JP4883936B2 - 走査型サイトメータの画像処理方法及び装置 - Google Patents
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Description
第1に、標本内の細胞核101及び細胞質領域102を含んだ細胞そのものの大きさは必ずしも一定ではなく、形状も様々である。このため、オペレータによる閾値や、「近傍」を決定する「膨張」の画素数などを一律に決めることができない。第2に、励起ビームは細胞の厚み方向に対する励起効果も考慮して、ビームウエストが急激に細くなる(NAが大きい)ような状態を避けるためにNAを小さくして、試料上のスポット径が細胞又は細胞核と同程度の大きさにすることが望ましい。しかし、このようにすると、実際の細胞走査で得られた画像の1画素あたりの蛍光強度は、励起光スポット内の全ての構造物から発せられた蛍光量ということになり、上述した方法では除去しきれないいくつかの誤差原因を含む。そして、第3に、近接して細胞質領域が重なっている2個の細胞と、分裂後期にある2核細胞などとの区別について上述した方法では考慮が払われていない。
図1は、本発明の画像処理方法が適用される走査型サイトメータ(LSC)の概略構成を示している。
図1において、1はレーザ光源で、このレーザ光源1から発せられるレーザ光の光路上には、集光レンズ2、コリメータレンズ3、可変光束絞り4及びダイクロイックミラー5が配置されている。集光レンズ2は、レーザ光源1から発せられるレーザ光を集光し、コリメータレンズ3は、集光されたレーザ光を平行光に変換する。可変光束絞り4は、所定形状の複数の孔を有するもので、コリメータレンズ3により平行光に変換されたレーザ光の光束径を所定の光束径に絞り込み、収束されるレーザ光の実効的開口数(NA)を小さくし、励起光のスポット径を最値化する。ダイクロイックミラー5は、コリメータレンズ3からの平行光を反射し、後述する標本10上で励起された蛍光を透過するような特性を有している。
いま、図2に示すように細胞200の構成部として、注目領域を細胞核201、その外側の注目領域外を細胞質202とすると、細胞核201についてDAPI/DNAやPIなどの蛍光物質を用いて蛍光標識を施した場合、細胞核201において高強度の蛍光を発するが、細胞質内物質や核蛍光の細胞質内構造物による散乱等の影響により、注目領域外の細胞質202においても比較的低輝度の蛍光が発生することが知られている。
次に、細胞核領域401A、402Aに対し、他の細胞の細胞質領域403A2、403A1が一部重なっているような場倉のバックグラウンド補正では、図6(b)に示すように、これらの重なり部分である細胞核重畳領域404の輝度値修正は、細胞質領域403A1、403A2が重なっている細胞質重畳領域405の輝度値を元に滅算を行うようにする。細胞質重畳領域405の境界と、細胞核重畳領域404の境界を決めるには、細胞質領域403A1、403A2、細胞核領域401A、402Aの全画素の中で、蛍光輝度がそれぞれの領域の基準値に対して、あらかじめ決められた値(+α)以上の画素を選択し、その画素集団が、細胞質又は細胞核の領域閉曲線と連続性が保たれるように再構築するなどのアルゴリズムを用いることができる。前記基準値と+αの値は、オペレータによって入力されるようにしても良いし、複数個の単離細胞から統計的に決定するようにしても良い。
3…コリメータレンズ、5…ダイクロイックミラー
6…XYスキャナミラー、7…瞳投影レンズ
8…対物レンズ、9…XYステージ
10…標本、
12…ダイクロイックミラー、14a…バリアフィルタ
14b…バリアフィルタ、16…制御部
16a…画像処理機能、16b…輝度情報取得機能
16c…画像修正処理機能、18…表示部
200…細胞、201…細胞核、201A…細胞核領域
201B…細胞質領域、202…細胞質
202A…細胞質領域、203…バックグラウンド算定用閉曲線
301…励起光スポット、302…走査線
401A.402A…細胞核領域、403A…細胞質領域
403A1.403A2…細胞質領域、404…細胞核重畳領域
405…細胞質重畳領域
Claims (4)
- 蛍光標識された細胞集団をスライドグラス上に固定した標本を、前記細胞の構成部の注目領域の大きさと同程度の径を有する励起光スポットにより二次元走査し、前記細胞集団の特性を統計的手段で特徴付ける走査型サイトメータにおいて、
前記二次元走査により取得した画像の各画素の輝度値に対して前記励起光スポットの強度分布を用いてデコンボリューションを実行するステップと、
前記デコンボリューションを実行することにより前記細胞の構成部の注目領域内外の修正された輝度値を得るステップと、
前記細胞の構成部の注目領域外の細胞構成部内にある複数の画素の前記デコンボリューションによって修正された前記輝度値から、前記注目領域内外双方の相互干渉から生じるバックグラウンドの補正のための輝度値を計算するステップと、
前記バックグラウンドの補正のための輝度値を前記細胞構成部の注目領域内の各画素の前記デコンボリューションによって修正された前記輝度値から減算するステップと、
を有することを特徴とする走査型サイトメータの画像処理方法。 - 前記細胞は、少なくとも2個あって、一方の細胞の注目領域の細胞構成部に、他の細胞の注目領域外の細胞構成部が重畳している場合、前記一方の細胞の注目領域外の細胞構成部と前記他の細胞の注目領域外の細胞構成部の重畳都分の輝度データから前記バックグラウンド補正のための輝度値を算出することを特徴とする請求項1記載の走査型サイトメータの画像処理方法。
- 前記バックグラウンド補正のための輝度値は、1以下の係数がかけられていることを特徴とする請求項1又は2のいずれかに記載の走査型サイトメータの画像処理方法。
- 蛍光標識された細胞集団をスライドグラス上に固定した標本を、前記細胞の構成部の注目領域の大きさと同程度の径を有する励起光スポットにより二次元走査し、前記細胞集団の特性を統計的手段で特徴付ける走査型サイトメータにおいて、
前記二次元走査により取得した画像の各画素の輝度値に対して前記励起光スポットの強度分布を用いてデコンボリューションを実行する手段と、
前記デコンボリューションを実行することにより前記細胞の構成部の注目領域内外の修正された輝度値を得る手段と、
前記細胞の構成部の注目領域外の細胞構成部内にある複数の画素の前記デコンボリューションによって修正された前記輝度値から、前記注目領域内外双方の相互干渉から生じるバックグラウンドの補正のための輝度値を計算する手段と、
前記バックグラウンドの補正のための輝度値を前記細胞構成部の注目領域内の各画素の前記デコンボリューションによって修正された前記輝度値から減算する手段と、
を備えたことを特徴とする画像処理装置。
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