JP4879543B2

JP4879543B2 - 蛍光分光分析装置

Info

Publication number: JP4879543B2
Application number: JP2005282687A
Authority: JP
Inventors: 淳一西村; 明美鈴木
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2005-09-28
Filing date: 2005-09-28
Publication date: 2012-02-22
Anticipated expiration: 2025-09-28
Also published as: JP2007093371A

Description

本発明は、蛍光分光分析装置に関する。

蛍光相関分光分析法（ＦＣＳ法）は、顕微鏡視野の微小観測領域内で蛍光分子のブラウン運動が作り出す光の揺らぎを解析することにより、蛍光強度の自己相関関数を求め、分子毎の拡散時間や平均分子数を解析する手法であり、例えば非特許文献１に詳述されている。

蛍光相互相関分光分析法（ＦＣＣＳ法）は、異なる蛍光信号間の相互相関関数を求めることにより、両者の関連性を解析する手法で、２色の蛍光色素で標識された分子間の相互作用の解析に用いられ、例えば非特許文献２と非特許文献３に詳述されている。蛍光相互相関分光分析法は拡散時間の少ない蛋白質の相互作用などには適している。同様の解析法に共焦点蛍光コインシデンス分析（ＣＦＣＡ法）があり、これは非特許文献４に詳述されている。
「蛍光相関分光法による１分子検出」金城著、蛋白質核酸酵素、1999, vol. 44N09 1431-1438 "Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy for Multicomponent Diffusional Analysis in Solution", Petra. Schwille et al, Biophysical Journal 1997, 72, 1878-1886 Adynamic view of cellular processes by in vivo fluorescence auto- and cross-correlation spectroscopy, Petra. Schwille et al, Methods 29 (2003) 74-85 Confocal fluorescence coincidence analysis (CFCA), Winkler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 1375-1378, 1999

相互相関分光分析法（ＦＣＣＳ法）において、蛍光スペクトルに重なりがある２つの蛍光色素を用いた場合、クロストークによる測定誤差の影響を受け、正確に相互相関演算することができない。

本発明は、このような実状を考慮してなされたものであり、その目的は、クロストークによる測定誤差の影響を受けずに正確に相互相関演算できる蛍光分光装置を提供することである。

本発明による蛍光分光分析装置は、波長または強度の異なる励起光を選択的に試料の特定部位に照射する励起光学手段と、前記励起光の照射に応じて前記試料から発生する蛍光を検出する蛍光検出手段と、前記蛍光検出手段が検出した前記蛍光に対応する信号またはデータを生成する信号処理手段と、前記信号処理手段により生成される前記信号またはデータを利用した前記蛍光の揺らぎの相関分析演算を行なうために、前記波長または強度の異なる前記励起光の照射に応じて発生したそれぞれの蛍光に対応する前記信号またはデータごとに、当該相関分析演算のための重み係数を変更する演算手段とを備えている。前記励起光学手段は、異なる波長の光を発する複数の光源と、当該光源の発する異なる波長の光の中から前記試料に照射される光を選択するために通過帯域を制御可能な音響光学素子とを含む。前記蛍光検出手段は、前記異なる波長または強度の励起光の照射に応じてそれぞれ発生する蛍光ごとに分離して検出を行なう。

本発明によれば、クロストークによる測定誤差の影響を受けずに正確に相互相関演算できる蛍光分光装置が提供される。

以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。

本発明の実施形態について説明する前に、まず、図１８を参照しながら、相互相関分光分析法（ＦＣＣＳ法）におけるクロストーク発生のしくみについて説明する。図１８は、蛍光スペクトルに重なりがある２つの蛍光色素においてクロストークが発生している場合の様子を表している。図１８において、第１励起スペクトルを持つ第１蛍光色素に第１励起光を照射すると、第１蛍光スペクトルを持つ第１蛍光が第１蛍光色素から発生する。第１蛍光は、フィルターを用いて第１光信号検出範囲内の波長の光を選択的に検出することにより検出される。また、第２励起スペクトルを持つ第２蛍光色素に第２励起光を照射すると、第２蛍光スペクトルを持つ第２蛍光が第２蛍光色素から発生する。第２蛍光は、フィルターを用いて第２光信号検出範囲内の波長の光を選択的に検出することにより検出される。図１８から明らかなように、第１蛍光スペクトルの右すそが第２光信号検出範囲に重なっている。このため、第２蛍光を検出する際に第１蛍光も一緒に検出されてしまい、これがクロストークとなる。その結果、相互相関分光分析法（ＦＣＣＳ法）においては、クロストークによる測定誤差の影響を受け、正確に相互相関演算することができない。

＜第一実施形態＞
図１は、本発明の第一実施形態の蛍光分光分析装置を概略的に示している。図１に示されるように、蛍光分光分析装置１００は、励起光学系１１０と蛍光検出部１４０と信号処理部１５０と演算部１６０とを有している。励起光学系１１０は、励起光を生成する励起光照射部１２０と、試料Ｓが載せられるステージ１１２と、対物レンズ１１４と、励起光と蛍光を分離するダイクロイックミラー１１６とを有している。

蛍光分光分析装置１００はさらに、異なる波長の励起光が時間をずらして排他的に試料Ｓに照射されるように励起光照射部１２０を制御する励起光制御部１３０を有している。従って、励起光照射部１２０は、波長または強度の異なる励起光を選択的に試料Ｓの特定部位に照射する。励起光の波長または強度は時系列的に変更される。

試料Ｓは、異なる波長の励起光が照射される部位に、異なる波長の励起光にそれぞれ反応して蛍光を発する異なる色素を含んでいる。異なる色素の蛍光スペクトルは少なくとも一部重なっている。

蛍光検出部１４０は、励起光の照射に応じて試料Ｓから発生する蛍光を検出する。蛍光検出部１４０は、異なる波長または強度の励起光の照射に応じてそれぞれ発生する蛍光ごとに分離して検出を行なう。

信号処理部１５０は、蛍光検出部１４０が検出した蛍光に対応する信号またはデータを生成する。演算部１６０は、信号処理部１５０により生成される信号またはデータを利用して前記蛍光の揺らぎの相関分析演算を行なう。その際、演算部１６０は、波長または強度の異なる励起光の照射に応じて発生したそれぞれの蛍光に対応する信号またはデータごとに相関分析演算のためのパラメータ（例えば後述する重み係数）を変更する。例えば演算部１６０は、それぞれの蛍光に対応した出力信号同士の比較に基づいて自己相関分析または相互相関分析または共焦点蛍光コインシデンス分析解析する。

図２は、励起光照射部１２０の構成例を示している。この例では、励起光照射部１２０は、第１光源１２２ａと、第２光源１２２ｂと、ミラー１２４ａと、ダイクロイックミラー１２４ｂと、音響光学素子（ＡＯＴＦ）１２６とから構成されている。第１光源１２２ａと第２光源１２２ｂは互いに波長帯域が異なる第１励起光と第２励起光をそれぞれ発する。ミラー１２４ａは第１光源１２２ａから発せられた第１励起光を図１の対物レンズ１１４に向けて反射する。ダイクロイックミラー１２４ｂは、ミラー１２４ａで反射された第１励起光を透過し、第２光源１２２ｂから発せられた第２励起光を図１の対物レンズ１１４に向けて反射する。第１光源１２２ａと第２光源１２２ｂは連続的に駆動され、第１励起光と第２励起光をそれぞれ発し続ける。音響光学素子１２６は、通過帯域を制御可能であり、図１の励起光制御部１３０から供給される励起光操作信号に応じて、第１励起光と第２励起光のいずれか一方を選択的に透過する。つまり音響光学素子１２６は、第１光源１２２ａと第２光源１２２ｂの発する異なる波長の光の中から試料Ｓに照射される光を選択する。励起光操作信号は時系列的に変化する信号であり、音響光学素子１２６は第１励起光と第２励起光を交互に透過する。

図３は、励起光照射部１２０の別の構成例を示している。この例では、励起光照射部１２０は、第１光源１２２ａと、第２光源１２２ｂと、ミラー１２４ａと、ダイクロイックミラー１２４ｂと、切替器１２８とから構成されている。第１光源１２２ａと第２光源１２２ｂとミラー１２４ａとダイクロイックミラー１２４ｂの機能は図２の例と同様である。さらに第１光源１２２ａと第２光源１２２ｂはオンオフ制御可能である。切替器１２８は、図１の励起光制御部１３０から供給される励起光操作信号に応じて、第１光源１２２ａと第２光源１２２ｂのいずれか一方を選択的にオンにし、他方を選択的にオフにする。つまり切替器１２８は、発光する光源を選択する。励起光操作信号は時系列的に変化する信号であり、第１光源１２２ａと第２光源１２２ｂが交互にオンされる。その結果、試料Ｓに第１励起光と第２励起光が交互に照射される。つまり切替器１２８は、第１光源１２２ａと第２光源１２２ｂの発する異なる波長の光の中から試料Ｓに照射される光を選択する。

図１に戻り、蛍光検出部１４０は、ダイクロイックミラー１４２と、第１蛍光フィルター１４４ａと、第２蛍光フィルター１４４ｂと、第１受光素子１４６ａと、第２受光素子１４６ｂとから構成されている。第１蛍光フィルター１４４ａは第１蛍光を選択的に透過し、第２蛍光フィルター１４４ｂは第２蛍光を選択的に透過する。第１受光素子１４６ａは第１蛍光の波長帯域に感度を有し、第２受光素子１４６ｂは第２蛍光の波長帯域に感度を有している。つまり第１受光素子１４６ａと第２受光素子１４６ｂは、異なる波長帯域に感度を有している。

以下、図４のフローチャートを参照しながら、本実施形態の蛍光分光分析装置の動作について説明する。

励起光制御部１３０は励起光操作信号を生成し、これを励起光照射部１２０に出力する。励起光操作信号は、図５に示されるように、周期的に変化する「０」と「１」の二値信号である。

励起光照射部１２０が図２の構成の場合、音響光学素子１２６は、励起光操作信号が「０」のときに第１励起光を選択的に透過し、励起光操作信号が「１」のときに第２励起光を選択的に透過する。

また励起光照射部１２０が図３の構成の場合、切替器１２８は、励起光操作信号が「０」のときに第１光源１２２ａを選択的にオンし、励起光操作信号が「１」のときに第２光源１２２ｂを選択的にオンにする。

その結果、試料Ｓに照射される励起光は、図５に示されるように、第１励起光と第２励起光が交互に切り替わるものとなる。

励起光の照射に応じて試料Ｓから蛍光が発生する。第１受光素子１４６ａは、第１励起光の照射に応じて試料Ｓから発生する第１蛍光を検出し、図５に示される第１蛍光検出信号を信号処理部１５０に出力する。第２受光素子１４６ｂは、第２励起光の照射に応じて試料Ｓから発生する第２蛍光を検出し、図５に示される第２蛍光検出信号を信号処理部１５０に出力する。

信号処理部１５０は、蛍光検出部１４０の第１受光素子１４６ａと第２受光素子１４６ｂからそれぞれ供給される第１蛍光検出信号と第２蛍光検出信号を一定時間ごとの蛍光強度信号に変換し、その蛍光強度信号と励起光制御信号を最適な形で組み合わせて演算用データを生成し、これを演算部１６０に出力する。

演算部１６０は、信号処理部１５０から供給される演算用データに基づいて自己相関分析または相互相関分析または共焦点蛍光コインシデンス分析を実施する。

以下、重み係数（相関分析のためのパラメータ）を用いたマルチプルτ方式相関関数のデータ解析について述べる。このデータ解析では、各蛍光検出信号からデータテーブルと重み係数テーブルを作成し、各蛍光のデータと重み係数中の第１蛍光と第２蛍光のデータと重み係数を用いて自己相関と相互相関計算を行なう。

相関関数の演算を行なう際、データと重み係数の計算用チャンネルはオクターブ方式を用い、データと重み係数の計算を数少ない有限個のチャンネルの結果に制限し、同間隔の計算結果のプロットを実現する。さらに、先に異なるτ領域において、異なる遅延時間相当分のデータ平均値と重み係数平均値を計算する。蛍光のデータと重み係数による諸処理は、１つのデータまたは重み係数を計算最小単位とする。

以下、具体例として、マルチプルτ方式について、図６Ａと図６Ｂのフローチャートに沿って説明する。

［ステップＳ０］
試料についての測定データとして、第１蛍光と第２蛍光の時系列測定データを取得する。取得した時系列データの補間方法による連続信号は図５に示した通りである。

［ステップＳ１］
取得データが存在するか否かを判断し、Ｙｅｓの場合はステップＳ２に進み、Ｎｏの場合はイメージング判断のステップＳ１８に入る。

［ステップＳ２］
読み込みデータ数をカウントする。このデータ総数は、チャンネル計算、総合計算などに用いる。

［ステップＳ３］
マルチプルτ方式のプロットτ値（チャンネル値）とチャンネル数などを計算する。マルチプルτ方式は読み込んだデータの総数によりチャンネル数を決める。具体的な計算方法は、図７に示されるように、ビンタイムτ_０を基準値として最初の１６個のチャンネル値とし、以降の８個ごとのチャンネル値はビンタイムτ_０が２倍に増える値を基準値とする。

別の言い方をすれば、最初の１６個のチャンネルを０段とし、それ以降、８個のチャンネルごとに１段、２段、・・・と分ける。各段のチャンネル値の増分（基準値）は、段の数をｎとして、２^ｎτ_０とする。例えば、０段のチャンネル値の増分はτ_０であり、２段のチャンネル値の増分は４τ_０である。

必要なチャンネル数は、ビンタイムと読み込んだデータの総数に基づいて算出される。

［ステップＳ４とＳ５］
蛍光の識別を行なう。ステップＳ４において、第１蛍光検出信号に対して、励起光が第１励起光の場合には、入力データは第１蛍光の有効なデータとしてステップＳ６以降で処理され、励起光が第２励起光の場合には、入力データはステップＳ５においてゼロとして処理され、励起光が第１励起光でも第２励起光でもない場合には、同様に第１蛍光のデータはステップＳ５でゼロとして補間される。また第２蛍光検出信号に対しては、励起光が第２励起光の場合には、入力データが第２蛍光の有効なデータとしてステップＳ６以降で処理され、励起光が第１励起光の場合には、第１蛍光のデータはステップＳ５でゼロとして処理され、励起光が第２励起光でも第１励起光でもない場合には、同様に第２蛍光のデータはステップＳ５でゼロとして補間される。

［ステップＳ６］
データ抽出を行なう。まず、第１蛍光検出信号に対して、第１蛍光のデータを抽出し、それを第１蛍光に相当する位置に埋め込み、ほかの蛍光（第２蛍光）に相当する位置にはデータ０を埋め込む。その結果、図８に示される第１蛍光のデータテーブルが作成される。同様に、第２蛍光についても別のデータテーブルを作成する。その結果、第１蛍光と第２蛍光に対して二枚のデータテーブルがそれぞれ構成される。

［ステップＳ７］
信号またはデータが欠落する期間の解析結果に対する影響を防止するため、信号またはデータが欠落する期間と、それ以外の期間との間で異なる重み付けを行なう。このための重み係数テーブルを作成する。励起光を時系列で切り替えながら測定した場合、検出データには、データの大きさの情報のほかに励起光の種類（すなわち蛍光の種類）の情報が含まれている。マルチプルτ方式では蛍光の種類の情報を重み係数として計算に用いる。第１蛍光と第２蛍光に対してデータ測定が行なわれた場合、データ数１個（重み係数＝１）で表す。第１蛍光検出信号に対して、第１蛍光に相当する位置には１という重み係数を埋め込み、そのほかの蛍光に相当する位置には０という重み係数を埋め込む。その結果、図９に示される第１蛍光の重み係数テーブルが作成される。同様に、第２蛍光についても別の重み係数テーブルを作成する。すなわち、第１蛍光または第２蛍光それぞれに対応するデータごとに演算に用いられるパラメータとしての重み係数が変更されたテーブルが作成される。その結果、第１蛍光と第２蛍光に対して二枚の重み係数テーブルがそれぞれ構成される。

［ステップＳ８］
データ再構成を行なう。つまり、基準値（増分）が異なる各チャンネルの最初チャンネルのデータを計算する。第１蛍光と第２蛍光のデータテーブルにより、蛍光ごとに和計算処理を行なう。チャンネル１６以降の遅延時間τは、８チャンネルごとに基準値（増分）を２倍に増しているため、各チャンネルのデータは基準値（増分）が２倍に増える前の二つのデータ和からなる。具体的なデータの変化は図１０の通りである。第１蛍光と第２蛍光において、それぞれの和計算の処理を行なうことにより、データ分割テーブルから次々と新しい基準値（増分）を有するチャンネルのデータが形成され、新しいデータテーブルが構成される。

別の言い方をすれば、読み込んだすべてのデータの並びを０行目のデータ列とし、そのうちの隣接する二つずつを足し算して、その並びを１行目のデータ列とする。それ以降、同様の操作に繰り返して、２行目のデータ列、３行目のデータ列、・・・を作る。この操作は、チャンネルの段数と同じ行数のデータ列を得るまで続ける。このようにして得られたデータテーブルにおいて、各行のデータは、それぞれ、各段のチャンネルに対応している。例えば、２行０列目のデータは、２段０列目のチャンネルに対応している。

［ステップＳ９］
重み係数再構成を行なう。つまり、基準値（増分）が異なる各チャンネルの最初チャンネルの重み係数を計算する。第１蛍光と第２蛍光の重み係数テーブルにより、蛍光ごとに和計算処理を行なう。重み係数テーブルの変化はステップＳ８と同様に、和計算処理の経過とともに、次々と新しい基準値（増分）を有するチャンネルの重み係数が形成され（図１１）、新しい重み係数テーブルが構成される。

別の言い方をすれば、すべての重み係数の並びを０行目の重み係数列とし、そのうちの隣接する二つずつを足し算して、その並びを１行目の重み係数列とする。それ以降、同様の操作に繰り返して、２行目の重み係数列、３行目の重み係数列、・・・を作る。この操作は、チャンネルの段数と同じ行数の重み係数列を得るまで続ける。このようにして得られた重み係数テーブルにおいて、各行の重み係数は、それぞれ、各段のチャンネルに対応している。

［ステップＳ１０］
第１蛍光のデータＩ_Ｄ１に対して、データ間の積和計算を行なう。つまり、図１２に示されるように、第１蛍光の同じ基準値（増分）を有するチャンネル位置のデータと０列目データとの掛け算をし、その和を算出する。言い換えれば、各段のチャンネルに対応する第１蛍光のデータ列において、最初のデータとほかの各データとの積の和を求める。次に、第２蛍光のデータＩ_Ｄ２に対して、データ間の積和計算を行なう。つまり、同様な処理を第２蛍光に対して行ない、第２蛍光の同じ基準値（増分）を有するチャンネル位置のデータと０列目データとの掛け算をし、その和を算出する。言い換えれば、各段のチャンネルに対応する第２蛍光のデータ列において、最初のデータとほかの各データとの積の和を求める。

［ステップＳ１１］
第１蛍光の重み係数Ｗ_Ｄ１に対して、重み係数間の積和計算を行なう。つまり、第１蛍光の同じ基準値（増分）を有するチャンネル位置の重み係数と０列目重み係数との掛け算をし、その和を算出する。言い換えれば、各段のチャンネルに対応する第１蛍光の重み係数列において、最初の重み係数とほかの各重み係数との積の和を求める。次に、第２蛍光の重み係数Ｗ_Ｄ２に対して、重み係数間の積和計算を行なう。つまり、同様な処理を第２蛍光に対して行ない、第２蛍光の同じ基準値（増分）を有するチャンネル位置の重み係数と０列目重み係数との掛け算をし、その和を算出する。言い換えれば、各段のチャンネルに対応する第２蛍光の重み係数列において、最初の重み係数とほかの各重み係数との積の和を求める。

［ステップＳ１２］
第１蛍光のデータＩ_Ｄ１と重み係数Ｗ_Ｄ１に対して、０列目データと重み係数との積和計算を行なう。つまり、第１蛍光の同じ基準値（増分）を有するチャンネル位置の重み係数と０列目データとの掛け算をし、その和を算出する。言い換えれば、各段のチャンネルに対応する第１蛍光のデータ列と重み係数列において、データ列の最初のデータと重み係数列の各重み係数との積の和を求める。次に、第２蛍光のデータＩ_Ｄ２と重み係数Ｗ_Ｄ２に対して、データと重み係数との積和計算を行なう。つまり、同様な処理を第２蛍光に対して行ない、第２蛍光の同じ基準値（増分）を有するチャンネル位置の重み係数と０列目データとの掛け算をし、その和を算出する。言い換えれば、各段のチャンネルに対応する第１蛍光のデータ列と重み係数列において、データ列の最初のデータと重み係数列の各重み係数との積の和を求める。

［ステップＳ１３］
第１蛍光の重み係数Ｗ_Ｄ１とデータＩ_Ｄ１に対して、０列目重み係数とデータとの積和計算を行なう。つまり、第１蛍光の同じ基準値（増分）を有するチャンネル位置のデータと０列目重み係数との掛け算をし、その和を算出する。言い換えれば、各段のチャンネルに対応する第１蛍光のデータ列と重み係数列において、重み係数列の最初の重み係数とデータ列の各データとの積の和を求める。次に、第２蛍光の重み係数Ｗ_Ｄ２とデータＩ_Ｄ２に対して、重み係数とデータとの積和計算を行なう。つまり、同様な処理を第２蛍光に対して行ない、第２蛍光の同じ基準値（増分）を有するチャンネル位置のデータと０列目重み係数との掛け算をし、その和を算出する。言い換えれば、各段のチャンネルに対応する第２蛍光のデータ列と重み係数列において、重み係数列の最初の重み係数とデータ列の各データとの積の和を求める。

［ステップＳ１４］
第１蛍光と第２蛍光のデータＩ_Ｄ１とＩ_Ｄ２に対して、第１蛍光と第２蛍光のデータ間の積和計算を行なう。つまり、図１３に示されるように、同じ基準値（増分）を有する第２蛍光のチャンネル位置のデータと第１蛍光の０列目データとの掛け算をし、その和を算出する。言い換えれば、各段のチャンネルに対応する第１蛍光のデータ列と第２蛍光のデータ列において、第１蛍光のデータ列の最初のデータと第２蛍光のデータ列の各データとの積の和を求める。

［ステップＳ１５］
第１蛍光と第２蛍光の重み係数Ｗ_Ｄ１、Ｗ_Ｄ２に対して、第１蛍光と第２蛍光の重み係数間の積和計算を行なう。つまり、同じ基準値（増分）を有する第２蛍光のチャンネル位置の重み係数と第１蛍光の０列目の重み係数との掛け算をし、その和を算出する。言い換えれば、各段のチャンネルに対応する第１蛍光の重み係数列と第２蛍光の重み係数列において、第１蛍光の重み係数列の最初の重み係数と第２蛍光の重み係数列の各重み係数との積の和を求める。

［ステップＳ１６］
第１蛍光のデータＩ_Ｄ１と第２蛍光の重み係数Ｗ_Ｄ２に対して、第１蛍光の０列目データと第２蛍光の重み係数間の積和計算を行なう。つまり、同じ基準値（増分）を有する第２蛍光のチャンネル位置の重み係数と第１蛍光の０列目のデータとの掛け算をし、その和を算出する。言い換えれば、各段のチャンネルに対応する第１蛍光のデータ列と第２蛍光の重み係数列において、第１蛍光のデータ列の最初のデータと第２蛍光の重み係数列の各重み係数との積の和を求める。

［ステップＳ１７］
第１蛍光の重み係数Ｗ_Ｄ１と第２蛍光のデータＩ_Ｄ２に対して、第１蛍光の０列目重み係数と第２蛍光のデータとの積和計算を行なう。つまり、同じ基準値（増分）を有する第２蛍光のチャンネル位置のデータと第１蛍光の０列目の重み係数との掛け算をし、その和を算出する。言い換えれば、各段のチャンネルに対応する第２蛍光のデータ列と第１蛍光の重み係数列において、第２蛍光のデータ列の最初のデータと第１蛍光の重み係数列の各重み係数との積の和を求める。

［ステップＳ１８］
演算終了とイメージングの判断を行なう。Ｙｅｓの場合には総合相関計算に入り、Ｎｏの場合にはデータ取得ステップＳ１に戻る。

［ステップＳ１９］
データの読み込みが終了した場合（ステップＳ２１がＹｅｓの場合）、上述した諸計算結果に基づいて、自己相関関数の推定と相互相関関数の推定とを行なう。つまり、Ｄ１→Ｄ２とＤ１→Ｄ１とＤ２→Ｄ２の各相関方向に対してそれぞれ異なる解析式を用いて相関関数を推定する。

例えば、Ｄ１→Ｄ１とＤ２→Ｄ２に対しては（Ｓ１０＊Ｓ１１）／（Ｓ１２＊Ｓ１３）の計算式を用い、Ｄ１→Ｄ２に対しては（Ｓ１４＊Ｓ１５）／（Ｓ１６＊Ｓ１７）の計算式を用いる。

例えば、相互相関関数の解析式は下記の（１）式のように表現できる。

上記の各式中、ｍｌＦ_ＤＲ_ＤＳｕｍ（τ_ν）はデータ間の積和計算を示し、ｍｌＷ_ＤＶ_ＤＳｕｍ（τ_ν）は重み係数の積和計算を示す。また、ｍｌＦ_ＤＶ_ＤＳｕｍ（τ_ν）は０列目データと重み係数の積和計算を示し、ｍｌＷ_ＤＲ_ＤＳｕｍ（τ_ν）は０列目重み係数とデータの積和計算を示す。ここで、添字のＤはＤ１またはＤ２であり、計算対象のデータすなわち第１蛍光に対応するデータまたは第２蛍光に対応するデータに対応している。なお、Ｆ_Ｄ１，Ｒ_Ｄ２は、和計算によるデータＤ１，Ｄ２の再構成データを表わし、Ｗ_Ｄ１，Ｖ_Ｄ２は、データＦ_Ｄ１，Ｒ_Ｄ２の計算に用いるデータ数（重み係数）を表わしている。

（１）式は、下記の（２）式の相互相関解析式に基づいている。また（２）式の相互相関解析式は、（３）式の汎用相互相関関数に対して重み付けを適用することにより導出される。（３）式は、Ｎ_１＝Ｎ_２＝Ｎ_１２であれば（９）式と表現できる。

［ステップＳ２０］
各最終計算結果に基づいて、相互相関関数のカーブ表示などの処理を行なう。

本実施形態では、蛍光のゆらぎの相関分析演算は、信号処理部１５０により生成される信号またはデータのうち、波長または強度の異なる励起光の照射に応じてそれぞれ発生する蛍光に対応する信号またはデータごとにパラメータを変更して行なわれる。このため、クロストークによる測定誤差の影響を受けずに正確な相互相関演算を行なえる。

＜第二実施形態＞
図１４は、本発明の第二実施形態の蛍光分光分析装置を概略的に示している。本実施形態の蛍光分光分析装置２００は、蛍光検出部２４０と信号処理部２５０のほかは、第一実施形態の蛍光分光分析装置１００と同様である。

蛍光検出部２４０は、マルチバンドフィルター２４２と受光素子２４４とから構成されている。マルチバンドフィルター２４２は第１蛍光と第２蛍光を選択的に透過する。受光素子２４４は第１蛍光と第２蛍光を検出可能な受光帯域を有している。つまり、受光素子２４４は、異なる励起光による異なる波長の蛍光を検出可能な受光帯域を有している。

本実施形態では、蛍光検出部２４０から出力される検出信号は、図１５に示されるように、第１蛍光と第２蛍光が交互に混在している時系列混在信号となる。図１５においてＤ１とＤ２はそれぞれ第１蛍光と第２蛍光の検出の時間範囲を示している。つまり、この信号には、第１蛍光と第２蛍光の検出信号が交互に含まれていて、時間で分割することができる。時系列混在信号には、実際には、第１蛍光と第２蛍光の検出の時間範囲のほかに、第１励起光と第２励起光を切り替える間の時間範囲も存在するが、図１５では省略している。

この時系列混在信号は信号処理部２５０に送られ、蛍光ごとの信号に分割され処理される。つまり、信号処理部２５０は、図１５の時系列混在信号から、図１６に示される疑似第１蛍光検出信号と、図１７に示される疑似第２蛍光検出信号とを抽出する。第１蛍光検出信号については、励起光照射部１２０が第１蛍光を照射している期間の蛍光強度だけを抽出して第１蛍光の情報とし、その以外の期間の情報はゼロとする。同様に、第１蛍光検出信号については、励起光照射部１２０が第２蛍光を照射している期間の蛍光強度だけを抽出して第２蛍光の情報とし、その以外の期間の情報はゼロとする。このようにして信号処理部２５０は、蛍光検出部２４０から出力される揺らぎ信号に基づいて疑似第１蛍光検出信号と疑似第２蛍光検出信号とを生成する。

疑似第１蛍光検出信号と疑似第２蛍光検出信号は、その後、第一実施形態で説明した第１蛍光検出信号と第２蛍光検出信号と同様に処理される。

これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。

本発明の第一実施形態の蛍光分光分析装置を概略的に示している。図１に示された励起光照射部の構成例を示している。図１に示された励起光照射部の別の構成例を示している。図１に示された蛍光分光分析装置の動作のフローチャートを示している。図１に示された蛍光分光分析装置における信号のタイムチャートを示している。図１の信号処理部による演算用データ生成と演算部による解析処理とのフローチャートの一部を示している。図１の信号処理部による演算用データ生成と演算部による解析処理とのフローチャートの一部を示している。チャンネルの構造と値を示している。図５の第１蛍光検出信号に対応する第１蛍光のデータを示している。図８のデータに対応する第１蛍光の分割重み係数を示している。第１蛍光と第２蛍光のデータを再構成して得たデータテーブルを示している。第１蛍光と第２蛍光の重み係数を再構成して得た重み係数テーブルを示している。第１蛍光のデータ間の積和計算を示している。第１蛍光と第２蛍光のデータ間の積和計算を示している。本発明の第二実施形態の蛍光分光分析装置を概略的に示している。図１４の装置において得られる第１蛍光と第２蛍光の揺らぎに対応する揺らぎ信号を含む時系列混在信号を示している。図１５の時系列混在信号から抽出された疑似第１蛍光検出信号を示している。図１５の時系列混在信号から抽出された疑似第２蛍光検出信号を示している。蛍光スペクトルに重なりがある２つの蛍光色素においてクロストークが発生する様子を表している。

符号の説明

１００…蛍光分光分析装置、１１０…励起光学系、１１２…ステージ、１１４…対物レンズ、１１６…ダイクロイックミラー、１２０…励起光照射部、１２２ａ…光源、１２２ｂ…光源、１２４ａ…ミラー、１２４ｂ…ダイクロイックミラー、１２６…音響光学素子、１２８…切替器、１３０…励起光制御部、１４０…蛍光検出部、１４２…ダイクロイックミラー、１４４ａ…蛍光フィルター、１４４ｂ…蛍光フィルター、１４６ａ…受光素子、１４６ｂ…受光素子、１５０…信号処理部、１６０…演算部、２００…蛍光分光分析装置、２４０…蛍光検出部、２４２…マルチバンドフィルター、２４４…受光素子、２５０…信号処理部。

Claims

波長または強度の異なる励起光を選択的に試料の特定部位に照射する励起光学手段と、
前記励起光の照射に応じて前記試料から発生する蛍光を検出する蛍光検出手段と、
前記蛍光検出手段が検出した前記蛍光に対応する信号またはデータを生成する信号処理手段と、
前記信号処理手段により生成される前記信号またはデータを利用した前記蛍光の揺らぎの相関分析演算を行なうために、前記波長または強度の異なる前記励起光の照射に応じて発生したそれぞれの蛍光に対応する前記信号またはデータごとに、当該相関分析演算のための重み係数を変更する演算手段とを具備し、
前記励起光学手段は、異なる波長の光を発する複数の光源と、当該光源の発する異なる波長の光の中から前記試料に照射される光を選択するために通過帯域を制御可能な音響光学素子とを含み、
前記蛍光検出手段は、前記異なる波長または強度の励起光の照射に応じてそれぞれ発生する蛍光ごとに分離して検出を行なうことを特徴とする蛍光分光分析装置。
前記蛍光検出手段は、異なる波長帯域に感度を有する複数の受光素子で構成されていることを特徴とする請求項１に記載の蛍光分光分析装置。
前記蛍光検出手段は、前記異なる励起光による異なる波長の蛍光を検出可能な受光帯域を有するひとつの受光素子で構成されていることを特徴とする請求項１に記載の蛍光分光分析装置。