JP3350442B2 - 顕微鏡システム - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この出願の発明は、顕微鏡シ
ステムに関するものである。さらに詳しくは、この出願
の発明は、染色された試料を複数の波長の光により照明
することで、高い空間分解能の高画質画像を得ることが
できる、高性能、且つ高機能な、新しい顕微鏡システム
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来より、光学顕微鏡は、様々なタイプ
のものが開発されており、近年のレーザ技術および電子
画像技術をはじめとする周辺技術の進歩にともない、そ
の高機能化が盛んに行われている。このような高機能光
学顕微鏡の一つとして、複数波長の光で試料を照明する
ことによって発する二重共鳴吸収過程を用い、得られる
画像のコントラストの制御のみならず化学分析も可能に
する顕微鏡が提案されている（特願平６−３２９１６
５）。

【０００３】この光学顕微鏡は、二重共鳴吸収を用いて
特定の分子を選択し、特定の光学遷移に起因する吸収お
よび蛍光を観測することができる。まず、図１に例示し
た基底状態の分子がもつ価電子軌道２の電子を、図２に
例示したように光照射により空軌道である価電子軌道３
に励起させる。この状態が第一励起状態である。次に、
図３に例示したように、別な波長の光を照射することに
より価電子軌道１の電子を、価電子軌道２に生成された
空孔に励起させる。この状態が第二励起状態である。分
子は、この第二励起状態から、図４に例示したように蛍
光あるいは燐光を発光したりして基底状態に戻る。そし
て、図２の吸収過程や図４の蛍光や燐光の発光を用い
て、吸収像や発光像を観察する。

【０００４】最初にレーザ光などにより共鳴波長λ１の
光で試料を構成する分子を第一励起状態に励起させる
際、単位体積内における第一励起状態の分子数は、照射
する光の強度が増加するにしたがって増加する。線吸収
係数は、分子一個あたりの吸収断面積と単位体積当たり
の分子数との積で与えられるので、図３のような励起過
程においては続いて照射する共鳴波長λ２に対する線吸
収係数は最初に照射したλ１の光の強度に依存する。

【０００５】すなわち、波長λ２に対する線吸収係数は
波長λ１の光の強度で制御できる。このことは、波長λ
１および波長λ２の二波長の光で試料を照射し、波長λ
２による透過像を撮影すれば、透過像のコントラストは
波長λ１の光量で完全に制御できることを示している。
また、図３の第二励起状態よりの蛍光または燐光による
脱励起過程が可能である場合には、その発光強度は第一
励起状態にある分子数に比例する。従って、蛍光顕微鏡
として利用する場合にも画像コントラストの制御が可能
となる。

【０００６】また、この従来の光学顕微鏡は、コントラ
ストの制御のみならず、化学分析も可能にする。図１に
おける最外殻価電子軌道は各々の分子に固有なエネルギ
ー準位を持つので、波長λ１は分子によって異なる。同
時に波長λ２も分子固有のものとなる。よって、波長λ
１および波長λ２の二波長により吸収あるいは発光する
分子を限定することができるので、正確な試料の化学組
成の同定が可能となる。

【０００７】さらには、価電子を励起する場合、分子軸
に対して特定の電場ベクトルを持つ光のみが強く吸収さ
れるので、波長λ１および波長λ２の偏光方向を決め
て、吸収像または蛍光像を撮影すれば、同じ分子でも配
向方向の同定も行うことができる。最近では、二重共鳴
吸収過程を用いて回折限界を超える高い空間分解能を持
つ蛍光顕微鏡も提案されている（特願平８−３０２２３
２）。

【０００８】図５は、分子における二重共鳴吸収過程を
例示した概念図であり、基底状態の分子が、波長λ１の
光で第一励起状態に励起され、さらにλ２の光で第二励
起状態に励起されており、この第二励起状態からの蛍光
が、ある種の分子では極めて弱いことを示している。こ
のような光学的性質を持つ分子では、極めて興味深い現
象が起きる。図６は、横軸にＸ軸を設けて二重共鳴吸収
過程における空間的距離の広がりを例示したものであ
る。この図６においては、波長λ２の光が照射された空
間領域Ａ１と、波長λ２の光が照射されない空間領域Ａ
０とが示されており、この空間領域Ａ０ではλ１光励起
により第一励起状態の分子が多数生成される。このと
き、空間領域Ａ０からは波長λ３で発光する蛍光が見ら
れる。しかし、空間領域Ａ１では、波長λ２の光を照射
したため第一励起状態のほとんどの分子が即座に高位の
第二励起状態に励起され、第一励起状態の分子は存在し
なくなる。このため、波長λ３の蛍光は完全になくな
り、しかも、第二励起状態からの蛍光はもともとないの
で、空間領域Ａ１では完全に蛍光自体が抑制されること
となる。従って、蛍光があるのは空間領域Ａ０のみであ
ることがわかる。

【０００９】この結果は、顕微鏡の応用分野から考察す
ると、極めて重要な意味を持つ。すなわち、従来の走査
型レーザ顕微鏡などでは、レーザ光を集光し、マイクロ
ビームを形成して観察試料上を走査する。この時、マイ
クロビームのサイズは、集光レンズの開口数と波長とで
決まる回折限界で決まり、原理的にそれ以上の空間分解
能は期待できない。しかし、図６によれば、λ２の照射
で蛍光領域が抑制されているので、λ１とλ２の二種類
の波長を空間的に上手に重ね合わせることで、たとえば
λ１の照射領域に着目すると、蛍光領域は集光レンズの
開口数と波長とで決まるサイズよりも狭くなっており、
実質的に空間分解能の向上が図られている。したがっ
て、この原理を用いれば、回折限界を超える蛍光顕微鏡
が可能となる。これが二重共鳴吸収過程を用いた超解像
顕微鏡である。

【００１０】さらに、この顕微鏡の超解像性をさらに高
めるために、新たな提案もされている（特願平９−２５
５４４４）。すなわち、少なくとも基底状態を含め３つ
の量子状態を有し、且つ第一励起状態を除く高位の励起
状態から基底状態へ脱励起するときの遷移において蛍光
による緩和過程よりも熱緩和過程の方が支配的である各
種分子を蛍光ラベラー分子として用い、この蛍光ラベラ
ー分子と生化学的な染色技術を施した生体分子とを化学
結合させてなる試料に波長λ１の光を照射して、蛍光ラ
ベラー分子を第一励起状態に励起させ、続いて即座に波
長λ２の光により高位な量子準位に励起させることで、
第二励起状態からの蛍光を抑制して、空間的な蛍光領域
の人為的な抑制を行い、空間分解能の向上を図る。

【００１１】このような分子の光学的な性質は量子化学
的な立場から以下のように説明することができる。一般
に、分子は、それを構成する各原子がσまたはπ結合に
よって結ばれている。言い換えると、量子化学によれ
ば、分子の分子軌道はσ分子軌道またはπ分子軌道を持
っていて、これらの分子軌道に存在する電子が各原子を
結合する重要な役割を担っている。そのうちでも、σ分
子軌道の電子は、各原子を強く結合し、分子の骨格であ
る分子内の原子間距離を決める。それに対して、π分子
軌道の電子は、各原子の結合にほとんど寄与しないで、
むしろ分子全体に極めて弱い力で束縛される。

【００１２】多くの場合、σ分子軌道にいる電子を光で
励起すると、分子の原子間隔が大きく変化し、分子の解
離を含む大きな構造変化が起きる。その結果として、原
子の運動エネルギーや構造変化するために光が分子に与
えたエネルギーのほとんどが、熱エネルギーに形を変え
る。したがって、励起エネルギーは蛍光という光の形態
で消費されない。また、分子の構造変化は極めて高速
に、たとえばピコ秒より短い、起こるので、その過程で
仮に蛍光が起きても極めて蛍光寿命が短い。しかし、そ
れに対し、π分子軌道の電子が励起しても分子の構造自
体はほとんど変化せず、高位の量子的な離散準位に長時
間とどまり、ナノ秒オーダーで蛍光を放出して脱励起す
る性質を持つ。

【００１３】量子化学によれば、分子がπ分子軌道を持
つことと、二重結合を持つこととは同等であり、用いる
蛍光ラベラー分子には、二重結合を豊富に持つ分子を選
定することが必要条件となる。そして、二重結合を持つ
分子でもベンゼンやピラジンなどの６員環分子において
は、第二励起状態からの蛍光が極めて弱いことが確かめ
られている（たとえば、M.Fujii et.a. Chem.Phys.Let
t. 171(1990)341）。したがって、ベンゼンやピラジン
などの６員環を含む分子を蛍光ラベラー分子として選定
すれば、第一励起状態からの蛍光寿命が長く、しかも光
励起により第一励起状態から第二励起状態に励起させる
ことで分子から蛍光を容易に抑制できるので、顕微鏡の
超解像性を効果的に利用することができる。

【００１４】すなわち、これら蛍光ラベラー分子により
試料を染色して観察を行えば、高空間分解能で試料の蛍
光像を観察することができるだけでなく、その蛍光ラベ
ラー分子の側鎖の化学基を調整することにより生体試料
の特定の化学基のみを選択的に染色でき、よって、詳細
な試料の化学組成までも分析可能となる。一般に、二重
共鳴吸収過程は、二つの光波長や偏光状態等が特定の条
件を満たすときにのみ起こるので、これを用いることで
非常に詳細な分子の構造を知ることができる。すなわ
ち、光の偏光面と分子の配向方向とは強い相関関係があ
り、二つの波長の光のそれぞれの偏光面と分子の配向方
向とが特定の角度を成すときに、二重共鳴吸収過程が強
く起こる。したがって、二つの波長の光を試料面に同時
照射して、それぞれの偏光面を回転させることにより、
蛍光の消失の程度が変化するようになるので、その様子
から観測しようとする組織の空間配向の情報も得られ
る。さらに、二つの波長の光を調整させることでもこの
ことが可能である。

【００１５】以上説明したように、二重共鳴吸収過程を
用いた従来の光学顕微鏡では、超解像性とともに、高い
分析能力も有していることがわかる。また、この二重共
鳴吸収過程を用いた超解像顕微鏡において、蛍光抑制を
より効果的に起こすことができる蛍光ラベラー分子や適
正な光の照射タイミングについても提案されている。

【００１６】図７は、波長λ１と波長λ２の二種類の光
を試料に照射するタイミングを例示したものである。こ
の図７に例示したように、蛍光ラベラー分子が蛍光を発
する時間、すなわち第一励起状態の寿命τより短いパル
ス光を用い、まず時間ｔだけ波長λ１の光を照射し、引
き続き波長λ２の光を照射している。定性的に述べる
と、まず、蛍光ラベラー分子の第一励起状態の寿命より
十分短い波長λ１のパルス光を時間ｔの間照射し、観察
領域に第一励起状態の分子を生成させる。その直後に、
観察に必要としない領域に同じく第一励起状態の寿命よ
り十分短い波長λ２のパルス光を照射し、第一励起状態
にある分子を第二励起状態に励起させて、蛍光を抑制す
る。

【００１７】この過程は、さらに以下のように定量的に
説明できる。一般に、基底状態の分子を波長λ１の光で
第一励起状態に励起する場合、その励起過程は下記のレ
ート方程式により記述できる。すなわち、試料に染色し
た分子の単位体積当たりの分子数をＮ₀ とし、波長λ１
の光のフォトンフラックスをＩ₀ 、波長λ１の光照射よ
り時間ｔ後の基底状態の分子数をＮとする。そして、第
一励起状態の寿命をτとし、波長λ１の光により基底状
態から第一励起状態に遷移する時の吸収断面積をσ₀₁と
すると、レート方程式は次式のようになる。

【００１８】

【数１】

【００１９】この式を具体的に解けば、光照射より時間
ｔ後の単位体積当たりの第一励起状態の分子数ｎを求め
ることができる。つまり、

【００２０】

【数２】

【００２１】となる。この数２によれば、下記の数３の
条件を満たすように強くない光量で波長λ１の光を照射
することにより、数２は数４とすることができる。

【００２２】

【数３】

【００２３】

【数４】

【００２４】すなわち、数３によれば、波長λ１の光の
照射時間を分子の第一励起状態の寿命より短くし、しか
も、波長λ１の光のフォトンフラックスが小さいとき
は、ｎは照射時間ｔにほぼ比例する。次に、波長λ１の
光の照射が終了し、その直後に波長λ２の光を時間Ｔ照
射したときの第一励起状態にある分子を第二励起状態に
励起する場合を考える。

【００２５】波長λ２の光のフォトンフラックスを
Ｉ₁ 、波長λ１の光照射より時間Ｔ＋ｔ後の第一励起状
態の分子数をｎとし、そして、波長λ２の光により第一
励起状態から第二励起状態に遷移するときの吸収断面積
をσ₁₂とすると、ｎに関するレート方程式は、次式のよ
うになる。

【００２６】

【数５】

【００２７】この式を解くことで、波長λ１の光を時間
ｔだけ照射し、波長λ１の光の照射を止め、その直後に
波長λ２の光を時間Ｔの間照射した場合の、ｎは、次式
のよに具体的に求められる。

【００２８】

【数６】

【００２９】一方、この数６によれば、波長λ２の光の
照射を全く行わない場合は、Ｉ₁ ＝０とおいて、

【００３０】

【数７】

【００３１】となる。実は、数６は、蛍光を抑制された
領域における単位体積あたりの第一励起状態の分子を数
を示し、数７は、蛍光を抑制されない領域における単位
体積当たりの第一励起状態の分子数を示している。分子
の蛍光収率をΦとすると、蛍光を抑制され領域からの蛍
光強度Ｆ１と、蛍光を抑制されない領域からの蛍光強度
Ｆ２とは、それぞれ、以下の数８および数９で与えられ
る。

【００３２】

【数８】

【００３３】

【数９】

【００３４】蛍光抑制比率（＝Ｆ１／Ｆ２）は、数８お
よび数９より求めると、数１０となる。

【００３５】

【数１０】

【００３６】したがって、図７に例示したタイミングで
λ１とλ２の二種類の光を照射すれば、数１０の比率で
観察に必要としない領域からの蛍光を抑制できる。数１
０によれば、Ｔ＜τの条件でＩ₁ とＴを調整することに
より、任意の比率で蛍光を抑制できる。図８は、観察領
域から発光する蛍光の強度を測定するタイミングを例示
したものである。蛍光強度を測定するタイミングは、基
本的には、波長λ２の光の照射が終了した後に、観察領
域から発光する蛍光の強度を十分に時間をかけて測定す
ることになる。このような測定タイミングによって、抑
制された領域からの蛍光がほとんどない状態で、非常に
Ｓ／Ｎ良く観察領域からの蛍光を計測できる。

【００３７】図９および図１０は、それぞれ、波長λ１
と波長λ２の二種類の光の試料への照射タイミングと観
察領域からの蛍光強度の測定タイミングとの一例を示し
たものである。これら図９および図１０に例示した各タ
イミングによっても、効果的に超解像顕微鏡を実現する
ことができる。しかし、これら図８〜図１０のタイミン
グのいずれの場合も、ｔおよびＴはτより短い（ｔ，Ｔ
＜τ）必要がある。それは、逆にｔ，Ｔ＞τであると、
λ１とλ２の二種類の光を照射中に第一励起状態の分子
が基底状態に脱励起してしまい、観察領域からの蛍光自
体が無くなってしまうためである。仮に、ｔ，Ｔ＜τの
場合に対応するために、図１１に例示したように、λ１
とλ２の二種類の光を同時に照射して、同時に観察領域
から発光する蛍光の強度を測定することも可能である
が、その場合には、蛍光測定時にλ１とλ２の二種類の
強い励起光が検出器に混入してしまう可能性がある。

【００３８】したがって、ｔ，Ｔ＜τの条件のもとで、
図８〜図１０に例示したようなタイミングでλ１とλ２
の二種類の光を試料に照射するのが望ましいとされてい
る。また、多少、Ｓ／Ｎは劣化するが、λ１光とλ２光
を全く同じタイミングで照射することもできる。また、
上述のような条件およびタイミングでλ１とλ２の二種
類の光を試料に照射する場合では、照射終了直後から、
観察領域より発光する蛍光を検出器で計測する必要があ
り、その際には、汎用市販のロジック回路によりゲート
信号を作成し、検出器からの出力電気信号をパーソナル
コンピュータのメモリに取り込む作業がある。基本的に
は、図７〜図１０のタイムチャートに示したように、染
色する分子の蛍光寿命が光源のパルス幅より長いことで
効果が大きくなる。しかし、現在の汎用市販のロジック
回路では、そのスイッチング速度が１ｎｓｅｃ程度であ
るために、τ自体が１ｎｓｅｃ以上であることが望まれ
る。すなわち、蛍光寿命が１ｎｓｅｃ以上でないと、検
出器および計測回路がアクティブになる前に、観察領域
からの蛍光現象が終了して、計測することができなくな
ってしまう。このように、試料を染色する蛍光ラベラー
分子は１ｎｓｅｃ以上の蛍光寿命を持つことが必要とな
る。

【００３９】一方、信号を取り出す有効蛍光領域に着目
すると、確かに蛍光抑制領域では蛍光強度が弱い方が望
ましいが、Ｓ／Ｎ比の向上という観点からは、有効蛍光
領域の発光強度が強い方が望まれている。すなわち、λ
１の光で励起された直後の第一励起状態の分子数が十分
にある時刻からの蛍光強度を測定する。上記の数９によ
れば、励起分子の数は、その励起寿命で決まる時定数に
より指数関数的に減衰する。ところで、指数関数の性質
として、光のパルス幅ｔおよびＴが第一励起状態の分子
寿命τよりも十分に短ければ、λ１の光で励起された直
後の第一励起状態の分子から十分強い強度の蛍光、すな
わち有効信号強度を測定できる。特に、ｔおよびＴが第
一励起状態の分子寿命τの１０分の１程度であれば、第
一励起状態の分子数はλ１の光で励起された直後の分子
数の９０％もあり、有効蛍光領域からの十分な信号強度
が得られる。

【００４０】

【発明が解決しようとする課題】上述した通りの従来の
光学顕微鏡は、その超解像性と分析能力において、際立
った有用性と技術的優位性を有している。しかしなが
ら、これら従来の光学顕微鏡では、第一励起状態から第
二励起状態へ励起させて、第一励起状態からの蛍光を抑
制するための十分な強度を有する波長λ２光（以下、こ
の光をイレース光と呼び、また、基底状態から第一励起
状態へ励起させる波長λ１の光をポンプ光と呼ぶことと
する）が必要であり、このイレース光は、現在実用化さ
れている非共鳴二光子吸収過程を用いたレーザ走査型の
蛍光顕微鏡における数ＴＷ／ｃｍ² という高強度レーザ
光よりも僅かに少ない強度ではあるものの、非常に強力
なものであるため、生体試料への影響が問題となってい
た。

【００４１】このような高強度レーザは、試料の生体細
胞にとっては強すぎる光であり、特に、長時間の測定を
要する場合には、サンプルの蓄熱や多光子吸収等の影響
が著しく、このような影響を極力低減する必要がある。
また、ポンプ光およびイレース光の波長が、生体細胞の
もつ吸収波長帯域から外れていることも必要である。

【００４２】さらにまた、理論予測通りの解像度を実現
するためには、試料面上に集光したイレース光のビーム
が、中央部がゼロである強度分布を有し、且つ軸対称で
ある形状を有するビームである必要がある（このような
ビームを、以下、中空ビームと呼ぶこととする）。これ
は、強度分布の乱れがそのまま顕微鏡の解像度の劣化に
つながるためである。

【００４３】イレース光の光源としてはレーザーを用い
る場合が多いが、上記のような理論通りの形状のビーム
とするには、その大前提として、レーザーのビームプロ
ファイルが良くなくてはならない。すなわち、ビームの
強度分布が光軸軸対称であることが望ましい。たとえ
ば、従来より光源として用いられる色素レーザーは、そ
のビーム形状が三角形に近く、その強度分布も一様でな
い。したがって、試料面で集光したビーム形状が、期待
する中空ビームではなく、崩れたビームパターンとなる
ため、顕微鏡画像の解像度の劣化や画質低下が生じてし
まう。加えて、微小な輪帯アパーチャーを設け、その縮
小像を中空ビームとして用いることも提案されてはいる
が、このような輪帯アパーチャーを利用すると、光軸合
わせや、焦点合わせ等が難しく、良好な画像を得るまで
の調整時間が非常に長くなり、且つそのための熟達技能
も必要となる。

【００４４】したがって、超解像顕微鏡の機能を十分に
引出すためには、これらの問題点を解決する光学技術が
必要とされている。また、実用面から考えると、操作性
のよさも重要な要素である。従来の顕微鏡技術は、色素
レーザーやオプティカルパラメトリックオシレータ（Ｏ
ＰＯ）によって、蛍光ラベラー分子のポンプ光やイレー
ス光の共鳴波長に光源の光を同調させることで、多くの
蛍光ラベラー分子に対して適用可能である。

【００４５】しかしながら、色素レーザーにおいては色
素の劣化による光量の低下、および頻繁で煩雑な色素交
換が伴うといった問題がある。ＯＰＯは、便利ではある
が、非常に高価である。さらに、非常に精密な光学シス
テムであり、湿度や温度の管理が厳しく、しかも使用す
る非線形光学結晶の寿命が短く、そして、これは高価で
あるので、ユーザにとっては保守管理の負担の大きい光
源である。

【００４６】したがって、使用する光源は、波長固定で
あって、その構成が簡単で廉価であることが好ましい。
ところで、近年では、顕微鏡観察下においてレーザ光を
用いることにより微小粒子を捕獲および移動することの
できるマイクロマニュピュレータ技術が開発されてお
り、超解像顕微鏡にもその機能を付加し、操作性と機能
性の高い顕微鏡システムの実現が強く望まれている。

【００４７】このマイクロマニュピュレータ技術は、た
とえばポリエチレン粒子の誘電体粒子に高強度のレーザ
ー光を集光させることにより、分極を生じさせて、その
粒子を電場が一番強い領域に引きつけることにより、捕
獲および移動を行うものである。また、この技術におい
ては、限られた特定の粒子を安定的に捕獲し、できるだ
け色々な方向からレーザー光を粒子に当てることが良い
ことが知られている。

【００４８】しかしながら、様々な方向からのレーザー
光照射のためには、多数のレーザー光源や複雑なミラー
光学系が必要となるので、一空間に捕獲することは可能
であっても、移動操作が極めて困難なものとなってい
た。また、１００ＭＷ／ｃｍ² 以上の強いレーザー集光
ビームを一方向から照射することにより、特定粒子を一
空間にトラップさせ、ビーム走査により空間移動させる
ことは可能であるものの、試料が高強度のレーザー光を
浴び続けることになるので、試料へのダメージが深刻な
ものとなっていた。その結果として、生体細胞が感光死
したり、分子自身の解離または光化学反応による化学変
化が引き起こされるといった問題があった。

【００４９】この出願の発明は、以上の通りの事情に鑑
みてなされたものであり、第一電子励起状態の分子を第
二電子励起状態へ励起させるイレース光を、簡単でコン
パクトな光学系を用いて、優れたビームプロファイルで
集光させることができ、安定性および操作性が高く、優
れた超解像性を有する、新しい顕微鏡システムを提供す
ることを目的としている。また、試料へダメージを与え
ることなく、中空ビームであるイレース光を用いて試料
粒子の捕獲および移動を行うことのできる、マイクロマ
ニュピュレータ機能を有する、新しい顕微鏡システムも
提供する。

【００５０】

【課題を解決するための手段】この出願の発明は、上記
の課題を解決するものとして、調整された試料と顕微鏡
本体とを備えた顕微鏡システムであって、調整された試
料は、少なくとも基底状態を含め３つの電子状態を有
し、その第一電子励起状態から第二電子励起状態への励
起波長帯域が、第一電子励起状態から基底状態の振動準
位に蛍光過程により脱励起する際の蛍光波長帯域と重複
している分子により染色されたものであって、顕微鏡本
体は、分子を基底状態から第一電子励起状態へ励起させ
る波長λ１光の光源と、第一電子励起状態の分子を第二
電子励起状態またはより高い電子励起状態へ励起させる
とともに、調整された試料の第一電子励起状態から基底
状態の高位の振動準位に蛍光過程により脱励起する際の
蛍光波長領域と重複した波長λ２光の光源と、波長λ１
光と波長λ２光とを調整された試料上に集光させる集光
光学系と、調整された試料上における波長λ１光の照射
領域の一部分に波長λ２光の照射領域を重ね合わせる重
ね手段と、励起された分子が基底状態へ脱励起する際の
発光を検出する発光検出器とを備え、重ね手段を介して
波長λ１光と波長λ２光とを照射することにより、分子
が第一電子励起状態から基底状態へ脱励起する際の発光
の領域を抑制するものであることを特徴とする光学顕微
鏡システム（請求項１）、調整された試料と顕微鏡本体
とを備えた顕微鏡システムであって、調整された試料
は、少なくとも基底状態を含め３つの電子状態を有する
分子により染色されたものであり、顕微鏡本体は、分子
を基底状態から第一電子励起状態へ励起させる波長λ１
光の光源と、第一電子励起状態の分子を第二電子励起状
態またはより高い電子励起状態へ励起させる波長λ２光
の光源と、波長λ１光と波長λ２光とを調整された試料
上に集光させる集光光学系と、調整された試料上におけ
る波長λ１光の照射領域および波長λ２光の照射領域を
一部分重ね合わせる重ね手段と、励起された分子が基底
状態へ脱励起する際の発光を検出する発光検出器とを備
え、重ね手段を介して波長λ１光と波長λ２光とを照射
することにより、分子が第一電子励起状態から基底状態
へ脱励起する際の発光の領域を抑制するものであり、波
長λ２光を集光して得られるビームが、その光軸と直交
する面内で、光軸に関する対称位置においてπだけ位相
がずれた位相分布を有していることを特徴とする顕微鏡
システム（請求項２）、および調整された試料と顕微鏡
本体とを備えた顕微鏡システムであって、調整された試
料は、少なくとも基底状態を含め３つの電子状態を有
し、その第一電子励起状態から第二電子励起状態への励
起波長帯域が、第一電子励起状態から基底状態の振動準
位に蛍光過程により脱励起する際の蛍光波長帯域に重複
している分子により染色されたものであり、顕微鏡本体
は、分子を基底状態から第一電子励起状態へ励起させる
波長λ１光の光源と、第一電子励起状態の分子を第二電
子励起状態またはより高い電子励起状態へ励起させる波
長λ２光の光源と、波長λ１光と波長λ２光とを調整さ
れた試料上に集光させる集光光学系と、調整された試料
上における波長λ１光の照射領域および波長λ２光の照
射領域を一部分重ね合わせる重ね手段と、励起された分
子が基底状態へ脱励起する際の発光を検出する発光検出
器とを備え、重ね手段を介して波長λ１光と波長λ２光
とを照射することにより、分子が第一電子励起状態から
基底状態へ脱励起する際の発光の領域を抑制するもので
あり、波長λ２光を集光して得られるビームが、その光
軸と直交する面内で、光軸に関する対称位置においてπ
だけ位相がずれる位相分布を有していることを特徴とす
る顕微鏡システム（請求項３）を提供する。

【００５１】また、この出願の発明は、上記の顕微鏡シ
ステムにおいて、第一電子励起状態から第二電子励起状
態への励起波長帯域と基底状態から第一電子励起状態へ
の励起波長帯域とが異なること（請求項４）、分子が、
六員環を一つまたは複数含む分子であること（請求項
５）、六員環が、ベンゼン環またはプリン塩基であるこ
と（請求項６）、分子が、六員環誘導体を一つまたは複
数含む分子であること（請求項７）、六員環誘導体が、
ベンゼン誘導体またはプリン誘導体であること（請求項
８）、分子が、キサンチン系分子、ローダミン系分子、
オキサンジン系分子、シアニン系分子、クマリン系分
子、オキサーゾール系分子、オキサジアゾール系分子、
スチルペン系分子のいずれかであること（請求項９）、
分子が、2,2''-Dimethyl-p-terphenyl: P-terphenyl(PT
P): 3,3',2'',3'''-Tetramethyl-P-quaterphenyl: 2,
2'''-Dimethyl-P-quaterphenyl: 2-Methyl-5-t-butyl-p
-quaterphenyl: 2-(4-Biphenylyl)-5-(4-t-butylpheny
l)-1,3,4-oxiazol(BPBD-365): 2-(4-Biphenylyl)-pheny
l-1,3,4-oxadiazol: 2,5,2'''',5''''-Tetramethyl-p-q
uinquephenyl: 3,5,3'''',5''''-Tetra-t-butyl-p-quin
quephenyl: 2,5-Diphenyloxazol: 2,5-Diphenylfuran:
PQP(p-Quanterphenyl): 2,5-Bis-(4-biphenylyl)-1,3,
4-oxadiazol: p-Quaterphenyl-4,4'''-disulfonicacid
Disodiumsalt: p-Quaterphenyl-4,4'''-disulfonicacid
Dipotassiumsalt: 4,4'''-Bis-(2-butyloctyloxy)-p-q
uanterphenyl: 3,5,3'''',5''''-Tetra-butyl-p-sexiph
enyl: 2-(1-Naphthyl)-5-phenyloxazol: 2-(4-Biphenyl
yl)-6-phenylbenzoxazotetrasulfonicacid Potassium S
alt: 2-(4-Biphenylyl)-6-phenylbenzoxazol-1,3: 4,4'
-Diphenylstilbene: [1,1'-Biphenyl]-4-sulfonic aci
d,4,4''-1,2-ethene-diylbis-,dipotassium salt: 2,5-
Bis-(4-biphenylyl)-oxazol: 2,2'-([1,1'-Biphenyl]-
4,4'-diyldi-2,1-ethenediyl)-bis-benzenesulfonic ac
id Disodium Salt: 7-Amino-4-methylcarbostyryl: 1,4
-Di[2-(5-phenyloxazoly)]benzene;7-Hydroxy-4-methyl
coumarin: p-Bis(o-methylstyryl)-benzene: Benzofura
n,2,2'-[1,1'-biphenyl]-4,4'-diyl-bis-tetrasulfonic
-acid: 7-Dimethylamino-4-methylquinolom-2: 7-Amino
-4-methylcoumarin: 2-(p-Dimethylaminostyryl)-pyrid
ylmethyl Iodide: 7-Diethylaminocoumarun: 7-Diethyl
amino-4-methylcoumarin: 2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-8
-methylqinolizino-[9,9a,1-gh]-coumarin: 7-Diethyla
mino-4-trifluormethylcoumarin: 7-Dimethylamino-4-t
rifluormethylcoumarin: 7-Amino-4-trifluormethylcou
marin: 2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydroquinolizino-[9,9a,1
-gh]-coumarin: 7-Ethylamino-6-methyl-4-trifluormet
hylcoumarin: 7-Ethylamino-4-trifluormethylcoumari
n: 2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-9-carboethoxyquinolizi
no-[9,9a,1-gh]coumarin: 2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-9
-(3-pyridyl)-quinolizino-[9,9a,1-gh]coumarin: 3-
(2'-N-Methylbenzimidazolyl)-7-N,N-diethylaminocoum
arin: 2,3,5,6,-1H,4H-Tetrahydro-9-acetylquinolizin
o-[9,9a,1-gh]coumarin: N-Metyl-4-trifluormethylpip
eridino-[3,2-g]-coumarin: 2-(p-Dimethylaminostyry
l)-benzothiazolylethyl Iodide: 3-(2'-Benzimidazoly
l)-7-N,N-diethylaminocoumarin: Brillantsulfaflavi
n: 3-(2'-Benzothiazolyl)-7-diethytaminocoumarin:
2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-8-trifluormethylquinolizi
no-[9,9a,1-gh]coumarin: 3,3'-Diethyloxacarbocyanin
e Iodide: 3,3'-Dimethyl-9-ethylthiacarbocyanine Io
dide: Disodium Fluorescein(Uranin): 9-(o-Carboxyp
henyl)-2,7-dichloro-6-hydroxy-3H-xanthen-3-on2,7-D
ichlorofluorescien・Fluorescein 548: Fluorol 555(F
luorol 7GA): o-(6-Amino-3-imino-3H-xanthen-9-yl)-b
enzonic acid(Rhodamine 560): Benzoic Acid,2-[6-(et
hylamino)-3-(ethylimino)-2,7-dimethyl-3H-xanthen9-
yl],perchlorate(Rhodamine 575): Benzonic Acid,2-[6
-(ethylamino)-3-(ethylimino)-2,7-dimethyl-3X-xanth
en-9-yl],ethyl ester,monohydrochloride(Rhodamine 5
90): 1,3'-Diethyl-4,2'-quinolyloxacarbocyanine Iod
ide: 1,1'-Diethyl-2,2'-carbocyanine Iodid: 2-[6-(D
iethylamino)-3-(ethylamino)-3H-xanthen-9-yl]benzon
ic acid(Rhodamine 610):Ethanaminium,N-[(6-diethyla
mino)-9-(2,4-disulfophenyl)-3H-xanthen-3-ylidene]-
N-ethylhydroxid,inner salt,sodium salt: Malachit G
reen: 3,3'-Diethylthiacarbocyanine Iodide: 1,3'-Di
ethyl-4,2'-quinolythiacarbocyanine Iodide: 8-(2-Ca
rboxyphenyl)-2,3,5,6,11,12,14,15-octahydro-1H,4H,1
0H,13H-diquinolizino[9,9a,1-bc:9',9a',1-hi]xanthyl
ium Perchlorate(Rhodamine 640): 4-Dicyanmethylene-
2-methyl-6-(p-dimethylaminostyryl)-4H-pyran: 3,3'-
Diethyloxadicarbocyanine Iodide: 8-(2,4-Disulfophe
nyl)-2,3,5,6,11,12,14,15-octahydro-1H,4H,10H,13H-d
iquinolizino[9,9a,1-bc:9',1-hi]xanthene(Sulforhoda
mine 640): 5,9-Diaminobenzo[a]phenoxazonium Percro
rate: 9-Diethylamino-5H-benzo(a)phenoxazin-5-one:
5-Amino-9-diethylimino[a]phenoxazonium Perchlorat
e: 3-Ethylamino-7-ethylimino-2,8-dimethylphenoxazi
n-5-ium Perchorate: 8-(Trifluoromethyl)-2,3,5,6,1
1,12,14,15-octahydro-1H,4H,10H,13H-diquinolizino
[9,9a,1-bc:9',9a,1-hi]xantbylium Perchlorate: 1-Et
hyl-2-(4-(p-Dimethylaminophenyl)-1,3-butadienyl)-p
yridinium Perchlorate: Carbazine 122: 9-Ethylamino
-5-ethylimino-10-methyl-5H-benzo(a)phenoxazonium P
erchlorate: 3-Diethylamino-7-diethyliminophenoxazo
nium Perchlorate: 3-Diethylthiadicarbocyanine Iodi
de: Oxazine 750: 1-Ethyl-4-(4-(p-Dimethylaminophen
yl)-1,3-butadienyl)-pyridininum Perchlorate: 1,1',
3,3,3',3'-Hexamethylindodicarcyanine Iodide: 1,1'-
Diethyl-4,4'-carbocyanine Iodide: 2-(4-(p-Dimethyl
aminophenyl)-1,3-butadienyl)-1,3,3-trimethyl-3H-in
dolium Perchlorate: 2-(4-(p-Dimethylaminophenyl)-
1,3-butadienyl)-3-ethylbenzothoazolium Perchlorat
e: 1,1'-Diethyl-2,2'-dicarbocyanine Iodide: 1-Ethy
l-4-(4-(9-(2,3,6,7-tetrahydro-1H,5H-benzo(i,j)-chi
nolinozinium))-1,3-butadienyl)-pyridinium Perchlor
ate: 3,3'-Dimethyloxatricarbocyanine Iodide: 1-Eth
yl-4-(4-(p-Dimethylaminophenyl)-1,3-butadienyl)-qu
inolinium Perchlorate: 8-Cyano-2,3,5,6,11,12,14,15
-octahydro-1H,4H,10H,13H-diquinolizino[9,9a1-bc:9
a',1-hi]xanthylium Perchlorate(Rhodamine 800): 2-
(6-(4-Dimethylaminophenyl)-2,4-neopentylene-1,3,5)
-3-methylbenzothiazolium Perchlorate: 1,1',3,3,3',
3'-Hexamethylindotricarbocyanine Iodide: IR125: 3,
3'-Diethylthiatricarbocyanine Iodide: IR144: 2-(6-
(9-(2,3,6,7-Tetrahydro-1H,5H-benzo(i,j)-chinolizin
ium))-2,4-neopentylene-1,3,5-hexatrienyl)-3-methyl
lbenzothiazolium Perchlorate: 3,3'-Diethyl-9,11-ne
opentylenethiatricarbocyanine Iodide: 1,1',3,3,3'
3'-Hexamethyl-4,4',5,5'-dibenzo-2,2'-indotricarboc
yanine Iodide:3,3'-Diethyl-4,4',5,5'-dibenzothiatr
icarbocyamine Iodide: 1,2'-Diethyl-4,4'-dicarbocya
nine Iodide: IR140: 2-(8-(4-p-Dimethylaminophenyl)
-2,4-neopentylene-1,3,5,7-octatetraenyl)-3-methylb
enzothiazolium Perchlorate: IR132: 2-(8-(9-(2,3,6,
7-Tetrahydro-1H,5H,benzo(i,j)chinolizinium))-2,4-n
eopentylene-1,3,5,7-octatetraenyl)-3-methylbenzoth
iazolium Perchlorate: IR26: IR5 のいずれかであるこ
と（請求項１０）、波長λ１光を集光して得られるビー
ムの光軸と波長λ２光を集光して得られるビームの光軸
とが同軸であること（請求項１１）、波長λ２光を集光
して得られるビームが、その光軸と直交する面内におい
て、光軸の周りを１回転したときに０から２πまで連続
的に変化する位相分布を有していること（請求項１
２）、波長λ２光を集光して得られるビームが、その光
軸と直交する面内において、該光軸の周りを１回転した
ときに０から２πまで不連続的に変化する位相分布を有
していること（請求項１３）、波長λ２光を集光して得
られるビームがベッセルビームであること（請求項１
４）、ベッセルビームが一次のベッセルビームであるこ
と（請求項１５）、波長λ２光を集光して得られるビー
ムが、ガウス型、ラゲール型またはエルミート型のいず
れかの発振モードを持つレーザービームであること（請
求項１６）、波長λ１光の光源として、気体レーザー、
固体レーザーまたは半導体レーザーのいずれかが備えら
れていること（請求項１７）、気体レーザー、固体レー
ザーまたは半導体レーザーのいずれかの発振波長が、波
長λ１であること（請求項１８）、気体レーザー、固体
レーザーまたは半導体レーザーのいずれかの発振波長の
高調波が、波長λ１であること（請求項１９）、気体レ
ーザー、固体レーザーまたは半導体レーザーのいずれか
の発振波長とその高調波との和周波または差周波が、波
長λ１であること（請求項２０）、波長λ２光の光源と
して、気体レーザー、固体レーザーまたは半導体レーザ
ーのいずれかが備えられていること（請求項２１）、気
体レーザー、固体レーザーまたは半導体レーザーのいず
れかの発振波長が、波長λ２であること（請求項２
２）、気体レーザー、固体レーザーまたは半導体レーザ
ーのいずれかの発振波長の高調波または差周波が、波長
λ２であること（請求項２３）、気体レーザー、固体レ
ーザーまたは半導体レーザーのいずれかの発振波長とそ
の高調波との和周波または差周波が、波長λ２であるこ
と（請求項２４）、気体レーザーが、エキシマレーザ
ー、銅蒸気レーザー、アルゴンレーザー、Ｈｅ−Ｎｅレ
ーザー、ＣＯ₂ レーザー、Ｈｅ−Ｃｄレーザーまたは窒
素レーザーのいずれかであること（請求項２５）、気体
レーザーが、モードロック型であること（請求項２
６）、固体レーザーが、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー、Ｔｉサ
ファイヤレーザー、ＹＬＦレーザーまたはルビーレーザ
ーのいずれかであること（請求項２７）固体レーザーが
半導体レーザー励起型であること（請求項２８）、 固
体レーザーがモードロック型であること（請求項２
９）、顕微鏡本体が、気体レーザー、固体レーザーまた
は半導体レーザーからのレーザー光の波長変換を行うた
めの非線形媒質または波長変調素子を一つまたは複数有
していること（請求項３０）、非線形媒質または波長変
調素子が非線形結晶であること（請求項３１）、非線形
媒質または波長変調素子がラマンシフターであること
（請求項３２）、波長λ１光が、気体レーザーまたは固
定レーザーの基本波を非線形媒質または波長変調素子で
波長変調したものであること（請求項３３）、波長λ１
光が、気体レーザーまたは固定レーザーの高調波を非線
形媒質または波長変調素子で波長変調したものであるこ
と（請求項３４）、波長λ２光が、気体レーザーまたは
固体レーザーの基本波を非線形媒質または波長変調素子
で波長変調したものであること（請求項３５）、波長λ
２光が、気体レーザーまたは固体レーザーの高調波を非
線形媒質または波長変調素子で波長変調したものである
こと（請求項３６）、波長λ２光の集光光学系が、波長
λ２光を集光して得られるビームにその光軸に対して直
交する平面内で位相差分布を与える屈折率分布または光
路差分布を有する位相板を備えていること（請求項３
７）、波長λ２光の集光光学系が輪帯光学系を備えてい
ること（請求項３８）、波長λ２光の集光光学系が回折
光学系を備えていること（請求項３９）、波長λ２光の
集光光学系がアキシコンを備えていること（請求項４
０）、気体レーザー、固体レーザーまたは半導体レーザ
ーの共振器内に、リング状の輪帯ミラー、輪帯回折格
子、フレネルゾーンプレート、輪帯アパーチャー、また
は光軸と直交する面内の電場に関して軸対称にある電場
の互いにπだけずれた位相差を与える位相板のいずれか
が、少なくとも一つ備えられていること（請求項４
１）、顕微鏡本体が、分子からの発光を発光検出器に集
光する発光集光光学系を有していること（請求項４
２）、発光集光光学系がシャープカットフィルタを備え
ていること（請求項４３）、発光集光光学系がノッチフ
ィルターを備えていること（請求項４４）、発光集光光
学系がパンドパスフィルターを備えていること（請求項
４５）、パンドパスフィルターが、波長λ１光および波
長λ２光を透過させず、分子からの発光を透過させるも
のであること（請求項４６）、調整された試料が、波長
λ１光および波長λ２光が透過する物質からなる封入手
段により封入されていること（請求項４７）、調整され
た試料が、波長λ１光および波長λ２光が透過する物質
からなるカバー手段によりカバーされていること（請求
項４８）、前記物質が、合成石英ＳｉＯ₂ 、ＣａＦ ₂ 、
ＮａＦ、Ｎａ₃ ＡｌＦ₆ 、ＬｉＦ、ＭｇＦ₂ 、Ｓｉ
Ｏ₂ 、ＬａＦ₃ 、ＮｄＦ ₃ 、Ａｌ₂ Ｏ₃ 、ＣｅＦ₃ 、Ｐ
ｂＦ₂ 、ＭｇＯ、ＴｂＯ₂ 、ＳｎＯ₂ 、Ｌａ₂ Ｏ ₃ 、ま
たはＳｉＯであること（請求項４９）、顕微鏡本体は、
波長λ１光と波長λ２光の光源とは別に、連続発振レー
ザーを備えており、この連続発振レーザーを調整された
試料上に集光して得られるビームが、その光軸と直交す
る面内で、光軸に関する対称位置においてπだけ位相が
ずれる位相分布を有していること（請求項５０）、顕微
鏡本体は、連続発振レーザーを調整された試料上に集光
して得られるビームを、波長λ１光を集光して得られる
ビームおよび波長λ２光を集光して得られるビームとは
独立して、調整された試料上を相対的に走査するための
手段を有していること（請求項５１）などもその態様と
して提供する。

【００５２】

【発明の実施の形態】この出願の発明の顕微鏡システム
においては、調整された試料が、少なくとも基底状態を
含め三つの電子状態を有し、その第一電子励起状態から
第二電子励起状態への励起波長帯域が、第一電子励起状
態から基底状態の振動準位に蛍光過程により脱励起する
際の蛍光波長帯域と重複している分子により染色された
ものである。

【００５３】ここで、この分子、いわゆる蛍光ラベラー
分子について、その高い電子励起状態からの脱励起過程
を考察することにより、詳しく説明する。図１２は、分
子の脱励起過程を概念的に例示したものである。一般
に、分子が基底状態であるＳ０から最低（＝第一）励起
状態であるＳ１に励起すると、π電子を持つ分子は多い
ものでは数１０％の収率で蛍光を発して、Ｓ０に脱励起
をする。これが蛍光過程である。それ以外は、振動緩
和、つまり内部転換により、直接、Ｓ０に無放射失活す
るが、一部はスピン多重度が異なる寿命が極めて長い状
態であるＴ１に至り、つまり系間交差をして、さらにそ
のＴ１から燐光を発してＳ０に戻る。通常の蛍光顕微鏡
では、蛍光収率の高い分子で試料を染色し、光照射でこ
の分子をＳ１に励起させ、そのＳ１からの蛍光を観察し
て映像化する。

【００５４】また、Ｓ１よりさらに高い第二励起状態で
あるＳ２に分子が励起すると、図１にも例示したように
非常に複雑な緩和過程により基底状態Ｓ０に脱励起す
る。すなわち、たとえば、一部のＳ２の励起分子は内部
転換や系間交差によりＳ０またはＴ１状態に脱励起す
る。また、その他の励起分子はＳ１の高い振動準位に内
部転換した後、Ｓ１の最も低い振動準位に至る。その後
は、上述したＳ１からの緩和過程を経て、Ｓ０に戻る。

【００５５】ここで、注目すべきことは、Ｓ２より高位
の励起状態からの蛍光発光収率が極めて低いことであ
る。これは、Ｓ２の分子の多くが直接Ｓ０の無放射失活
したり、Ｓ１に内部転換した後、かなりの割合でＳ０に
無放射失活するためである。また、Ｔ１に至った分子も
蛍光過程に寄与しないので、結局Ｓ１に至った一部の分
子のみが蛍光を発する。これはＫｒａｓｈの法則と呼ば
れるものである。特に、気相のベンゼン誘導体分子では
Ｓ２からの蛍光がほとんど観測されない。

【００５６】一般に、二重共鳴吸収過程を用いた超解像
顕微鏡は、上記のようにＳ２以上の高位の電子励起状態
からの分子の蛍光収率が極めて低いことを利用してい
る。ところで、一部の分子は、図１３のエネルギーダイ
ヤグラムに例示したように、Ｓ１からＳｎ（ｎは２以上
である）に遷移するときの波長帯域が、Ｓ１からＳ０の
振動準位に蛍光過程により脱励起する際の蛍光発光波長
帯域と重複している構造を持つ。このような電子構造を
もつ分子では、実質的にイレース光による蛍光抑制効果
が強まる現象が起こる。

【００５７】すなわち、波長λ１のポンプ光でＳ０の分
子をＳ１に励起し、共鳴波長λ２のイレース光を照射す
ると、Ｓ１の分子は、Ｓｎに遷移すると同時に、かなり
のものが誘導放出によってＳ０の高位の振動準位に脱励
起する。この時、Ｓｎに励起した分子は蛍光が抑制され
る。一方、誘導放出した分子については、イレース光と
同じ波長の光が発光するので、イレース光と同じ波長の
光の強度は若干増加し、イレース光以外の波長で光る蛍
光強度は減る。したがって、イレース光以外の波長で光
る蛍光発光をモニターしているかぎり、実質的に優れた
蛍光抑制を行うことができる。

【００５８】このようにＳ１からＳｎに遷移するときの
波長帯域がＳ１からの蛍光発光波長帯域と重複している
分子を、この出願の発明の顕微鏡システムにおける試料
を染色する分子とすることにより、上述した誘導放出が
寄与する蛍光抑制効果が加わるので、顕微鏡本体の超解
像性をさらに向上させることができる。また、それと同
時に、イレース光の強度が低くても蛍光抑制を容易に起
こすことができ、観察試料のダメージを減少させること
ができる。

【００５９】上述したような光学的特性を有する分子と
しては、たとえば、キサンチン系に属するローダミン
（Rhodamine ）系の分子がある。図１４は、ローダミン
系の分子の一つであるRhodamine6G の分子構造式、およ
びその光学特性としての各断面積と波長との関係を例示
したものである（E.Sahar&D.Treves:IEEE J.Quantum El
ectron., QE-13,962(1977)）。この図１４において、σ
_a はＳ０からＳ１への吸収断面積、σ_e はＳ１からＳ０
への誘導放出断面積、σ_a ^* はＳ１からＳｎへの吸収断
面積、σ_T はＴ１からＴｎへの吸収断面積を表してい
る。

【００６０】この図１４に例示したように、Ｓ０からＳ
１への共鳴波長は約５３０ｎｍの前後に広がっている
（σ_a 参照）が、Ｓ１からＳｎへの共鳴波長は約５００
〜６００ｎｍの前後に広がっている（σ_a ^* 参照）。そ
して、Ｓ１からＳｎへの共鳴波長領域と重複して、約５
３０〜６５０ｎｍの領域に蛍光発光帯域が広がっている
（σ_e 参照）。さらに、約５３０〜６００ｎｍには特別
な波長帯域が存在することがわかる。すなわち、この波
長帯域の光では、分子をＳ０からＳ１へ励起させること
はできないが、Ｓ１からＳｎへの二重共鳴吸収過程と誘
導放出が可能となる。

【００６１】一般に、このRhodamine6G を初め、ローダ
ミン系の分子は、Ｓ１からＳｎに遷移するときの波長
が、Ｓ１からＳ０の振動準位に蛍光過程により脱励起す
る際の蛍光波長帯域と重複している。また、クマリン系
の分子もＳ１からＳｎに遷移するときの波長帯域がＳ１
からの蛍光発光波長帯域と重複している。たとえば、ク
マリン系分子であるCoumarin500 は、Ｓ０からＳ１への
共鳴波長が２６０ｎｍの前後、Ｓ１からＳｎへの共鳴波
長が３５５ｎｍの前後、そして、蛍光発光領域が３２０
〜４６０ｎｍの領域に広がっている。

【００６２】基本的に、このような光学的性質をもつ分
子は、上記のローダミン系分子やクマリン系分子でもそ
うであるように、ベンゼン環や窒素塩基（つまり、プリ
ン塩基）などの六員環やベンゼン誘導体やプリン誘導体
などの六員環誘導体を一つまたは複数含み、たとえば、
ローダミン系分子およびクマリン系分子の他に、キサン
チン系分子、オキサンジン系分子、シアニン系分子、オ
キサーザール系分子、オキサジアゾール系分子、スチル
ベン系分子がある。

【００６３】これらの具体的な分子としては、以下のよ
うな分子を例として挙げることができる。2,2''-Dimeth
yl-p-terphenyl: P-terphenyl(PTP): 3,3',2'',3'''-Te
tramethyl-P-quaterphenyl: 2,2'''-Dimethyl-P-quater
phenyl: 2-Methyl-5-t-butyl-p-quaterphenyl: 2-(4-Bi
phenylyl)-5-(4-t-butylphenyl)-1,3,4-oxiazol(BPBD-3
65): 2-(4-Biphenylyl)-phenyl-1,3,4-oxadiazol: 2,5,
2'''',5''''-Tetramethyl-p-quinquephenyl: 3,5,
3'''',5''''-Tetra-t-butyl-p-quinquephenyl: 2,5-Di
phenyloxazol: 2,5-Diphenylfuran: PQP(p-Quanterphen
yl): 2,5-Bis-(4-biphenylyl)-1,3,4-oxadiazol: p-Qua
terphenyl-4、4'''-disulfonicacid Disodiumsalt: p-Q
uaterphenyl-4,4'''-disulfonicacid Dipotassiumsalt:
4,4'''-Bis-(2-butyloctyloxy)-p-quanterphenyl: 3,
5,3'''',5''''-Tetra-butyl-p-sexiphenyl:2-(1-Naphth
yl)-5-phenyloxazol: 2-(4-Biphenylyl)-6-phenylbenzo
xazotetrasulfonicacid Potassium Salt: 2-(4-Bipheny
lyl)-6-phenylbenzoxazol-1,3: 4,4'-Diphenylstilben
e: [1,1'-Biphenyl]-4-sulfonic acid,4,4''-1,2-ethen
e-diylbis-,dipotassium salt: 2,5-Bis-(4-biphenyly
l)-oxazol: 2,2'-([1,1'-Biphenyl]-4,4'-diyldi-2,1-e
thenediyl)-bis-benzenesulfonic acid Disodium Salt:
7-Amino-4-methylcarbostyryl: 1,4-Di[2-(5-phenyloxa
zoly)]benzene;7-Hydroxy-4-methylcoumarin: p-Bis(o-
methylstyryl)-benzene: Benzofuran,2,2'-[1,1'-biphe
nyl]-4,4'-diyl-bis-tetrasulfonic-acid: 7-Dimethyla
mino-4-methylquinolom-2: 7-Amino-4-methylcoumarin:
2-(p-Dimethylaminostyryl)-pyridylmethyl Iodide: 7
-Diethylaminocoumarun: 7-Diethylamino-4-methylcoum
arin: 2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-8-methylqinolizino-
[9,9a,1-gh]-coumarin: 7-Diethylamino-4-trifluormet
hylcoumarin: 7-Dimethylamino-4-trifluormethylcouma
rin:7-Amino-4-trifluormethylcoumarin: 2,3,5,6-1H,4
H-Tetrahydroquinolizino-[9,9a,1-gh]-coumarin: 7-Et
hylamino-6-methyl-4-trifluormethylcoumarin: 7-Ethy
lamino-4-trifluormethylcoumarin: 2,3,5,6-1H,4H-Tet
rahydro-9-carboethoxyquinolizino-[9,9a,1-gh]coumar
in: 2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-9-(3-pyridyl)-quinoli
zino-[9,9a,1-gh]coumarin: 3-(2'-N-Methylbenzimidaz
olyl)-7-N,N-diethylaminocoumarin: 2,3,5,6,-1H,4H-T
etrahydro-9-acetylquinolizino-[9,9a,1-gh]coumarin:
N-Metyl-4-trifluormethylpiperidino-[3,2-g]-coumar
in: 2-(p-Dimethylaminostyryl)-benzothiazolylethyl
Iodide: 3-(2'-Benzimidazolyl)-7-N,N-diethylaminoco
umarin: Brillantsulfaflavin: 3-(2'-Benzothiazoly
l)-7-diethytaminocoumarin: 2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydr
o-8-trifluormethylquinolizino-[9,9a,1-gh]coumarin:
3,3'-Diethyloxacarbocyanine Iodide: 3,3'-Dimethyl
-9-ethylthiacarbocyanine Iodide: Disodium Fluores
cein(Uranin): 9-(o-Carboxyphenyl)-2,7-dichloro-6-h
ydroxy-3H-xanthen-3-on2,7-Dichlorofluorescien ・Fl
uorescein 548: Fluorol 555(Fluorol 7GA): o-(6-Amin
o-3-imino-3H-xanthen-9-yl)-benzonic acid(Rhodamine
560): Benzoic Acid,2-[6-(ethylamino)-3-(ethylimin
o)-2,7-dimethyl-3H-xanthen9-yl],perchlorate(Rhodam
ine 575): Benzonic Acid,2-[6-(ethylamino)-3-(ethyl
imino)-2,7-dimethyl-3X-xanthen-9-yl],ethyl ester,m
onohydrochloride(Rhodamine 590): 1,3'-Diethyl-4,2'
-quinolyloxacarbocyanine Iodide: 1,1'-Diethyl-2,2'
-carbocyanine Iodid: 2-[6-(Diethylamino)-3-(ethyla
mino)-3H-xanthen-9-yl]benzonic acid(Rhodamine 61
0): Ethanaminium,N-[(6-diethylamino)-9-(2,4-disulf
ophenyl)-3H-xanthen-3-ylidene]-N-ethylhydroxid,inn
er salt,sodium salt: Malachit Green: 3,3'-Diethylt
hiacarbocyanine Iodide: 1,3'-Diethyl-4,2'-quinolyt
hiacarbocyanine Iodide: 8-(2-Carboxyphenyl)-2,3,5,
6,11,12,14,15-octahydro-1H,4H,10H,13H-diquinolizin
o[9,9a,1-bc:9',9a',1-hi]xanthylium Perchlorate(Rho
damine640): 4-Dicyanmethylene-2-methyl-6-(p-dimeth
ylaminostyryl)-4H-pyran: 3,3'-Diethyloxadicarbocya
nine Iodide: 8-(2,4-Disulfophenyl)-2,3,5,6,11,12,1
4,15-octahydro-1H,4H,10H,13H-diquinolizino[9,9a,1-
bc:9',1-hi]xanthene(Sulforhodamine 640): 5,9-Diami
nobenzo[a]phenoxazonium Percrorate: 9-Diethylamino
-5H-benzo(a)phenoxazin-5-one: 5-Amino-9-diethylimi
no[a]phenoxazonium Perchlorate: 3-Ethylamino-7-eth
ylimino-2,8-dimethylphenoxazin-5-iumPerchorate: 8-
(Trifluoromethyl)-2,3,5,6,11,12,14,15-octahydro-1
H,4H,10H,13H-diquinolizino[9,9a,1-bc:9',9a,1-hi]xa
ntbylium Perchlorate: 1-Ethyl-2-(4-(p-Dimethylamin
ophenyl)-1,3-butadienyl)-pyridinium Perchlorate: C
arbazine 122: 9-Ethylamino-5-ethylimino-10-methyl-
5H-benzo(a)phenoxazoniumPerchlorate: 3-Diethylamin
o-7-diethyliminophenoxazonium Perchlorate: 3-Dieth
ylthiadicarbocyanine Iodide: Oxazine 750: 1-Ethyl-
4-(4-(p-Dimethylaminophenyl)-1,3-butadienyl)-pyrid
ininum Perchlorate: 1,1',3,3,3',3'-Hexamethylindod
icarcyanine Iodide: 1,1'-Diethyl-4,4'-carbocyanine
Iodide: 2-(4-(p-Dimethylaminophenyl)-1,3-butadien
yl)-1,3,3-trimethyl-3H-indolium Perchlorate: 2-(4-
(p-Dimethylaminophenyl)-1,3-butadienyl)-3-ethylben
zothoazolium Perchlorate: 1,1'-Diethyl-2,2'-dicarb
ocyanine Iodide: 1-Ethyl-4-(4-(9-(2,3,6,7-tetrahyd
ro-1H,5H-benzo(i,j)-chinolinozinium))-1,3-butadien
yl)-pyridinium Perchlorate: 3,3'-Dimethyloxatricar
bocyanine Iodide: 1-Ethyl-4-(4-(p-Dimethylaminophe
nyl)-1,3-butadienyl)-quinolinium Perchlorate: 8-Cy
ano-2,3,5,6,11,12,14,15-octahydro-1H,4H,10H,13H-di
quinolizino[9,9a1-bc:9a',1-hi]xanthylium Perchlora
te(Rhodamine 800): 2-(6-(4-Dimethylaminophenyl)-2,
4-neopentylene-1,3,5)-3-methylbenzothiazolium Perc
hlorate: 1,1',3,3,3',3'-Hexamethylindotricarbocyan
ine Iodide: IR125: 3,3'-Diethylthiatricarbocyanine
Iodide: IR144: 2-(6-(9-(2,3,6,7-Tetrahydro-1H,5H-
benzo(i,j)-chinolizinium))-2,4-neopentylene-1,3,5-
hexatrienyl)-3-methyllbenzothiazolium Perchlorate:
3,3'-Diethyl-9,11-neopentylenethiatricarbocyanine
Iodide: 1,1',3,3,3'3'-Hexamethyl-4,4',5,5'-dibenz
o-2,2'-indotricarbocyanine Iodide-3,3'-Diethyl-4,
4',5,5'-dibenzothiatricarbocyamine Iodide:1,2'-Die
thyl-4,4'-dicarbocyanine Iodide: IR140: 2-(8-(4-p-
Dimethylaminophenyl)-2,4-neopentylene-1,3,5,7-octa
tetraenyl)-3-methylbenzothiazolium Perchlorate: IR
132: 2-(8-(9-(2,3,6,7-Tetrahydro-1H,5H,benzo(i,j)c
hinolizinium))-2,4-neopentylene-1,3,5,7-octatetrae
nyl)-3-methylbenzothiazolium Perchlorate: IR26: IR
5 。

【００６４】以上の分子のなかで、たとえばクマリン系
分子である7-Ethylamino-4-trifluormethylcoumarin(C
₁₂H₁₀NO₂F₃:Coumarin500)では、Ｓ０からＳ１への励起
波長帯域が２６６ｎｍ前後、Ｓ１からＳ２への励起波長
帯域が５３２ｎｍ付近、蛍光波長帯域が５３２ｎｍとな
っている。これらの２６６ｎｍおよび５３２ｎｍは、そ
れぞれ、ＹＡＧレーザーの四倍波および二倍波に対応し
ているので、その基本波や高調波を、波長変換可能な非
線形媒質または波長変調素子素子としてのＢＢＯ結晶や
ＫＴＰ結晶などの非線形結晶により波長変調することで
容易に生成することができる。

【００６５】よって、この発明の顕微鏡システムにおい
て、たとえば、試料染色分子がクマリン系分子であり、
顕微鏡本体におけるポンプ光の光源およびイレース光の
光源としてＹＡＧレーザーを用いることで、優れた超解
像性が得られるだけでなく、色素レーザーを用いた従来
の顕微鏡と比べて、優れた作業性および光学性能を有す
ることができる。

【００６６】すなわち、使用する波長を、基本的に非線
形結晶の角度を初期設定するだけで決定することができ
るため、煩雑な波長調整作業をせずに、所望の励起波長
の発生を容易に行うことができ、また、色素の劣化によ
るレーザーパワーの変動や低下が無く、発振効率も良い
ので、高出力なレーザーを用いる必要がなく、光源を小
型で廉価なものとすることができるとともに、生体試料
へのダメージをさらに低減させることができる。

【００６７】ＹＡＧレーザのビームプロファイルに関し
ては、位相面がそろった良好なガウシアンビームの発振
技術が確立しているので、光軸対称で良質な中空ビーム
型のイレース光を生成することができる。このようなＹ
ＡＧレーザーとしては、たとえば、市販されているパル
ス幅２０ｐｓｅｃ以下で、繰り返し周波数１００ＭＨｚ
のモードロックＹＡＧレーザーを用いることができる。

【００６８】また、染色分子がキサンチン系またはロー
ダミン系の分子である場合でも、同様にしてＹＡＧレー
ザと非線形結晶を用いてポンプ光およびイレース光を発
生させることができる。たとえば、Rhodamine6G では、
前述のようにＳ０からＳ１への共鳴波長は５３０ｎｍの
前後に広がって、Ｓ１からＳｎへの共鳴波長は５００〜
６００ｎｍの前後に広がっている。５３０ｎｍ前後のポ
ンプ光は、ＹＡＧレーザーの二倍波で対応できる。５０
０〜６００ｎｍ前後のイレース光は、非線形結晶のラマ
ン効果を用いて（いわゆるラマンシフター）簡単に発生
できる。たとえばＹＡＧレーザーの２倍波の５３２ｎｍ
の光をラマンシフターに通すことにより、変換効率２０
％程度で約長波長側に３０ｎｍ程度シフトした５６０ｎ
ｍ前後のレーザー光を生成することがきる。

【００６９】また、非線形結晶を用いて生成されるＹＡ
Ｇレーザーの基本波と高調波との和周波あるいは差周波
を有するレーザー光を、ポンプ光またはイレース光とす
ることもできる。もちろん、ＹＡＧレーザー以外にも、
上記した各分子に合わせて、波長固定の気体レーザー、
固体レーザーまたは半導体レーザーや、各種非線形媒質
または波長変調素子を用いることができる。

【００７０】たとえば、気体レーザーとしては、エキシ
マレーザー、銅蒸気レーザー、アルゴンレーザー、Ｈｅ
−Ｎｅレーザー、ＣＯ₂ レーザー、Ｈｅ−Ｃｄレーザ
ー、窒素レーザーなどを用いることができ、また、固体
レーザーとしては、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー、Ｔｉサファ
イヤレーザー、ＹＬＦレーザー、ルビーレーザーなどを
用いることができる。

【００７１】これらの各レーザーのなかでも、モードロ
ック型のレーザーは、繰り返し周波数が高く、パルス振
幅が数１０ｐｓｅｃ以下であり、この発明の顕微鏡シス
テムにける超解像の顕微鏡本体により適した光源であ
る。近年では、小型で、高輝度、短パルス、高繰り返し
である、半導体レーザー励起で、且つモードロック型の
固体レーザーも、廉価でメンテナンスフリーとして実現
されており、この固体レーザーは、超解像の顕微鏡本体
の機能を十分に活かす条件を全て有している。

【００７２】上述したような各気体レーザー、固定レー
ザーまたは半導体レーザーを波長λ１ポンプ光の光源お
よび波長λ２光の光源として用いて、その発振波長や高
調波、あるいは発振波長と高調波との和周波または差周
波を波長λ１および波長λ２にして、ポンプ光およびイ
レース光を発生させる。また、これら各種光源の基本波
や高調波を非線形結晶などの各種非線形媒質または波長
変調素子によって波長変調して、波長λ１ポンプ光およ
び波長λ２イレース光を発生させることもできる。

【００７３】ところで、蛍光抑制効果を用いた超解像顕
微鏡が理論通りの解像度を有するようになるには、前述
したように、波長λ２光であるイレース光を試料面上に
集光して得られるビームを、中央部の光強度がゼロとな
る形状とし、照射領域の中央部に蛍光領域を残すように
する必要がある。この発明では、イレース光を集光して
得られるビームを、中央部の光強度がゼロとなる形状と
するため、光軸と直交する面内で、光軸に関する対象位
置においてπだけ位相がずれる位相分布を有するものと
している。

【００７４】このような位相分布を有するビームとして
は、ベッセルビームが適している。たとえば、図１５に
例示したような座標系を仮定すると、ベッセルビームは
次式のような形で表すことができる。

【００７５】

【数１１】

【００７６】この式において、Ｅ（ｘ，ｙ）は電場ベク
トル、Ｅ０は電場ベクトルの振幅である。ここで、ｍ＝
１とすると、上式は、一次のベッセルビームになる。こ
の一次のベッセルビームは、光軸上で電場強度がゼロと
なる特異点をもち、実は、次式の電磁波の波動方程式を
解くことで、得られる。

【００７７】

【数１２】

【００７８】ある軸について軸対称な境界条件を与えれ
ば、数１２は（ｒ，φ，ｚ）円筒座標系で次式のように
書き直すことができる。

【００７９】

【数１３】

【００８０】ここで、ｋは波数を示し、改めて図１５に
例示した座標系を用いれば、ベッセル関数を重ね合わせ
で表現できる数１１の解が得られる。図１６は、ｍ＝１
とした場合の一次ベッセルビームのビーム面、つまり瞳
面の位相分布を例示したものである。この図１６から明
らかなように、一次ベッセルビームは、その光軸と直交
する面内において、光軸の周りを一回転したときに０か
ら２πまで連続的に変化する位相分布を有しており、軸
対称にある電場の位相がお互いπだけずれているので、
電場が光軸上において完全に打ち消し合ってゼロとなる
ため、電場強度が光軸上でゼロとなる特異点を持つこと
がわかる。

【００８１】つまり、この発明の顕微鏡システムは、イ
レース光の集光ビームをたとえば集光光学系を用いてベ
ッセルビーム、特に一次のベッセルビーム、とすること
により、照射領域の中央部に蛍光領域が残り、理論通り
の解像度を有するようになる。さらに、このベッセルビ
ームは、図１７に例示した２次元強度分布であるプロフ
ァイルのように、見かけ上拡散しない疑似非回折ビーム
である。

【００８２】従来の顕微鏡では、回折限界を小さくして
解像度を高めるために開口数が大きい対物レンズを使用
するので、焦点深度が極めて浅くなり、ピント合わせが
困難であったが、この発明の顕微鏡システムでは、イレ
ース光の集光ビームとしてのベッセルビームが疑似非回
折ビームであるので、実質的に焦点深度が深くなり、ピ
ント合わせの問題が軽減されることとなる。さらに、顕
微鏡本体においては、イレース光により解像度が支配さ
れるので、解像度を低下させることなく、その操作性が
高められる。

【００８３】上述のような光学的特性を有するベッセル
ビームを一例としたイレース光の集光ビーム、つまり、
光軸について軸対称な境界条件を持ち、光軸に関する対
称位置においてπだけ位相がずれた位相分布を有してい
る集光ビームの形成は、既存の光学素子を用いた集光光
学系によって簡単に行うことができる。光軸について軸
対称な境界条件を与えるために、集光光学系は、たとえ
ば、輪体瞳を持つ反射型対物レンズなどの輪帯光学系、
つまり輪体開口を持つ光学系や、フレネルゾーンプレー
トなどの回折光学系や、アキシコンなどを備えているこ
とが好ましい。

【００８４】また、光軸に関する対称位置においてπだ
け位相がずれた位相分布を与えるために、集光光学系
は、光軸に対して直交する平面内で位相差分布を与える
ような屈折率分布または光路差分布を有する位相板を備
えていてもよい。たとえば、完全な一次ベッセルビーム
のように、光軸と直交する面内において光軸の周りを一
回転したときに０から２πまで連続的に変化する位相分
布を有する集光ビームは、図１８に例示したように、ビ
ームの光軸と直交する面内において、その光軸の周りを
回転する方向に位相板が一回転したとき、その屈折率分
布または光路差分布が０から２πまで連続的に変化し
て、形成される。

【００８５】なお、完全な一次ベッセルビームでなくて
も、光軸と直交する面内において光軸の周りを一回転し
たときに０から２πまで不連続的に変化する位相分布を
有する集光ビームならば、屈折率分布または光路差分布
が０から２πまで不連続的に変化しても、形成できる。
イレース光の光源には、このような集光ビームを形成す
る機能を持たせるようにしてもよい。

【００８６】また、イレース光光源としてのレーザーの
共振器内に、透過型の輪帯型回折格子や、リング状の輪
帯ミラー、フレネルゾーンプレート、輪帯アパーチャ
ー、光軸と直交する面内の電場に関して軸対称にある電
板の互いにπだけずれた位相差を与える位相板などを挿
入して、上述した境界条件を与えて直接イレース光自体
を一次ベッセルビームにしてしまうことも可能である。

【００８７】さらにまた、イレース光光源としてのレー
ザーの共振器の境界条件を調整して、ＴＥＭ１１等の光
軸上において強度がゼロで軸対称のモードパターンを形
成し、このモードパターンを上述した輪体開口を持つ回
折光学系で集光することにより、たとえば、高次のモー
ドパターンを持つ、ガウス型、ラゲール型またはエルミ
ート型のいずれかの発振モードのレーザービームを、イ
レース光の集光ビームとしてもよい。

【００８８】一方、この発明の顕微鏡システムの顕微鏡
本体においては、さらに、中空ビームで試料粒子を捕獲
および移動することのできる、マイクロマニュピュレー
タ機能をも有することができる。中空ビームを照射する
と、試料粒子は、レーザー強度の強い領域に吸引され
て、その安定点が中空ビームの集光点位置の中空部にな
って、中空ビーム内に完全に封印されて捕獲されるよう
になる。この発明の顕微鏡本体では、捕獲対象の試料に
はほとんどレーザー光が照射されないので、試料へのダ
メージを抑制することができる。さらに、その空間移動
は、通常のレーザービームのように、ガルバノミラー等
の光学系によるビーム走査で実現できる。

【００８９】また、捕獲に適切なレーザー強度は、約数
１０ＭＷ／ｃｍ² であることが知られており、この強度
は、この発明の顕微鏡システムにおける顕微鏡本体で用
いられるイレース光の最大強度とほぼ等しいので、上述
したイレース光の光源および集光光学系をそのまま利用
できる。従って、この発明の顕微鏡システムでは、中空
ビームを用いることで、試料を、光照射によるダメージ
を与えることなく、捕獲および移動させることができ、
高度なマイクロマニュピュレータ機能を有することがで
きる。

【００９０】以下、添付した図面に沿って実施例を示
し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明す
る。

【００９１】

【実施例】（実施例１）この発明の顕微鏡システムにお
いて、調整された試料が、Rhodamine6G により染色され
たものであり、顕微鏡本体が、ポンプ光（つまり、Rhod
amine6G を基底状態Ｓ０から第一電子励起状態Ｓ１へ励
起させる波長λ１の光）の光源およびイレース光（つま
り、第一電子励起状態Ｓ１のRhodamine6G を第二電子励
起状態Ｓ２へ励起させる波長λ２の光）の光源としてＹ
ＡＧレーザーを備えているとする。また、ＹＡＧレーザ
ーの波長変調素子として、ラマンシフターも備えている
とする。

【００９２】Rhodamine6G は、上述したように、二重共
鳴吸収と誘導放出とによる優れた蛍光抑制を実現させる
ことができ、そのＳ０からＳ１への励起波長λ１は５３
２ｎｍ、Ｓ１からＳ２への励起波長λ２は５６０ｎｍで
あるので、ＹＡＧレーザーの二倍高調波光（＝５３２ｎ
ｍ）をポンプ光とし、その二倍高調波をラマンシフター
で５６０ｎｍに波長変調したものをイレース光とする。

【００９３】下記の表１は、５３２ｎｍおよび５６０ｎ
ｍにおけるRhodamine6G の光学パラメータを例示したも
のである。

【００９４】

【表１】

【００９５】さらに、顕微鏡本体に備えられた集光光学
系によってイレース光を集光して得られるビームは、そ
の光軸と直交する面内で、光軸に関する対称位置におい
てπだけ位相がずれ、且つ光軸の周りを一回転したとき
に０から２πまで連続的に変化した位相分布を有してい
るとする。そして、集光光学系は、このような位相分布
をイレース光の集光ビームに与えることのできる、図１
８に例示したような屈折率分布または光路差分布を有す
る位相板を備えている。

【００９６】このようなこの発明の顕微鏡システムにお
ける顕微鏡本体の分解能の高さは、前記の一次ベッセル
ビームの一般式である数１１で表される。この分解能の
高さは、イレース光の集光光学系の開口数が、図１９の
ように具体的に与えられていると、次式のようなコンボ
リューション計算の形式で書き直すことができる。

【００９７】

【数１４】

【００９８】この式において、ＰＳＦ（ｘ，ｙ）は光学
系の２次元点像分布関数、Φ（ｘ，ｙ）は位相分布、ａ
は積分領域の半径を示している。また、集光光学系が輪
帯光学系である場合には、ＰＳＦ（ｘ，ｙ）は、次式で
与えられる。

【００９９】

【数１５】

【０１００】但し、ρ₀ は集光光学系の瞳の遮光率であ
り、ξは次式となる。

【０１０１】

【数１６】

【０１０２】但し、ＮＡは集光光学系の開口数、λはイ
レース光の波長を示している。数１５において、ρ
₀ は、０〜１の間で値を取り、０のときは、集光光学系
が輪帯光学系ではない場合のＰＳＦ（ｘ，ｙ）を示す。
ここで、数１４で与えられるＩ（ｘ，ｙ）を前記の数８
に代入すれば、Ｓ１の分子が均一に分布した試料面にイ
レース光を照射したときの蛍光強度Ｆ１（ｘ，ｙ）を次
式のように求めることができる。

【０１０３】

【数１７】

【０１０４】さらに、蛍光抑制に誘導放出が寄与する場
合には、誘導放出断面積を６ｆとして、数１７は数１８
となる。

【０１０５】

【数１８】

【０１０６】したがって、蛍光ラベラー分子がRhodamin
e6G であり、イレース光の集光ビームが上述したような
位相分布を有している場合では、この数１８を用いて、
Rhodamine6G が第一励起状態から基底状態へ脱励起する
際に発光する蛍光を、どの程度の空間分解能で検出でき
るかを見積もることができる。そこで、本実施例１にお
けるこの発明の顕微鏡システムの顕微鏡本体が検出でき
る空間分解能を、数１８により求めた。

【０１０７】表２は、この際に用いた環境パラメータを
例示したものである。

【０１０８】

【表２】

【０１０９】また、Rhodamin6Gの光学パラメータは上記
表１の値を用いた。なお、ポンプ光のフォトンフラック
スは指定してないが、Rhodamin6Gの場合では、ＹＡＧレ
ーザーの二倍高調波の波長帯域におけるσ₁₂が十分な数
のＳ１を生成できる大きな吸収断面積であるとして、特
にＳ１の生成量と均一性の論議は無視している。

【０１１０】図２０は、算出されたイレース光強度Ｉ
（ｘ，ｙ）と蛍光強度Ｆ₁ （ｘ，ｙ）とを例示したもの
である。なお、各強度はそれぞれのピーク値で規格化し
ている。この図２０から明らかなように、イレース光強
度はその中央部においてゼロとなっており、蛍光強度も
中央部において高く、蛍光領域が中央部にのみ残ってい
ることがわかる。集光光学系のRayligh-limit は、４５
５ｎｍであるが、もし蛍光強度Ｆ₁ （ｘ，ｙ）の半値幅
をRhodamine6G を検出できる空間分解能と定義すると、
それは１００ｎｍとなり、集光光学系の回折限界を上回
っている。つまり、本実施例におけるこの発明の顕微鏡
システムの顕微鏡本体は、優れた超解像性を有している
ことがわかる。

【０１１１】一方、ポンプ光およびイレース光の光源と
しているＹＡＧレーザーとしては、廉価で、安定性の高
いモードロック型のものを用いることができ、たとえ
ば、ポンプ光としての二倍高調波５２３ｎｍ光の一部を
ビームスプリッターで取り出し、これを、安全性のよい
ＢＢＯ結晶などの非線形結晶や、ラマンシフターなどの
波長変調素子または非線形媒質で５６０ｎｍに波長変換
して、イレース光とする。このように光源の構成は極め
て簡単なものとなる。

【０１１２】また、ＹＡＧレーザーが、モードロック型
であり、且つ半導体レーザー励起型である場合には、繰
り返しが高い１００ＭＨｚ、且つ数１０ｐｓｅｃの短パ
ルス光を得ることができるとともに、光源を小型でソリ
ッドステートのメンテナンスフリーであるものとするこ
とができる。さらには、照射光の強度が低くくて良く、
また、照射光波長が生体試料の光吸収帯域ではない５０
０ｎｍ近辺であるので、生体試料へのダメージを極めて
少なくすることができる。

【０１１３】また、Rhodamine6G と同様に、たとえば、
7-Ethylamino-4-trifluormethycoumarin(C₁₂H₁₀NO₂F₃:C
oumarin500) は、前述したように、ポンプ光とイレース
光が、ＹＡＧレーザーの二倍高調波と四倍高調波で対応
することができ、イレース光の強度を１００ＭＷ／ｃｍ
² として、Rhodamine6G と同じ１００ｎｍ程度の空間分
解能を得ることができる。

【０１１４】また、Rhodamine6G や7-Ethylamino-4-tri
fluormethycoumarinとは異なり、ＹＡＧレーザーの基本
波とその高調波を簡単な非線形結晶で変調して生成でき
る波長ではない共鳴波長λ１およびλ２を有する分子の
場合には、ＹＡＧレーザーの発振波長を、たとえば、オ
プティカルパラメトリックオシレータ（ＯＰＯ）などの
ような、非線形結晶を用いた光学システムで変調するこ
とにより、紫外から赤外までの範囲で走査することがで
きる。

【０１１５】もちろん、ＹＡＧレーザーであるので、従
来用いられてきた色素レーザーなどと比べ、色素の交換
などを行う必要がなく、顕微鏡本体の操作性が向上され
る。 （実施例２）上述の実施例１では、イレース光の集光ビ
ームを、光軸の周りを一回転したときに０から２πまで
連続的に変化した位相分布を有したものとしているが、
本実施例２では、不連続的に変化した位相分布を有した
ものとする。

【０１１６】不連続的に変化した位相分布をイレース光
の集光ビームに与えるには、たとえば、図２１に例示し
たように、光軸周りに不連続に変化する屈折率分布（ｎ
１〜ｎ８）を有する位相板を用いる。ここで、たとえ
ば、蛍光ラベラー分子をRhodamine6G とし、その光学パ
ラメータおよび環境パラメータをそれぞれ表１および表
２とした場合において、顕微鏡本体の集光光学系が、図
２２に例示したように光軸周りを四分割し、０，π／
２，π，３π／４と、飛び飛びの不連続位相分布をイレ
ース光の集光ビームに与える屈折率分布を有する位相板
を備えているとして、イレース光の集光ビームの強度分
布と、発光される蛍光の強度分布とを求めた。

【０１１７】図２３（ａ）（ｂ）は、各々、位相板の構
造と光学パラメータを例示した平面図および側面図であ
る。この図２３（ａ）（ｂ）に例示した位相板は、ガラ
ス基板（ＢＫ−７）上にフッ化マグネシューム膜がコー
トされて形成されている。フッ化マグネシューム膜は、
波長５６０ｎｍにおいて屈折率が１．３８であるので、
膜厚３５０ｎｍでλ／４の位相差を与える。よって、光
軸周りを四分割した各領域において０，π／２，π，お
よび（３π）／２の位相分布を与えることのできる各膜
厚は、それぞれ、図２３（ａ）に例示したように、３５
０ｎｍ、７００ｎｍ、１０５０ｎｍ、および０ｎｍとな
る。

【０１１８】また、このような屈折率分布を有するフッ
化マグネシューム膜などの光学薄膜をコーティングする
他にも、ガラス基板を直接エッチングすることにより、
各領域の位相を与える光路差を有するようにして位相板
を形成してもよい。なお、このように光学薄膜のガラス
基板上へのコーティングまたはガラス基板のエッチング
により形成される位相板では、イレース光の位相面の乱
れを防ぐために、ガラス基板自体の平行度や粗さがλ／
４の位相差を与える光路差より小さい必要がある。

【０１１９】つまり、フッ化マグネシューム膜を用いた
位相板では、ガラス基板自体の平行度や粗さによる光路
差の乱れが３５０ｎｍ以下としている。図２４は、この
ような図２３の位相板を備えた集光光学系により集光さ
れて得られたイレース光の集光ビームの強度と蛍光強度
とを例示したものである。この図２４から明らかなよう
に、イレース光の集光ビーム強度は、実施例１における
図２０に例示したイレース光集光ビーム強度とほぼ同じ
形状となっており、中央部の光強度がゼロとなっている
ことがわかる。

【０１２０】つまり、イレース光の集光ビームが、光軸
周りに不連続的に変化した位相分布を有している場合で
も、優れた超解像性が実現される。また、位相板の製作
において、光軸周りに不連続的に変化した屈折率分布ま
たは光路差分布を有するように、たとえばフッ化マグネ
シューム膜を製膜することは、連続的に変化させるより
も、極めて簡単であり、製作コストの低減を図ることが
できる。

【０１２１】（実施例３）この発明の顕微鏡システムで
は、波長λ２光であるイレース光を集光して得られるビ
ームが、非回折ビームである一次ベッセルビームである
ことが最も望ましいが、顕微鏡本体を理論通りの超解像
度を有するものとするには、前述したように、中央部の
強度がゼロとなる形状を有していれば良い。

【０１２２】したがって、図１８または図２２に例示し
たような位相板で位相変調されたビームを、通常の集光
光学系、つまり実施例１のように輪帯光学系を備えてい
ない集光光学系によって、縮小結像するだけでよく、非
回折性はなくなるが、優れた超解像性を実現することは
できる。図２５は、試料がRhodamine6G により染色され
たものであり、瞳の遮光率をゼロとし、光学パラメータ
および環境パラメータを表１および表２の値とした場合
で、算出したイレース光集光ビームの強度分布および蛍
光強度分布を例示したものである。

【０１２３】この図２５から明らかなように、位相板を
備えた通常の集光光学系によって集光されたビームは、
その中央部の強度がゼロとなる形状を有しており、中央
部に蛍光領域が残っている。集光光学系のRayleigh-lim
itは４５５ｎｍであるが、もし蛍光強度Ｆ₁ （ｘ，ｙ）
の半値幅をRhodamine6G を検出できる空間分解能とする
と、それは２００ｎｍとなり、集光光学系の回折限界を
上回っている。したがって、優れた超解像性が得られて
いることがわかる。

【０１２４】（実施例４）図２６は、超解像顕微機能を
有するこの発明の顕微鏡システムの一例を示した要部構
成図である。この図２６に例示した顕微鏡システムで
は、蛍光ラベラー分子としてRhodamine6G を用いてい
る。つまり調整された試料（１００）を、Rhodamine6G
により染色したものである。

【０１２５】波長λ１光であるポンプ光および波長λ２
光であるイレース光の光源として、モードロック型のＮ
ｄ：ＹＡＧレーザー（１）が備えられ、その波長変換用
の非線形媒質としての非線形結晶であるＢＢＯ結晶
（２）が備えられており、このＮｄ：ＹＡＧレーザー
（１）の基本波をＢＢＯ結晶（２）により波長変換し
て、二倍高調波５３２ｎｍを発振させ、これをポンプ光
としている。

【０１２６】このポンプ光の光路上にはハーフミラー
（３）が備えられており、このハーフミラー（３）によ
って、二倍高調波の一部、つまりポンプ光の一部を取り
出し、非線形結晶としてのＢａ（ＮＯ₃ ）₂ 結晶で構成
されたラマンシフター（４）によって、５６３ｎｍに波
長変換し、これをイレース光としている。このイレース
光は、ミラー（５）を介して、実施例２において例示し
た位相板（６）に照射されて、この位相板（６）によっ
て中央部の電場強度がゼロとなる中空ビームに成形され
る。

【０１２７】この中空ビームとして成形されたイレース
光とポンプ光は、ダイクロックミラー（７）により同じ
光路を通るようにされ、そして、次のダイクロックミラ
ー（８）および集光対物レンズ（９）を介して、図中の
矢印方向に移動する二次元移動ステージ（１０）に設置
されている、調整された試料（１００）上に集光され
る。

【０１２８】このようにして集光されたポンプ光および
イレース光の照射により、調整された試料（１００）か
ら発光する蛍光は、ダイクロックミラー（８）により反
射され、蛍光集光レンズ（１１）によって、シャープカ
ットフィルター（１２）およびピンホール（１３）を介
して、フォトマル（１４）の受光面に集光される。ダイ
クロックミラー（８）は、ポンプ光およびイレース光を
透過し、蛍光帯域で反射率をもつ干渉フィルターであ
る。このため、ポンプ光およびイレース光と、シグナル
光である蛍光との分別が可能となっている。

【０１２９】また、ダイクロックミラー（８）とフォト
マル（１４）との間に配設されているシャープカットフ
ィルター（１２）は、ダイクロックミラー（８）などの
表面散乱により混入したポンプ光およびイレース光をカ
ットする帯域フィルターであり、ピンホール（１３）
は、同じく空間的に拡散した迷光をカットする空間フィ
ルターとして機能するものである。これらシャープカッ
トフィルター（１２）およびピンホール（１３）によっ
て、蛍光の検出感度の向上と、Ｓ／Ｎ比の向上が図られ
る。

【０１３０】このような構成を有するこの発明の顕微鏡
システムにおいて、Ｎｄ：ＹＡＧレーザーのパルス光の
照射のタイミングと同期して、二次元移動ステージ（１
０）を移動させながら、蛍光の強度をモニターすること
により、調整された試料（１００）の２次元蛍光画像を
得ることができる。なお、ポンプ光とイレース光の強度
はフォトマル（１５）によりモニターしており、たとえ
ば、信号処理を加えることでレーザー光の強度変換によ
る各ピクセルごとの画像信号の変動を抑制でき、画質の
向上を図ることができる。

【０１３１】もちろん、このような図２６に示した例に
おいて、各構成要素については様々な態様が可能であ
り、また、他の機能の付加も可能である。たとえば、集
光対物レンズ（９）としては、通常の光学レンズを用い
れば、集光点中央で強度がゼロとなるイレース光集光ビ
ームを形成することができ、また、光軸の周りを周回す
る対称な境界条件を与えるものを用いれば、非回折ビー
ムである一次ベッセルビームを形成することができる。

【０１３２】以下に一次ベッセルビームを形成すること
のできる集光対物レンズ（９）としての光学系を例示し
て説明する。 （Ｉ）輪帯光学系 この輪帯光学系としては、たとえば図２７に例示したよ
うな、環状の輪帯スリット（１６）と通常のガラスレン
ズ（１７）とが組み合わされてなるものがある。環状の
輪帯スリット（１６）を用いる場合には、たとえば、輪
帯スリット（１６）の前にエタロン（図示していない）
を配置させ、その一次回折光を利用して、通過する光量
を増加させることが望ましい。

【０１３３】また、輪帯瞳をもともと有する輪帯光学系
もあり、それ自体が一次ベッセルビームの形成に必要な
境界条件を持っている。この輪帯瞳をもともと有する輪
帯光学系としては、たとえば、図２８に例示したような
反射対物レンズなどがある。この反射対物レンズは、カ
セグレンまたはシュバルツシルド型光学系であり、内側
に配置されている凸曲面の反射ミラーが、光学瞳の中央
部を遮蔽しており、実質上、上記の環状輪帯スリット
（１６）と同様な役割を果たしている。 反射型光学系
としては、図２９に例示したような斜入射型のＷａｌｔ
ｅｒ型レンズもある。このＷａｌｔｅｒ型レンズは、極
端な輪帯光学系であり、ほぼ理想的な環状輪帯スリット
を用いたことと等価になる。

【０１３４】（II）回折光学系 軸対称な回折光学系（透過型および反射型を含む）も、
光軸の周りを周回する対称な境界条件を前記の数１２の
波動方程式に与えるので、集光光学系として適用するこ
とができる。この回折光学系としては、たとえばフレネ
ルゾーンプレートがある。図３０（ａ）（ｂ）は、各
々、透過型および反射型のフレネルゾーンプレートを例
示したものである。フレネルゾーンプレートは、もとも
と結像能力を有しているので、集光能力と一次ベッセル
ビーム形成に必要な境界条件とを併せ持っている。

【０１３５】また、単に、境界条件を与えることのみを
目的とする場合には、図３１に例示したように、同心円
上に溝や螺旋溝が切られてなる回折格子が備えられてい
てもよい。 （III）アキシコン アキシコンも軸対称の光学系であり、軸上の点光源をそ
の軸上の広い範囲に渡って結像させることができる。図
３２は、アキシコンの一例を示したものである。この図
３２に例示したアキシコンは、円錐面とメッキした平面
とを有する、マクレオードと呼ばれる反射レンズであ
る。このアキシコンは、ある範囲で軸上の点に対し必ず
軸上同一点が存在し、軸外の点に対してはそれと対称の
点に像点が存在する。このようなアキシコンも光軸の周
りを周回する対称な境界条件を与えるものである。

【０１３６】以上のような光学系を集光対物レンズ
（９）として備えることができる。また、図２６に示し
た例において、蛍光検出器としては、フォトマルのよう
な光電子倍増管以外にも、ＰＩＮフォトダイオードやＣ
ＣＤ等の半導体検出器が備えられていてもよい。Rhodam
ine6G を蛍光ラベラー分子とした場合には、光源につい
ても別の手段が可能である。たとえば、イレース光を生
成するためには、ラマンシフター（４）の代りに、ＯＰ
Ｏや色素レーザーを用いることも可能ではある。この場
合には、イレース光が波長可変となるためラベラー分子
として、Rhodamine110などのローダミン系分子を利用す
ることができる。

【０１３７】さらにまた、図２６の顕微鏡システムで
は、調整された試料（１００）の二次元蛍光画像を得る
ために、二次元移動ステージ（１０）を集光ビームに対
して相対的に二次元移動させるようになっており、この
他にも、たとえば、従来のレーザー走査型顕微鏡のよう
に、直接、ガルバノミラーなどにより光学系を振動させ
て、ビーム自体で調整された試料（１００）上を二次元
走査することもできる。

【０１３８】（実施例５）図３３は、共焦点型の超解像
顕微機能を有するこの発明の顕微鏡システムの一例を示
した要部構成図である。この図３３に例示した顕微鏡シ
ステムでは、調整された試料（１００）が、Coumarin50
0 により染色されたものとしている。

【０１３９】ポンプ光およびイレース光の光源として、
モードロック型のＮｄ：ＹＡＧレーザー（１）が備えら
れており、このＮｄ：ＹＡＧレーザー（１）の基本波
（１０６４ｎｍ）はハーフミラー（２８）によって二系
統に分岐される。分岐された一方の基本波は、ＢＢＯ-1
結晶からなる三倍波発生器（１８）により３５５ｎｍに
波長変換されて、ポンプ光とされる。他方の基本波は、
ミラー（２９）を介してＢＢＯ-2結晶からなる二倍波発
生器（１９）に入射され、この二倍波発生器（１９）に
より３５５ｎｍに波長変換されて、イレース光とされ
る。

【０１４０】イレース光は、ミラー（３０）を介して、
実施例２において例示したような位相板（３１）に照射
され、この位相板（３１）によって中央部が電場強度が
ゼロとなる中空ビームに成形される。この中空ビームと
されたイレース光とポンプ光は、ダイクロックミラー
（２０）により同じ光路を通るようにされる。

【０１４１】また、このダイクロックミラー（２０）と
三倍波発生器（１８）との間には、偏光子（２１）が配
設されており、この偏光子（２１）によって、ポンプ光
の偏光面を自由に回転できるようになっている。ダイク
ロックミラー（２０）により同軸上に光路を揃えられた
ポンプ光およびイレース光は、シュバルツシルド型反射
光学系であるコンデンサーレンズ（２２）によりピンホ
ール（２３）を照明する。

【０１４２】集光されたポンプ光およびイレース光によ
り照明されたピンホール（２３）の像は、あらためてマ
イクロビーム形成用の光源として用いられる。ピンホー
ル（２３）を通過したポンプ光およびイレース光は、ダ
イクロックミラー（２４）を透過し、シュバルツシルド
型反射光学系である対物レンズ（２５）によって、二次
元移動ステージ（１０）上に設置されている、調整され
た試料（１００）上に、集光される。

【０１４３】シュバルツシルド型反射光学系であるコン
デンサーレンズ（２２）および対物レンズ（２５）は、
アルミなどの金属膜がコーティングされた各鏡面を有し
ており、赤外から紫外領域までの広い波長領域の光を色
収差なく結像できる。したがって、波長の異なるポンプ
光とイレース光とを、全く同じ結像性能、且つ高分解能
で、調整された試料（１００）上に集光できる。このシ
ュバルツシルド型反射光学系は、輪帯光学系であり、内
側に配置されている凸面鏡の半径を調整して、遮光率ρ
₀ を０から１の間の値とすることで、一次ベッセルビー
ムの形成に必要な境界条件を与える。

【０１４４】集光されたポンプ光およびイレース光の照
射により、調整された試料（１００）から発光する蛍光
は、対物レンズ（２５）を介して、ダイクロックミラー
（２４）により反射される。この際、ポンプ光とイレー
ス光の散乱光や迷光は、ダイクロックミラー（２４）で
反射されないので、信号光である蛍光光のみを分別でき
る。

【０１４５】そして、ダイクロックミラー（２４）によ
り反射された蛍光光は、ピンホール（２６）を通過し、
シャープカットフィルター（２７）によってポンプ光と
イレース光の残光がカットされて、フォトマル（１４）
の受光面に集光される。このような図３３に例示したこ
の発明の顕微鏡システムにおける顕微鏡本体の光学系
は、共焦点光学系である。すなわち、ピンホール（２
３）および（２６）は、調整された試料（１００）上の
集光点を中心にして光学的に共焦点位置にある。このた
め、同等の共焦点光学系を有する走査型レーザー蛍光顕
微鏡と同様にＳ／Ｎ比に優れ、しかも二次元移動ステー
ジ（１０）の光軸方向の移動により、調整された試料
（１００）の三次元の蛍光画像を得ることができる。

【０１４６】また、偏光子（２１）によって、超解像機
能の他に新たな有用な機能が付加されている。一般に、
分子は特定の方向の電気ベクトルに対して吸収が強くな
り、たとえば、ベンゼン誘導体やプリン誘導体は分子平
面の平面方向と同じ方向の電気ベクトルを持つ光を吸収
する。その場合、ポンプ光の偏光方向を回転させること
によって、特定の方向に空間配向した分子のみを励起
し、蛍光を起こさせることができる。したがって、偏光
子（２１）により、ポンプ光の偏光方向を変えながら、
蛍光画像を撮ることで、調整された試料（１００）の特
定の分子あるいは組織の空間的配向特性を分析できるよ
うになる。

【０１４７】（実施例６）図３４は、この発明の顕微鏡
システムの他の一例を示した要部構成図である。この図
３４に例示した顕微鏡システムは、超解像顕微機能の他
に、中空マイクロビームを用いたマイクロマニュピュレ
ータ機能をも有している。さらに、通常の蛍光顕微機能
も持ち合わせ、レーザー走査をしなくとも常にリアルタ
イムで、調整された試料（１００）からの蛍光像をモニ
ターできるようになっている。

【０１４８】この図３４に例示した顕微鏡システムにお
いて、調整された試料（１００）は、Rhodamine6G によ
り染色されたものとなっている。超解像顕微機能のため
のポンプ光とイレース光の光源および波長変換用の非線
形媒質として、モードロック型のＮｄ：ＹＡＧレーザー
（３２）および非線形結晶であるＫＴＰ結晶（３５）が
備えられている。また、マイクロマニュピュレータ機能
用の中空マイクロビームを形成するためのレーザー光源
および波長変換用の非線形媒質として、連続発振ＣＷの
Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（３３）およびＫＴＰ結晶（３
６）が備えられている。さらにまた、通常の蛍光顕微機
能のための光源として、水銀ランプ（３１）も設けられ
ている。

【０１４９】まず、超解像顕微機能について説明する。
Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（３２）の基本波はＫＴＰ結晶
（３５）により波長変換されて、ポンプ光としての５３
２ｎｍの２倍高調波が発振される。このポンプ光の一部
は、ハーフミラー（３７）により取り出されて、ミラー
（３８）を介して、Ｂａ（ＮＯ₃ ）結晶で構成されたラ
マンシフター（３９）に入射され、このラマンシフター
（３９）により５６３ｎｍに波長変換されて、イレース
光とされる。

【０１５０】イレース光はダイクロックミラー（４０）
に入射し、このダイクロックミラー（４０）によって、
混入した５３２ｎｍの二倍高調波がカットされて、５６
３ｎｍの光のみが純度良く抽出される。このイレース光
は、さらに、実施例２において例示したような位相板
（６）により、中央部で電場強度がゼロとなる中空ビー
ムに成形される。

【０１５１】この中空ビームに成形されたイレース光と
ポンプ光とは、ダイクロックミラー（４１）により同じ
光路を通るようにされる。ハーフミラー（３７）とダイ
クロックミラー（４１）との間には偏光子（２１）が設
置されており、この偏光子（２１）によってポンプ光の
偏光面を自由に回転できるようになっている。

【０１５２】ダイクロックミラー（４１）により同軸上
に光路を揃えられたポンプ光およびイレース光は、さら
にリレーレンズ（４２）により成形された後、ハーフミ
ラー（４３）により反射されて対物レンズ（９）に入射
し、この集光対物レンズ（９）によって、二次元移動ス
テージ（１０）上に設置されている、調整された試料
（１００）上に集光される。

【０１５３】ポンプ光およびイレース光の照射によって
調整された試料（１００）から発光する蛍光は、ハーフ
ミラー（４３）および（４４）を透過し、ハーフミラー
（４５）によってレンズ（４６）に入射する方向に反射
される。そして、レンズ（４６）によってピンホール
（４７）の中央に集光された後、レンズ（４８）を介し
てスペクトルメーター（４９）に入射する。

【０１５４】ピンホール（４７）は、空間フィルターと
して機能し、調整された試料（１００）以外、たとえば
光学系など、から発する蛍光等をカットして、測定のＳ
／Ｎ比を高める役割をする。また、この図３４に示した
例では、蛍光検出器としてスペクトルメーター（４９）
が備えられているため、単に蛍光強度を測定するだけで
なく、蛍光スペクトルの観測やレーザー照射に対する時
間応答の測定をも行うことができるので、調整された試
料（１００）の化学構造や組成の解析ができる。さら
に、偏光子（７）によって、ポンプ光とイレース光の偏
光面を相対的に変化させることで、組成の空間配向情報
も得られる。

【０１５５】このように、調整された試料（１００）に
対する様々な測定や解析を行うことができる、非常に優
れた超解像顕微機能を有している。次に、マイクロマニ
ュピュレート機能について説明する。マイクロマニュピ
ュレートにおいて粒子を捕獲する場合は、基本的に、連
続発振光源を用いる必要があるので、連続発振光源とし
て、ＣＷのＮｄ：ＹＡＧレーザー（３３）が備えられて
いる。

【０１５６】このＮｄ：ＹＡＧレーザー（３３）の基本
波がＫＴＰ結晶（３６）により波長変換されて５３２ｎ
ｍの二倍高調波が発生される。この二倍高調波を、マイ
クロマニュピュレートに用いる中空マイクロビーム生成
用の光源としている。ハーフミラー（３８）を通過した
二倍高調波は、ラマンシフター（３９）によって５６３
ｎｍに波長変換され、さらに、ダイクロックミラー（４
０）により、混入した５３２ｎｍの二倍高調波がカット
されて、５６３ｎｍの光のみが純度良く抽出される。

【０１５７】この５６３ｎｍ光は、位相板（６）によ
り、中央部で電場強度がゼロとなる中空マイクロビーム
に成形され、ダイクロックミラー（４１）およびリレー
レンズ（４２）を通過して、ハーフミラー（４３）によ
り集光対物レンズ（９）に入射するように反射される。
そして、集光対物レンズ（９）により、調整された試料
（１００）上に集光される。

【０１５８】このように、マイクロマニュピュレート用
の５６３ｎｍ中空マイクロビームは、上述した超解像機
能用のイレース光と同じ光学系を用いることができる。
「光ピンセット」と称されている従来のマイクロマニュ
ピュレートでは単一の粒子しか移動させることができな
かったが、この中空マイクロビームを用いたマイクロマ
ニュピュレートは、中空マイクロビーム内に複数個の粒
子を閉じ込めることができ、「光ピペット」として機能
することができ、高度なマイクロマニュピュレートを行
うことができる。もちろん、レーザー強度も非常に弱く
てすむので、試料へのダメージを減少させることができ
る。

【０１５９】実際のマイクロマニュピュレートの際に
は、全体の顕微鏡像をモニターしながら操作するので、
顕微鏡像をモニターするための通常の蛍光顕微機能をも
付加されている。この蛍光顕微機能のための光源として
は水銀ランプ（３１）が備えられており、この水銀ラン
プ（３１）からの光は、ハーフミラー（４４）、ハーフ
ミラー（４３）および集光対物レンズ（９）を介して、
調整された試料（１００）上に照射される。そして、こ
の光照射により発光した蛍光像は、ふたたび、集光対物
レンズ（９）、ハーフミラー（４３）およびハーフミラ
ー（４４）を介して、ＣＣＤカメラ結像レンズ（５０）
に入射し、このＣＣＤカメラ結像レンズ（５０）によっ
て、ＣＣＤカメラ（５１）の受光面上に直接結像され
る。この蛍光像は、直接、ＣＲＴ上で随時モニターでき
る。

【０１６０】したがって、ＣＲＴ上の蛍光像を見なが
ら、中空マイクロビームにより、たとえば赤血球などの
粒子を、高度にマイクロマニュピュレートすることがで
きる。 （実施例７）この発明の顕微鏡システムでは、顕微鏡本
体を優れた超解像性および操作性とするめに、イレース
光を集光して得られるビームを、一次ベッセルビームと
することが望ましい。

【０１６１】一次ベッセルビームの成形は、上述したよ
うに集光光学系に備えられる位相板や、輪帯光学系、回
折光学系、アキシコンなどを用いて行う他にも、イレー
ス光の光源としての気体レーザー、固体レーザーまたは
半導体レーザーの共振器内に一次のベッセルビームを形
成するのに必要な境界条件を与えることで、イレース光
自体を一次ベッセルビームとすることが可能である。

【０１６２】図３５は、その境界条件を兼ね備えたレー
ザー共振器の一例を示した要部構成図である。この図３
５に例示したレーザー共振器は、通常の焦点距離ｆのレ
ンズ（５３）、位相板（５４）、出力ミラー（５５）を
備えており、さらに、端面の共振器ミラーとして、リン
グ状の輪帯ミラー（５２）を備えている。

【０１６３】このリング状輪帯ミラー（５２）内でビー
ム光軸に対して軸対称な境界条件が与えられ、さらに、
光軸と直交する面内の電場に関して軸対称にある電場が
互いにπだけずれた位相差をビームに与える位相板をレ
ーザー共振器内に設けることにより、一次ベッセルビー
ムを直接発生させることができる。このようなリング状
輪帯ミラー（５２）や位相板をレーザー共振器内に設け
て境界条件を与えることにより、顕微鏡本体の集光光学
系の構造を単純にし、アライメントなどを非常に簡単な
ものとすることができる。

【０１６４】図３６は、Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（５６）
が図３５に例示した構成のレーザー共振器を持つ場合
の、この発明の顕微鏡システムの一例を示した要部構成
図である。この図３６に示した例では、調整された試料
（１００）がRhodamine6G により染色されたものである
とし、光源として、図３５に例示した構成のレーザー共
振器を持つモードロック型のＮｄ：ＹＡＧレーザー（５
６）が備えられている。

【０１６５】このＮｄ：ＹＡＧレーザー（５６）は、直
接一次ベッセルビームの基本波を発生させることがで
き、この基本波をＫＴＰ結晶（５７）によって５３２ｎ
ｍの二倍高調波に波長変換して、ポンプ光として、ま
た、その二倍高調波の一部をＢａ（ＮＯ₃ ）₂ 結晶から
なるラマンシフター（４）により５６３ｎｍに波長変換
して、イレース光とする。

【０１６６】このイレース光は、すでに一次ベッセルビ
ームであるので、集光光学系において、前述した実施例
におけるイレース光を中空ビームとする位相板（６）
や、一次ベッセルビームとする輪帯光学系などの光学系
を備える必要がなく、そのままダイクロックミラー
（７）（８）および集光対物レンズ（９）を介して、調
整された試料（１００）上に集光させることができる。

【０１６７】もちろん、調整された試料（１００）上の
集光ビームは、一次ベッセルビームとなっている。この
ように一次ベッセルビームを形成する光学系が全てレー
ザー内に強固に組み込まれていることにより、簡単な構
成であるとともに、ずれに強く、安定性に優れた集光光
学系となり、超解像性および操作性をさらに向上させる
ことができる。

【０１６８】一次ベッセルビームを形成する境界条件を
与えることのできる光学系としては、上記のリング状の
輪帯ミラー（５２）や光軸と直交する面内の電場に関し
て軸対象にある電場が互いにπだけすれた位相差をビー
ムに与える位相板の他にも、輪帯回折格子、フレネルゾ
ーンプレート、輪帯アパーチャーなどを、イレース光レ
ーザー光源の共振器内に備えることができる。

【０１６９】なお、一般に、レーザーは、その共振器の
構成によって、様々なモードパターンをもつビームパタ
ーンを生成することができるので、ガウス型、ラゲール
型またはエルミート型の高次発振モードでは、図３７
（ａ）〜（ｄ）に例示したように、レーザービームの中
央部で強度がゼロとなるパターンが存在する。よって、
光源としての各種レーザーは、そのレーザー共振器を図
３５に例示したような構成とする他にも、ガウス型、ラ
ゲール型またはエルミート型の高次発振モードをもつレ
ーザービームを発振させることで、一次ベッセルビーム
と同様に、優れた超解像性を有することができるように
もなる。

【０１７０】（実施例８）上述したようなこの発明の顕
微鏡システムでは、いくつかのフィルター素子を用いる
ことで、発光検出器に入射する、試料からの蛍光信号の
Ｓ／Ｎ比を向上させることができる。一般に、超解像顕
微鏡では、検出すべき観察試料からの蛍光の他に、いく
つかのバックグラウンド光が存在する。これらのバック
グラウンド光としては、ｉ）ポンプ光の散乱光、ｉｉ）
イレース光の散乱光、ｉｉｉ）試料以外の光学系からの
蛍光がある。

【０１７１】ｉ）については、ポンプ光の波長λ１の散
乱光であり、主に集光レンズ表面での散乱や、観察試料
を保護するカバーガラスの界面での散乱である。ｉｉ）
については、ｉ）と同様の理由によるイレース光の波長
λ１の散乱光である。イレース光は、ポンプ光よりも強
度が強いので、蛍光検出に障害となる。ｉｉｉ）につい
ては、光学系のレンズやカバーガラスの硝材が理想的な
無蛍光石英や蛍石であれば、これらの硝材からの２５０
ｎｍ以上の波長領域の蛍光は存在しない。しかし、材質
が悪いと、不純部やカラーセンターにより、それらから
の蛍光がある。

【０１７２】これらのバックグラウンド光は、この発明
の顕微鏡システムにおける超解像の顕微鏡本体において
も発生する場合があるため、蛍光に混入して検出器に入
射してしまうのを防ぎ、Ｓ／Ｎ比の向上を図ることが望
ましい。図３８に例示したように、基本的には、光学フ
ィルターと空間フィルターの組み合わせでバックグラウ
ンド光を完全に除去するこができる。

【０１７３】通常、ポンプ光の波長λ１が一番短く、イ
レース光の波長λ２、およびＳ１からＳ０への脱励起時
の蛍光の波長帯域が長波長側に存在する。Rhodamine6G
は、Ｓ１からＳ２への吸収帯域とＳ１からＳ０への蛍光
波長帯域が重複し、波長λ２と検出する蛍光波長とが近
接しているので、このような分子を蛍光ラベラー分子と
して使用する場合には、バックグラウンド光の除去を入
念に行うことが好ましい。

【０１７４】まず、ｉ）のポンプ光の散乱光の除去は、
一般にポンプ光とイレース光との波長が比較的離れてい
るので、高分子を含んだ吸収剤をガラス基板に拡散した
り、干渉膜をガラス基板上にコートして成るシャープカ
ットフィルターを設けることにより行うことができる。
このようなシャープカットフィルターによって、たとえ
ば図３８から明らかなように、波長λ２より短波長側を
完全に除去できることがわかる。たとえば、誘電体多層
膜を用いたものでは、最適設計を行えば、波長分別設計
位置の前後大体３０ｎｍ程度の間隔を置いて、これより
波長幅で短波長側の光をほぼ１００％除去し、反対に長
波長側の光を透過させることができる。Rhoudamine6Gで
は、前述の図１４に例示したように、蛍光測定波長領域
とポンプ光とを４０ｎｍ以上間隔があけられるので、シ
ャープカットフィルターにより、ポンプ光の散乱光を、
試料からの蛍光から分離して取り除くことができる。

【０１７５】このようなシャープカットフィルターは、
たとえば、前述の実施例４における図２６に例示したよ
うに、蛍光検出器（フォトマル（１４））の前に、蛍光
の光路上に設置させることができる。次に、ｉｉ）のイ
レース光の除去は、ノッチフィルターを設けることによ
り行うことができる。ノッチフィルターは、誘電体多層
膜を用いたフィルターであり、図３８に例示したよう
に、特定の波長のみを透過させないようにしたものであ
る。誘電体多層膜を多く積層して、膜厚を最適化すれ
ば、設計波長を中心に２０ｎｍ程度バンド内の光を完全
に除去できる。

【０１７６】特に、Rhodamine6G の場合には、蛍光発光
領域が５５０〜６５０ｎｍの領域に広がり、イレース光
の波長が５６２ｎｍとなっているが、ノッチフィルター
により、５６２ｎｍ近傍のイレース光の散乱光が検出器
に入射することを防ぐことができる。また、Rhodamine6
G のように、二重共鳴吸収過程と誘導放出とを利用して
試料からの発光蛍光の抑制を行う場合には、Ｓ１からＳ
２への吸収帯域とＳ１からＳ０への蛍光波長帯域が重複
するので、発光検出器に入射する試料からの蛍光が一部
損失することとなる。しかしながら、ノッチフィルター
を用いることにより、５５０〜６５０ｎｍの領域のう
ち、５６２ｎｍを含む２０ｎｍ程度の狭域の蛍光が欠損
するだけで、観察対象である蛍光の損失も極力少なくす
ることができる。

【０１７７】さらに、試料からの蛍光以外のバックグラ
ウンド光をより完全に除去させるために、バンドパスフ
ィルターを配設させることも好ましい。バンドパスフィ
ルターは、誘電体多層膜をガラス基板にコートして成る
ものであり、ノッチフィルターとは反対に、特定の波長
を含み、その前後の波長領域の光のみを透過させること
ができる。

【０１７８】したがって、ポンプ光とイレース光の波長
と透過せず、且つ、蛍光発光波長帯域のみに透過特性の
バンドパスフィルターが備えられていることにより、原
理的には完全に試料からの蛍光以外の波長をカットする
ことができる。以上のように、シャープカットフィルタ
ー、ノッチフィルター、バンドパスフィルターを併用し
て、たとえば発光検出器へ試料からの発光を集光する発
光集光光学系において、備えることにより、蛍光ラベラ
ー分子が脱励起する際に発光する蛍光を、非常に優れた
Ｓ／Ｎ比で検出することができる。

【０１７９】ｉｉｉ）の試料以外の光学系からの蛍光の
除去については、光学系のレンズやカバーガラスの硝材
の不純物やカラーセンターに起因するものであるので、
理想的な合成石英（つまり無蛍光石英）や蛍石を利用す
れば問題ない。このような硝材としては、合成石英の他
に、ＣａＦ₂ 、ＮａＦ、Ｎａ₃ ＡｌＦ ₆ 、ＬｉＦ、Ｍｇ
Ｆ₂ 、ＳｉＯ₂ 、ＬａＦ₃ 、ＮｄＦ₃ 、Ａｌ₂ Ｏ₃ 、Ｃ
ｅＦ₃、ＰｂＦ₂ 、ＭｇＯ、ＴｈＯ₂ 、ＳｎＯ₂ 、Ｌａ
₂ Ｏ₃ 、ＳｉＯなどを用いることができる。

【０１８０】もちろん、試料からの蛍光と試料以外の光
学系からの蛍光とを分離させるフィルター光学系をも設
置させておくことが望ましい。このようなフィルター光
学系としては、スリットまたはピンホールなどの空間フ
ィルターがある。図３９は、フィルター光学系が備えら
れているこの発明の顕微鏡システムの一例を示した要部
構成図である。

【０１８１】この図３９に例示した顕微鏡システムのフ
ィルター光学系では、遮光ボックス（６２）の中におい
て、ノッチフィルター（１４）の前方に、ノッチフィル
ター（５８）、バンドパスフィルター（５９）、シャー
プカットフィルター（６０）が順に配設されている。さ
らに、遮光ボックス（６２）におけるダイクロックミラ
ー（２４）側の面部は、ピンホール（６１）を有してい
る。

【０１８２】また、調整された試料（１００）のレーザ
ー光照射面側は、カバーガラス（６３）によりカバーさ
れて保護されている。このカバーガラス（６３）は、た
とえば上記した硝材により形成されている。このような
図３９の顕微鏡システムにおいて、ピンホール（２３）
と、空間フィルターとして機能するピンホール（６１）
とは、対物レンズ（６４）と調整された試料（１００）
面に対して共焦点位置となっている。このような共焦点
光学系の場合には、光線追跡をすると自明であるが、ポ
ンプ光およびイレース光の集光点以外のところ、言い換
えると試料面でないところで発光した蛍光は、ピンホー
ル（６１）を通過して、発光検出器であるフォトマル
（１４）の受光面に到達できない。

【０１８３】たとえば、カバーガラス（６３）から発光
した蛍光は対物レンズ（６４）を通ると、ピンホール
（６１）上には結像しない。従って、結像しない大多数
の蛍光は、ピンホール（６１）を通過することができな
い。また、対物レンズ（６４）面から発光した蛍光は、
対物レンズ（６４）レンズで直接ピンホール（６１）に
集光しないので、ピンホール（６１）を通過せず、フォ
トマル（４）の受光面に到達しない。

【０１８４】図３８のノーテーションに従えば、発光検
出器に入射する蛍光強度Ｉ_signalは、次式のように表す
ことができる。

【０１８５】

【数１９】

【０１８６】この式において、Ｆ（λ）は蛍光ラベラー
分子の蛍光強度であり、λ_ex1 とλ _ex2 は発光検出器の
感度域の下限波長と上限波長を示している。図３８が示
すように、このＩ_signalは、バックグラウンド光の混入
してない、試料からの蛍光強度に対応している。なお、
図３９において、対物レンズ（６４）を反射対物レンズ
とすると、レンズ硝材からの蛍光が無くなるので、より
Ｓ／Ｎ比を向上させることが可能となる。

【０１８７】（実施例９）図４０は、実施例６における
図３４に例示したこの発明の顕微鏡システムに対応する
電気系システムの一例を示したものである。図４０に示
した例では、この発明の顕微鏡システムの全系は、基本
的に、パーソナルコンピュータ（６６）によって制御さ
れる。

【０１８８】このパーソナルコンピュータ（６６）は、
ＹＡＧレーザーの発振、および調子されたたとえば図３
４における試料（１００）の走査ステージである二次元
移動ステージ（１０）の駆動制御を行う。系のタイミン
グは全てパーソナルコンピュータ（６６）のクロックに
準拠している。このクロックは、分周器（６７）によ
り、レーザー発振可能な周波数まで分割され、分周され
たクロック信号は、ゲート＆ディレイジェネレータ（６
８）により、遅延および波形成形されて、レーザー制御
用のＱスイッチ信号とフラッシュランプ信号として、Ｙ
ＡＧレーザーを制御する。

【０１８９】レーザーショットごとの蛍光スペクトル
は、ＣＣＤアレー（６９）でモニターされる。具体的に
は、レーザーショットにより、調整された試料（１０
０）から発光した蛍光は回折格子（７０）で分光され、
一次元のＣＣＤアレー（６９）により蛍光スペクトルと
して検出される。ＣＣＤアレー（６９）の各画素の蓄積
データは、二次元移動ステージ（１０）の移動およびレ
ーザー発光と同期しながら、レーザーショットごとにパ
ーソナルコンピュータ（６６）のメモリに転送される。

【０１９０】パーソナルコンピュータ（６６）のメモリ
に記憶された蛍光スペクトルデータからは、パーソナル
コンピュータ（６６）の数値演算処理により、特定の蛍
光波長のデータだけが抽出されて、このデータによって
調整された試料（１００）の二次元走査画像が形成され
る。測定された各波長に対して二次元操作画像を画像解
析することにより、単なる蛍光像を得るだけでなく、２
次元組成分析をも可能となる。

【０１９１】さらに、水銀ランプ（３１）の照射で得ら
れる調整された試料（１００）の蛍光画像は、同時にＣ
ＣＤカメラ（７１）でモニターされ、その蛍光画像デー
タは図時フレームメモリー（７２）に蓄積できるように
なっている。このことにより、二次元走査画像とは別
に、随時、調整された試料（１００）の蛍光像の全体を
モニターしておくことができる。この機能は、前述した
ように、特に、中空マイクロビームを用いたマイクロマ
ニュピュレートを行う際に大変便利である。

【０１９２】この他、パーソナルコンピュータ（６６）
は、ＣＲＴ（７３）およびフレームメモリー（７２）を
制御し、画像表示や、画像処理を随時行うことができ
る。このようにして形成された画像データは、たとえば
ＣＲＴ（７３）またはビデオプリンター（７４）により
出力できる。この発明は以上の例に限定されるものでは
なく、細部については様々な態様が可能である。

【０１９３】

【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明によ
って、第一電子励起状態の分子を第二電子励起状態へ励
起させるイレース光を、簡単でコンパクトな光学系を用
いて、優れたビームプロファイルで集光させることがで
き、安定性および操作性が高く、優れた超解像性を有す
る、新しい顕微鏡システムが提供される。また、試料へ
ダメージを与えることなく、中空ビームであるイレース
光を用いて試料粒子の捕獲および移動を行うことのでき
る、マイクロマニュピュレータ機能を有する、新しい顕
微鏡システムも提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】分子の電子構造を例示した概念図である。

【図２】図１の分子の波長λ１による第一励起状態への
励起を例示した概念図である。

【図３】図１の分子の波長λ２による第二励起状態への
励起を例示した概念図である。

【図４】図３の第二電子励起状態から基底状態への発光
を伴う脱励起過程を例示した概念図である。

【図５】第二励起状態ん発光収率の小さい分子における
長解像顕微鏡の原理を例示した概念図である。

【図６】二重共鳴吸収過程を例示した概念図である。

【図７】波長λ１光と波長λ２光の照射タイミングおよ
び第一励起状態の分子数の一例を示した図である。

【図８】波長λ１光と波長λ２光の照射タイミングおよ
び測定タイミングの一例を示した図である。

【図９】波長λ１光と波長λ２光の照射タイミングおよ
び測定タイミングの別の一例を示した図である。

【図１０】波長λ１光と波長λ２光の照射タイミングお
よび測定タイミングの別の一例を示した図である。

【図１１】波長λ１光と波長λ２光の照射タイミングお
よび測定タイミングの別の一例を示した図である。

【図１２】高い励起状態からの分子の脱励起過程を例示
した図である。

【図１３】第一電子励起状態から第二電子励起状態に励
起する波長帯域が、第一電子励起状態から基底状態の振
動準位に蛍光過程により脱励起する際の蛍光長帯域に重
なりをもつ分子のエネルギーダイヤグラムを例示した図
である。

【図１４】ローダミン６Ｇの分子構造式および光学的性
質としての各断面積と波長との関係を例示した図であ
る。

【図１５】ベッセルビームを表現するための座標系を例
示した図である。

【図１６】ベッセルビームのビーム面の位相分布を例示
した図である。

【図１７】一次ベッセルビームの２次元強度分布を例示
した図である。

【図１８】位相板がイレース光の集光ビームに与える位
相分布の一例を示した図である。

【図１９】集光光学系の開口数の一例を示した図であ
る。

【図２０】実施例１のこの発明の顕微鏡システムの顕微
鏡本体におけるイレース光集光ビーム強度および蛍光強
度の一例を示した図である。

【図２１】光軸周りに不連続に変化する屈折率分布を持
つ位相板を例示した概念図である。

【図２２】光軸周りを四分割して不連続に変化する屈折
率分布を持つ位相板において、位相板がイレース光に与
える位相分布を例示した概念図である。

【図２３】（ａ）（ｂ）は、各々、位相板の構造と光学
パラメータを例示した平面図および側面図である。

【図２４】実施例２のこの発明の顕微鏡システムの顕微
鏡本体におけるイレース光集光ビーム強度および蛍光強
度の一例を示した図である。

【図２５】実施例３のこの発明の顕微鏡システムの顕微
鏡本体におけるイレース光集光ビーム強度および蛍光強
度の一例を示した図である。

【図２６】この発明の顕微鏡システムの一例を示した要
部構成図である。

【図２７】環状輪帯スリットと通常のガラスレンズとが
組み合わされてなる輪帯光学系の一例を示した図であ
る。

【図２８】輪帯光学系の一例である反射型対物レンズを
例示した図である。

【図２９】輪帯光学系の一例であるＷａｌｔｅｒ型レン
ズを例示した図である。

【図３０】（ａ）（ｂ）は、各々、回折光学系の一例で
ある透過型および反射型のフレネルゾーンプレートを例
示した図である。

【図３１】同心円上に溝をもつ透過型回折格子を例示し
た図である。

【図３２】アキシコン光学系の一例を示した図である。

【図３３】この発明の顕微鏡システムの他の一例を示し
た要部構成図である。

【図３４】この発明の顕微鏡システムの他の一例を示し
た要部構成図である。

【図３５】一次ベッセルビームを直接発振できるレーザ
ー共振器の一例を示した要部構成図である。

【図３６】Ｎｄ：ＹＡＧレーザーが図３５に例示したレ
ーザー共振器を持つ場合の、この発明の顕微鏡システム
の一例を示した要部構成図である。

【図３７】（ａ）（ｂ）（ｃ）（ｄ）は、各々、ｎ＝
０，ｎ＝１，ｎ＝２，ｎ＝３の高次ビームに関する振幅
分布と強度分布とを例示した図である。

【図３８】各種フィルターの波長特性と検出光波長特性
の関係を例示した図である。

【図３９】フィルター光学系が備えられているこの発明
の顕微鏡システムの一例を示した要部構成図である。

【図４０】図３４のこの発明の顕微鏡システムに対応す
る電気系システムの一例を示した要部構成図である。

【符号の説明】

１ Ｎｄ：ＹＡＧレーザー ２ ＢＢＯ結晶 ３ ハーフミラー ４ ラマンシフター ５ ミラー ６ 位相板 ７ ダイクロックミラー ８ ダイクロックミラー ９ 集光対物レンズ １０ 二次元移動ステージ １００ 調整された試料 １１ 蛍光集光レンズ １２ シャープカットフィルター １３ ピンホール １４，１５ フォトマル １６ 輪帯スリット １７ ガラスレンズ １８ 三倍波発生器 １９ 二倍波発生器 ２０，２４ ダイクロックミラー ２１ 偏光子 ２２ コンデンサーレンズ ２３ ピンホール ２５ 対物レンズ ２６ ピンホール ２７ シャープカットフィルター ２８ ハーフミラー ２９，３０ ミラー ３１ 水銀ランプ ３２，３３ Ｎｄ：ＹＡＧレーザー ３５，３６ ＫＴＰ結晶 ３７，３８，ハーフミラー ３９ ラマンシフター ４０，４１ ダイクロックミラー ４２ リレーレンズ ４３，４４，４５ ハーフミラー ４６，４８ レンズ ４７ ピンホール ４９ スペクトルメーター ５０ ＣＣＤカメラ結像レンズ ５１ ＣＣＤカメラ ５２ 輪帯ミラー ５３ レンズ ５４ 位相板 ５５ 出力ミラー ５６ Ｎｄ：ＹＡＧレーザー ５７ ＫＴＰ結晶 ５８ ノッチフィルター ５９ バンドパスフィルター ６０ シャープカットフィルター ６１ ピンホール ６２ 遮光ボックス ６３ カバーガラス ６４ 対物レンズ ６５ コンデンサーレンズ ６６ パーソナルコンピュータ ６７ 分周器 ６８ ゲート＆ディレイジェネレータ ６９ ＣＣＤアレー ７０ 回折格子 ７１ ＣＣＤカメラ ７２ フレームメモリー ７３ ＣＲＴ ７４ ビデオプリンター

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平８−184552（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−248200（ＪＰ，Ａ) 特開 平10−142151（ＪＰ，Ａ) 特開 平11−95120（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−265698（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−265699（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G02B 21/06 G02B 21/00

Claims (51)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 調整された試料と顕微鏡本体とを備えた
   顕微鏡システムであって、 調整された試料は、少なくとも基底状態を含め３つの電
   子状態を有し、その第一電子励起状態から第二電子励起
   状態への励起波長帯域が、第一電子励起状態から基底状
   態の振動準位に蛍光過程により脱励起する際の蛍光波長
   帯域と重複している分子により染色されたものであっ
   て、 顕微鏡本体は、 分子を基底状態から第一電子励起状態へ励起させる波長
   λ１光の光源と、 第一電子励起状態の分子を第二電子励起状態またはより
   高い電子励起状態へ励起させるとともに、調整された試
   料の第一電子励起状態から基底状態の高位の振動準位に
   蛍光過程により脱励起する際の蛍光波長領域と重複した
   波長λ２光の光源と、 波長λ１光と波長λ２光とを調整された試料上に集光さ
   せる集光光学系と、 調整された試料上における波長λ１光の照射領域の一部
   分に波長λ２光の照射領域を重ね合わせる重ね手段と、 励起された分子が基底状態へ脱励起する際の発光を検出
   する発光検出器とを備え、 重ね手段を介して波長λ１光と波長λ２光とを照射する
   ことにより、分子が第一電子励起状態から基底状態へ脱
   励起する際の発光の領域を抑制するものであることを特
   徴とする光学顕微鏡システム。
2. 【請求項２】 調整された試料と顕微鏡本体とを備えた
   顕微鏡システムであって、 調整された試料は、少なくとも基底状態を含め３つの電
   子状態を有する分子により染色されたものであり、 顕微鏡本体は、 分子を基底状態から第一電子励起状態へ励起させる波長
   λ１光の光源と、 第一電子励起状態の分子を第二電子励起状態またはより
   高い電子励起状態へ励起させる波長λ２光の光源と、 波長λ１光と波長λ２光とを調整された試料上に集光さ
   せる集光光学系と、 調整された試料上における波長λ１光の照射領域および
   波長λ２光の照射領域を一部分重ね合わせる重ね手段
   と、 励起された分子が基底状態へ脱励起する際の発光を検出
   する発光検出器とを備え、 重ね手段を介して波長λ１光と波長λ２光とを照射する
   ことにより、分子が第一電子励起状態から基底状態へ脱
   励起する際の発光の領域を抑制するものであり、 波長λ２光を集光して得られるビームが、その光軸と直
   交する面内で、光軸に関する対称位置においてπだけ位
   相がずれた位相分布を有していることを特徴とする顕微
   鏡システム。
3. 【請求項３】 調整された試料と顕微鏡本体とを備えた
   顕微鏡システムであって、 調整された試料は、少なくとも基底状態を含め３つの電
   子状態を有し、その第一電子励起状態から第二電子励起
   状態への励起波長帯域が、第一電子励起状態から基底状
   態の振動準位に蛍光過程により脱励起する際の蛍光波長
   帯域に重複している分子により染色されたものであり、 顕微鏡本体は、 分子を基底状態から第一電子励起状態へ励起させる波長
   λ１光の光源と、 第一電子励起状態の分子を第二電子励起状態またはより
   高い電子励起状態へ励起させる波長λ２光の光源と、 波長λ１光と波長λ２光とを調整された試料上に集光さ
   せる集光光学系と、 調整された試料上における波長λ１光の照射領域および
   波長λ２光の照射領域を一部分重ね合わせる重ね手段
   と、 励起された分子が基底状態へ脱励起する際の発光を検出
   する発光検出器とを備え、 重ね手段を介して波長λ１光と波長λ２光とを照射する
   ことにより、分子が第一電子励起状態から基底状態へ脱
   励起する際の発光の領域を抑制するものであり、 波長λ２光を集光して得られるビームが、その光軸と直
   交する面内で、光軸に関する対称位置においてπだけ位
   相がずれる位相分布を有していることを特徴とする顕微
   鏡システム。
4. 【請求項４】 第一電子励起状態から第二電子励起状態
   への励起波長帯域と基底状態から第一電子励起状態への
   励起波長帯域とが異なる請求項１ないし３のいずれかの
   顕微鏡システム。
5. 【請求項５】 分子が、六員環を一つまたは複数含む分
   子である請求項１ないし４のいずれかの顕微鏡システ
   ム。
6. 【請求項６】 六員環が、ベンゼン環またはプリン塩基
   である請求項５の顕微鏡システム
7. 【請求項７】 分子が、六員環誘導体を一つまたは複数
   含む分子である請求項１ないし４のいずれかの顕微鏡シ
   ステム。
8. 【請求項８】 六員環誘導体が、ベンゼン誘導体または
   プリン誘導体である請求項７の顕微鏡システム。
9. 【請求項９】 分子が、キサンチン系分子、ローダミン
   系分子、オキサンジン系分子、シアニン系分子、クマリ
   ン系分子、オキサーゾール系分子、オキサジアゾール系
   分子、スチルペン系分子のいずれかである請求項５ない
   し８のいずれかの顕微鏡システム。
10. 【請求項１０】 分子が、以下の分子のいずれかである
    請求項９の顕微鏡システム。2,2''-Dimethyl-p-terphen
    yl: P-terphenyl(PTP): 3,3',2'',3'''-Tetramethyl-P-
    quaterphenyl: 2,2'''-Dimethyl-P-quaterphenyl: 2-Me
    thyl-5-t-butyl-p-quaterphenyl: 2-(4-Biphenylyl)-5-
    (4-t-butylphenyl)-1,3,4-oxiazol(BPBD-365):2-(4-Bip
    henylyl)-phenyl-1,3,4-oxadiazol: 2,5,2'''',5''''-T
    etramethyl-p-quinquephenyl: 3,5,3'''',5''''-Tetra-
    t-butyl-p-quinquephenyl: 2,5-Diphenyloxazol: 2,5-
    Diphenylfuran: PQP(p-Quanterphenyl): 2,5-Bis-(4-bi
    phenylyl)-1,3,4-oxadiazol: p-Quaterphenyl-4,4'''-d
    isulfonicacid Disodiumsalt: p-Quaterphenyl-4,4'''-
    disulfonicacid Dipotassiumsalt: 4,4'''-Bis-(2-buty
    loctyloxy)-p-quanterphenyl: 3,5,3'''',5''''-Tetra-
    butyl-p-sexiphenyl: 2-(1-Naphthyl)-5-phenyloxazol:
    2-(4-Biphenylyl)-6-phenylbenzoxazotetrasulfonicac
    id Potassium Salt: 2-(4-Biphenylyl)-6-phenylbenzox
    azol-1,3: 4,4'-Diphenylstilbene: [1,1'-Biphenyl]-4
    -sulfonic acid,4,4''-1,2-ethene-diylbis-,dipotassi
    um salt: 2,5-Bis-(4-biphenylyl)-oxazol: 2,2'-([1,
    1'-Biphenyl]-4,4'-diyldi-2,1-ethenediyl)-bis-benze
    nesulfonic acid Disodium Salt: 7-Amino-4-methylcar
    bostyryl: 1,4-Di[2-(5-phenyloxazoly)]benzene;7-Hyd
    roxy-4-methylcoumarin: p-Bis(o-methylstyryl)-benze
    ne: Benzofuran,2,2'-[1,1'-biphenyl]-4,4'-diyl-bis-
    tetrasulfonic-acid: 7-Dimethylamino-4-methylquinol
    om-2: 7-Amino-4-methylcoumarin: 2-(p-Dimethylamino
    styryl)-pyridylmethylIodide: 7-Diethylaminocoumaru
    n: 7-Diethylamino-4-methylcoumarin: 2,3,5,6-1H,4H-
    Tetrahydro-8-methylqinolizino-[9,9a,1-gh]-coumari
    n: 7-Diethylamino-4-trifluormethylcoumarin: 7-Dime
    thylamino-4-trifluormethylcoumarin: 7-Amino-4-trif
    luormethylcoumarin: 2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydroquinol
    izino-[9,9a,1-gh]-coumarin: 7-Ethylamino-6-methyl-
    4-trifluormethylcoumarin: 7-Ethylamino-4-trifluorm
    ethylcoumarin: 2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-9-carboeth
    oxyquinolizino-[9,9a,1-gh]coumarin: 2,3,5,6-1H,4H-
    Tetrahydro-9-(3-pyridyl)-quinolizino-[9,9a,1-gh]co
    umarin: 3-(2'-N-Methylbenzimidazolyl)-7-N,N-diethy
    laminocoumarin: 2,3,5,6,-1H,4H-Tetrahydro-9-acetyl
    quinolizino-[9,9a,1-gh]coumarin: N-Metyl-4-trifluo
    rmethylpiperidino-[3,2-g]-coumarin: 2-(p-Dimethyla
    minostyryl)-benzothiazolylethyl Iodide: 3-(2'-Benz
    imidazolyl)-7-N,N-diethylaminocoumarin: Brillants
    ulfaflavin: 3-(2'-Benzothiazolyl)-7-diethytaminoco
    umarin: 2,3,5,6-1H,4H-Tetrahydro-8-trifluormethylq
    uinolizino-[9,9a,1-gh]coumarin: 3,3'-Diethyloxacar
    bocyanine Iodide: 3,3'-Dimethyl-9-ethylthiacarbocy
    anine Iodide: Disodium Fluorescein(Uranin): 9-(o-
    Carboxyphenyl)-2,7-dichloro-6-hydroxy-3H-xanthen-3
    -on2,7-Dichlorofluorescien・Fluorescein 548: Fluor
    ol 555(Fluorol 7GA): o-(6-Amino-3-imino-3H-xanthen
    -9-yl)-benzonic acid(Rhodamine 560): Benzoic Acid,
    2-[6-(ethylamino)-3-(ethylimino)-2,7-dimethyl-3H-x
    anthen9-yl],perchlorate(Rhodamine 575):Benzonic Ac
    id,2-[6-(ethylamino)-3-(ethylimino)-2,7-dimethyl-3
    X-xanthen-9-yl],ethyl ester,monohydrochloride(Rhod
    amine 590): 1,3'-Diethyl-4,2'-quinolyloxacarbocyan
    ine Iodide: 1,1'-Diethyl-2,2'-carbocyanine Iodid:
    2-[6-(Diethylamino)-3-(ethylamino)-3H-xanthen-9-y
    l]benzonic acid(Rhodamine 610): Ethanaminium,N-[(6
    -diethylamino)-9-(2,4-disulfophenyl)-3H-xanthen-3-
    ylidene]-N-ethylhydroxid,inner salt,sodium salt: M
    alachit Green: 3,3'-Diethylthiacarbocyanine Iodid
    e: 1,3'-Diethyl-4,2'-quinolythiacarbocyanineIodid
    e: 8-(2-Carboxyphenyl)-2,3,5,6,11,12,14,15-octahyd
    ro-1H,4H,10H,13H-diquinolizino[9,9a,1-bc:9',9a',1-
    hi]xanthylium Perchlorate(Rhodamine 640): 4-Dicyan
    methylene-2-methyl-6-(p-dimethylaminostyryl)-4H-py
    ran: 3,3'-Diethyloxadicarbocyanine Iodide: 8-(2,4-
    Disulfophenyl)-2,3,5,6,11,12,14,15-octahydro-1H,4
    H,10H,13H-diquinolizino[9,9a,1-bc:9',1-hi]xanthene
    (Sulforhodamine 640): 5,9-Diaminobenzo[a]phenoxazo
    nium Percrorate: 9-Diethylamino-5H-benzo(a)phenoxa
    zin-5-one: 5-Amino-9-diethylimino[a]phenoxazoniumP
    erchlorate: 3-Ethylamino-7-ethylimino-2,8-dimethyl
    phenoxazin-5-ium Perchorate: 8-(Trifluoromethyl)-
    2,3,5,6,11,12,14,15-octahydro-1H,4H,10H,13H-diquin
    olizino[9,9a,1-bc:9',9a,1-hi]xantbylium Perchlorat
    e: 1-Ethyl-2-(4-(p-Dimethylaminophenyl)-1,3-butadi
    enyl)-pyridinium Perchlorate: Carbazine 122: 9-Eth
    ylamino-5-ethylimino-10-methyl-5H-benzo(a)phenoxaz
    onium Perchlorate: 3-Diethylamino-7-diethyliminoph
    enoxazonium Perchlorate: 3-Diethylthiadicarbocyani
    ne Iodide: Oxazine 750: 1-Ethyl-4-(4-(p-Dimethylam
    inophenyl)-1,3-butadienyl)-pyridininum Perchlorat
    e: 1,1',3,3,3',3'-Hexamethylindodicarcyanine Iodid
    e: 1,1'-Diethyl-4,4'-carbocyanine Iodide: 2-(4-(p-
    Dimethylaminophenyl)-1,3-butadienyl)-1,3,3-trimeth
    yl-3H-indolium Perchlorate: 2-(4-(p-Dimethylaminop
    henyl)-1,3-butadienyl)-3-ethylbenzothoazolium Perc
    hlorate: 1,1'-Diethyl-2,2'-dicarbocyanine Iodide:
    1-Ethyl-4-(4-(9-(2,3,6,7-tetrahydro-1H,5H-benzo(i,
    j)-chinolinozinium))-1,3-butadienyl)-pyridinium Pe
    rchlorate: 3,3'-Dimethyloxatricarbocyanine Iodide:
    1-Ethyl-4-(4-(p-Dimethylaminophenyl)-1,3-butadien
    yl)-quinolinium Perchlorate: 8-Cyano-2,3,5,6,11,1
    2,14,15-octahydro-1H,4H,10H,13H-diquinolizino[9,9a
    1-bc:9a',1-hi]xanthylium Perchlorate(Rhodamine 80
    0): 2-(6-(4-Dimethylaminophenyl)-2,4-neopentylene-
    1,3,5)-3-methylbenzothiazolium Perchlorate: 1,1',
    3,3,3',3'-Hexamethylindotricarbocyanine Iodide: IR
    125: 3,3'-Diethylthiatricarbocyanine Iodide: IR14
    4: 2-(6-(9-(2,3,6,7-Tetrahydro-1H,5H-benzo(i,j)-ch
    inolizinium))-2,4-neopentylene-1,3,5-hexatrienyl)-
    3-methyllbenzothiazolium Perchlorate: 3,3'-Diethyl
    -9,11-neopentylenethiatricarbocyanine Iodide: 1,
    1',3,3,3'3'-Hexamethyl-4,4',5,5'-dibenzo-2,2'-indo
    tricarbocyanine Iodide:3,3'-Diethyl-4,4',5,5'-dibe
    nzothiatricarbocyamine Iodide: 1,2'-Diethyl-4,4'-d
    icarbocyanine Iodide: IR140: 2-(8-(4-p-Dimethylami
    nophenyl)-2,4-neopentylene-1,3,5,7-octatetraenyl)-
    3-methylbenzothiazolium Perchlorate: IR132: 2-(8-
    (9-(2,3,6,7-Tetrahydro-1H,5H,benzo(i,j)chinolizini
    um))-2,4-neopentylene-1,3,5,7-octatetraenyl)-3-met
    hylbenzothiazolium Perchlorate: IR26: IR5
11. 【請求項１１】 波長λ１光を集光して得られるビーム
    の光軸と波長λ２光を集光して得られるビームの光軸と
    が同軸である請求項１ないし１０のいずれかの顕微鏡シ
    ステム。
12. 【請求項１２】 波長λ２光を集光して得られるビーム
    が、その光軸と直交する面内において、光軸の周りを１
    回転したときに０から２πまで連続的に変化する位相分
    布を有している請求項１ないし１１のいずれかの顕微鏡
    システム。
13. 【請求項１３】 波長λ２光を集光して得られるビーム
    が、その光軸と直交する面内において、該光軸の周りを
    １回転したときに０から２πまで不連続的に変化する位
    相分布を有している請求項１ないし１１のいずれかの顕
    微鏡システム。
14. 【請求項１４】 波長λ２光を集光して得られるビーム
    が、ベッセルビームである請求項１ないし１３のいずれ
    かの顕微鏡システム。
15. 【請求項１５】 ベッセルビームが、一次のベッセルビ
    ームである請求項１４の顕微鏡システム。
16. 【請求項１６】 波長λ２光を集光して得られるビーム
    が、ガウス型、ラゲール型またはエルミート型のいずれ
    かの発振モードを持つレーザービームである請求項１な
    いし１３のいずれかの顕微鏡システム。
17. 【請求項１７】 波長λ１光の光源として、気体レーザ
    ー、固体レーザーまたは半導体レーザーのいずれかが備
    えられている請求項１ないし１６のいずれかの顕微鏡シ
    ステム。
18. 【請求項１８】 気体レーザー、固体レーザーまたは半
    導体レーザーのいずれかの発振波長が、波長λ１である
    請求項１７の顕微鏡システム。
19. 【請求項１９】 気体レーザー、固体レーザーまたは半
    導体レーザーのいずれかの発振波長の高調波が、波長λ
    １である請求項１７の顕微鏡システム。
20. 【請求項２０】 気体レーザー、固体レーザーまたは半
    導体レーザーのいずれかの発振波長とその高調波との和
    周波または差周波が、波長λ１である請求項１７の顕微
    鏡システム。
21. 【請求項２１】 波長λ２光の光源として、気体レーザ
    ー、固体レーザーまたは半導体レーザーのいずれかが備
    えられている請求項１ないし２０のいずれかの顕微鏡シ
    ステム。
22. 【請求項２２】 気体レーザー、固体レーザーまたは半
    導体レーザーのいずれかの発振波長が、波長λ２である
    請求項２１の顕微鏡システム。
23. 【請求項２３】 気体レーザー、固体レーザーまたは半
    導体レーザーのいずれかの発振波長の高調波が、波長λ
    ２である請求項２１の顕微鏡システム。
24. 【請求項２４】 気体レーザー、固体レーザーまたは半
    導体レーザーのいずれかの発振波長とその高調波との和
    周波または差周波が、波長λ２である請求項２１の顕微
    鏡システム。
25. 【請求項２５】 気体レーザーが、エキシマレーザー、
    銅蒸気レーザー、アルゴンレーザー、Ｈｅ−Ｎｅレーザ
    ー、ＣＯ₂ レーザー、Ｈｅ−Ｃｄレーザーまたは窒素レ
    ーザーのいずれかである請求項１７ないし２４のいずれ
    かの顕微鏡システム。
26. 【請求項２６】 気体レーザーが、モードロック型であ
    る請求項２５の顕微鏡システム。
27. 【請求項２７】 固体レーザーが、Ｎｄ：ＹＡＧレーザ
    ー、Ｔｉサファイヤレーザー、ＹＬＦレーザーまたはル
    ビーレーザーのいずれかである請求項１７ないし２４の
    いずれかの顕微鏡システム。
28. 【請求項２８】 固体レーザーが、半導体レーザー励起
    型である請求項２７の顕微鏡システム。
29. 【請求項２９】 固体レーザーが、モードロック型であ
    る請求項２７または２８の顕微鏡システム。
30. 【請求項３０】 顕微鏡本体が、気体レーザー、固体レ
    ーザーまたは半導体レーザーからのレーザー光の波長変
    換を行うための非線形媒質または波長変調素子を、一つ
    または複数有している請求項１７ないし２９のいずれか
    の顕微鏡システム。
31. 【請求項３１】 非線形媒質または波長変調素子が、非
    線形結晶である請求項３０の顕微鏡システム。
32. 【請求項３２】 非線形媒質または波長変調素子が、ラ
    マンシフターである請求項３０または３１の顕微鏡シス
    テム。
33. 【請求項３３】 波長λ１光が、気体レーザーまたは固
    定レーザーの基本波を非線形媒質または波長変調素子で
    波長変調したものである請求項３０ないし３２のいずれ
    かの顕微鏡システム。
34. 【請求項３４】 波長λ１光が、気体レーザーまたは固
    定レーザーの高調波を非線形媒質または波長変調素子で
    波長変調したものである請求項３０ないし３２のいずれ
    かの顕微鏡システム。
35. 【請求項３５】 波長λ２光が、気体レーザーまたは固
    体レーザーの基本波を非線形媒質または波長変調素子で
    波長変調したものである請求項３０ないし３４のいずれ
    かの顕微鏡システム。
36. 【請求項３６】 波長λ２光が、気体レーザーまたは固
    体レーザーの高調波を非線形媒質または波長変調素子で
    波長変調したものである請求項３０ないし３４のいずれ
    かの顕微鏡システム。
37. 【請求項３７】 波長λ２光の集光光学系が、波長λ２
    光を集光して得られるビームにその光軸に対して直交す
    る平面内で位相差分布を与える屈折率分布または光路差
    分布を有する位相板を備えている請求項１ないし３６の
    いずれかの顕微鏡システム。
38. 【請求項３８】 波長λ２光の集光光学系が、輪帯光学
    系を備えている請求項１ないし３７のいずれかの顕微鏡
    システム。
39. 【請求項３９】 波長λ２光の集光光学系が、回折光学
    系を備えている請求項１ないし３７のいずれかの顕微鏡
    システム。
40. 【請求項４０】 波長λ２光の集光光学系が、アキシコ
    ンを備えている請求項１ないし３７のいずれかの顕微鏡
    システム。
41. 【請求項４１】 気体レーザー、固体レーザーまたは半
    導体レーザーの共振器内に、リング状の輪帯ミラー、輪
    帯回折格子、フレネルゾーンプレート、輪帯アパーチャ
    ー、または光軸と直交する面内の電場に関して軸対称に
    ある電場の互いにπだけずれた位相差を与える位相板の
    いずれかが、少なくとも一つ備えられている請求項１７
    ないし３６のいずれかの顕微鏡システム。
42. 【請求項４２】 顕微鏡本体が、分子からの発光を発光
    検出器に集光する発光集光光学系を有している請求項１
    ないし４１のいずれかの顕微鏡システム。
43. 【請求項４３】 発光集光光学系が、シャープカットフ
    ィルタを備えている請求項４２の顕微鏡システム。
44. 【請求項４４】 発光集光光学系が、ノッチフィルター
    を備えている請求項４２の顕微鏡システム。
45. 【請求項４５】 発光集光光学系が、パンドパスフィル
    ターを備えている請求項４２の顕微鏡システム。
46. 【請求項４６】 パンドパスフィルターが、波長λ１光
    および波長λ２光を透過させず、分子からの発光を透過
    させるものである請求項４５の顕微鏡システム。
47. 【請求項４７】 調整された試料が、波長λ１光および
    波長λ２光が透過する物質からなる封入手段により封入
    されている請求項１ないし４６のいずれかの顕微鏡シス
    テム。
48. 【請求項４８】 調整された試料が、波長λ１光および
    波長λ２光が透過する物質からなるカバー手段によりカ
    バーされている請求項１ないし４６のいずれかの顕微鏡
    システム。
49. 【請求項４９】 前記物質が、合成石英ＳｉＯ₂ 、Ｃａ
    Ｆ₂ 、ＮａＦ、Ｎａ₃ＡｌＦ₆ 、ＬｉＦ、ＭｇＦ₂ 、Ｓ
    ｉＯ₂ 、ＬａＦ₃ 、ＮｄＦ₃ 、Ａｌ₂ Ｏ₃ 、ＣｅＦ₃ 、
    ＰｂＦ₂ 、ＭｇＯ、ＴｂＯ₂ 、ＳｎＯ₂ 、Ｌａ₂ Ｏ₃ 、
    またはＳｉＯである請求項４７または４８の顕微鏡シス
    テム。
50. 【請求項５０】 顕微鏡本体は、波長λ１光と波長λ２
    光の光源とは別に、連続発振レーザーを備えており、こ
    の連続発振レーザーを調整された試料上に集光して得ら
    れるビームが、その光軸と直交する面内で、光軸に関す
    る対称位置においてπだけ位相がずれる位相分布を有し
    ている請求項１ないし４９のいずれかの顕微鏡システ
    ム。
51. 【請求項５１】 顕微鏡本体は、連続発振レーザーを調
    整された試料上に集光して得られるビームを、波長λ１
    光を集光して得られるビームおよび波長λ２光を集光し
    て得られるビームとは独立して、調整された試料上を相
    対的に走査するための手段を有している請求項５０のい
    ずれかの顕微鏡システム。