JP2010506203A - 並行化された顕微鏡イメージングのための方法および装置 - Google Patents

Abstract

並行化された顕微鏡イメージングのための方法および装置であって、少なくとも１つの領域内の試料の、蛍光励起のための第１の照明と、検出器要素による試料光の、領域に割り当てられた位置分解検出とを含み、その際、第２の照明により、領域が、検出器要素に割り当てられている、離間されて蛍光を発する部分領域へと区分され、その際、部分領域の離間が、蛍光を低下させた中間領域または蛍光を発しない中間領域による蛍光範囲の空間的な分離、および部分領域からの蛍光の様々なスペクトル特性による蛍光範囲の空間的な分離のうちの少なくとも一つによって行われる方法および装置。

Description

構造化された照明による顕微鏡イメージングのための方法および装置を説明する。その際、現況技術から知られている非線形の試料相互作用により、空間解像度の向上を達成する。

現況技術から、適切な実施の際に空間解像度を向上させ得る様々な非線形の試料相互作用が知られている。ここで具体的に挙げると：
１． 誘導放出による励起レベルの脱励起（Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ−ＳＴＥＤ）（例えば、クラール（Ｋｌａｒ）およびヘル（Ｈｅｌｌ）、Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．第２４巻（１９９９年）９５４〜９５６ページ）
２． ３重項占有による基底状態の抑制（Ｇｒｏｕｎｄ Ｓｔａｔｅ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ−ＧＳＤ）（例えば、ヘル（Ｈｅｌｌ）およびクロウク（Ｋｒｏｕｇ）、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｂ６０（１９９５年）、４９５〜４９７ページ）
３． 蛍光状態と、非蛍光状態または比較的弱い蛍光状態または別の特徴（別の放出波長のような）によって特徴付けられた蛍光状態との間の色素の可逆的または非可逆的な切替え（例えば、ヘル（Ｈｅｌｌ）、ヤコブス（Ｊａｋｏｂｓ）、およびカストラップ（Ｋａｓｔｒｕｐ）、Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ａ７７（２００３年）８５９〜８６０ページ）。

その際、これらの方法の基本的な流れは、空間的に制限された領域内の色素が、
ａ）非蛍光状態または比較的弱い蛍光状態に遷移されることにより、その後の励起が、制限された範囲内だけでの、または主に制限された範囲内での蛍光を引き起こし得る（２．および３．）、または
ｂ）先行する励起の後に脱励起されることにより、制限された領域のうちの僅かからしか蛍光が生じない（１．）、ことにある。

両方の場合で、蛍光領域は、回折によって制限された励起によって達成し得るよりも小さいと考えられている。基本原理は、図１において、工程に基づき、およびそれぞれ使用された空間分布または結果として生じる空間分布の概略図に基づき、図解されている。現況技術から既知の装置は、ポイント・スキャン方法を基礎としており、この方法の場合、抑制／切替え／脱励起のために、好ましくは中心に零位を備えた光分布（いわゆるドーナツ・モード）が適用される。その際、レーザ放射線が試料の表面に沿ってスキャンされ、かつ各空間点において、図１に示した工程が順次的に実施される。ここまでは、１．（クラールら（Ｋｌａｒ ｅｔ ａｌ．）、ＰＮＡＳ ９７（２０００年）、８２０６〜８２１０ページ）および３．（例えば、ホフマンら（Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）、ＰＮＡＳ １０２（２００５年）、１７５６５〜１７５６９ページ）に基づく、全てが上述の流れに従って機能する装置について説明されている。これらの装置の決定的な欠点は、順次的なデータ取得である。空間解像度の向上は、励起ボリュームの減少を引き起こすので、蛍光放出が減少され、これにより、一般的にピクセル積分時間はより増加せざるを得ない（横方向にのみ解像度が５倍向上すると、例えば回折によって制限された励起の広さにわたって色素分布が均質な場合、約２５倍少ない蛍光放出が予測され得る）。さらに、ドロンパのような、既知の切替え可能な色素の幾つかでは、可能な切替えサイクルを多くするため、制限された光出力でしか切替えることができない（例えば、ハブチら（Ｈａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．）、ＰＮＡＳ １０２（２００５年）９５１１〜９５１６ページ）。したがって、この場合、３．に基づく方法は、オフ切替えのために、蛍光励起だけのために必要であるよりもかなり長い露光時間が、ピクセルごとに必要である。このため受け入れ可能な画像構築時間にするには、並行したデータ取得が必要であることが明らかである。その際、焦点外の蛍光によって、コントラストおよび獲得した解像度を損なわないために、共焦点イメージングが必要であることを留意すべきである。現況技術から明らかな並行化の可能性は、複数のスポットでの同時励起であり、これらのスポットのそれぞれが、その蛍光特性をドーナツ状の照明によって変えられる。ただし解像度の向上を達成するため、ドーナツ状の照明は、非線形の試料相互作用、一般的に飽和を引き起こさなければならない。これは、つまり、この光分布により個々のスポットの周りの相対的に大きな範囲が相互作用するということであり、これは低いスポット密度しか、したがって低い並行化しか許容しない。それだけでなく、このようなマルチ・スポット装置における共焦点の検出は、技術的に労力がかかる。

本方法および相応の装置は、イメージングに関し、並行したデータ取得の際に全ての空間方向において回折限界を超える解像度での共焦点イメージングが可能なように、前述の試料相互作用を利用するという課題を解決する。

以下に、並行したデータ取得によって、直接的に（画像処理なしで）高解像度の画像を達成する方法および装置を説明する。焦点外の背景は、可変の共焦点検出によって排除され得る。この方法および装置は、現況技術に基づくマルチ・スポット装置の上述の欠点を回避する。特に本発明に基づく実現により、最適な並行化（同時に励起される試料領域の最大密度）および技術的に比較的容易な実施が可能になる。

基本原理
上述の要求にふさわしい装置は、ライン状の励起、およびスリット絞りの後ろのライン・カメラによる共焦点検出に基づく。非線形の試料相互作用との組合せにおける適切な露光パターンによって、脱励起／抑制／切替え（以下、例示的に常に切替えと言う）は、ラインに沿ってスポット列だけが蛍光を放出し得るように実現される。その際、これらのスポットの間隔は、光学システムの回折によって制限された解像度と少なくとも同等の大きさである（ただし、解像度よりあまり大きくないことが有利である）。このような照明（同時に軸方向にも構造化されている）の生成を可能にするのは、本願明細書に援用する出願（独国特許出願公開第１０２００４０３４９６２号明細書（Ａ１））に記載されているような、周期構造でのコヒーレント光の回折、および対象面内での回折次数の干渉である。その際、カメラのライン上では、回折によって制限されており、互いに分離している光分布が生じ、この光分布は、相応のピクセル上に当たり、かつそこで分離されて検出される（図２を参照）。

図２に縦に並べて示されているのは、対象面内での切替え放射線分布、対象面内での励起分布、対象面内での励起および切替え光の重なり合い、カメラ・ピクセル、およびカメラ面内での光分布である。

切替え放射線分布では、Ｘが、図９ａ）および図１１での図および注釈に基づく０次回折を意味する。ＸＸは、図９ａ）および図１１での図および注釈に基づく＋／−１次回折を意味する。

ラインに沿って（ｘ）、またはラインに対し垂直に（ｙ）、対象物を走査することにより、高解像度の画像が得られる。この走査は、例えばガルバノメータ・スキャナによる照明分布の移動および対象物の移動のうちの少なくとも一つによって行われ得る。第１の場合には、検出器上での固定的な光分布を維持するため、照明用放射線および検出用放射線が同じ放射線偏向要素を介して送出されなければならない（デスキャン検出）。対象物だけの移動（対象物スキャニング）の場合には、光分布はいずれにせよ固定的である。

その際、試料上の測定点へのピクセルの割り当てについての情報は、スキャン移動および相応の光学系から一義的に明らかになる。これを、以下にさらに詳しく解説することとする。つまりカメラ・ピクセルを試料上に結像することにより、検出器によって観察される画像エリアのラスタが規定される。例えば５１２個のピクセルを、各ピクセルが回折によって制限された解像度の１．５倍の画像面積を検出するように試料上に結像させる（開口数１．４の対物レンズに関してこれは、４８８ｎｍの波長の場合、４８８ｎｍ／（２×１．４）×１．５＝２６０ｎｍの辺の長さのエリアに相当する）。照明パターン（切替え光分布）のアライメントによって、試料とカメラ・ピクセル内での、発光するスポットの一義的な割り当てがなされていることが保証される。対象物と照明パターンの相対移動により、様々な試料点が結像される。その際、スキャン移動およびそれに同期した検出は、試料内のスポットの大きさに適応していなければならない。典型的には、スポット直径の半分の走査が行われる（ナイキストの定理）。つまり上述の例では、非線形の試料相互作用によって５倍の解像度向上（Ｎ＝５）が達成される場合、試料走査は、２６０ｎｍ／（５×２）＝２６ｎｍの間隔で行わなければならない。このため１本のラインが完全に走査され得るには、Ｎ×２のスキャン／検出工程が必要である（上記の例では１０）。したがって、ｘ方向に５１２個のピクセルでは、高解像されたデータ点が５１２×２×Ｎ個になる（図３を参照）。

図３に縦に並べて示されているのは、カメラ・ピクセルおよび光分布、第１〜第１０のスキャン工程における対象点の割り当て、結果として生じるライン画像、およびＹスキャン工程に基づき結果として生じる２Ｄ画像である。

これまでの考察は、対象面に限定されていた。しかし対象物は常に３次元である。これは複数の結論を有する。１つには、向上された解像度での焦点内の蛍光と共に、焦点の外でも蛍光が励起される。この蛍光は、上述のイメージングを妨害し、かつ高解像された対象点へのピクセルの割り当てを不可能にする可能性がある。ここで、焦点外の蛍光を効果的に抑制する共焦点検出が役に立つ。ここで論じられている場合には、この共焦点検出は、カメラの前の理想的には可変のスリット絞りによって、ラインに平行に実現される。もう１つには、イメージングのために３次元の点広がり関数（ＰＳＦ）を考慮すべきである。これは、励起および検出のＰＳＦと共に、切替え光分布に依存するであろう。ＰＳＦは、軸方向において、回折によって制限されたＰＳＦに相応する広がりを有し得る（横方向にのみの構造化された切替え光）。図４は、対象面内での横方向（Ｘ／Ｘ）および軸方向（光軸Ｚ）の光分布を示している。しかし、軸方向での切替え光の更なる構造化により、軸方向の解像度向上も達成し得る（図５）。図５には概略的に、軸方向に構造化されていない切替え光が生じさせるであろう軸方向の光分布が、切替え光の軸方向の構造化と一緒に描き込まれている。この切替え光分布は、例えば図１２（これに帰属する説明を含む）に基づく装置内での、図８ｂ）または図８ｃ）に基づく光学要素の使用から結果として生じる。この場合に実際に得られた光分布が図５の下側に示されている。適用に応じて、図４の下側または図５の下側のような分布が有意義であり得る。このため機器内で両方の状況を実現し得ることが有用である。

全ての上述の考察は、原理的に、２次元の構造化された切替え放射線分布および平面検出器による検出にも転用できる。この場合には、励起および場合によっては必要なオン切替えが、平面的な照明（遠視野における）によって行われる。このような構成は、並行性の向上という利点を有するであろう（例えば５１２^２個の点を同時に露光し得る）が、非共焦点検出の欠点も有するであろう。その際、焦点外の蛍光の発生は、試料に応じて（特に厚い、強く着色された試料の場合）、重大な問題を示し得る。

結像のある程度の共焦点性を同時に確保する場合の、向上された並行性の利用に対する選択肢は、互いに離間した複数のラインを試料上に結像し、かつ平面検出器によって検出することにある。このラインが、平面検出器上で十分に離間されている場合（例えば約１０ピクセル）、ラインに割り当てられたピクセルを選択的に読み取ることにより、共焦点検出が達成され得る。隣接するピクセルをも考慮することによって、共焦点性が調整され得る。例えば、このラインに隣接する２本のピクセル・ラインの読取りおよび相応の割り当てられたピクセル要素の足し合わせは、共焦点性の相応の低下と共に、有効な「スリット絞り」を３倍に拡大することを意味する。このような構成のために、照明用放射線経路内で、図８および図９に示されたような、瞳付近にある要素を利用することができる。ただし、主カラー・スプリッタの前に接続された要素により、瞳内で様々な角度で接触するｎ本の部分放射線への光の分割が行われなければならない。これは、対象面内では、ｎ本の互いに離間されたラインにおいて結果として生じ、その際、各ラインは、図４および図５で示したやり方で成形される。主カラー・スプリッタの前に接続された上述の要素は、相応の結像を備える適切に成形された回折性要素（または複数の要素の組合せ）、または幾何学的な分割および部分放射線の放射線偏向のための装置であり得る。これに関する例は図６に示されており、その際、ここでは見易くするため、ｎ＝３本のラインだけへの分割が示されている。

工程に基づき、およびそれぞれ使用された空間分布または結果として生じる空間分布の概略図に基づき基本原理を示す図。 対象面内での切替え放射線分布、対象面内での励起分布、対象面内での励起および切替え光の重なり合い、カメラ・ピクセル、およびカメラ面内での光分布を示す図。 カメラ・ピクセルおよび光分布、第１〜第１０のスキャン工程における対象点の割り当て、結果として生じるライン画像、およびＹスキャン工程に基づき結果として生じる２Ｄ画像を示す図。 対象面内での横方向（Ｘ／Ｘ）および軸方向（光軸Ｚ）の光分布を示す図。 軸方向に構造化されていない切替え光が生じさせるであろう軸方向の光分布と切替え光の軸方向の構造化とを一緒に示す図。 主カラー・スプリッタの前に接続された要素の実施例を示す図。 従来のライン・スキャン・システムを示す図。 ａは横方向の構造化のための位相マスクを示す図。ｂは軸方向の構造化のための位相マスクを示す図。ｃは軸方向の構造化のための位相マスクを示す図。 ａはアクロマート・カラー・スプリッタを示す図。ｂは共役の瞳面内の放射線経路内にあるアクロマート・カラー・スプリッタを示す図。 ａはマスクなしでの分布を示す図。ｂは図８ｂに基づくマスク有りでの分布を示す図。ｃは図８ａに基づくマスク有りでの分布を示す図。ｄはインコヒーレントな重ね合わせにより生じた分布を示す図。 ａは交互のオンおよびオフ切替えを示す図。ｂはオフ切替えの詳細を示す図。 ドロンパを使用するための走査型レーザ顕微鏡用の好ましい照明ユニットの概略図。 本発明による照明ユニットが組込まれたライン・スキャン顕微鏡を示す図。 ａは位相格子を示す図。ｂは格子定数が一定の位相格子を示す図。ｃは位相マスクを示す図。 図８ａからの位相マスクの使用のもとでの対象面内の照明の強度分布を示す図。 例えばドロンパでの、オフ切替えが飽和した際の励起状態において結果として生じる分子ポピュレーションを示す図。 照明の例示的実施形態を示す図。 ａは対象面内での横方向の強度構造を示す図。ｂは対象面内での軸方向の強度構造を示す図。

好ましい装置は、図７に示したような、および例えば本願明細書に援用する（独国特許出願公開第１０２５７２３７号明細書（Ａ１））、（欧州特許出願第１６１７２７１号明細書（Ａ２））に記載されたようなライン・スキャン・システムを改良したシステムを利用する。

その際、改良は以下の点に関する：
１． アクロマート・カラー・スプリッタ・アクロゲートを、対象面内での切替え光の構造化を可能にするようなカラー・スプリッタと取り替える――これは、適切なアクロマート設計または２色性ビーム・スプリッタであり得る。

２． 照明ユニットを、必要な非線形の試料相互作用および切替え光の構造化を可能にするような照明ユニットと取り替える。
３． 試料の露光および検出が、適切な時間の長さでの切替え／励起／検出／オン切替えの適切な連続（図１を参照）によって行われるようなやり方に、照明およびデータ取得を適応させる。

４． 図３に概略的に示したような対象点へのピクセルの割り当てが行われるように、データ評価を適応させる。
切替え光の構造化
横方向の構造化の生成の好ましい形態は、図８ａ）に基づく位相マスクによって可能であり、この位相マスクは、対物レンズの瞳付近で結像されるべきである。ここで図１２の放射線経路を参照のこと。このマスクは中央で分割されており、その際、右半分および左半分は、通過する光の異なる位相ずれを引き起こす。この場合、中央のラインの半分に関するπの位相ジャンプにより、図２の上部で示したような２重ラインが達成される。２重ラインの間隔内のラインの正弦波変調（２重ラインの間隔内の励起変調を達成するための、図２の上部を参照）は、瞳の端にある両方のライン分布の干渉によって達成される。例えば限界周波数の２／３でのライン変調を達成するためには、ラインは、瞳半径を形成する直径の２／３の間隔を有していなければならない。重要なのは、２重ラインを生成する光成分と、変調された中央のラインを生成する成分が、試料内でインコヒーレントに重なることである。これは、相応の光成分の対象物内への到達時間の遅れが、コヒーレントな長さより大きいことによって保証され得る。しかし、好ましくは、図８に概略的に矢印で示したように、光成分の偏光を互いに直交となるように調整するだけである。これは例えば、選択的に瞳の外側の領域内の光を回転させるλ／２板によって生じさせ得る（図８を参照）。図８ａ）に示したような位相マスク上での光の分布を得るために、適切な位相格子をマスクの前の共役の画像面付近で使用することができる。その際、中央のラインは、０次回折に相当し、かつ瞳の端にある両方のラインは相応の格子の１次回折に相当する。格子の回折次数を使用することにより、同時に、対象面内での光分布の最適な相対的な位置が保証される。上述の措置によって達成された、０次回折に対する１次回折のインコヒーレンスにより、コヒーレントな照明にもかかわらず、対象面内での中央のラインの変調が、インコヒーレントな光の結像の限界周波数（それはコヒーレントな光による結像の場合の２倍）まで可能になることも保証される。更なる結論は、（独国特許出願公開第１０２００４０３４９６２号明細書（Ａ１））に記載された装置とは違い、軸方向における光の構造化を行わないことにある。

図５の上側で概略的に示したように、切替え光の構造化が軸方向にも所望される場合は、切替え光の更なる部分放射線が、対物レンズの瞳に共役な面の付近にある図８ｂ）に基づく位相マスクによって変形される。

マスク８ｂ）および８ｃ）は、光軸に対して、および光軸に垂直な軸に対して対称的に、中央の領域を有しており、この中央の領域は、右および左での外側の領域に比べ、通過する光の異なる位相遅れを引き起こす。この場合、ライン状の瞳照明の内側の部分に対して、外側の部分のπの位相遅れが起こる。その際、位相ジャンプの最適な半径は、理論的には対物レンズの瞳半径の１／√２である。実際にはしばしば、もう少し小さい半径が最適である。半径を最適に適応させるには、並進によって半径適応を行い得る図８ｃ）に示したような位相板が適している。

図８の瞳光分布から生じ、励起およびオン切替えのための分布（ライン）とも適合するアクロマート・カラー・スプリッタが、図９ａ）に示されている。このスプリッタは、図９ｂ）に示したように、共役の瞳面内の放射線経路内にある。試料から放出された蛍光は瞳に充満し、そのため（反射性帯状部以外で）スプリッタを通過する。外側のミラー面（Ｘ）は、図１１のＳ１の＋／−１次回折の伝送のために使用され、内側のミラー面（ＸＸ）は、図１２のＳ１の０次回折および放射線経路Ｓ２、Ｓ３の伝送のために使用される。場合によっては、ミラー面の全てが同じ焦点面内にはないことを留意すべきである。この焦点面内に合焦された光のレイリー領域が、外側のミラー面の焦点ずれより小さい場合、内側のミラー面に対する外側の（焦点内にない）ミラー面の拡大によるピンぼけを考慮しなければならない。

図９には、４８８ｎｍで、開口数（ＮＡ）１．４の油浸対物レンズにより、相応のマスクを用いた実験の結果（試料内での光分布による工程）が示されている。図１０ａ）はマスクなしでの分布（励起分布に相当）を、ｂ）は図８ｂ）に基づくマスク有りでの分布を、およびｃ）は図８ａ）（中央部分のみ）に基づくマスク有りでの分布を示している。インコヒーレントな重ね合わせが、結果的に図１０ｄ）に示した分布を生じさせ、この分布は、ｙおよびｚ方向で囲んだ最小値を示している。この最小値は、約１７０ｎｍ（ｙ）または４００ｎｍ（ｚ）の広さを有しており、これは、おおよそ、回折によって制限された限界周波数の逆側に相当する
（横方向：λ／（２・ＮＡ）≒１７０ｎｍ、軸方向：

）。

焦点内の試料内で発生する強度最小値の点パターンは、相応の非線形の試料相互作用により、励起可能な範囲（ＧＳＤ／切替え）または、まだ励起があると言える範囲（ＳＴＥＤ）の点パターンを生じさせる。この範囲は、色素に最適化させた適切な露光（波長、強度、露光時間）に基づき、回折によって制限された光分布より明らかに小さく、このため向上された解像度での試料の走査を可能にする。照明の調整は、色素の情報に基づいて行われ、かつ機器でのテスト構造（例えばビーズ）の解像度に基づき最適化され得る。この点パターンは、ライン・カメラのピクセル上に正確に結像されなければならないので、照明用放射線経路または検出用放射線経路内に、有利には可変の光学システム（ズーム）が設けられるべきであり、この光学システムが、パターン周期を検出器要素の周期に適応させることを可能にする。照明用放射線経路または検出用放射線経路内での傾動可能な厚いガラス板のような更なる要素によって、結像されたスポットの位置（つまりスポットの重心）をピクセル内で中心に合わせることができる（例えば（独国特許出願公開第１０２００４０３４９６０号明細書（Ａ１））を参照）。

励起およびオン切替え
励起およびオン切替えは、マスクなしで生成される回折によって制限された光分布を用いて行われる。好ましい装置ではラインであり、このラインは、ラインに沿ってできるだけ均質な強度推移を有しており、かつラインに垂直に、回折によって制限された広がりを有している。

励起は、時間的には切替え／脱励起の前（ＳＴＥＤ）か、または構造化されたやり方で切替え光により色素がオフ切替え／退色された後（ＧＳＤ／切替え）に行われる。切替えの場合のみ、一般的に、引き続きオン切替えレーザによってオフ切替えを反転させる必要がある。というのは、他の方法では、色素は自然に再び元の状態に戻るからである（時間的な順序に関し図１も参照）。パルスレーザを使用する場合（それはＳＴＥＤの場合に一般的に必要である）、時間的な順序は、相応の部分放射線の遅れによって達成され得る。連続的に放出する（ｃｗ）レーザを使用する場合、時間的な順序は、速いスイッチ（好ましくはＡＯＴＦ）によって達成されなければならない。

励起およびオン切替えのための最適なパラメータは、色素特性の情報を基に前もって決定される。オン切替えに関しては、オフ切替えのできるだけ完全な反転を得るよう努められ、励起の最適化および放出された蛍光信号の同時の検出は、信号対雑音比の最大化のもとで行われる。この場合、様々な相互作用メカニズムのために、様々な境界条件について留意されるべきである。

・ＳＴＥＤでは、励起およびそれに続く脱励起の後に残された、励起された分子ポピュレーションだけが蛍光に寄与し得る。これらの分子の１回の放出を超える光子検出は、この工程（励起‐脱励起‐蛍光検出）の繰り返しを必要とする。

・ＧＳＤでは、分子が自然に３重項レベルから戻ってくるまでの間だけ、励起され、かつ結果として生じる蛍光が検出され得る。これは１μｓ程度の比較的短い期間である。
・色素の切替えでは、幾つかの場合、励起波長と切替え波長が一致している。この切替えが、色素のオフ切替えである場合（ドロンパの場合のように）、切替え光分布による狙いを定めた切替えの間は蛍光光子の検出を阻止しなければならないか、または空間的に制限された範囲からの光子の検出と分けなければならない。それだけでなく、空間的に制限された範囲内でも、色素のオフ切替えまでしか蛍光信号を検出することができない。そうでない場合、色素がオフ切替えされた状態に安定して留まる間は、更なる制限はない。励起波長と分子のオン切替えのための波長が一致しても（例えばタンパク質ａｓＦＰ５８５に関し知られている（ホフマンら（Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）、ＰＮＡＳ １０２（２００５年）、１７５６５〜１７５６９ページ））、蛍光励起が切替え工程より効率がよく、かつ励起出力および切替え出力ならびに露光時間が相応に適応されるような場合は、問題を示さない。

試料内では一般的に、全ての光放出性分子が非線形の試料相互作用（ＳＴＥＤ／切替え／ＧＳＤ）に関与することはないであろう。このことは、非線形の放射線成形の影響下になく、かつ達成可能な高解像度を制限する背景信号を生じさせる。ＧＳＤおよび切替えの場合のような、長く続く（つまり約＞１μｓ）状態の場合には、再度のオン切替え（切替え）または基底状態への自然な緩和（ＧＳＤ）の前の更なる記録によって、非線形の試料相互作用に関与した分子の信号に対する背景の大きさの程度を判断し得る。これはつまり、例えばドロンパのような光スイッチの場合、構造化されていない励起（Ｓ２、図１１）は、蛍光励起に加えて、ドロンパ分子のオフ切替えも引き起こすという状態になる（類似して、ＧＳＤの場合の励起は、３重項状態の占有も引き起こす）。したがって、更なる（構造化されていない）励起および検出の際には、光切替え工程（またはＧＳＤ）の影響下にない分子だけしか発光しなくなる。（ａｓＦＰの場合のような（ホフマンら（Ｈｏｆｆｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．）、ＰＮＡＳ １０２（２００５年）、１７５６５〜１７５６９ページ））蛍光励起が分子のオン切替えを引き起こす切替え可能な分子の場合、やり方は類似している。ただし、ここでは、追加的な工程において色素をまず構造化せずにオフ切替えし、その後、構造化されていない照明で励起された蛍光を検出しなければならない。

例：タンパク質ドロンパの切替え
切替えのための適切な候補は、タンパク質ドロンパである（例えば、ハブチら（Ｈａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．）、ＰＮＡＳ １０２（２００５年）９５１１〜９５１６ページ）。この場合、オフ切替えおよび励起が約４５０ｎｍ〜５２０ｎｍの範囲内の波長で行われる。オン切替えは３５０ｎｍ〜４２０ｎｍの範囲内で行われ得る。これは、例えば４７７ｎｍおよび４８８ｎｍのアルゴン・レーザのラインによって働くこと、および４０５ｎｍのレーザ・ダイオードをオン切替えのために使用することを可能にする。交互のオンおよびオフ切替えを図１１ａ）が示している。図１１ｂ）にはオフ切替えの詳細が再現されている。この図は、十分なオフ切替えを達成するために約５ｍｓの長い露光時間を示している。確かに強度を向上させれば露光時間を短縮させ得るが、しかし、それは、約１００回の切替えサイクルが示された図１１ａ）に比べて、可能な切替えサイクルを減少させる。

ドロンパを使用するための走査型レーザ顕微鏡用の好ましい照明ユニットの概略図を図１２が示している。ここで、Ｓ１は、切替え光分布を生成するための放射線経路である（図２、７および５を参照）。ここで、色素のオン切替えは、オフ切替えの前か、または励起の後に行われる。Ｓ２は励起用放射線経路である。Ｓ３は、場合によっては必要な、オフ切替えされた色素をオン切替えするための更なる放射線経路である。つまり最初にＳ１（オフ切替え）、その後Ｓ２（励起）が行われ、かつ完全にそれ以前に、または完全にその後にＳ３（オン切替え）が行われ、その際、この場合はＳ２で検出が行われる。Ｓ２での波長４７７ｎｍは、別の励起波長（例えば４８８ｎｍ）と取り替えてもよい。

ＳＴＥＤおよびＧＳＤ（冒頭を参照）は、Ｓ１、Ｓ２を用いて実現可能であり、ＳＴＥＤはＳ２に続くＳ１およびＳ１での検出により、ＧＳＤはＳ１に続くＳ２およびＳ２での検出により実現され得る。

Ｓ１では、（例えばパウエル・レンズによる）放射線成形およびスプリッタＤＣの通過の後、格子の０次回折においては、後ろのマスク７ａ）（位相ジャンプ）により、試料内では切替え放射のうちの横方向を制限する両方の外側のラインが生成され、かつ＋／−１次回折によって中央のラインの構造化が生成される。

マスク７ｂ）または７ｃ）（スプリッタＤＣでの反射後から、マスク７ｃの後までの分かれた放射線経路）は、説明した位相ジャンプにより、切替え放射を軸方向で制限するラインを生成する。

７ａ）および７ｃ）を通る放射線経路のために、少し異なる波長（ここでは４８８ｎｍ、４７７ｎｍ）を使用することができ、ただしその波長は両方とも、それぞれの色素の応答挙動の範囲内になければならない。

ライン・スキャン顕微鏡内への本発明による照明ユニットの組込みが図１３に示されている。この顕微鏡は、検出用放射線経路内に、検出器のライン上でのスポットの位置を決めるための上述のアライメント板を含んでいる。このシステム内の更なるズームは、対象物内での照明されたラインのライン検出器上への結像を調整することに用いられる。こうしてラインの選択された部分が、ライン検出器上に結像され得る。両方のズームの相互作用により、いかなる場合も、照明スポットとカメラ・ピクセルの一義的な割り当てが保証されなければならない。

更なる色素の切替え（ドロンパと同時にも）のためのフレキシブルなシステムを得るため、更なるレーザの結合および複数の色のための２色性スプリッタＤＣ（またはニュートラル・スプリッタとして）の設計が企図され得る。それだけでなく（波長差に応じて）マスクを交換する必要があり得る（ただし、これは、その後、同時に働かせることができなくなり得る）。

容易な適応は、格子定数の変更であり、これにより回折次数は瞳内の同じ箇所に当たる。これは、図１４ａ）に示したような格子の並進によって実現され得る。控え目な波長変更（５％程度で）の場合、マスクを複数の波長で同時に使用することもできる。

１つの波長を使用する場合も、システム内での調整が可能である必要性があり、この必要性は、例えば様々な対物レンズの使用から生じる。その際、様々な対物レンズの瞳への照明の基礎適応は、主カラー・スプリッタ直後のズーム・システムによって行われる（図８）。更なる特有の適応は、回折次数における強度の相対的な配分であり、この相対的な配分は、対物レンズを交換する場合の次数の様々な喪失から生じ得る。それだけでなく、これによって対象物特有の適応が可能になる。適応の好ましい形態は、格子定数が一定の格子での効果的な垂直辺比率の変更による図１４ｂ）を示している。図８ｂ）のマスクの位相ジャンプの半径の適応は、軸方向での最適な構造化のために特に問題がある。例えば使用すべき対物レンズでのＰＳＦの記録に基づく半径の精密な最適化は、図１２ｃ）に示されたようなマスク設計によって可能である。このマスクの並進によって、効果的な半径が、位相縁に適応され得る。

ドロンパのための強度分布のシミュレーション
図１５には、図８ａ）からの位相マスクの使用のもとでの対象面内の照明の強度分布が示されている。

励起された分子の数ｎは、照明強度および露光期間と共に指数関数的に減っていく。図１６は、例えばドロンパでの、オフ切替えが飽和した場合の励起状態において結果として生じる分子ポピュレーションを示しており、この分子ポピュレーションがＰＳＦの程度を示す。

図１７に示された詳細な光学的な例示的実施形態
図１７には照明の例示的実施形態が示されている。左側および上側には、放射線経路の側面図を見ることができる。

ファイバ結合によって、パウエル・レンズに適応した、ガウス状の強度プロフィルを有する光束が提供される。この光束は、４７７ｎｍおよび４８８ｎｍの２つの波長から成る。パウエル・レンズ（発散３０°）は、後ろに続く焦点距離１０ｍｍのアクロマートの焦点面内でライン状の照らし出しを、ラインに沿って均質な強度分布で生成する。この面は、顕微鏡の対象面に対して共役である。第１のカラー・スプリッタは、両方の均質化されたレーザ・ラインを分離する。有利には４８８ｎｍでの一方の光経路は、５５ｌ／ｍｍのライン格子を有しており、この格子は、８：１の所定の強度割合で０次回折および±１次回折を生成する。この回折次数は、焦点距離１５０ｍｍでの２ｆ結像により、顕微鏡の瞳に共役な面内にある位相要素上に結像される。この位相要素は図８ａ）に説明されている。対象面内では、この位相要素が図１８ａ）に基づく強度構造をもたらす。格子は、位相格子として形成されるのが有利である。格子は、０次回折と１次回折の間の強度割合を正確に調整するため、図１４ｂ）に示したように可変の溝深さを有している。格子の照らし出しがライン状なので、格子を横方向にずらすことにより、回折次数の効率を調整し得る。第２の光経路は、第１の光経路のように、ただし、格子なしで、同じ２ｆ結像からのみ成る。第２の光経路の瞳内での位相介入は、図８ｃ）に基づく位相マスクによって実現される。これにより、対象面内での照明光の軸方向の構造化が可能である（図１８ｂ）。マスクの横方向の広さは、約１２×１２ｍｍ^２である。第１の光経路における回折次数は、−４ｍｍ、０ｍｍ、および４ｍｍのところにある。この介入の後、放射線統合器によって両方の光経路が再び一緒にされる。リレー光学系により、照明瞳が顕微鏡の瞳に適応される。インターフェイスは主カラー・スプリッタである。リレー光学系の結像縮尺は４．３５である。リレー光学系の可変性は、結像縮尺の精密なアライメントに役立つ。放射線統合器の後ろには、蛍光励起のための光（４７７ｎｍ）および対象物内に印された構造を消去するための光（４０５ｎｍ）の結合に役立つニュートラル・スプリッタがある。

Claims (35)

1. 並行化された顕微鏡イメージングのための方法であって、少なくとも１つの領域内の試料の、蛍光励起のための第１の照明と、検出器要素による試料光の、該領域に割り当てられた位置分解検出とを含む方法において、
   第２の照明により、該領域が、該検出器要素に割り当てられている、離間して蛍光を発する部分領域へと区分され、その際、該部分領域の該離間が、蛍光を低下させた中間領域または蛍光を発しない中間領域による蛍光範囲の空間的な分離、および該部分領域からの蛍光の様々なスペクトル特性による蛍光範囲の空間的な分離のうちの少なくとも一つによって行われることを特徴とする方法。
2. 前記第２の照明が、空間的に構造化されるか、またはパターン化される、請求項１に記載の方法。
3. 前記様々なスペクトル特性が、別の波長または別のスペクトル分布の蛍光である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記部分領域の広さの縮小が、前記第２の照明による、蛍光状態の脱励起（抑制）および切替えのうちの少なくとも一つによって行われる、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記部分領域の広さの前記縮小が、前記第２の照明の、前記試料内にある少なくとも１つの蛍光性物質との非線形の相互作用によって行われ、
   ａ）誘導放出による励起レベルの脱励起（ＳＴＥＤ）、
   ｂ）３重項占有による基底状態の抑制（ＧＳＤ）、および
   ｃ）該少なくとも１つの蛍光性物質が、蛍光の第１の特性の状態から蛍光の第２の特性の状態または蛍光を低下させた状態となる可逆的または非可逆的な光学的切替えのうちの少なくとも一つによって行われることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記部分領域から放出された蛍光の、前記検出器上への光学的な結像により、前記検出器要素への前記部分領域の一義的な割り当てが行われる、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記検出器要素への前記部分領域の前記割り当てが、前記部分領域の重心を前記検出器要素上の基本的に中心に結像するように行われる、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
8. 向上された解像度で画像を記録するために、試料および前記第２の照明のパターンが互いに相対的に移動し、それによって該試料内の異なる部分領域が走査され、かつ該部分領域から放出された蛍光が検出される、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
9. 更なる測定工程において、前記第２の照明が、前記領域Ａにパターン化されずに行われ、かつ前記第１の照明によって励起された蛍光が、位置分解されて検出される、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記向上された解像度の画像内の背景信号の減少を達成するため、前記第２の測定工程によって得られた画像が、前記向上された解像度で記録された画像と差引される、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記領域がライン状の広がりを持つ、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
12. ラインに垂直な広がりが回折によって制限される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記第２の照明が、前記照明ラインの方向に沿った周期的なパターンと、横方向および軸方向のうちの少なくとも一つを制限する少なくとも２本の外側のラインとから成るパターン化された光分布を有する、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記検出器要素の前にある可変に調整可能なスリット絞りによって、焦点外で励起された蛍光の抑制が行われる、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記領域が、互いに空間的に離間されたライン状の複数の下位領域から成る、請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 検出器要素による可変の読取りおよび可変の統合により、焦点外で励起された蛍光の調整可能な抑制が行われる、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記試料の構造化された照明が行われ、
    発光する試料点の第１の検出が行われ、
    前記試料上での照明分布の空間的な変位が行われ、
    発光する試料点の少なくとも１つの第２の検出が行われ、
    および
    該空間的な変位の値を基に、組み立てられた試料画像上での該検出された試料点の位置が算定され、かつ記憶される、
    特に請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の蛍光顕微鏡の作動方法。
18. 並行化された顕微鏡イメージングのための装置であって、試料の少なくとも第１および第２の照明のための少なくとも２つの光源と、該試料上でのパターン化された光分布の生成のための手段と、少なくとも１つの方向に位置分解し、複数の検出器要素を有する少なくとも１つの検出器とを備えた装置において、
    パターン化されるか、または空間的に構造化された光分布により、蛍光が、該試料のうちの少なくともＮ個の互いに離間された部分領域内で励起され、かつ該部分領域が、部分領域と検出器要素の一義的な割り当てが行われるように該検出器上に結像されることを特徴とする装置。
19. 前記パターンが照明用放射線経路内の放射線偏向要素の移動によって移動されること、および前記試料がスキャン・ステージによって移動されることのうちの少なくとも一つが行われ、かつそれに同期して、前記試料から放出された蛍光の検出が行われる、請求項１８に記載の装置。
20. パターン化されるか、または空間的に構造化された第２の照明の、パターン化されていない第１の照明との重ね合わせが、前記試料内で行われる、請求項１乃至１９のいずれか１項に記載の装置。
21. 部分領域と検出器要素の前記割り当てが、光学ズームおよび透明な平行平面板の傾動によって調整されて、照明用放射線経路および検出用放射線経路のうちの少なくとも一つ内で調整可能である、請求項１乃至２０のいずれか１項に記載の装置。
22. 前記照明がライン状に形成される、請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の装置。
23. １つの空間方向において、前記照明用放射線経路の瞳が完全に満たされる、請求項１乃至２２のいずれか１項に記載の装置。
24. 前記パターン化されるか、または空間的に構造化された第２の照明が分割され、その際、１つの部分は、前記試料内で、ライン状の周期的にパターン化された光分布を生成し、かつ更なる部分は、該周期的な光分布を軸方向および横方向のうちの少なくとも一つで制限する２重ラインへと形成される、請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の装置。
25. 前記制限する２重ラインを生成するため、中央および対称的な端の範囲内のうちの少なくとも一つにおいて位相ジャンプを有する位相マスクが、前記照明用放射線経路内に設けられる、請求項１乃至２４のいずれか１項に記載の装置。
26. 前記第２の照明の前記部分放射線の少なくとも部分的な分割のために光学格子が設けられ、
    その際、該分割が、該格子の０次回折および＋／−１次回折によって行われる、請求項１乃至２５のいずれか１項に記載の装置。
27. 構造化方向に垂直な前記光学格子が、周波数および前記位相ジャンプの大きさのうちの少なくとも一つにおいて可変に設計され、前記格子の並進により、前記回折次数の方向および強度のうちの少なくとも一つが調整される、請求項１乃至２６のいずれか１項に記載の装置。
28. 前記位相マスクが、前記格子の前記０次回折の後ろに配列される、請求項１乃至２７のいずれか１項に記載の装置。
29. 前記位相マスクが、その中央または対称的な端の範囲内で位相ジャンプを有する、請求項１乃至２８のいずれか１項に記載の装置。
30. 前記位相マスクが、ライン状の照明に垂直な方向において、前記位相ジャンプの位置および大きさのうちの少なくとも一つを可変に設計されており、前記位相マスクの並進により、光に影響を及ぼす様々な特性が調整される、請求項１乃至２９のいずれか１項に記載の装置。
31. 前記軸方向および横方向で制限する２重ラインおよび前記周期的なパターン化された光分布が、前記試料内で互いに対しインコヒーレントに重なり合う、請求項１乃至３０のいずれか１項に記載の装置。
32. 前記インコヒーレンスの重なり合いが、重なり合う部分放射線の、互いに直交する偏光または様々な波長または時間的な遅れによって行われる、請求項１乃至３１のいずれか１項に記載の装置。
33. 前記位置分解検出器が、可変のスリット絞りを前置したライン検出器である、請求項１乃至３２のいずれか１項に記載の装置。
34. 平行な複数のラインによる照明および位置分解する平面検出器による検出が行われる、請求項１乃至３３のいずれか１項に記載の装置。
35. 走査型レーザ顕微鏡内での、請求項１乃至３４のいずれか１項に記載の装置および方法の使用。

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