限界よりも狭くでき、実質的に空間分解能を向上させることが可能となる。したがって、この原理を利用することで、回折限界を越える二重共鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡、例えば蛍光顕微鏡を実現することが可能となる。
【００１７】
さらに、波長λ１と波長λ２との２つの光の照射タイミングを工夫することで、Ｓ／Ｎを改善でき、かつ蛍光抑制を効果的に起す条件も提案されており、これにより超解像性をより効果的に発現することも可能である（例えば、特許文献３参照）。
【００１８】
このような超解像顕微鏡法の具体例として、蛍光ラベラー分子をＳ０状態からＳ１状態へ励起する波長λ１の光（特にレーザ光）をポンプ光とし、Ｓ１状態からＳ２状態へ励起する波長λ２の光をイレース光として、図１７に示すように、光源８１からポンプ光を、光源８２からイレース光をそれぞれ放射させ、ポンプ光はダイクロイックミラー８３で反射させた後、集光光学系８４により試料８５上に集光させ、イレース光は位相板８６で中空ビーム化した後、ダイクロイックミラー８３を透過させてポンプ光と空間的に重ね合わせて集光光学系８４により試料８５上に集光させるようにしたものが提案されている（例えば、特許文献４参照）。
【００１９】
この顕微鏡によると、イレース光の強度がゼロとなる光軸近傍以外の蛍光は抑制されるので、結果的にポンプ光の広がりより狭い領域（Δ＜０．６１・λ１／ＮＡ、ＮＡは集光光学系８４の開口数）に存在する蛍光ラベラー分子のみが観察されることになり、結果的に超解像性が発現することになる。なお、イレース光を中空ビーム化する位相板８６は、例えば、図１８に示すように、光軸に対して点対称な位置で位相差πを与えるように構成したものや、液晶面を用いた光空間変調器、あるいはミラー自身の形状を波長オーダーで制御するデフォーマブルミラーを用いることができる。
【００２０】
【特許文献１】
特開平８−１８４５５２号公報
【特許文献２】
特開２００１−１００１０２号公報
【特許文献３】
特開平１１−９５１２０号公報
【特許文献４】
特開２００１−２７２３４５号公報
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、本発明者らによる種々の実験検討によると、従来提案されている超解像蛍光顕微鏡にあっては、以下に説明するような改良すべき点があることが判明した。
【００２２】
以下、超解像蛍光顕微鏡を図１９に示すように構成した場合を例にとって説明する。図１９に示す超解像蛍光顕微鏡は、上記の特許文献２に開示されているもので、ローダミン６Ｇで染色された試料１００を観察するものである。この顕微鏡では、モードロック型のＮｄ：ＹＡＧレーザ１０１から出射される波長１０６４ｎｍのレーザ光をベータ硼酸バリウム（ＢＢＯ）結晶からなる波長変換素子１０２により２倍高調波の波長５３２ｎｍのレーザ光に波長変換し、このレーザ光をハーフミラー１０３で透過光と反射光との二光路に分岐して、その透過光をポンプ光としてダイクロイックミラー１０４および１０５を順次透過させた後、対物レンズ１０６により二次元移動ステージ１０７上に載置された試料１００に集光させるようにしている。
【００２３】
また、ハーフミラー１０３での反射光は、反射ミラー１０８で反射させた後、Ｂａ（ＮＯ３）２ 結晶からなるラマンシフタ１０９で波長５９９ｎｍのレーザ光に波長変換し、このレーザ光をイレース光として反射ミラー１１０で反射させた後、位相板１１１により中空ビームに整形し、さらにダイクロイックミラー１０４によりポンプ光と同軸上に揃えて、ダイクロイックミラー１０５を経て対物レンズ１０６により試料１００に集光させるようにしている。
【００２４】
一方、試料１００からの蛍光は、対物レンズ１０６を経てダイクロイックミラー１０５で反射させた後、蛍光集光レンズ１１２、シャープカットフィルタ１１３およびピンホール１１４を経てフォトマル１１５で受光するようになっている。なお、試料１００に投射されるポンプ光およびイレース光は、フォトマル１１６で受光され、その出力に基づいてＮｄ：ＹＡＧレーザ１０１から出射されるレーザ光の強度が一定となるようにフィードバック制御されるようになっている。
【００２５】
このような構成の超解像蛍光顕微鏡においては、イレース光のビーム形状によって超解像性の発現精度が大きく影響される。すなわち、理想的な中空ビームが形成されないと、逆に空間分解能が低下したり、蛍光信号が低下してＳ／Ｎが低下したりすることが懸念される。
【００２６】
ここで、整形による中空ビームの形状精度は、位相変調技術すなわち波面制御技術の精度に依存する。例えば、イレース光の波面が何らかの原因で乱れると、中空ビームの形状が崩れ、光軸中央部で電場強度の相殺が不完全となって電場強度が残存することになる。このため、この状態でポンプ光とイレース光とを重ね合わせて試料に集光すると、光軸中央部でも蛍光強度が抑制されて、空間分解能が低下するのみならず、Ｓ／Ｎが低下することになる。
【００２７】
この波面の乱れの原因となるものは、種々考えられるが、例えば、レーザ光自身の波面の歪み、レーザ光が通過する各光学素子の形状精度誤差やアライメント誤差等がある。
【００２８】
したがって、かかる点に鑑みてなされた本発明の目的は、特にイレース光に対して上記原因による波面の乱れを除去して完全な中空形状をもつビームに整形でき、これにより極限に近い超解像性を誘起して空間分解能を向上できる顕微鏡を提供することにある。
【００２９】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成する請求項１に係る発明は、少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から第１電子励起状態に励起するための第１の光、または上記分子を上記第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起するための第２の光を所定のビーム形状に空間位相変調して、これら第１の光および第２の光を一部分重ね合わせて集光し、上記試料からの発光を検出するようにした顕微鏡において、
上記第１の光の光路中および／または上記第２の光の光路中に波面補償手段を設け、
該波面補償手段により上記第１の光および／または上記第２の光に生じる波面収差を除去するよう構成したことを特徴とするものである。
【００３０】
請求項２に係る発明は、請求項１に記載の顕微鏡において、上記波面補償手段は、光空間変調器を有することを特徴とするものである。
【００３１】
請求項３に係る発明は、請求項２に記載の顕微鏡において、上記第１の光および／または上記第２の光の空間位相分布を計測する空間位相分布計測手段を設け、該空間位相分布計測手段で計測した空間位相分布に基づいて上記光空間変調器により上記第１の光および／または上記第２の光を空間変調するよう構成したことを特徴とするものである。
【００３２】
請求項４に係る発明は、請求項３に記載の顕微鏡において、上記空間位相分布計測手段で計測した空間位相分布に基づいて波面補償データを生成して、上記光空間変調器による上記第１の光および／または上記第２の光の空間変調をフィードバック制御する制御手段を設けたことを特徴とするものである。
【００３３】
請求項５に係る発明は、請求項２，３または４に記載の顕微鏡において、上記光空間変調器により、上記第１の光または第２の光を上記所定のビーム形状に空間位相変調するよう構成したことを特徴とするものである。
【００３４】
先ず、本発明の原理について説明する。本発明では、顕微鏡の光源光学系で発生する波面収差による波面の乱れを波面補償法により除去して上記課題を解決する。このため、本発明の好適一実施の形態では、波面補償手段として、波面を補償制御できる光空間変調器を導入する。この光空間変調器は、回折面の各点への入射光に対して人為的に位相差を与えて入射光を光空間変調するための光学機器で、顕微鏡の光学系で発生する波面の乱れを計測し、そのデータをもとに光空間変調器で波面補償することにより、超解像顕微鏡の分解能を極限まで高めることが可能となる。
【００３５】
このような光空間変調器としては、波面制御の観点から位相制御型光空間変調器を用いるのが好ましい。その一例として、複屈折制御型の液晶を有し、この液晶に印加する電圧を制御することにより液晶の傾き状態を変化させて屈折率を変化させ、これにより入射した光の位相を２次元的に制御して波面を補正するようにした複屈折制御型（ＥＣＢモード）のものを用いることができる（例えば、特開平６−５１３４０号公報参照）。
【００３６】
図１は、かかる光空間変調器の概略構成を示す断面図である。この光空間変調器１は、対向する２枚のガラス基板２，３の内側表面にそれぞれ透明電極（ＩＴＯ）４，５を形成し、これらＩＴＯ４，５を有するガラス基板２，３の間に、光導電層としてのアモルファスシリコン（α−Ｓｉ）層６、遮光層７、誘電体多層膜ミラー８、および配向膜９，１０とスペーサ１１とで挟まれた平行配向の液晶層１２を配置した多層構造を有している。なお、ガラス基板２，３の外側表面にはそれぞれ反射防止膜１３，１４が形成されている。
【００３７】
かかる光空間変調器１は、ＩＴＯ４，５間にバイアス電圧を印加した状態で、ガラス基板２側から書き込み光を入射させ、ガラス基板３側から読み出し光を入射させて、その読み出し光を液晶層１２を経て誘電体多層膜ミラー８で反射させ、更に液晶層１２を経てガラス基板３から出射させるようにして使用される。
【００３８】
このように、ガラス基板２側から書き込み光を入射させると、α−Ｓｉ層６の抵抗またはインピーダンスが書き込み光の入射強度に応じて低下するので、ＩＴＯ４，５を介して液晶層１２に印加される電圧は、書き込み光の強度に応じて変化し、それに応じて液晶分子の傾き状態、すなわち屈折率が変化して読み出し光の光路長が変化し、読み出し光が変調される。
【００３９】
図１に示した光空間変調器１は、光アドレス型と呼ばれるタイプのもので、各部において書き込み光強度によって読み出し光の位相制御を行うものである。この光空間変調器１を用いて読み出し光の位相を２次元的に制御するには、例えば図２に示すように、光空間変調器１と、書き込み用電気信号発生器２１、液晶ディスプレイ（ＬＣＴＶ）２２、照明光源２３、コリメータレンズ２４、および結像レンズ２５とにより光空間変調装置２６を構成して、図示しないコンピュータで計算して作成した波面補償データであるコンピュータ合成ホログラム（ＣＧＨ）を、書き込み用電気信号発生器２１でビデオ信号に変換してＬＣＴＶ２２に表示し、このＬＣＴＶ２２を照明光源２３によりコリメータレンズ２４を介して照明して、その表示画像を結像レンズ２５により光空間変調器１に書き込み光として結像するようにすればよい（例えば、特開２０００−１００５８号公報参照）。
【００４０】
このようにすれば、ＣＧＨが再生されて、読み出し光が変調を受けるので、読み出し光を２次元的に位相制御でき、波面を補正することができる。
【００４１】
ここで、コンピュータで作成するＣＧＨは、補正対象波面を実際に検出し、その検出した波面に基づいて作成すればよい。例えば、図３に示すように、レーザ光源３１からのレーザ光を空間フィルタ３２を経てコリメータレンズ３３で平行光にしたのち、対物レンズ３４で試料３５に集光させる光学系の場合には、コリメータレンズ３３からのレーザ光を光空間変調装置２６の光空間変調器で反射させて対物レンズ３４に導くようにすると共に、光空間変調器への入射光路あるいは出射光路（図３では入射光路）にハーフミラー３６を配置してレーザ光を分岐し、その分岐されたレーザ光を、例えばシャックハルトマンセンサ等の波面検出器３７で受光して波面を計測する。
【００４２】
波面検出器３７で検出した波面情報はコンピュータ３８に供給し、ここで入力波面情報に基づいて所望の波面を得るためのＣＧＨ（波面補償データ）を計算して、その計算したＣＧＨを光空間変調装置２６に供給し、ここで図２で説明したようにビデオ信号に変換してＬＣＴＶに表示して、その表示画像を光空間変調装置２６の光空間変調器に書き込み光として結像させることにより、光空間変調器によるレーザ光の空間変調をフィードバック制御する。
【００４３】
例えば、均一な波面のレーザ光を得る場合において、波面検出器３７で検出された波面が図４（ａ）に示す形状のときは、その検出された波面とは逆の形状の図４（ｂ）に示す波面を光空間変調器にて形成することにより、図４（ｃ）に示すような均一な出力波面を得るようにする。
【００４４】
なお、波面補償手段は、図１に示したような光アドレス型の光空間変調器に限らず、ＬＣＴＶ等の電気アドレス型光空間変調器を用いたり、光路中に位相板や他の光空間変調器等を配置して、その出力面にホログラム等の手法により波面補正パターンを形成したりすることもできる。また、一つの光空間変調器で、波面補正のパターンとホログラム等のパターンとを重ね合わせたものを位相パターンとして形成することにより、上記と同様に所望の波面を得ることもできる。
【００４５】
上述したような光空間変調器を、超解像顕微鏡の光源光学系に挿入して、光源からのコヒーレント光が試料に到達するまでに発生する波面収差を除去することにより、イレース光として理想的な中空ビームを形成でき、その結果として極限に近い超解像性を誘起でき、空間分解能を向上することが可能となる。
【００４６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明による顕微鏡の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００４７】
図５は、本発明の第１実施の形態における顕微鏡の光学系の要部構成を示す図である。本実施の形態の顕微鏡は、ポンプ光およびイレース光をともに空間変調して超解像性を発現させて空間分解能を向上させたレーザ走査型の超解像蛍光顕微鏡を示すものである。以下、ローダミン６Ｇで染色された生体試料を観察する場合を例にとって説明する。
【００４８】
ローダミン６Ｇは、波長５３０ｎｍ近傍に基底状態（Ｓ０）から第１電子励起状態（Ｓ１）に励起される吸収帯があり、また、波長６００ｎｍ近傍に第１電子励起状態（Ｓ１）から、よりエネルギー準位の高い電子励起状態に励起される二重共鳴吸収帯域が存在することが確認されている（例えば、Ｅ．Ｓａｈａｒ ａｎｄ Ｄ．Ｔｒｅｖｅｓ：ＩＥＥＥ，Ｊ．Ｑｕａｎｔｕｍ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ．，ＱＥ−１３，６９２（１９７７）参照）。
【００４９】
そこで、本実施の形態では、光源として一台のＮｄ：ＹＡＧパルスレーザ５１を用い、その２倍高調波（５３２ｎｍ）をビームスプリッタ５２でコヒーレントな２光束に分岐し、その一方の光束をポンプ光（第１の光）としてビームコンバイナ５３およびハーフミラー５４で反射させて対物レンズ５５により試料５６に集光させる。
【００５０】
また、ビームスプリッタ５２で分岐された他方の光束は、Ｂａ（ＮＯ３）２結晶からなるラマンシフタ５７に入射させ、このラマンシフタ５７から出射される波長５９９ｎｍのコヒーレントな誘導ラマン光をイレース光（第２の光）として用いる。
【００５１】
ラマンシフタ５７から出射されるイレース光は、ミラー５８およびポンプ光との照射タイミングを合わせる遅延光学系５９を経て図１８に示した構成の位相板６０に入射させて中空ビームに空間位相変調する。この中空ビーム化されたイレース光は、波面補償手段としての図２に示した構成の光空間変調装置６１の空間位相変調器に入射させ、ここで回折されるイレース光をビームサンプラ６２を経てビームコンバイナ５３に入射させることによりポンプ光と同軸上に合成して、ハーフミラー５４および対物レンズ５５を経て試料５６に集光させる。なお、光空間変調装置６１を構成する空間位相変調器は、例えば図１に示した複屈折制御型の液晶を有する位相制御型光空間変調器を用いる。
【００５２】
試料５６は、試料移動ステージ６３上に載置し、この試料移動ステージ６３を二次元駆動することで、ポンプ光およびイレース光により試料５６を二次元走査する。
【００５３】
一方、上記のポンプ光およびイレース光の照射により試料５６から発する蛍光は、対物レンズ５５を経た後、ハーフミラー５４を透過させ、さらにハーフミラー６４で反射させて、レンズ６５によりピンホール６６の中央に集光させ、さらにレンズ６７によりフォトマル６８に入射させて検出する。ここで、ピンホール６６は共焦点位置に配置されており、空間フィルタとして機能する。これは、試料５６以外から発する、例えば光学系からの蛍光や散乱光をカットして測定のＳ／Ｎを高める作用をなすのと同時に、試料５６内の特定の深さの断層像の信号のみを選び出すオプティカルセクショニングの機能をもつ。
【００５４】
また、ハーフミラー６４を通過した蛍光は、結像レンズ６９を有するＣＣＤカメラ７０により結像して蛍光スポット像を直接観察できるようにし、対物レンズ５５のピント合わせ等に利用する。
【００５５】
本実施の形態では、位相板６０で中空ビーム化されたイレース光の一部をビームサンプラ６２で取り出して、その空間位相分布を波面測定器７１により計測する。
【００５６】
波面測定器７１は、例えば、２次元ＣＣＤと、その受光面の前方に配置された２次元マイクロレンズアレイとを有し、２次元マイクロレンズアレイにより入射光の瞳面を分割してマイクロレンズ毎にＣＣＤ受光面に集光するようにしたシャックハルトマン型のもの（例えば、仏国：Ｉｍａｇｉｎｅ Ｏｐｔｉｃ社製のＨＡＳＯＩＩ）を用いる。
【００５７】
この波面測定器７１は、瞳面内で均一の位相分布をもった波面が入射した場合には、マイクロレンズアレイにより分割された各瞳面を通過する光は、全く同じ条件でＣＣＤ受光面に集光し、瞳面内で均一でない位相分布をもった波面が入射した場合には、空間的に位置ずれを生じて集光するのを利用して、その位置ずれを位相のずれに変換して瞳面における位相分布に関するデータを出力するようになっている。
【００５８】
波面測定器７１でのイレース光の空間位相分布の計測結果は、制御コンピュータ７２に供給し、ここで計測結果に基づいてイレース光の波面の乱れを補償するための波面補償データを演算する。この波面補償データは、光空間変調装置６１に供給して、図２で説明したように光空間変調器に波面補償データに基づく波面補償パターンを結像させて液晶回折面に屈折率分布を与え、これにより光学系でのイレース光の波面収差を除去するようにイレース光を空間変調する。
【００５９】
なお、光空間変調装置６１によるイレース光の空間変調は、イレース光が理想的な中空ビームになるまで、波面測定器７１での計測結果をフィードバックして制御する。
【００６０】
このように、本実施の形態では、位相板６０で中空ビーム化されたイレース光の空間位相分布を波面測定器７１で測定し、その測定結果に基づいて波面の乱れを補償するように光空間変調装置６１によりイレース光を空間変調するようにしたので、イレース光を完全な中空形状にビーム整形することができる。したがって、極限に近い超解像性を誘起でき、空間分解能を向上することができる。
【００６１】
図６は、本発明の第２実施の形態における顕微鏡の光学系の要部構成を示す図である。本実施の形態の顕微鏡は、図５に示した構成において、光空間変調装置６１にイレース光を中空ビーム化する機能をも持たせて、位相板６０を省略したものである。
【００６２】
ここで、仮に、イレース光の波面が完全に均一であれば、イレース光の波長に対して図１８に示したような位相分布を光空間変調装置６１を構成する光空間変調器の液晶回折面に与えることにより、イレース光を理想的な中空ビームに整形することができる。また、光空間変調器に入射するイレース光の波面が乱れていても、波面測定器７１でその波面の乱れを測定して制御コンピュータ７２により波面補償データを演算し、その波面補償データを図１８の位相分布に重畳して光空間変調装置６１に供給すれば、中空ビーム整形と波面補償とを同時に行うことができる。
【００６３】
このため、本実施の形態では、光空間変調装置６１を構成する光空間変調器の液晶回折面に図１８で示したような位相パターンを書き込んで、イレース光を中空ビームとして回折させる。図７は、この際に光空間変調器に結像させる書き込み光（バックライト光）の空間強度分布を示すもので、バックライト光は液晶回折面の中央点を周回するように線形的かつ連続的に光強度分布が増加しており、一番強度が高い光書き込み領域でイレース光波長の入射光に対して２πの位相差を有している。
【００６４】
ところが、単に、光空間変調装置６１でイレース光を中空ビーム化しただけでは、試料５６に集光されるイレース光のビーム形状は、例えば図８に拡大して示すように、中空化しているものの光強度が不均一で、しかも光軸対称とはならない。これは、Ｎｄ：ＹＡＧパルスレーザ５１から出射されるレーザ光の波面の不均一性、ラマンシフタ５７で発生する波面収差、その他、光路に存在する光学素子で発生する位相ずれ等による。
【００６５】
そこで、本実施の形態では、波面測定器７１でイレース光の波面を測定して制御コンピュータ７２により波面補償データを演算し、その波面補償データを中空ビーム化するための位相分布データに重畳して光空間変調装置６１に供給することにより、中空ビーム整形と波面補償とを同時に行う。
【００６６】
このようにすれば、光空間変調装置６１を構成する光空間変調器には、イレース光を中空ビーム化するための図９（ａ）に示す空間強度分布と、波面測定器７１での測定結果に基づいてイレース光の波面を補償するための例えば図９（ｂ）に示す空間強度分布とが重畳された、図９（ｃ）に示すような空間強度分布のバックライト光が書き込まれ、これにより試料５６に集光されるイレース光を、図１０に拡大して示すように、完全に光軸対称で均一な中空ビームとすることができる。
【００６７】
したがって、本実施の形態においても、第１実施の形態と同様に、極限に近い超解像性を誘起でき、空間分解能を向上することができる。しかも、本実施の形態では、位相板を用いることなく、光空間変調装置６１によりイレース光の中空ビーム整形と波面補償とを行うようにしたので、第１実施の形態におけるよりも部品点数を削減でき、その分、コストダウンを図ることができる。
【００６８】
なお、本発明は上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、上記実施の形態では、一つのＮｄ：ＹＡＧパルスレーザ５１を用いてポンプ光とイレース光とを得るようにしたが、ポンプ光を放射する光源とイレース光を放射する光源とを独立して設けることもできる。
【００６９】
また、上記実施の形態ではイレース光を波面補償するように構成したが、ポンプ光の光路に例えば光空間変調器を配置してポンプ光を波面補償するように構成したり、イレース光の光路とポンプ光の光路とに例えば光空間変調器をそれぞれ配置してイレース光およびポンプ光の双方を波面補償するように構成したりすることもできる。
【００７０】
【発明の効果】
本発明によれば、少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から第１電子励起状態に励起するための第１の光、または上記分子を第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起するための第２の光を所定のビーム形状に空間位相変調して、これら第１の光および第２の光を一部分重ね合わせて集光するようにした顕微鏡において、第１の光の光路中および／または第２の光の光路中に波面補償手段を設けて波面収差を除去するようにしたので、特に超解像顕微鏡においては、イレース光を波面の乱のない完全な中空形状にビーム整形でき、これにより極限に近い超解像性を誘起して空間分解能を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る顕微鏡で用いる光空間光変調器の一例の概略構成を示す断面図である。
【図２】図１に示す光空間変調器を有する光空間変調装置の構成を示す図である。
【図３】図２に示す光空間変調装置の使用態様を説明するための図である。
【図４】図３に示す構成での波面補償原理を説明するための図である。
【図５】本発明の第１実施の形態を示す超解像顕微鏡の概略構成図である。
【図６】同じく、第２実施の形態を示す超解像顕微鏡の概略構成図である。
【図７】図６に示す構成において、イレース光を中空ビーム化する際の光空間変調装置における書き込み光の空間強度分布を示す図である。
【図８】図６に示す構成において、光空間変調装置によりイレース光の中空ビーム化のみを行った場合のイレース光の集光ビーム形状および光強度分布を拡大して示す図である。
【図９】第２実施の形態による光空間変調装置での書き込み光の空間強度分布を説明するための図である。
【図１０】第２実施の形態でのイレース光の集光ビーム形状および光強度分布を拡大して示す図である。
【図１１】試料を構成する分子の価電子軌道の電子構造を示す概念図である。
【図１２】図１１の分子の第１励起状態を示す概念図である。
【図１３】同じく、第２励起状態を示す概念図である。
【図１４】同じく、第２励起状態から基底状態に戻る状態を示す概念図である。
【図１５】分子における二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１６】同じく、二重共鳴吸収過程を説明するための概念図である。
【図１７】従来の超解像顕微鏡の一例の構成を示す図である。
【図１８】図１７に示す位相板の構成を示す平面図である。
【図１９】従来の超解像顕微鏡の他の例の構成を示す図である。
【符号の説明】
１ 光空間変調器
２，３ ガラス基板
４，５ 透明電極
６ アモルファスシリコン（α−Ｓｉ）層
７ 遮光層
８ 誘電体多層膜ミラー
９，１０ 配向膜
１１ スペーサ
１２ 液晶層
１３，１４ 反射防止膜
５１ Ｎｄ：ＹＡＧパルスレーザ
５２ ビームスプリッタ
５３ ビームコンバイナ
５４ ハーフミラー
５５ 対物レンズ
５６ 試料
５７ ラマンシフタ
５８ ミラー
５９ 遅延光学系
６０ 位相板
６１ 光空間変調装置
６２ ビームサンプラ
６３ 試料移動ステージ
６４ ハーフミラー
６５ レンズ
６６ ピンホール
６７ レンズ
６８ フォトマル
６９ 結像レンズ
７０ ＣＣＤカメラ
７１ 波面測定器
７２ 制御コンピュータ
Claims (5)
- 少なくとも基底状態を含む３つの電子状態を有する分子を含む試料に対して、上記分子を基底状態から第１電子励起状態に励起するための第１の光、または上記分子を上記第１電子励起状態から、よりエネルギー準位の高い第２電子励起状態に励起するための第２の光を所定のビーム形状に空間位相変調して、これら第１の光および第２の光を一部分重ね合わせて集光し、上記試料からの発光を検出するようにした顕微鏡において、
上記第１の光の光路中および／または上記第２の光の光路中に波面補償手段を設け、
該波面補償手段により上記第１の光および／または上記第２の光に生じる波面収差を除去するよう構成したことを特徴とする顕微鏡。 - 上記波面補償手段は、光空間変調器を有することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
- 上記第１の光および／または上記第２の光の空間位相分布を計測する空間位相分布計測手段を設け、該空間位相分布計測手段で計測した空間位相分布に基づいて上記光空間変調器により上記第１の光および／または上記第２の光を空間変調するよう構成したことを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡。
- 上記空間位相分布計測手段で計測した空間位相分布に基づいて波面補償データを生成して、上記光空間変調器による上記第１の光および／または上記第２の光の空間変調をフィードバック制御する制御手段を設けたことを特徴とする請求項３に記載の顕微鏡。
- 上記光空間変調器により、上記第１の光または第２の光を上記所定のビーム形状に空間位相変調するよう構成したことを特徴とする請求項２，３または４に記載の顕微鏡。
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