JP5139885B2 - 蛍光解析装置及び解析方法 - Google Patents

Description

本発明は、測定試料中の蛍光プローブから発生する蛍光を検出して、測定試料についての解析を行う蛍光解析装置、及び蛍光解析方法に関するものである。

蛍光相関分光法（ＦＣＳ: Fluorescence Correlation Spectroscopy）は、極低濃度の蛍光物質が存在する測定試料溶液中の微小領域に励起光を照射して測定領域とし、測定領域内で発生した蛍光の強度を時系列的に測定して自己相関関数を求めることで、試料中での蛍光物質の並進拡散運動等の情報を得るものである（例えば特許文献１〜３参照）。このような蛍光解析法は、例えば臨床診断における免疫分析に適用可能である。
特開２００７−２０５６５号公報 特開２００７−３１６０１７号公報 特開２００６−１７６２８号公報

上記した蛍光解析では、蛍光物質によって標識された分子プローブ（蛍光プローブ）を測定試料に加え、測定領域内にある蛍光プローブからの蛍光を検出するとともに、その自己相関関数から並進拡散運動等についての情報を取得する。これにより、分析対象となる試料中の標的分子と、蛍光プローブとの反応量を知ることができ、測定試料についての情報を取得することができる。このような試料解析方法は、ホモジニアス・アッセイにおける非分離型の計測方法であるため、ＥＬＩＳＡ法などのヘテロジニアス・アッセイに比べて、消耗品類の消費を少なくしてランニングコストを低減することが可能である。また、解析装置の小型化、低価格化も可能である。

一方、ＦＣＳなどの手法を用いた蛍光解析において、その測定感度や効率等のさらなる向上が求められている。そのような方法の１つとして、標的分子に対して複数個の蛍光プローブを凝集するように結合させ、それらの蛍光プローブからの蛍光を検出する蛍光解析方法が提案されている（例えば特許文献１、２参照）。しかしながら、このような方法では、複数個の蛍光プローブが結合した標的分子からの蛍光検出イベントと、それ以外のノイズイベントとの識別が難しいという問題がある。

本発明は、以上の問題点を解決するためになされたものであり、測定領域内にある蛍光プローブからの蛍光を測定することによる測定試料の蛍光解析を好適に実行することが可能な蛍光解析装置、及び蛍光解析方法を提供することを目的とする。

このような目的を達成するために、本発明による蛍光解析装置は、（１）測定試料に対して設定された測定領域に励起光を照射する励起光照射手段と、（２）励起光照射手段によって励起光が照射された測定試料の測定領域内にある蛍光プローブから発生する蛍光を２つの蛍光成分に分岐する光分岐手段と、（３）分岐された一方の第１蛍光成分を検出する第１蛍光検出手段と、（４）分岐された他方の第２蛍光成分を検出する第２蛍光検出手段と、（５）第１蛍光検出手段及び第２蛍光検出手段でそれぞれ検出された光子数を所定の計数時間幅で時系列的に計数して、第１光子数測定データＦ_Ａ（ｔ）及び第２光子数測定データＦ_Ｂ（ｔ）を取得する光子計数手段と、（６）第１光子数測定データＦ_Ａ（ｔ）及び第２光子数測定データＦ_Ｂ（ｔ）に基づいて、測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）の少なくとも一方が０の場合に
ｎ_ＡＢ（ｔ）＝０
となり、測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）の両者が０でない場合に、相乗平均、相加平均、または調和平均のいずれかとなる関数ｆで
ｎ_ＡＢ（ｔ）＝ｆ（Ｆ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ））
となる光子数解析データｎ_ＡＢ（ｔ）を生成する解析データ生成手段と、（７）解析データ生成手段によって生成された光子数解析データｎ_ＡＢ（ｔ）に対し、蛍光プローブを含む測定試料の測定結果についての蛍光解析を行う測定結果解析手段とを備え、測定結果解析手段は、光子数解析データｎ _ＡＢ （ｔ）を、測定試料中での蛍光プローブの濃度に応じて設定されたビン時間幅でビニングし、ビニングされた解析データに対して蛍光解析を行うことを特徴とする。

また、本発明による蛍光解析方法は、（１）測定試料に対して設定された測定領域に励起光を照射する励起光照射ステップと、（２）励起光照射ステップで励起光が照射された測定試料の測定領域内にある蛍光プローブから発生する蛍光を２つの蛍光成分に分岐する光分岐ステップと、（３）分岐された一方の第１蛍光成分を検出する第１蛍光検出ステップと、（４）分岐された他方の第２蛍光成分を検出する第２蛍光検出ステップと、（５）第１蛍光検出ステップ及び第２蛍光検出ステップでそれぞれ検出された光子数を所定の計数時間幅で時系列的に計数して、第１光子数測定データＦ_Ａ（ｔ）及び第２光子数測定データＦ_Ｂ（ｔ）を取得する光子計数ステップと、（６）第１光子数測定データＦ_Ａ（ｔ）及び第２光子数測定データＦ_Ｂ（ｔ）に基づいて、測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）の少なくとも一方が０の場合に
ｎ_ＡＢ（ｔ）＝０
となり、測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）の両者が０でない場合に、相乗平均、相加平均、または調和平均のいずれかとなる関数ｆで
ｎ_ＡＢ（ｔ）＝ｆ（Ｆ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ））
となる光子数解析データｎ_ＡＢ（ｔ）を生成する解析データ生成ステップと、（７）解析データ生成ステップにおいて生成された光子数解析データｎ_ＡＢ（ｔ）に対し、蛍光プローブを含む測定試料の測定結果についての蛍光解析を行う測定結果解析ステップとを備え、測定結果解析ステップにおいて、光子数解析データｎ _ＡＢ （ｔ）を、測定試料中での蛍光プローブの濃度に応じて設定されたビン時間幅でビニングし、ビニングされた解析データに対して蛍光解析を行うことを特徴とする。

上記した蛍光解析装置、及び蛍光解析方法においては、励起光照射系及び蛍光検出系によって測定試料中に微小な測定領域を設定する。また、測定領域内の蛍光プローブで発生する蛍光に対して光分岐手段を設けるとともに、蛍光検出系として第１、第２蛍光検出手段を設置して第１、第２光子数測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）を取得する。そして、それらの測定データを直接に蛍光解析に用いるのではなく、Ｆ_Ａ（ｔ）・Ｆ_Ｂ（ｔ）＝０のときに０となる解析データｎ_ＡＢ（ｔ）を生成して蛍光解析を行っている。

このような構成では、光子数測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）に代えて光子数解析データｎ_ＡＢ（ｔ）を用いることにより、第１、第２蛍光検出手段での蛍光検出の同時性を考慮した形で蛍光解析を実行することができる。これにより、例えば、複数個の蛍光プローブが結合した標的分子からの蛍光検出イベントと、それ以外のノイズイベントとの識別精度を向上するなど、測定試料の蛍光解析の精度を向上することが可能となる。

ここで、測定試料に対する蛍光解析に用いられる励起光、蛍光については、励起光は単一波長領域の励起光であり、第１蛍光成分及び第２蛍光成分は同一波長領域の蛍光成分である構成を用いることが可能である。このような構成は、測定試料に加える蛍光プローブとして１種類の蛍光プローブのみを用いるとともに、試料に含まれる標的分子に２個以上の同一種類の蛍光プローブが結合する場合の蛍光解析に好適に適用することができる。

光子数測定データから解析データへのデータ変換については、具体的には例えば、解析データ生成において、測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）の両者が０でない場合に、測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）の相乗平均となる関数ｆで
ｎ_ＡＢ（ｔ）＝√（Ｆ_Ａ（ｔ）・Ｆ_Ｂ（ｔ））
によって光子数解析データｎ_ＡＢ（ｔ）を生成することが好ましい。このように相乗平均を用いて解析データを求めることにより、蛍光検出の同時性が考慮された蛍光解析を好適に実行することができる。また、この方法では、測定データＦ_Ａ、Ｆ_Ｂの少なくとも一方が０の場合においても、相乗平均の上記関数√（Ｆ_Ａ・Ｆ_Ｂ）でｎ_ＡＢ＝０となる。

あるいは、解析データ生成において、測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）の両者が０でない場合に、測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）の調和平均となる関数ｆで
ｎ_ＡＢ（ｔ）＝２／｛１／Ｆ_Ａ（ｔ）＋１／Ｆ_Ｂ（ｔ）｝
によって光子数解析データｎ_ＡＢ（ｔ）を生成する構成を用いても良い。このように調和平均を用いて解析データを求めることにより、相乗平均の場合と同様に、蛍光検出の同時性が考慮された蛍光解析を好適に実行することができる。

光子数解析データを用いた蛍光解析については、具体的には、測定結果解析において、光子数解析データｎ_ＡＢ（ｔ）に対し、蛍光解析として、自己相関解析またはフォトンバースト解析の少なくとも一方を行うことが好ましい。このように、自己相関解析法、フォトンバースト解析法、あるいはそれらを組み合わせた解析法を用いることにより、測定試料の蛍光解析を精度良く実行することができる。

また、測定結果解析において、光子数解析データｎ_ＡＢ（ｔ）を所定のビン時間幅でビニングし、ビニングされた解析データに対して蛍光解析を行う構成としても良い。この場合、具体的な測定条件等に応じて解析データのビン時間幅を設定することにより、蛍光解析の精度を向上することができる。

本発明の蛍光解析装置及び解析方法によれば、試料中に設定された測定領域内にある蛍光プローブからの蛍光に対して光分岐手段を設けるとともに、第１、第２蛍光検出手段を設置して第１、第２光子数測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）を取得し、それらの測定データから少なくとも一方が０の場合にｎ_ＡＢ＝０となる解析データｎ_ＡＢ（ｔ）を生成して蛍光解析を行うことにより、２つの検出手段での蛍光検出の同時性を考慮した形で蛍光解析を実行して、測定試料の蛍光解析の精度を向上することが可能となる。

以下、図面とともに本発明による蛍光解析装置、及び蛍光解析方法の好適な実施形態について詳細に説明する。なお、図面の説明においては同一要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。また、図面の寸法比率は、説明のものと必ずしも一致していない。

図１は、本発明による蛍光解析装置の一実施形態の構成を概略的に示す図である。本実施形態による蛍光解析装置１Ａは、測定試料Ｓに対して設定された測定領域内にある蛍光プローブから発生する蛍光を検出して時系列の光子数測定データを取得し、得られた測定データに対して所定の蛍光解析を行うことで測定試料Ｓについての情報を取得するものである。以下においては、試料Ｓ中にあって測定対象となる蛍光物質（蛍光物質によって標識された分子等を含む）を「蛍光プローブ」とする。

本蛍光解析装置１Ａによる解析対象の一例としては、図２に示す標的分子（ターゲット物質）Ｔ、及び蛍光プローブＰ１、Ｐ２を含むものが挙げられる。図２の模式図は、生体分子などの標的分子Ｔに対する蛍光プローブＰの特異的結合を利用して標的分子Ｔについての情報を取得するホモジニアス・アッセイの一例を示すものである。

具体的には、図２においては、３個所の認識部位ｔ１〜ｔ３を有する標的分子Ｔを含む試料（図２（ａ））に対し、認識部位ｔ１に特異的に結合する認識部位を有する蛍光標識された分子プローブＰ１、及び認識部位ｔ２に特異的に結合する認識部位を有する蛍光標識された分子プローブＰ２（図２（ｂ））を蛍光プローブとして混合し、図２（ｃ）に示すようにそれらを反応させて、蛍光解析の対象となる溶液状の測定試料Ｓとする。

このような試料Ｓにおいて、蛍光プローブＰ１、Ｐ２が同一種類の分子プローブである場合、または蛍光プローブＰ１、Ｐ２の蛍光物質が同一種類の物質である場合、試料Ｓで発生する蛍光は単一波長領域の蛍光となる。以下においては、標的分子Ｔに対して複数個の同一種類の蛍光プローブが結合する場合を主な蛍光解析の対象として想定する。以下、本実施形態による解析装置１Ａの構成について、蛍光解析方法とともに説明する。

図１に示す蛍光解析装置１Ａは、試料ホルダ１０と、対物レンズ２０と、ダイクロイックミラー２１と、励起光源２２と、光フィルタ２３と、反射ミラー２４と、結像レンズ２５と、ピンホール２６と、コリメートレンズ２７と、ビームスプリッタ３０と、光検出器３１、３２とを備えており、これらの各要素が本蛍光解析装置１Ａにおける蛍光顕微鏡部を構成している。また、この蛍光顕微鏡部の各要素に加えて、本蛍光解析装置１Ａは、検出信号処理部３３、３４と、光子計数部３５と、測定制御部５０とを備えている。

試料ホルダ１０は、蛍光測定及び解析の対象となる蛍光プローブを含む測定試料Ｓを保持する試料保持手段であり、その底面がスライドグラスとして機能する容器によって構成されている。また、この試料ホルダ１０に対し、所定位置に対物レンズ２０が設置されている。対物レンズ２０としては、例えば水浸（液浸）系の対物レンズを好適に用いることができる。また、このような対物レンズ２０に対し、試料ホルダ１０は、その形状が対物レンズ２０の作動距離に対応するように構成されている。

図１に示す構成では、対物レンズ２０、ダイクロイックミラー２１、及び励起光源２２によって、測定試料Ｓの測定領域に励起光を照射する励起光照射手段が構成されている。励起光源２２としては、例えばレーザ光源を好適に用いることができる。励起光源２２から供給された励起レーザ光は、ダイクロイックミラー２１によって反射され、対物レンズ２０を介して集光されつつ、試料ホルダ１０内の測定試料Ｓへとビームスポットとして照射される（励起光照射ステップ）。励起光源２２の例としては、波長４７３ｎｍ、５３２ｎｍ、または６３５ｎｍのレーザ光を供給するレーザ光源を用いることができる。

また、図１に示す構成では、対物レンズ２０、光フィルタ２３、反射ミラー２４、結像レンズ２５、ピンホール２６、コリメートレンズ２７、ビームスプリッタ３０、第１光検出器３１、及び第２光検出器３２によって蛍光検出手段が構成されている。測定試料Ｓの蛍光プローブからの蛍光は対物レンズ２０によって収集され、ダイクロイックミラー２１を透過し、さらに光フィルタ２３を通過した後、反射ミラー２４によってビームスプリッタ３０に向けて反射される。光フィルタ２３としては、例えば、試料Ｓからの散乱光、迷光等の余分な光成分を除去するための、測定対象の蛍光プローブの蛍光スペクトルに合わせて選択されたバンドパスフィルタを用いることができる。

反射ミラー２４によって光路が変更された蛍光は、結像レンズ２５及びピンホール２６を順に通過し、コリメートレンズ２７によって平行光束とされた後に、ビームスプリッタ３０へと入射する。ピンホール２６は、結像レンズ２５によって集光される蛍光に対して共焦点となる位置に設置されており、焦点外れの光を除去して、試料Ｓ中に形成されたビームスポットの測定領域からの蛍光のみを通過させる構成となっている。

ビームスプリッタ３０は、蛍光を分岐する光分岐手段であり、励起光が照射された測定試料Ｓの測定領域内にある蛍光プローブからの蛍光を２つの蛍光成分に分岐する（光分岐ステップ）。すなわち、ビームスプリッタ３０は、試料Ｓからの蛍光の個々の光子を第１光検出器３１への光路または第２光検出器３２への光路のいずれか一方へと導くことで、蛍光を２つの蛍光成分に分岐する。このようなビームスプリッタ３０としては、例えば蛍光を５０：５０の分岐比で２つの蛍光成分に等分割するものが用いられる。

ビームスプリッタ３０で分岐された一方の第１蛍光成分（ビームスプリッタ３０を透過した光子）は第１蛍光検出手段を構成する光検出器３１によって検出され、検出信号が出力される（第１蛍光検出ステップ）。また、ビームスプリッタ３０で分岐された他方の第２蛍光成分（ビームスプリッタ３０で反射された光子）は第２蛍光検出手段を構成する光検出器３２によって検出され、検出信号が出力される（第２蛍光検出ステップ）。光検出器の具体例としては、光電子増倍管を用いることができる。また、光フィルタ２３からレンズ２７までの各光学要素は、第１、第２蛍光検出手段で共用されている。

以上の励起光照射手段及び蛍光検出手段により、試料Ｓにおいて微小な測定領域を設定し、励起光を照射するとともに、測定領域からの蛍光を検出する共焦点光学系による蛍光顕微鏡が構成されている。また、本実施形態の蛍光顕微鏡は、試料Ｓからの蛍光に対し、光分岐手段、及びそれに対応する２つの蛍光検出手段を含んで構成されている。

ここで、上記構成の蛍光顕微鏡によって測定試料Ｓ中に設定される測定領域は、例えば１ｆｌ（フェムトリットル）程度の極微小領域である。また、試料Ｓに含まれる蛍光プローブの分子濃度の一例を１ｎＭとすると、測定領域内での蛍光プローブの平均分子数は、６・１０^２３×１・１０^−９×１・１０^−１５＝０．６個である。また、図２に例示したホモジニアス・アッセイでは、標的分子の濃度は例えば１ｐＭ程度である。ただし、これらの数値は測定領域等の設定の一例であり、具体的な設定は個々の場合で異なる。

第１、第２光検出器３１、３２から出力された検出信号は、それぞれ第１、第２検出信号処理部３３、３４へと入力される。検出信号処理部３３、３４は、例えばプリアンプなどの信号増幅回路及び波高弁別器などの信号処理回路によって構成され、光検出器３１、３２からの検出信号に対して所定の信号処理を行って、光検出器３１、３２のそれぞれでの単一光子検出イベントを示す検出パルス信号列を生成し出力する。

信号処理部３３、３４からの検出パルス信号列は光子計数部３５へと入力される。光子計数部３５は、蛍光解析に用いる測定データを取得する計数手段であり、光検出器３１、３２からの検出信号（処理部３３、３４からの信号列）に基づいて、検出光子数を所定の計数時間幅で計数して、時系列の第１、第２光子数測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）を生成する（光子計数ステップ）。これにより、試料Ｓに対する単一光子計数による蛍光測定が可能となる。ここで、以下において、第１光検出器での検出結果に関する量を添え字「Ａ」で示し、第２光検出器での検出結果に関する量を添え字「Ｂ」で示す。

本解析装置１Ａにおいては、光子計数部３５での計数時間幅が蛍光解析のビン幅の初期条件（最小ビン幅）となる。また、光子計数部３５としては、具体的には例えば、マルチチャンネルスケーラ（ＭＣＳ）を用いることができる。また、光子計数部３５での計数時間幅となるＭＣＳの時間分解能は、例えば２００ｎｓｅｃ（ナノ秒）以下である。

光子計数部３５において生成された時系列の光子数測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）は測定制御部５０に入力され、この測定制御部５０において、測定データに対して蛍光解析が行われる。本実施形態による測定制御部５０は、解析データ生成部５１と、測定結果解析部５２とを有している。このような測定制御部５０は、例えば、蛍光解析用のソフトウェアが動作する制御用コンピュータによって構成することができる。

解析データ生成部５１は、光子数測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）から、蛍光解析に用いる光子数解析データｎ_ＡＢ（ｔ）を生成する（解析データ生成ステップ）。具体的には、生成部５１は、測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）に基づいて、測定データの少なくとも一方が０の場合（Ｆ_Ａ・Ｆ_Ｂ＝０）に
ｎ_ＡＢ（ｔ）＝０
となり、測定データの両者が０でない場合（Ｆ_Ａ・Ｆ_Ｂ＞０）に所定の関数ｆで
ｎ_ＡＢ（ｔ）＝ｆ（Ｆ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ））
となる光子数解析データｎ_ＡＢ（ｔ）を生成する。

具体的な光子数解析データとしては、好ましくは、測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）の相乗平均を用い、下記の式（１）

によって解析データｎ_ＡＢ（ｔ）を生成する方法を用いることができる。なお、相乗平均の場合、その定義式で測定データの少なくとも一方が０の場合にｎ_ＡＢ＝０となる条件が満たされるため、その場合も含めて上記式（１）で解析データが定義される。

測定結果解析部５２は、必要な蛍光解析を行う解析手段であり、生成部５１で生成された解析データｎ_ＡＢ（ｔ）に対し、蛍光プローブを含む測定試料Ｓの測定結果についての蛍光解析を行う（測定結果解析ステップ）。これにより、例えば試料Ｓ中にある標的分子の情報など、測定試料Ｓについての必要な情報を取得することができる。

上記実施形態による蛍光解析装置、及び蛍光解析方法の効果について説明する。

図１に示した蛍光解析装置１Ａ、及び蛍光解析方法においては、対物レンズ２０、励起光源２２、及び光検出器３１、３２等を含む励起光照射系及び蛍光検出系によって試料Ｓ中に微小な測定領域を設定する。また、測定領域内の蛍光プローブで発生する蛍光に対してビームスプリッタ３０を設けるとともに蛍光検出系として第１、第２蛍光検出手段を設置して、第１光子数測定データＦ_Ａ（ｔ）及び第２光子数測定データＦ_Ｂ（ｔ）を取得する。そして、測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）からＦ_Ａ（ｔ）・Ｆ_Ｂ（ｔ）＝０のときにｎ_ＡＢ（ｔ）＝０となる解析データｎ_ＡＢ（ｔ）を生成して蛍光解析を行っている。

このような構成では、光子数測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）に代えて光子数解析データｎ_ＡＢ（ｔ）を用いることにより、第１、第２光検出器３１、３２での蛍光検出の同時性を考慮した形で蛍光解析を実行することができる。これにより、例えば、複数個の蛍光プローブが結合した標的分子からの蛍光検出イベントと、それ以外のノイズイベントとの識別精度を向上するなど、試料Ｓの蛍光解析の精度を向上することが可能となる。

蛍光解析の励起光、蛍光については、励起光は単一波長領域の励起光であり、第１、第２蛍光成分は同一波長領域の蛍光成分である構成を用いることが可能である。このような構成は、図２に関して上述したように、測定試料Ｓに加える蛍光プローブとして１種類の蛍光プローブのみを用いるとともに、試料Ｓに含まれる標的分子に２個以上の同一種類の蛍光プローブが結合する場合の蛍光解析に好適に適用することができる。また、図１の解析装置１Ａでは、このような解析対象に対応して、単一の励起光源２２を用いている。

ここで、蛍光プローブとして２種類以上の蛍光プローブを用いる方法では、複数種類の蛍光プローブが均等に反応する必要があり、プローブの選定が難しい。また、例えば各種類の蛍光プローブに対する測定領域の不一致などの問題を生じる場合もある（特許文献３参照）。これに対して、１種類の蛍光プローブを用いる蛍光解析法では、これらの問題点がなく測定が容易であり、蛍光解析の精度を向上することも可能である。

光子数解析データを用いた蛍光解析の具体的な内容については、解析部５２において、光子数解析データｎ_ＡＢに対し、自己相関解析またはフォトンバースト解析の少なくとも一方を行うことが好ましい。このように、自己相関解析法、フォトンバースト解析法、あるいはそれらを組み合わせた解析法を用いることにより、試料Ｓの蛍光解析を精度良く実行することができる。また、解析部５２において、解析データｎ_ＡＢを所定のビン時間幅でビニングし、ビニングされた解析データに対して蛍光解析を行う構成としても良い。この場合、具体的な測定条件等に応じて解析データのビン時間幅を設定することにより、蛍光解析の精度を向上することができる。

図１に示した蛍光解析装置１Ａ、及び解析装置１Ａにおいて実行される蛍光解析方法について、さらに具体的に説明する。

まず、光子数測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）を用いた一般的な蛍光解析について説明する。試料Ｓに１種類の蛍光プローブを加えて測定した場合、光検出器３１、３２での測定結果による自己相関関数Ｇ（τ）は、光子数測定データＦ_Ａ、Ｆ_Ｂに対して、それぞれ下記の式（２）、式（３）

によって求めることができる。

また、光検出器３１、３２間の相互相関関数は、下記の式（４）、式（５）

によって求められる。ここで、これらの相関関数Ｇ_ＡＢ（τ）、Ｇ_ＢＡ（τ）の対称性

を考慮すると、下記の式（７）で定義される関数Ｇ_Ｃ（τ）＝Ｇ_{ＣＲＯＳＳ}（τ）

を光検出器３１、３２間の相互相関関数として用いることができる。

一般に、蛍光相関分光法における１成分系の波形解析では、自己相関、相互相関ともに相関関数Ｇ（τ）は、下記の式（８）

によって求められる。ここで、＜Ｎ＞は試料Ｓで共焦点光学系によって構築される測定領域内に滞在する蛍光プローブの平均分子数を示し、また、τ_Ｄは拡散時定数、ｒ_０、ｚ_０は構造パラメータ（ストラクチャパラメータ）、Ｔは三重項状態へと遷移する割合、λは三重項遷移の時定数をそれぞれ示している。これらのパラメータは、取得された相関関数に対してフィッティング計算による波形解析を行うことで求めることができる。

式（７）、式（８）を用いる解析法は従来法であるが、測定データを直接用いずに解析データｎ_ＡＢを用いる図１に示した解析装置１Ａにおいても、このような解析法によって平均分子数、並進拡散時定数、三重項に関するパラメータ等を解析することは、蛍光プローブの初期状態を把握する上で好適である。また、式（８）において三重項状態への遷移確率をＴ＝０とすると、時間遅れτ＝０のときに、Ｇ（τ）のｙ切片について
Ｇ（τ＝０）＝１／＜Ｎ＞
の関係が得られる。すなわち、相関関数Ｇ（τ）のｙ切片により、試料Ｓ中での蛍光プローブの濃度に対応する測定領域内での平均分子数＜Ｎ＞が求められる。

ここで、式（７）に示した相互相関関数Ｇ_Ｃ（τ）は、１種類の蛍光プローブを用いて求められたものであるため、上記の式（８）で波形解析することができる。このような蛍光解析法では、相互相関によって光検出器のノイズをキャンセルすることができる利点がある。ただし、このように２つの光検出器を用いた相互相関では、１つの光検出器の場合に比べてＳＮ比が１／√２倍に低下する。

次に、光子数解析データｎ_ＡＢ（ｔ）を用いた蛍光解析について説明する。ここで、図１の解析装置１Ａにおいて、試料Ｓの測定領域内に１個の蛍光プローブのみが存在している場合には、光検出器３１、３２で同時に蛍光が検出されることはなく、光検出器３１、３２で同時に蛍光が検出された場合には、必ず複数個の蛍光プローブが測定領域内に存在するものとする。

この場合、上記の式（１）に示した相乗平均による解析データｎ_ＡＢ（ｔ）
ｎ_ＡＢ（ｔ）＝√（Ｆ_Ａ（ｔ）・Ｆ_Ｂ（ｔ））
を用いることにより、光子検出の同時性の観点から１個の蛍光プローブによる検出イベントを排除することができる。また、この解析データでは、同時性の評価のため、測定データＦ_Ａ、Ｆ_Ｂの一方または両方が０でｎ_ＡＢ＝０となる場合も除外せずに解析データを求める。また、相乗平均による上記の解析データは、光分岐手段として分岐比１：１のビームスプリッタを用いた場合の蛍光解析において、特に好適に適用することができる。

この解析データｎ_ＡＢを時系列の光子数データとして、蛍光検出の同時性が加味された自己相関関数Ｇ_ｎｅｗ（τ）を求めると、下記の式（９）

となる。なお、相乗平均による解析データは実数データであるため、この式（９）の相関関数を求める演算も実数演算となる。このような演算を含む蛍光解析は、測定制御部５０でソフトウェア的に解析演算を行う構成において好適に実現することできる。

式（９）の自己相関関数では、光子数データのビン時間幅が例えば１μｓｅｃと小さい場合にはｎ_ＡＢ＝０である確率が高いため、相関波形を求めることができない。これに対して、解析データｎ_ＡＢのビン時間幅をビニングで大きくしていくと、ｎ_ＡＢ＝０の確率が次第に減少して相関波形が現れてくる。すなわち、上記の相関波形Ｇ_ｎｅｗ（τ）は、２つの光検出器３１、３２で取得される光子数データに対して任意のビン時間幅を設定したときに、そのビン幅内で光子が同時に検出される程度を示すものである。

また、自己相関関数Ｇ（τ）では、上記したように、そのｙ切片が蛍光プローブの平均分子数の逆数１／＜Ｎ＞に対応している。したがって、試料Ｓの測定領域内に蛍光プローブが多い場合には、それらが同時に観測される確率が高くなって相関波形のｙ切片が小さくなる。一方、蛍光プローブが少ない場合には、同時に観測される確率が低くなってｙ切片が大きくなる。蛍光検出の同時性を考慮した上記の相関関数Ｇ_ｎｅｗ（τ）は、一般的な相関関数Ｇ_Ｃ（τ）に対して、上記特性によって変動することとなる。

なお、蛍光プローブの並進拡散運動等については、いずれの相関関数でも同じ運動を観測している。このため、式（９）の相関関数Ｇ_ｎｅｗ（τ）の波形解析においても、相互相関関数Ｇ_Ｃ（τ）について求められた拡散時定数τ_Ｄ、遷移割合Ｔ、及び時定数λの各パラメータを、同じパラメータ値で適用することが可能である。

上記の相関関数Ｇ_ｎｅｗ（τ）の導出において、解析データｎ_ＡＢのビン時間幅を蛍光プローブの濃度に対して適切に設定することにより、蛍光検出の同時性による制限によって測定領域内に滞在する見かけ上の分子数を少なく見積もることができる。これは、測定領域内にある複数個の蛍光プローブからの蛍光を２つの光検出器で同時に検出する頻度が、ビン時間幅の大きさによって異なってくることによる。このビン時間幅については、光子計数部３５での計数時間幅を初期ビン幅として取得された光子数データについて、必要に応じてビニングを行ってビン時間幅を設定、変更することが好ましい。

解析データｎ_ＡＢを用いた蛍光解析の上記性質は、標的分子に対して複数個の蛍光プローブが凝集するように結合する場合の蛍光解析に特に有効である。この場合、試料Ｓに加える蛍光プローブを多くすることにより、複数個の蛍光プローブが結合した標的分子による蛍光検出イベントが増加する。また、複数個の蛍光プローブの標的分子への結合によって並進拡散運動が変化するため、ＦＣＳによる蛍光解析において標的分子の検出能力が向上される。また、フリーの蛍光プローブについては、測定領域内に複数個が滞在する場合でも滞在タイミングがずれて同時性が小さくなるため、ビン時間幅の設定によって、フリーの蛍光プローブによるイベントを効果的に除外することが可能である。

標的分子に複数個の蛍光プローブが結合する場合のＦＣＳによる蛍光解析では、相関関数Ｇ（τ）は下記の式（１０）、式（１１）

によって求められる。ここで、式（１０）、式（１１）において、添え字ｉは標的分子に対する蛍光プローブの結合状態が異なる場合の各蛍光成分を示している。また、αは蛍光の発光効率に関する係数である。また、式（１１）の相関波形成分では、三重項に関する波形部分を省略している。

蛍光プローブとして１種類の分子プローブのみを用い、図１の解析装置１Ａで取得された測定データを式（７）の相互相関関数Ｇ_Ｃ（τ）によって解析する場合、係数α_ｉは正の整数の値をとり、それに応じて平均分子数＜Ｎ_ｉ＞がそれぞれ求められる。例えば、標的分子に対して蛍光プローブが最大で２個までしか結合しない場合、式（１０）の相関関数Ｇ（τ）は下記の式（１２）

となる。ここで、添え字ｉ＝１はフリーの蛍光プローブによる蛍光成分を示し、ｉ＝２は標的分子に蛍光プローブが１個結合した場合の蛍光成分を示し、ｉ＝３は標的分子に蛍光プローブが２個結合した場合の蛍光成分を示している。また、この場合の蛍光プローブの総分子数＜Ｎ＞は、下記の式（１３）

によって求められる。

これらの式（１２）、式（１３）を用い、式（７）の相互相関関数Ｇ_Ｃ（τ）について各相関波形成分ｇ_ｉ（τ）の係数を求めることによって、試料Ｓにおける蛍光プローブの状態、及び標的分子の量などについての情報を取得することができる。ただし、このような蛍光解析において、標的分子の量が少なくフリーの蛍光プローブが多い場合には、相関波形は主にフリーの蛍光プローブによる蛍光成分によって表されることとなり、標的分子についての情報を充分な精度で取得することが困難となる。

このような場合、測定データＦ_Ａ、Ｆ_Ｂによる相関関数Ｇ_Ｃ（τ）に代えて、解析データｎ_ＡＢによる相関関数Ｇ_ｎｅｗ（τ）を用いることにより、標的分子の情報を好適に取得することができる。すなわち、蛍光検出の同時性が考慮された相関関数Ｇ_ｎｅｗ（τ）では、フリーの蛍光プローブ、及び標的分子に１個のみ結合した蛍光プローブの分子数が低く見積もられるため、標的分子に蛍光プローブが２個結合した分子数＜Ｎ_３＞を精度良く定量することができる。

また、式（１）に示した光子数解析データｎ_ＡＢ（ｔ）自体については、試料Ｓの測定領域内に複数個の蛍光プローブが同時に滞在する場合の蛍光ゆらぎに相当している。このため、蛍光解析については、上記した自己相関解析以外にも、解析データに対してフォトンバースト解析（光子数データでの検出光子数についての解析）を行うことによっても、標的分子の情報等を取得することが可能である。なお、解析データのフォトンバースト解析については、具体的には後述する。

ここで、標的分子Ｔに対する蛍光プローブＰの特異的結合（図２参照）を利用するホモジニアス・アッセイでは、具体的には例えば、標的分子を含む試料Ｓに対し、（１）反応前の蛍光プローブの評価工程、（２）標的分子と蛍光プローブとの反応工程、及び（３）反応後の蛍光の評価工程の３つの工程によって蛍光解析が行われる。この場合、反応前の評価工程（１）では、式（７）の相互相関関数Ｇ_Ｃ（τ）を求め、式（８）を適用して波形解析を行って必要なパラメータの値を決定する。さらに、式（１）の解析データ、及び式（９）の相関関数Ｇ_ｎｅｗ（τ）による解析を行い、反応前の状態の初期値を求めるとともに、同時性を評価する上で重要となる蛍光解析用のビン時間幅を設定する。

また、反応後の評価工程（３）では、先に求めた蛍光解析用のビン時間幅を適用して式（１）、式（９）による解析を行い、さらに、相関波形に対して式（１０）、式（１１）を用いた波形解析を行うことにより、試料Ｓでの標的分子の量を見積もることができる。あるいは、波形解析に代えて、式（１）の解析データに対してフォトンバースト解析を行っても良い。なお、ビン時間幅の設定方法等については、具体的には後述する。

また、自己相関関数Ｇ（τ）の算出においては、一定のビン時間幅で演算を行わず、時間遅れτに応じてビン幅を変えて相関関数を求めるマルチプルタウ方式を用いても良い。すなわち、一般的な自己相関関数は、下記の式（１４）

によって求められるが、時間遅れτが例えば１００ｎｓｅｃ〜１ｓｅｃの範囲全体で一定のビン幅１００ｎｓｅｃの分解能を適用すると演算量が膨大となり、また、時間遅れτが大きい領域で求められる波形のＳＮ比が劣化する場合がある。

これに対し、時間遅れτが大きい領域でビン時間幅が大きくなるように、時間遅れτに応じてビン幅を変えるマルチプルタウ方式によれば、相関波形の演算量を低減するとともに、時間遅れτが大きい領域でのＳＮ比を改善することができる。具体的には例えば、初期ビン幅が１００ｎｓの時系列の測定データに対して解析演算を行う場合、τ＝１μｓでは初期ビン幅１００ｎｓのままで演算を行い、τ＝１ｍｓではビン幅が１μｓとなるようにビニングした光子数データを用いて演算を行う方法を用いることができる。

一般には、相関関数の算出において、時間遅れτが小さい領域で適用する最小ビン幅を設定し、時間遅れτが大きい領域では最小ビン幅を整数倍したビン時間幅でビニングして相関関数を算出する方法を用いることができる。このような演算方法は、測定制御部５０でソフトウェア的に蛍光解析を行う構成において好適に実現することできる。すなわち、ソフトウェア的に解析する構成では、解析演算に対する自由度が大きく、また、蛍光測定後にデータ処理を実行できることから、例えば解析条件を変えて何回も演算を繰り返すなど、様々な蛍光解析を行うことが可能である。

次に、解析データｎ_ＡＢ及び相関関数Ｇ_ｎｅｗ（τ）による蛍光解析について、その具体例とともにさらに説明する。以下においては、蛍光解析における測定データＦ_Ａ、Ｆ_Ｂの初期ビン幅となる光子計数部３５での計数時間幅を１００ｎｓとする。また、相関関数の算出においては、基本的に上記したマルチプルタウ方式を用いるものとする。

図３は、光子数測定データに対して得られる相関関数を示すグラフである。図３において、グラフ（ａ）は、光検出器３１での測定データＦ_Ａから式（２）によって算出された自己相関関数Ｇ_Ａ（τ）を示している。また、グラフ（ｂ）は、光検出器３１、３２での測定データＦ_Ａ、Ｆ_Ｂから式（７）によって算出された相互相関関数Ｇ_Ｃ（τ）を示している。これらの相関関数は、いずれも最小ビン幅を１００ｎｓとしたマルチプルタウ方式によって算出されている。また、図３では、図１の解析装置１Ａで３秒間の蛍光測定を１０回繰り返して得られた測定データから求められる相関関数を示している。

図３の自己相関関数のグラフ（ａ）では、τ＝１μｓ程度までの速い時間領域では光検出器のアフターパルスノイズが重畳された波形となっており、１μｓ以降の相関波形についてのみ、有効に解析することができる。また、相互相関関数のグラフ（ｂ）では、三重項状態への遷移過程が充分に観測されており、この相関波形を解析することで蛍光プローブの状態を正確に知ることができる。蛍光測定における平均光子検出数は、第１光検出器３１で３５．３ｋｃｐｓ、第２光検出器３２で３２．９ｋｃｐｓであり、ビームスプリッタ３０による蛍光の分岐比は約５２：４８となっている。また、グラフ（ｂ）の相関波形について、式（８）で波形フィッティングを行った場合、各パラメータの値は
＜Ｎ＞：２１．４
τ_Ｄ：０．２５６ｍｓ
Ｔ：０．１２３
λ：０．３９６μｓ
ｒ_０／ｚ_０：０．２
と求められ、この場合の平均分子数は＜Ｎ＞＝２１．４となっている。

図３と同一の測定データＦ_Ａ、Ｆ_Ｂについて、式（１）の解析データｎ_ＡＢを求め、さらに式（９）の同時性を考慮した相関関数Ｇ_ｎｅｗ（τ）を算出した結果を図４に示す。図４においては、ビニングによって初期ビン幅１００ｎｓよりも大きい所定の時間幅を最小ビン幅としてマルチプルタウ方式によって算出された相関関数を示している。また、図４において、グラフＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４は、それぞれ最小ビン幅を６．４μｓ、２５．６μｓ、１０２．４μｓ、４０９．６μｓとしたときの相関関数を示している。ここで、例えばビン幅６．４μｓの光子数データは、初期ビン幅１００ｎｓの光子数データを６４個ずつ加算するビニング処理によって得られる。また、初期ビン幅よりも大きい時間幅を最小ビン幅としているのは、最小ビン幅１００ｎｓでは同時性を考慮することでほとんどのビンの計数値が０になってしまうためである。

図４のグラフＡ１〜Ａ４より、相関関数Ｇ_ｎｅｗ（τ）を求める際の最小ビン幅を大きくすることにより、１／＜Ｎ＞に相当する相関関数のｙ切片が小さくなり、測定領域内での同時性が考慮された蛍光プローブの平均分子数＜Ｎ＞が増加することがわかる。この図４の相関関数に対し、分子数＜Ｎ＞以外のパラメータについて図３のグラフ（ｂ）で求めた上記のパラメータ値を適用して波形フィッティングによる解析を行うことにより、グラフＡ１〜Ａ４のそれぞれについて各最小ビン幅での平均分子数＜Ｎ＞が求められる。

図５は、相関関数Ｇ_ｎｅｗ（τ）から求められる分子数のビン幅依存性を示すグラフである。図５において、横軸はマルチプルタウ方式による相関関数の算出での最小ビン時間幅（ｓｅｃ）を示し、縦軸は各最小ビン幅での相関関数のｙ切片から求められる平均分子数＜Ｎ＞を示している。ここで、光子数解析データｎ_ＡＢでは、時系列の測定データにおいて計数値が０のビンが存在することを前提として同時性を評価している。このため、ビニング処理によってビン時間幅当たりの蛍光量が増えて計数値が０となる頻度が低くなる時間領域、例えば図５においてビン幅が０．３ｍｓ以上の領域では、解析データｎ_ＡＢを求めて同時性を評価する効果が充分に得られていない。

一方、例えばビン幅を６．４μｓとした場合の相関関数Ｇ_ｎｅｗ（τ）では、図３のグラフ（ｂ）の相関関数Ｇ_Ｃ（τ）で２１．４個であった平均分子数＜Ｎ＞が６．１個まで減少している。これは、解析データｎ_ＡＢで蛍光検出の同時性を考慮することにより、試料Ｓの測定領域内にある見かけ上の分子数が少なく見積もられたことを示すものである。このような解析条件は、上述したように、標的分子に対して複数個の蛍光プローブが凝集するように結合する場合の蛍光解析において、複数個のフリーの蛍光プローブによるバックグラウンドイベントの影響が低減されるなどの点で特に有効である。

図６は、光子数測定データに対して得られる相関関数の他の例を示すグラフである。図６のグラフは、図３の場合よりも蛍光プローブの濃度が低い条件で蛍光測定を行って得られた相互相関関数Ｇ_Ｃ（τ）を示している。このグラフにおいて、蛍光測定における平均光子検出数は、第１光検出器３１で２．３ｋｃｐｓ、第２光検出器３２で２．２ｋｃｐｓであり、ビームスプリッタ３０による蛍光の分岐比は約５１：４９となっている。また、図６のグラフの相関波形について、式（８）で波形フィッティングを行った場合、各パラメータの値は
＜Ｎ＞：１．６６
τ_Ｄ：０．２５６ｍｓ
Ｔ：０．２４７
λ：２．２８μｓ
ｒ_０／ｚ_０：０．２
と求められ、この場合の平均分子数は＜Ｎ＞＝１．６６となっている。

図７は、図６と同一の測定データについて、相関関数Ｇ_ｎｅｗ（τ）から求められる分子数のビン幅依存性を示すグラフである。このグラフにおいて、例えばビン幅を６．４μｓとした場合の相関関数Ｇ_ｎｅｗ（τ）では、図６の相関関数Ｇ_Ｃ（τ）で１．６６個であった平均分子数＜Ｎ＞が０．２７個まで減少している。これらの図５、図７のグラフからわかるように、蛍光解析において光子数測定データ、解析データをビニングする場合のビン時間幅については、相関関数から求められる分子数のビン幅依存性を参照してビン時間幅を設定することが好ましい。また、分子数のビン幅依存性は、蛍光プローブの濃度等の条件によって変化するが、条件が同じであれば再現性は高いと考えられる。

次に、光子数測定データＦ_Ａ、Ｆ_Ｂから解析データｎ_ＡＢへのデータ変換について説明する。同時性を考慮した解析データは、一般には、Ｆ_Ａ・Ｆ_Ｂ＝０の場合に

となり、Ｆ_Ａ・Ｆ_Ｂ＞０の場合に所定の関数ｆで

となるように求められる。また、Ｆ_Ａ・Ｆ_Ｂ＞０の場合の解析データの具体的な算出方法としては、上記に例示した相乗平均による解析データｎ_ＡＢ

を用いることができる。これにより、蛍光検出の同時性が考慮された蛍光解析を好適に実行することができる。また、この方法では、Ｆ_Ａ・Ｆ_Ｂ＝０の場合においても、相乗平均の上記関数でｎ_ＡＢ＝０となる。

また、Ｆ_Ａ・Ｆ_Ｂ＞０の場合の解析データの他の算出方法としては、相加平均による解析データｎ_ＡＢ

を用いることができる。なお、この方法では、相加平均の上記関数ではＦ_Ａ、Ｆ_Ｂの一方のみが０の場合にｎ_ＡＢ＝０とならない。このため、Ｆ_Ａ・Ｆ_Ｂ＝０の場合については、別にｎ_ＡＢ＝０と定義する。

あるいは、Ｆ_Ａ・Ｆ_Ｂ＞０の場合の解析データのさらに他の算出方法としては、調和平均による解析データｎ_ＡＢ

を用いることができる。これにより、相乗平均の場合と同様に、蛍光検出の同時性が考慮された蛍光解析を好適に実行することができる。また、この方法でも、Ｆ_Ａ・Ｆ_Ｂ＝０の場合については、別にｎ_ＡＢ＝０と定義する。

あるいは、Ｆ_Ａ・Ｆ_Ｂ＞０の場合の解析データのさらに他の算出方法としては、測定データの積による解析データｎ_ＡＢ

を用いても良い。ただし、この積による解析データは、他の相乗平均、相加平均、調和平均による解析データとは性質が異なっている。

一般には、解析データｎ_ＡＢ（ｔ）の算出において、Ｆ_Ａ・Ｆ_Ｂ＞０の場合には、相乗平均、相加平均、調和平均、または積のいずれかとなる関数ｆ（Ｆ_Ａ、Ｆ_Ｂ）で解析データｎ_ＡＢを求めることが好ましく、特に、相乗平均、相加平均、または調和平均のいずれかとなる関数ｆ（Ｆ_Ａ、Ｆ_Ｂ）で解析データｎ_ＡＢを求めることが好ましい。

図８は、相関関数から求められる分子数のビン幅依存性を示すグラフである。図８において、グラフ（ａ）は図５に示した蛍光プローブの濃度が高い場合のグラフに対応し、グラフ（ｂ）は図７に示した濃度が低い場合のグラフに対応している。また、グラフ（ａ）において、グラフＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４は、それぞれ解析データの算出に相乗平均、相加平均、調和平均、積を用いた場合の分子数＜Ｎ＞を示している。グラフ（ｂ）におけるグラフＣ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４についても同様である。

また、図９は、図８のグラフ（ａ）に示した蛍光プローブの濃度が高い条件における、光子数解析データに対して得られる相関関数を示すグラフである。図９において、グラフ（ａ）は、ビン幅を６．４μｓとした場合の相関関数を示し、グラフＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４は、それぞれ解析データの算出に相乗平均、相加平均、調和平均、積を用いた場合の相関関数を示している。また、図９のグラフ（ｂ）は、ビン幅を１０２．４μｓとした場合の相関関数を示し、グラフＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４は、それぞれ解析データの算出に相乗平均、相加平均、調和平均、積を用いた場合の相関関数を示している。

これらのグラフに示すように、相乗平均、相加平均、及び調和平均による解析データを用いた場合は、いずれも分子数＜Ｎ＞のビン幅依存性について同様の傾向を示している。一方、積による解析データを用いた場合は、自己相関演算において平均強度とゆらぎとが同じように変動するため、相関波形のｙ切片、及びそれによって求められる分子数＜Ｎ＞は、ほぼ一定値を示す結果となっている。また、上記のいずれの場合でも、相関関数（図９参照）については、分子数＜Ｎ＞以外のパラメータについて、相互相関関数から求めたパラメータ値を適用して波形フィッテイングによる解析を行うことが可能である。

図８のグラフ（ａ）に示す例では、上記したように相乗、相加、調和平均について同様の傾向を示している。これは、この測定例では光検出器３１、３２での平均光子検出数が３５．３ｋｃｐｓ、３２．９ｋｃｐｓであり、例えば６．４μｓのビン幅では平均計数値が０．２２となる。このため、各ビンでの計数値の多くが０、１、２のいずれかとなり、光検出器間の検出の偏りについて、相乗、相加、調和平均で大きな差が無いことによる。これらの相乗、相加、調和平均のうちでは、蛍光ゆらぎを過剰に評価しないことから、相乗平均、及び調和平均が特に解析データの算出に適していると考えられる。

次に、光子数解析データｎ_ＡＢ（ｔ）のフォトンバースト解析について説明する。フォトンバースト解析は、時系列の光子数データに対し、その各ビンでの検出光子数及びその時間変化について解析することで、測定領域内での蛍光プローブの個数等についての情報を得る解析方法である。

図１０は、時系列の光子数データでの計数値（ビン当たりの検出光子数）の分布の一例を示すグラフである。図１０に示す計数値分布は、図３〜図５に示した蛍光プローブの濃度が高い場合の測定結果によるものである。図１０のグラフ（ａ）は、光検出器３１、３２での測定データＦ_Ａ、Ｆ_Ｂを加算した光子数データにおいて、ビニングによってビン幅を３０７．２μｓとしたときの計数値分布を示している。ここで、この図１０の測定例では、測定データＦ_Ａ、Ｆ_Ｂでの平均光子検出数を加算すると６８．２ｋｃｐｓとなり、分子数が＜Ｎ＞＝２１．４であることから、１分子当たりの蛍光強度は約３．２ｋｃｐｓである。上記のビン幅は、この蛍光強度を考慮し、蛍光プローブ１分子に対応する計数値が約１となるように選択している。このため、グラフ（ａ）において、そのピーク計数値はおよそ２１となっている。

一方、図１０のグラフ（ｂ）は、ビン幅６．４μｓで相乗平均による解析データｎ_ＡＢを求め、さらにビニングによってビン幅を３０７．２μｓとしたときの計数値分布を示している。この場合、測定データＦ_Ａ、Ｆ_Ｂの平均という点でいうと、計数値０．５が蛍光プローブ１分子に相当することとなる。このグラフ（ｂ）では、計数値が５以上で２つ以上のビンをまたいで発光するような現象について、その識別が容易になる。すなわち、図１０の例では、例えば１０個程度の蛍光プローブが標的分子に凝集、結合する反応系の場合、測定データのグラフ（ａ）ではフリーの蛍光プローブによるイベントに埋もれてしまい識別が困難であるが、蛍光検出の同時性が考慮された解析データのグラフ（ｂ）ではそれらを識別することが可能である。

図１１は、光子数データでの計数値の分布の他の例を示すグラフである。図１１に示す計数値分布は、図６、図７に示した蛍光プローブの濃度が低い場合の測定結果によるものである。図１１のグラフ（ａ）、（ｂ）は、それぞれ図１０のグラフ（ａ）、（ｂ）と同様に求められた計数値分布を示している。ここで、この図１１の測定例では、測定データＦ_Ａ、Ｆ_Ｂでの平均光子検出数を加算すると４．５ｋｃｐｓとなり、分子数が＜Ｎ＞＝１．６６であることから、１分子当たりの蛍光強度は約２．６ｋｃｐｓである。このとき、上記のビン幅では、蛍光プローブ１分子に対応する計数値は約０．８となっている。

図１１のグラフ（ｂ）では、計数値１の頻度が１４２、計数値２の頻度が１となっており、その他のイベントは全て計数値が０となっている。このような測定結果では、上記した３０７．２μｓのビン幅で例えば計数値０．４を基準としてフォトンバースト解析を行うことが可能である。

標的分子に対して複数個の蛍光プローブが結合する反応系では、解析データｎ_ＡＢが０よりも大きくなる確率は非常に高い。このため、相乗平均などによる解析データを用いることで、フリーの蛍光プローブなどによるバックグラウンドイベントを低減した形での蛍光解析が可能となる。ただし、フォトンバースト解析は相対的な評価であるため、濃度が既知の測定試料についてあらかじめ測定を行って検量線を作成し、その検量線を参照して解析を行うことが好ましい。また、同時性を考慮した解析データの算出方法については、フォトンバースト解析においても、相乗、相加、調和平均のいずれを用いても大きな差は無かった。また、積については、分散が大きくなる傾向があるため、解析データの算出方法としては相乗平均等が適しているものと考えられる。

本発明による蛍光解析装置、及び蛍光解析方法は、上記実施形態及び構成例に限られるものではなく、様々な変形が可能である。例えば、蛍光測定に用いられる蛍光顕微鏡等の装置構成については、図１はその一例を示すものであり、具体的には様々な構成を用いて良い。また、上記した蛍光解析法は、測定試料に１種類の蛍光プローブのみを加える場合以外にも、様々な条件での蛍光測定に対して適用可能である。また、上記した蛍光解析装置及び解析方法は、フリーの蛍光プローブの影響を抑制できることから、例えば分子間相互作用における結合力が弱い反応系に対する蛍光解析法として有効であると考えられ、これまでＥＬＩＳＡ法等に適用できなかった抗原抗体反応の組合せについても適用できる可能性がある。

本発明は、測定領域内にある蛍光プローブからの蛍光を測定することによる測定試料の蛍光解析を好適に実行することが可能な蛍光解析装置、及び蛍光解析方法として利用可能である。

蛍光解析装置の一実施形態の構成を示す図である。 蛍光解析装置による解析対象の一例を示す図である。 光子数測定データに対して得られる相関関数を示すグラフである。 同時性を考慮した光子数解析データに対して得られる相関関数を示すグラフである。 相関関数から求められる分子数のビン幅依存性を示すグラフである。 光子数測定データに対して得られる相関関数を示すグラフである。 相関関数から求められる分子数のビン幅依存性を示すグラフである。 相関関数から求められる分子数のビン幅依存性を示すグラフである。 同時性を考慮した光子数解析データに対して得られる相関関数を示すグラフである。 光子数データでの計数値の分布を示すグラフである。 光子数データでの計数値の分布を示すグラフである。

符号の説明

１Ａ…蛍光解析装置、Ｓ…測定試料、１０…試料ホルダ、２０…対物レンズ、２１…ダイクロイックミラー、２２…励起光源、２３…光フィルタ、２４…反射ミラー、２５…結像レンズ、２６…ピンホール、２７…コリメートレンズ、
３０…ビームスプリッタ、３１…第１光検出器、３２…第２光検出器、３３…第１検出信号処理部、３４…第２検出信号処理部、３５…光子計数部、５０…測定制御部、５１…解析データ生成部、５２…測定結果解析部。

Claims (13)

1. 測定試料に対して設定された測定領域に励起光を照射する励起光照射手段と、
   前記励起光照射手段によって前記励起光が照射された前記測定試料の前記測定領域内にある蛍光プローブから発生する蛍光を２つの蛍光成分に分岐する光分岐手段と、
   分岐された一方の第１蛍光成分を検出する第１蛍光検出手段と、
   分岐された他方の第２蛍光成分を検出する第２蛍光検出手段と、
   前記第１蛍光検出手段及び前記第２蛍光検出手段でそれぞれ検出された光子数を所定の計数時間幅で時系列的に計数して、第１光子数測定データＦ_Ａ（ｔ）及び第２光子数測定データＦ_Ｂ（ｔ）を取得する光子計数手段と、
   前記第１光子数測定データＦ_Ａ（ｔ）及び前記第２光子数測定データＦ_Ｂ（ｔ）に基づいて、測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）の少なくとも一方が０の場合に
   ｎ_ＡＢ（ｔ）＝０
   となり、測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）の両者が０でない場合に、相乗平均、相加平均、または調和平均のいずれかとなる関数ｆで
   ｎ_ＡＢ（ｔ）＝ｆ（Ｆ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ））
   となる光子数解析データｎ_ＡＢ（ｔ）を生成する解析データ生成手段と、
   前記解析データ生成手段で生成された前記光子数解析データｎ_ＡＢ（ｔ）に対し、前記蛍光プローブを含む前記測定試料の測定結果についての蛍光解析を行う測定結果解析手段と
   を備え、
   前記測定結果解析手段は、前記光子数解析データｎ _ＡＢ （ｔ）を、前記測定試料中での前記蛍光プローブの濃度に応じて設定されたビン時間幅でビニングし、ビニングされた解析データに対して前記蛍光解析を行うことを特徴とする蛍光解析装置。
2. 前記解析データ生成手段は、測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）の両者が０でない場合に、測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）の相乗平均となる関数ｆで
   ｎ_ＡＢ（ｔ）＝√（Ｆ_Ａ（ｔ）・Ｆ_Ｂ（ｔ））
   によって前記光子数解析データｎ_ＡＢ（ｔ）を生成することを特徴とする請求項１記載の蛍光解析装置。
3. 前記解析データ生成手段は、測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）の両者が０でない場合に、測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）の調和平均となる関数ｆで
   ｎ_ＡＢ（ｔ）＝２／｛１／Ｆ_Ａ（ｔ）＋１／Ｆ_Ｂ（ｔ）｝
   によって前記光子数解析データｎ_ＡＢ（ｔ）を生成することを特徴とする請求項１記載の蛍光解析装置。
4. 前記解析データ生成手段は、測定データＦ _Ａ （ｔ）、Ｆ _Ｂ （ｔ）の両者が０でない場合に、測定データＦ _Ａ （ｔ）、Ｆ _Ｂ （ｔ）の相加平均となる関数ｆで
   ｎ _ＡＢ （ｔ）＝｛Ｆ _Ａ （ｔ）＋Ｆ _Ｂ （ｔ）｝／２
   によって前記光子数解析データｎ _ＡＢ （ｔ）を生成することを特徴とする請求項１記載の蛍光解析装置。
5. 前記測定結果解析手段は、前記光子数解析データｎ_ＡＢ（ｔ）に対し、前記蛍光解析として、自己相関解析またはフォトンバースト解析の少なくとも一方を行うことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項記載の蛍光解析装置。
6. 前記励起光は単一波長領域の励起光であり、前記第１蛍光成分及び前記第２蛍光成分は同一波長領域の蛍光成分であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項記載の蛍光解析装置。
7. 測定試料に対して設定された測定領域に励起光を照射する励起光照射ステップと、
   前記励起光照射ステップで前記励起光が照射された前記測定試料の前記測定領域内にある蛍光プローブから発生する蛍光を２つの蛍光成分に分岐する光分岐ステップと、
   分岐された一方の第１蛍光成分を検出する第１蛍光検出ステップと、
   分岐された他方の第２蛍光成分を検出する第２蛍光検出ステップと、
   前記第１蛍光検出ステップ及び前記第２蛍光検出ステップでそれぞれ検出された光子数を所定の計数時間幅で時系列的に計数して、第１光子数測定データＦ_Ａ（ｔ）及び第２光子数測定データＦ_Ｂ（ｔ）を取得する光子計数ステップと、
   前記第１光子数測定データＦ_Ａ（ｔ）及び前記第２光子数測定データＦ_Ｂ（ｔ）に基づいて、測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）の少なくとも一方が０の場合に
   ｎ_ＡＢ（ｔ）＝０
   となり、測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）の両者が０でない場合に、相乗平均、相加平均、または調和平均のいずれかとなる関数ｆで
   ｎ_ＡＢ（ｔ）＝ｆ（Ｆ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ））
   となる光子数解析データｎ_ＡＢ（ｔ）を生成する解析データ生成ステップと、
   前記解析データ生成ステップで生成された前記光子数解析データｎ_ＡＢ（ｔ）に対し、前記蛍光プローブを含む前記測定試料の測定結果についての蛍光解析を行う測定結果解析ステップと
   を備え、
   前記測定結果解析ステップにおいて、前記光子数解析データｎ _ＡＢ （ｔ）を、前記測定試料中での前記蛍光プローブの濃度に応じて設定されたビン時間幅でビニングし、ビニングされた解析データに対して前記蛍光解析を行うことを特徴とする蛍光解析方法。
8. 前記解析データ生成ステップにおいて、測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）の両者が０でない場合に、測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）の相乗平均となる関数ｆで
   ｎ_ＡＢ（ｔ）＝√（Ｆ_Ａ（ｔ）・Ｆ_Ｂ（ｔ））
   によって前記光子数解析データｎ_ＡＢ（ｔ）を生成することを特徴とする請求項７記載の蛍光解析方法。
9. 前記解析データ生成ステップにおいて、測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）の両者が０でない場合に、測定データＦ_Ａ（ｔ）、Ｆ_Ｂ（ｔ）の調和平均となる関数ｆで
   ｎ_ＡＢ（ｔ）＝２／｛１／Ｆ_Ａ（ｔ）＋１／Ｆ_Ｂ（ｔ）｝
   によって前記光子数解析データｎ_ＡＢ（ｔ）を生成することを特徴とする請求項７記載の蛍光解析方法。
10. 前記解析データ生成ステップにおいて、測定データＦ _Ａ （ｔ）、Ｆ _Ｂ （ｔ）の両者が０でない場合に、測定データＦ _Ａ （ｔ）、Ｆ _Ｂ （ｔ）の相加平均となる関数ｆで
    ｎ _ＡＢ （ｔ）＝｛Ｆ _Ａ （ｔ）＋Ｆ _Ｂ （ｔ）｝／２
    によって前記光子数解析データｎ _ＡＢ （ｔ）を生成することを特徴とする請求項７記載の蛍光解析方法。
11. 前記測定結果解析ステップにおいて、前記光子数解析データｎ_ＡＢ（ｔ）に対し、前記蛍光解析として、自己相関解析またはフォトンバースト解析の少なくとも一方を行うことを特徴とする請求項７〜１０のいずれか一項記載の蛍光解析方法。
12. 前記励起光は単一波長領域の励起光であり、前記第１蛍光成分及び前記第２蛍光成分は同一波長領域の蛍光成分であることを特徴とする請求項７〜１１のいずれか一項記載の蛍光解析方法。
13. 前記測定試料に加える前記蛍光プローブとして１種類の蛍光プローブのみを用いるとともに、前記測定試料に含まれる標的分子に２個以上の同一種類の前記蛍光プローブが結合する場合の前記蛍光解析に適用されることを特徴とする請求項７〜１２のいずれか一項記載の蛍光解析方法。

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