KR102021488B1 - 광학현미경의 광 검출방법 - Google Patents

광학현미경의 광 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 형광물질이 염색된 샘플의 한 지점로부터 방출되는 형광빛을 검출하여 이를 전기적 신호인 펄스로 변환하고, 변환된 펄스를 이용하여 그 지점의 형광농도를 계산하는 광학현미경의 광 검출방법에 관한 것으로서, 센싱단계와, 산출단계와, 환산단계와, 초점 이동단계를 포함한다. 센싱단계는 형광물질이 염색된 샘플의 제1지점에 여기광을 조사하여 다수의 광자를 방출시키고, 다수의 광자를 변환하여 전기적 펄스 신호를 생성하는 단계이다. 산출단계는 전기적 펄스 신호를 계수(count)하여, 전기적 펄스 신호의 수가 미리 설정된 기준 소요시간 내에 미리 설정된 기준 검출개수에 이를 경우 기준 소요시간까지 계수될 전기적 펄스 신호의 수로 환산된 환산 검출개수를 산출하고, 전기적 펄스 신호의 수가 기준 소요시간까지 기준 검출개수에 이르지 못할 경우 기준 소요시간까지 계수된 전기적 펄스 신호의 수인 실제 검출개수를 산출한다. 환산단계는 전기적 펄스 신호의 수가 미리 설정된 기준 소요시간 내에 미리 설정된 기준 검출개수에 이를 경우 환산 검출개수를 기준 소요시간으로 나누거나 또는 전기적 펄스 신호의 수가 기준 소요시간까지 기준 검출개수에 이르지 못할 경우 실제 검출개수를 기준 소요시간으로 나누어 제1지점의 형광농도를 환산한다. 초점 이동단계는 여기광의 초점 위치를 제1지점과 다른 제2지점으로 이동시키는 단계이다.

Description

광학현미경의 광 검출방법{Optical detection method of optical microscope}
본 발명은 광학현미경의 광 검출방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 형광물질이 염색된 샘플의 한 지점로부터 방출되는 형광빛을 검출하여 이를 전기적인 펄스 신호로 변환하고, 변환된 전기적 펄스 신호를 이용하여 그 지점의 형광농도를 계산하는 광학현미경의 광 검출방법에 관한 것이다.
일반적으로, 광학현미경은 육안으로 식별이 불가능한 샘플의 특정부위를 일정 배율로 확대하고, 그 상태를 확인 및 검사하는데 사용된다. 광학현미경은 볼록렌즈와 오목렌즈를 조합한 일반적인 생물현미경 외에 위상차 현미경, 간섭현미경, 형광현미경, 자외선 현미경, 실체현미경, 암시야 현미경, 도립현미경, 금속현미경 등이 있으며 사용목적에 따라 선택적으로 사용된다.
이 중 형광현미경은 샘플의 원하는 지점에 레이저빔과 같은 여기광을 조사하고, 여기서 방출되는 광자를 검출하는 광센서의 초점을 동시에 일치시켜 상의 선명도를 극대화시킨 현미경으로서, 샘플을 고정해야 하는 전자현미경과는 달리 움직이는 관찰 대상체의 내부까지 쉽게 관찰할 수 있기 때문에 생물학, 법의학, 식품공학, 병리학 등의 분야에서 주로 사용되고 있다.
종래의 형광현미경은 이와 같은 광자들을 샘플의 각 지점(또는 픽셀)마다 검출하고, 이를 전기적 펄스 신호로 변환한 후, 단위시간당 펄스 신호의 수로 환산한다. 환산된 펄스 신호의 수가 상대적으로 많으면 밝게, 환산된 펄스 신호의 수가 상대적으로 적으면 어둡게 처리하여 샘플의 전체적인 3차원 영상을 구현하게 된다.
종래의 형광현미경은 샘플의 각 지점(dot) 또는 각 픽셀(pixel)에서 높은 신호대잡음비(signal to noise ratio, 신호에 동반하는 잡음 성분의 비)가 얻어지도록, 여기광의 초점 위치를 여기광의 세기와 관계없이 각 픽셀마다 일정 시간 이상 체류시킨다. 이로 인해, 샘플의 3차원 영상을 구현하는데 소요되는 시간이 샘플의 전체 픽셀수 및 각 픽셀 체류시간의 곱에 비례하여 길어지는 문제점이 있었다.
대한민국 등록특허공보 제10-0500610호(2005.07.11. 등록 공고, 발명의 명칭 : 형광 현미경 및 이를 사용한 관측 방법)
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 샘플의 3차원 영상의 품질은 그대로 유지하면서 3차원 영상의 구현 시간은 단축할 수 있는 광학현미경의 광 검출방법을 제공함에 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 광학현미경의 광 검출방법은, 형광물질이 염색된 샘플의 제1지점에 여기광을 조사하여 다수의 광자를 방출시키고, 상기 다수의 광자를 변환하여 전기적 펄스 신호를 생성하는 센싱단계; 상기 전기적 펄스 신호를 계수(count)하여, 상기 전기적 펄스 신호의 수가 미리 설정된 기준 소요시간 내에 미리 설정된 기준 검출개수에 이를 경우 상기 기준 소요시간까지 계수될 전기적 펄스 신호의 수로 환산된 환산 검출개수를 산출하고, 상기 전기적 펄스 신호의 수가 상기 기준 소요시간까지 상기 기준 검출개수에 이르지 못할 경우 상기 기준 소요시간까지 계수된 전기적 펄스 신호의 수인 실제 검출개수를 산출하는 산출단계; 상기 전기적 펄스 신호의 수가 상기 기준 소요시간 내에 상기 기준 검출개수에 이를 경우 상기 환산 검출개수를 상기 기준 소요시간으로 나누거나 또는 상기 전기적 펄스 신호의 수가 상기 기준 소요시간까지 상기 기준 검출개수에 이르지 못할 경우 상기 실제 검출개수를 상기 기준 소요시간으로 나누어 상기 제1지점의 형광농도를 환산하는 환산단계; 및 상기 여기광의 초점 위치를 상기 제1지점과 다른 제2지점으로 이동시키는 초점 이동단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 광학현미경의 광 검출방법은, 형광물질이 염색된 샘플의 제1지점에 여기광을 조사하여 다수의 광자를 방출시키고, 상기 다수의 광자를 변환하여 전기적 펄스 신호를 생성하는 센싱단계; 상기 전기적 펄스 신호를 계수(count)하여, 상기 전기적 펄스 신호의 수가 미리 설정된 기준 소요시간 내에 미리 설정된 기준 검출개수에 이를 경우 상기 기준 검출개수를 산출하고, 상기 전기적 펄스 신호의 수가 상기 기준 소요시간까지 상기 기준 검출개수에 이르지 못할 경우 상기 기준 소요시간까지 계수된 전기적 펄스 신호의 수인 실제 검출개수를 산출하는 산출단계; 상기 전기적 펄스 신호의 수가 상기 기준 소요시간 내에 상기 기준 검출개수에 이를 경우 상기 기준 검출개수를 상기 기준 검출개수에 이를 때까지의 시간인 검출 소요시간으로 나누거나 또는 상기 전기적 펄스 신호의 수가 상기 기준 소요시간까지 상기 기준 검출개수에 이르지 못할 경우 상기 실제 검출개수를 상기 기준 소요시간으로 나누어 상기 제1지점의 형광농도를 환산하는 환산단계; 및 상기 여기광의 초점 위치를 상기 제1지점과 다른 제2지점으로 이동시키는 초점 이동단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 광학현미경의 광 검출방법에 있어서, 상기 여기광은, 계수 포화(photon counting saturation)가 발생하는 포화 휘도보다 작은 휘도로 상기 샘플에 조사될 수 있다.
본 발명의 광학현미경의 광 검출방법에 있어서, 상기 기준 검출개수는, 명목(nominal) 신호대잡음비에 대응되는 표준 검출개수 이상으로 설정될 수 있다.
본 발명의 광학현미경의 광 검출방법에 있어서, 상기 기준 소요시간은, 최소 신호대잡음비에 대응되는 픽셀 체류시간으로 설정될 수 있다.
본 발명의 광학현미경의 광 검출방법에 따르면, 정해진 시간이 아닌, 기준 검출개수 또는 기준 소요시간을 이용하여 샘플의 각 지점의 형광농도를 산출함으로써, 영상 획득 시간을 획기적으로 단축시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 광학현미경의 광 검출방법에 따르면, 여기광을 계수 포화(photon counting saturation)가 발생하는 포화 휘도보다 작은 휘도로 샘플에 조사함으로써, 계수포화에 따른 영상 감도 저하를 방지할 수 있다.
또한, 본 발명의 광학현미경의 광 검출방법에 따르면, 기준 검출개수를 최소한의 영상 대비(minimum image contrast)가 가능한 명목(nominal) 신호대잡음비에 대응되는 표준 검출개수로 설정함으로써, 영상의 품질은 일정수준 이상 유지하면서 영상의 구현 시간을 보다 단축할 수 있다.
또한, 본 발명의 광학현미경의 광 검출방법에 따르면, 기준 소요시간을 광센서에서 식별 가능한 최소 신호대잡음비에 대응되는 픽셀 체류시간으로 설정함으로써, 영상의 구현 시간 측면에서 유리한 효과를 얻을 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 광학현미경의 광 검출방법이 수행되는 흐름을 개략적으로 나타낸 도면이고,
도 2는 도 1의 광학현미경의 광 검출방법의 블록도이고,
도 3은 종래의 광학현미경의 광 검출방법과 본 발명의 일 실시예에 따른 광학현미경의 광 검출방법의 차이점을 설명하기 위한 도면이고,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 광학현미경의 광 검출방법에 있어서, 여기광의 휘도에 따라 계수기에서 계수되는 계수값의 변화를 나타낸 그래프이고,
도 5는 기준 검출개수에 따른 신호대잡음비의 변화를 나타낸 그래프이고,
도 6은 픽셀 체류시간에 따른 신호대잡음비의 변화를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명에 따른 광학현미경의 광 검출방법의 실시예들을 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 광학현미경의 광 검출방법이 수행되는 흐름을 개략적으로 나타낸 도면이고, 도 2는 도 1의 광학현미경의 광 검출방법의 블록도이고, 도 3은 종래의 광학현미경의 광 검출방법과 본 발명의 일 실시예에 따른 광학현미경의 광 검출방법의 차이점을 설명하기 위한 도면이고, 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 광학현미경의 광 검출방법에 있어서, 여기광의 휘도에 따라 계수기에서 계수되는 계수값의 변화를 나타낸 그래프이고, 도 5는 기준 검출개수에 따른 신호대잡음비의 변화를 나타낸 그래프이고, 도 6은 픽셀 체류시간에 따른 신호대잡음비의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 1 내지 도 6을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 광학현미경의 광 검출방법은 형광물질(미도시)이 염색된 샘플(S)의 한 지점로부터 방출되는 형광빛을 검출하여 이를 전기적 펄스 신호(C)로 변환하고, 변환된 전기적 펄스 신호(C)를 이용하여 그 지점의 형광농도를 계산하는 광학현미경의 광 검출방법에 관한 것으로서, 센싱단계(S1)와, 산출단계(S2)와, 환산단계(S3)와, 초점 이동단계(S4)를 포함한다.
상기 센싱단계(S1)는 형광물질이 염색된 샘플(S)의 제1지점(S1)에 여기광(L)을 조사하여 다수의 광자(P)를 방출시키고, 다수의 광자(P)를 변환하여 전기적 펄스 신호(C)를 생성하는 단계이다.
형광물질이 염색된 샘플(S)에 제1파장의 여기광(L)을 조사하면, 하나의 광자에 의해 형광물질(즉, 형광물질의 전자)의 에너지 레벨은 그라운드 에너지 레벨에서 상위 에너지 레벨로 여기된다. 여기된 형광물질의 상위 에너지 레벨은 주변 물질과의 충돌 등으로 인해 하위 에너지 레벨(<상위 에너지 레벨)로 전이되고, 다시 그라운드 에너지 레벨로 전이된다. 하위 에너지 레벨에서 그라운드 에너지 레벨(<하위 에너지 레벨)로 전이될 때, 형광물질은 제1파장보다 긴 제2파장을 갖는 광자(P)를 방출한다.
샘플(S)에서 방출되는 다수의 광자(P)는 형광물질에 포함된 형광분자가 생성시킨 다수의 광자(P)로 이루어질 수 있다.
도 1과 도 4를 참조하면, 여기광(L)의 휘도(Lp)가 높아짐에 따라 샘플(S)에서 방출되는 광자(P)의 수(Pn)도 증가하게 되는데, 펄스 계수기(20)는 이러한 광자(P)의 수(Pn)에 비례하는 계수값(W)을 산출하다가 펄스 계수기(20)의 분해능, 즉 광자(P)의 수(Pn)가 포화점(Wo)을 초과하는 지점부터는 계수값(W)이 지수적으로 감소하면서 계수포화 현상이 발생하게 된다.
이는 샘플(S)로부터 방출되는 광자(P)의 수(Pn)가 많아져 광자(P)들 사이의 시간 차가 줄어들면, 서로 인접한 광자(P)들에 의해 발생되는 전기적 펄스 신호(C)들을 제대로 계수하지 못하고 하나의 전기적 펄스 신호(C)로 인식하기 때문이다. 이와 같이 계수포화(counting saturation) 상태에 이르게 되면, 그 지점이 다른 지점보다 더 밝음에도 불구하고 동일 명암으로 처리됨으로써, 영상의 감도(또는 해상도)가 저하되는 문제가 발생하게 된다.
따라서, 여기광(L)은 계수 포화(photon counting saturation)가 발생하는 포화 휘도(Lp')보다 작은 휘도로 샘플(S)에 조사되는 것이 바람직하다.
상기 산출단계(S2)는 도 3에 도시된 바와 같이 전기적 펄스 신호(C)를 계수(count)하여, 전기적 펄스 신호(C)의 수가 미리 설정된 기준 소요시간(t1) 내에 미리 설정된 기준 검출개수(N1)에 이를 경우 기준 소요시간(t1)까지 계수될 전기적 펄스 신호의 수로 환산된 환산 검출개수를 산출하고, 전기적 펄스 신호(C)의 수가 기준 소요시간(t1)까지 기준 검출개수(N1)에 이르지 못할 경우 기준 소요시간(t1)까지 계수된 전기적 펄스 신호(C)의 수인 실제 검출개수(N2)를 산출하는 단계이다.
여기서 기준 검출개수(N1)는 도 5에 도시된 바와 같이 최소한의 영상 대비(minimum image contrast)가 가능한 명목(nominal) 신호대잡음비(SN1)에 대응되는 표준 검출개수(N3)로 설정하여, 영상의 품질은 일정수준 이상 유지하면서 영상의 구현 시간을 보다 단축하는 것이 바람직하다.
종래에는 샘플(S)의 각 픽셀(pixel)마다 충분한 신호대잡음비(SN)가 얻어지도록, 여기광(L)의 초점 위치를 샘플(S)의 각 픽셀에 일정시간 이상 체류하였다. 신호대잡음비(SN)는 원하는 신호의 크기와 잡음 신호의 크기의 비율로서, 이 수치가 높을수록 영상의 질도 높아진다.
만약, 여기광(L)의 초점이 픽셀에 체류하는 시간을 나타내는 픽셀 체류시간(tp)이 도 6에 도시된 바와 같이 영상 구현에 필요한 최소 신호대잡음비(SN2)에 대응되는 픽셀 체류시간(tp')보다 짧아지게 되면, 신호대잡음비(SN)도 영상 구현에 필요한 최소 신호대잡음비(SN2)보다 낮아지게 된다. 따라서, 사용자가 영상을 명확하게 식별하기 어려워진다.
이 때문에 종래에는 여기광(L)의 초점을 샘플(S)의 각 픽셀에 최소 신호대잡음비(SN2)에 대응되는 픽셀 체류시간(tp') 이상으로 위치시켰다. 결국, 각각의 픽셀에서 발생되는 전기적 펄스 신호(C)의 수와 관계없이 여기광(L)의 초점 위치를 각 픽셀마다 일정 시간 이상 체류시켰기 때문에, 샘플(S)의 3차원 영상을 구현하는데 소요되는 시간이 샘플(S)의 전체 픽셀수 및 각 픽셀 체류시간의 곱에 비례하여 길어질 수밖에 없었다.
그러나, 본 실시예에 따른 광학현미경의 광 검출방법은 도 3에 도시된 바와 같이 계수하고자 하는 기준 검출개수(N1))를 미리 정해 놓고, 기준 소요시간(t1) 내에 기준 검출개수(N1)에 도달되면 전기적 펄스 신호(C)의 수를 산출하고 샘플(S)의 다음 픽셀로 이동할 수 있다.
예를 들면, 도 3의 (a)에 도시된 바와 같이, 전기적 펄스 신호(C)의 수가 기준 소요시간(t1)인 1초 이내인 0.8초(검출 소요시간(t2))에 기준 검출개수(N1)인 100개에 이를 경우, 여기광(L) 조사를 멈추고 기준 소요시간(t1)까지 계수될 전기적 펄스 신호(C)의 수로 환산된 수인 125개를 환산 검출개수로 산출한다.
또한, 형광신호가 매우 약하여 샘플(S)에서 방출되는 광자의 수가 적으면 전기적 펄스 신호(C)의 수도 그만큼 줄어들게 되어 검출 소요시간이 매우 길어지거나 무한해질 수 있기 때문에, 전기적 펄스 신호(C)의 수가 기준 소요시간(t1)까지 기준 검출개수(N1)에 이르지 못할 경우 기준 소요시간(t1)까지 계수된 전기적 펄스 신호(C)의 수인 실제 검출개수(N2)를 산출한다.
예를 들면, 도 3의 (b)에 도시된 바와 같이, 전기적 펄스 신호(C)의 수가 기준 소요시간(t1)인 1초까지 기준 검출개수(N1)인 100개에 이르지 못하고 80개일 경우 기준 소요시간(t1)인 1초까지 계수된 전기적 펄스 신호(C)의 수인 80개를 실제 검출개수(N2)를 산출한다.
이와 같이 본 실시예에 따른 광학현미경의 광 검출방법은 정해진 시간이 아닌, 기준 검출개수(N1) 또는 기준 소요시간(t1)을 이용하여 샘플(S)의 각 지점의 형광농도를 산출하기 때문에 종래의 광학현미경의 광 검출방법보다 영상 획득 시간을 획기적으로 단축할 수 있는 것이다.
여기서 기준 소요시간(t1)은 도 6에 도시된 바와 같이 영상 구현에 필요한 최소 신호대잡음비(SN2)에 대응되는 픽셀 체류시간(tp')으로 설정하는 것이 바람직하다. 픽셀 체류시간(tp)이 길어질수록 영상의 명암 대비는 더욱 명확해지기는 하나, 영상의 명암 대비에 영향을 미치는 신호대잡음비(SN)는 픽셀 체류시간(tp)의 제곱근에 비례하여 증가하기 때문에, 픽셀 체류시간(tp)이 길어질수록 신호대잡음비(SN)가 향상되는 비율은 점점 감소한다. 따라서, 기준 소요시간(t1)을 광센서(10)에서 식별 가능한 최소 신호대잡음비(SN2)에 대응되는 픽셀 체류시간(tp')으로 설정하는 것이 영상의 구현 시간 측면에서 유리하다.
상기 환산단계(S3)는 도 1 내지 도 3에 도시된 바와 같이, 전기적 펄스 신호(C)의 수가 기준 소요시간(t1) 내에 기준 검출개수(N1)에 이를 경우 환산 검출개수를 기준 소요시간(t1)으로 나누거나 또는 전기적 펄스 신호(C)의 수가 기준 소요시간(t1)까지 기준 검출개수(N1)에 이르지 못할 경우 실제 검출개수(N2)를 기준 소요시간(t1)으로 나누어 샘플(S)의 제1지점(S1)의 형광농도를 환산한다.
예를 들어, 전기적 펄스 신호(C)의 수가 기준 소요시간(t1)인 1초 이내인 0.8초(검출 소요시간(t2))에 기준 검출개수(N1)인 100개에 이를 경우, 환산 검출개수로는 125개가 산출되고, 이를 통해 환산기(30)에서는 샘플(S)의 제1지점(S1)의 형광농도를 125로 환산한다.
한편, 전기적 펄스 신호(C)의 수가 기준 소요시간(t1)인 1초까지 기준 검출개수(N1)인 100개에 이르지 못하고 80개일 경우, 실제 검출개수(N2)로는 80개가 산출되고, 이를 통해 환산기(30)에서는 샘플(S)의 제1지점(S1)의 형광농도를 80으로 환산한다.
결국, 환산기(30)를 통해 환산되는 값에 따라 여기광(L)을 조사한 지점의 명암을 결정하여, 명암 대비에 의한 샘플(S)의 전체적인 영상정보를 얻게 된다. 환산기(30)에서 환산된 값이 상대적으로 크면 그 지점을 밝게 처리하고, 그 값이 상대적으로 작으면 그 지점을 어둡게 처리하는 것이다.
상기 초점 이동단계(S4)는 여기광(L)의 초점 위치를 제1지점(S1)과 다른 제2지점(미도시)으로 이동시키는 단계이다. 초점 이동단계(S4)는 여기광(L)의 초점 위치를 2차원 횡방향으로 이동시켜 주는 2차원 광학 스캐너(미도시)와, 여기광(L)의 초점 위치를 3차원 축방향으로 이동키는 3차원 이송장치(미도시) 등을 사용하여 수행될 수 있다.
한편, 본 발명의 다른 실시예에 따른 광학현미경의 광 검출방법은, 산출단계와, 환산단계에 있어서 본 발명의 일 실시예에 따른 광학현미경의 광 검출방법와 차이가 있다. 센싱단계와, 초점 이동단계는 실질적으로 동일하므로, 반복되는 설명은 생략한다.
본 실시예의 산출단계는 전기적 펄스 신호(C)를 계수(count)하여, 전기적 펄스 신호(C)의 수가 미리 설정된 기준 소요시간(t1) 내에 미리 설정된 기준 검출개수(N1)에 이를 경우 기준 검출개수(N1)를 산출하고, 전기적 펄스 신호(C)의 수가 기준 소요시간(t1)까지 기준 검출개수(N1)에 이르지 못할 경우 기준 소요시간(t1)까지 계수된 전기적 펄스 신호(C)의 수인 실제 검출개수(N2)를 산출한다.
예를 들면, 전기적 펄스 신호(C)의 수가 기준 소요시간(t1)인 1초 이내인 0.8초(검출 소요시간(t2))에 기준 검출개수(N1)인 100개에 이를 경우, 여기광(L) 조사를 멈추고 검출 소요시간(t2)까지 검출된 100개를 산출한다.
전기적 펄스 신호(C)의 수가 기준 소요시간(t1)인 1초까지 기준 검출개수(N1)인 100개에 이르지 못하고 80개일 경우, 기준 소요시간(t1)인 1초까지 계수된 전기적 펄스 신호(C)의 수인 80개를 실제 검출개수(N2)를 산출한다.
본 실시예의 환산단계는, 전기적 펄스 신호(C)의 수가 기준 소요시간(t1) 내에 기준 검출개수(N1)에 이를 경우 기준 검출개수(N1)를 기준 검출개수(N1)에 이를 때까지의 시간인 검출 소요시간(t2)으로 나누거나 또는 전기적 펄스 신호(C)의 수가 기준 소요시간(t1)까지 기준 검출개수(N1)에 이르지 못할 경우 실제 검출개수(N2)를 기준 소요시간(t1)으로 나누어 제1지점(S1)의 형광농도를 환산한다.
예를 들면, 전기적 펄스 신호(C)의 수가 기준 소요시간(t1)인 1초 이내인 0.8초(검출 소요시간(t2))에 기준 검출개수(N1)인 100개에 이를 경우, 기준 검출개수로는 100개가 산출되고, 이를 통해 환산기(30)에서는 샘플(S)의 제1지점(S1)의 형광농도를 125(=100/0.8)로 환산한다.
전기적 펄스 신호(C)의 수가 기준 소요시간(t1)인 1초까지 기준 검출개수(N1)인 100개에 이르지 못하고 80개일 경우, 실제 검출개수(N2)로는 80개가 산출되고, 이를 통해 환산기(30)에서는 샘플(S)의 제1지점(S1)의 형광농도를 80(=80/1.0)으로 환산한다.
상술한 바와 같이 구성된 본 발명의 광학현미경의 광 검출방법은, 정해진 시간이 아닌, 기준 검출개수 또는 기준 소요시간을 이용하여 샘플의 각 지점의 형광농도를 산출함으로써, 영상 획득 시간을 획기적으로 단축시킬 수 있는 효과를 얻을 수 있다.
또한, 상술한 바와 같이 구성된 광학현미경의 광 검출방법은, 여기광을 계수 포화(photon counting saturation)가 발생하는 포화 휘도보다 작은 휘도로 샘플에 조사함으로써, 계수포화에 따른 영상 감도 저하를 방지할 수 있는 효과를 얻을 수 있다.
또한, 상술한 바와 같이 구성된 광학현미경의 광 검출방법은, 기준 검출개수를 최소한의 영상 대비(minimum image contrast)가 가능한 명목(nominal) 신호대잡음비에 대응되는 표준 검출개수로 설정함으로써, 영상의 품질은 일정수준 이상 유지하면서 영상의 구현 시간을 보다 단축할 수 있는 효과를 얻을 수 있다.
또한, 상술한 바와 같이 구성된 광학현미경의 광 검출방법은, 기준 소요시간을 광센서에서 식별 가능한 최소 신호대잡음비에 대응되는 픽셀 체류시간으로 설정함으로써, 영상의 구현 시간 측면에서 유리한 효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 권리범위는 상술한 실시예 및 변형례에 한정되는 것이 아니라 첨부된 특허청구범위 내에서 다양한 형태의 실시예로 구현될 수 있다. 특허청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 변형 가능한 다양한 범위까지 본 발명의 청구범위 기재의 범위 내에 있는 것으로 본다.
S1 : 센싱단계
S2 : 산출단계
S3 : 환산단계
S4 : 초점 이동단계
S : 샘플
S1 : 제1지점
L : 여기광
P : 광자
C : 전기적 펄스 신호
N1 : 기준 검출개수
N2 : 실제 검출개수
t1 : 기준 소요시간

Claims (5)

  1. 형광물질이 염색된 샘플의 제1지점에 여기광을 조사하여 다수의 광자를 방출시키고, 상기 다수의 광자를 변환하여 전기적 펄스 신호를 생성하는 센싱단계;
    상기 전기적 펄스 신호를 계수(count)하여, 상기 전기적 펄스 신호의 수가 미리 설정된 기준 소요시간 내에 미리 설정된 기준 검출개수에 이를 경우 상기 기준 소요시간까지 계수될 전기적 펄스 신호의 수로 환산된 환산 검출개수를 산출하고, 상기 전기적 펄스 신호의 수가 상기 기준 소요시간까지 상기 기준 검출개수에 이르지 못할 경우 상기 기준 소요시간까지 계수된 전기적 펄스 신호의 수인 실제 검출개수를 산출하는 산출단계;
    상기 전기적 펄스 신호의 수가 상기 기준 소요시간 내에 상기 기준 검출개수에 이를 경우 상기 환산 검출개수를 상기 기준 소요시간으로 나누거나 또는 상기 전기적 펄스 신호의 수가 상기 기준 소요시간까지 상기 기준 검출개수에 이르지 못할 경우 상기 실제 검출개수를 상기 기준 소요시간으로 나누어 상기 제1지점의 형광농도를 환산하는 환산단계; 및
    상기 여기광의 초점 위치를 상기 제1지점과 다른 제2지점으로 이동시키는 초점 이동단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 광학현미경의 광 검출방법.
  2. 형광물질이 염색된 샘플의 제1지점에 여기광을 조사하여 다수의 광자를 방출시키고, 상기 다수의 광자를 변환하여 전기적 펄스 신호를 생성하는 센싱단계;
    상기 전기적 펄스 신호를 계수(count)하여, 상기 전기적 펄스 신호의 수가 미리 설정된 기준 소요시간 내에 미리 설정된 기준 검출개수에 이를 경우 상기 기준 검출개수를 산출하고, 상기 전기적 펄스 신호의 수가 상기 기준 소요시간까지 상기 기준 검출개수에 이르지 못할 경우 상기 기준 소요시간까지 계수된 전기적 펄스 신호의 수인 실제 검출개수를 산출하는 산출단계;
    상기 전기적 펄스 신호의 수가 상기 기준 소요시간 내에 상기 기준 검출개수에 이를 경우 상기 기준 검출개수를 상기 기준 검출개수에 이를 때까지의 시간인 검출 소요시간으로 나누거나 또는 상기 전기적 펄스 신호의 수가 상기 기준 소요시간까지 상기 기준 검출개수에 이르지 못할 경우 상기 실제 검출개수를 상기 기준 소요시간으로 나누어 상기 제1지점의 형광농도를 환산하는 환산단계; 및
    상기 여기광의 초점 위치를 상기 제1지점과 다른 제2지점으로 이동시키는 초점 이동단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 광학현미경의 광 검출방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 여기광은, 계수 포화(photon counting saturation)가 발생하는 포화 휘도보다 작은 휘도로 상기 샘플에 조사되는 것을 특징으로 하는 광학현미경의 광 검출방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 기준 검출개수는, 명목(nominal) 신호대잡음비에 대응되는 표준 검출개수 이상으로 설정되는 것을 특징으로 하는 광학현미경의 광 검출방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 기준 소요시간은, 최소 신호대잡음비에 대응되는 픽셀 체류시간으로 설정되는 것을 특징으로 하는 광학현미경의 광 검출방법.
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