KR100500610B1 - 형광 현미경 및 이를 사용한 관측 방법 - Google Patents

형광 현미경 및 이를 사용한 관측 방법 Download PDF

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KR100500610B1 KR10-2003-0075916A KR20030075916A KR100500610B1 KR 100500610 B1 KR100500610 B1 KR 100500610B1 KR 20030075916 A KR20030075916 A KR 20030075916A KR 100500610 B1 KR100500610 B1 KR 100500610B1
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Abstract

본 발명은 형광 현미경 장치 및 이를 사용한 관측 방법에 관한 것으로, 광학적 잡음을 감소시키고, 보다 감도 높은 이미지를 얻을 수 있어 형광 물질의 농도, 양 및 위치 등에 관한 정확한 정보를 얻는 것이 가능하며, 여기 및 형광 파장의 범위가 다른 다수의 형광 물질이 분포된 경우에도 구별된 이미지의 동시 처리가 가능하여 그 각각에 대한 정보를 용이하게 얻을 수 있도록 한다. 본 발명의 형광 현미경은: 대물 렌즈; 형광 물질을 포함하는 하나 이상의 미세 객체를 수용하며, 형광 물질을 여기 시키기 위한 여기 광의 경로를 제공하며, n1의 굴절율을 갖는 제1 매질부; 및 제1 매질부와 대물 렌즈 사이의 위치에 설치되며, 제1 매질부와 접한 경계면에서 제1 매질부를 통해 입사된 여기 광을 전반사하며, n3의 굴절율을 갖는 제3 매질부를 포함하며, 여기서 제3 매질부와 제1 매질부의 굴절율은, n1 > n3 의 관계를 만족하며, 여기 광의 경계면에 대한 입사각은 임계각 이상이며, 제1 매질부 내의 여기 광의 통과 경로 내에 존재하는 미세 객체에 포함된 형광 물질이 여기 되어 방출하는 형광을 대물렌즈에 의하여 포착함으로써 미세 객체를 관측한다.

Description

형광 현미경 및 이를 사용한 관측 방법{FLUORESCENT MICROSCOPE AND METHOD FOR MEASUREMENT USING THE SAME}
본 발명은 형광 현미경 장치 및 이를 사용한 시료 관측 방법에 관한 것으로, 보다 상세히는, 우선, 광학적 잡음을 감소시키고, 보다 감도 높은 이미지를 얻을 수 있어 형광 물질의 농도, 양 및 위치 등에 관한 정확한 정보를 얻는 것이 가능하며, 나아가서, 여기 및 형광 파장의 범위가 다른 다수의 형광 물질이 분포된 경우에도 구별된 이미지의 동시 처리가 가능하여 그 각각에 대한 정보를 용이하게 얻을 수 있도록 하는 새로운 형광 현미경 장치 및 이를 사용한 시료 관측 방법에 관한 것이다.
본 발명은 광학 장비인 형광(fluorescence) 현미경에 관련된 것이며, 유전체 칩 등의 바이오 칩(bio-chip)의 형광 분석을 비롯한 다양한 생체 의학(biomedical) 분야에서 형광을 이용한 미세 시료의 상세 관찰을 위해 사용되는 기술에 관한 것이다. 형광 현미경은 마이크로 객체(micro-object)에 광을 조사하고, 조사된 광에 의하여 객체에서 여기(excitation) 및 형광(fluorescence) 방출 과정을 거쳐 방출되는 형광을 포착하여 마이크로 객체의 이미지 등 정보를 관측하는 장치이다.
종래 기술의 형광 현미경은, 도 1에 나타낸 바와 같이, 광원(5) 앞에 설치된 여기 필터(10) 및 차폐 필터들과 색선별 거울(dichroic mirror)(15) 등의 조합으로 구성된 광 분리기에 의해 여기광(excitation light)(12) 및 형광 방출광(emission)(13)의 경로를 분리한다. 색선별 거울(15)의 표면에 마련된 간섭 코팅 막은 여기광(12)을 잘 반사하고, 더 긴 파장을 갖는 형광 방출광(13)을 잘 통과시키는 특성을 갖고 있기 때문에, 여기광(12)은 CCD 카메라(40) 쪽으로는 잘 도달하지 못하며, 시편(25)에 존재하는 마이크로 객체로부터 방출되는 형광 방출 광(13)이 주로 도달하게 된다. 이러한 광 조사 방식은 마이크로 객체로부터 방출되는 고유 파장의 형광을 이용하기 때문에, 원리적으로 현미경의 콘덴서(condenser)를 통해 객체에 광을 조사하여 객체로부터의 산란 광을 관측하는 이전의 방식에 비해 명암 대비(contrast)가 개선된 이미지를 얻을 수 있도록 하며, 일반적인 형광 현미경에서 널리 사용되고 있다.
그러나 도 1에 도시된 바와 같이, 대물렌즈(20)를 전후로 하여, 여기광(12) 및 형광 방출 광(13)의 경로가 공간적으로 일치하는 부분이 존재하기 때문에, 대물렌즈(20)의 광학 구성 성분들로부터 발생하는 고유 형광(autofluorescence) 및 대물렌즈(20) 내부와 표면에 존재하는 산란원이나 형광 발생원들에 의한 밝은 부위(hot spots)들의 형성에 의하여 광학적 잡음(noise)(55, 50, 45)이 야기되게 된다. 이러한 광학적 잡음은 형성된 형광 이미지(fluorescence image)의 명암 대비를 낮추게 되며, 관측 대상인 마이크로 객체에 포함된 소량의 형광물질(fluorophore)에 의해 발생하는 미약한 형광의 정확한 식별(registration)을 어렵게 한다.
또한, 위의 종래 기술의 형광 현미경과 같이 여기광(12)과 형광 방출광(13)이 대물렌즈(20)를 전후로 하여 같은 경로를 거치도록 하고, 그러한 상황에서 CCD 카메라 등의 관측부(40)에 여기광이 도달하는 것을 막기 위해 광 경로에 광 스펙트럼의 선별적 선택을 하는 요소(예를 들면,위의 색선별 거울)(15)를 사용하는 구성에서는, 다색의 안료(dye)들에 의해 착색된 표본을 한 화면에서 비교하는 등의 관측이 근본적으로 불가능하게 된다.
위와 같은 문제점을 극복하기 위하여, 도 2에 도시된 바와 같이, 여기광(12)이 대물렌즈(20)를 거치지 않도록 하여, 여기광(12) 및 형광 방출광(13)의 공간적인 경로를 분리하는 방식이 제안된 바 있다(예를 들어, 광원(5)과 광섬유(60)를 조합하여 분석 객체에 광을 조사하는 방식인, 미국의 Applied Precision 사의 Biochip Reader인, 제품명 "Array WoRx"). 이러한 방식은, 도시된 바와 같이 대물렌즈(20)의 광축 방향에 대해 비스듬한 각도에서 객체에 광을 조사함으로써, 여기광(12)이 대물렌즈(20)를 거치지 않게 하여 광학 잡음의 양을 감소시킨다. 그러나, 이러한 방식의 경우 대물렌즈(20)와 대상 객체(25) 사이에 상당한 여유 공간(S)이 필요하게 되며, 그에 따라 높은 개구수(numerical aperture)를 갖는 대물렌즈(20)의 사용을 어렵게 만든다. 그 외에 대상 객체(25)와 현미경의 여러 표면으로부터 발생하는 산란 광이 대물렌즈에 들어가게 되어 광학 잡음의 발생을 피하기 어렵다는 문제를 갖고 있다.
도 3에는 광학 잡음을 보다 감소시키기 위하여, 완전 내부 반사를 이용하여 여기광(140)을 조사하는 형광 현미경 방법(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy: TIRFM)을 도시하였다. 이 방법에서는, 굴절율이 다른 두 매질의 경계에서 입사각이 임계각(critical angle)을 넘을 경우에 발생하는 전반사를 이용하여 여기광(140)과 형광 방출광의 경로를 분리하며, 광학적으로 밀도가 작은 매질에서 발생하는 감쇠 파(evanescent wave)(130)를 경계면 근처에 배치된 마이크로 객체(110)의 형광 여기(120)를 위해 사용하는 구조이다.
이러한 구성에서는 도 3과 같이, 관측 대상 객체는 굴절율 n1을 갖는 매질 1에 위치한다. 관측 대상 객체(110)에는 형광물질이 포함되어 있으며, 형광물질이 여기광의 작용에 의해 형광을 발산한다는 점에서는 상술한 종래의 형광 현미경과 차이가 없다. 조사되는 광선은 매질 2를 통과하여, θ의 입사 각도를 갖고 매질 2와 매질 1의 경계면 방향으로 향한다. 매질들의 굴절율이 n2 > n1의 관계를 만족할 경우, 광선의 입사각이 θ > θc = sin-1 (n1/n2)의 관계를 만족할 경우(여기서 θc는 입사 임계각임), 매질 1과 매질 2의 경계면에서 완전 내부 반사(total internal reflection, TIR) 현상이 일어나는 것이 알려져 있으며, 경계면에서 반사된 광선은 매질 2로 완전히 되돌아가게 된다.
두 매질의 분리 경계에 입사되는 전자기 방사선(electromagnetic radiation)의 극히 일부는 경계면을 투과하여 도 3의 z축 방향에서 그 세기가 지수적으로 감쇠하여 소멸하게 되고, 매질 1의 내부로 전파하지는 못하게 된다. 따라서, 매질 1의 경계면 근처의 극히 일부 영역(130)에 지수적으로 그 세기가 감쇠하는 에버네센트(evanescent) 파의 전파가 일어나게 된다. 매질 1의 경계면을 z=0 이라 하면, z 축 방향에서의 에버네센트 파의 강도는 다음과 같은 관계식을 따른다.
I(z)= I0 e-z/d
여기서 d=(λ0/4π)(n2 2 sinθ- n1 2)-1/2
에버네센트 파는 경계면 근처에 존재하는 마이크로 객체(120)에 포함된 형광 물질을 여기 시키는 작용을 할 수 있으며, 매질 1에서 에버네센트 파의 투과되는 깊이는 일반적으로 수백 나노미터를 초과하지 않는다. 따라서, 이 방법은 경계면 근처의 얇은 두께의 영역(130)에 존재하는 미세 객체를 관측하기에 적합하나, 상술한 바와 같이 에버네센트 파는 그 세기가 낮으므로, 검출되는 광의 감도가 지극히 낮다는 문제점이 있고, 항상 경계면 근처에 존재하는 미세 객체들만이 관측된다는 문제점을 갖고 있어, 일정 부피 내에 분포된 마이크로 객체들의 관측용으로는 적합하지 않다는 문제점을 갖고 있다.
이러한 완전 내부 반사를 이용한 형광 현미경(TIRFM)은 다음의 두 가지 방식에 의해 구현되고 있다. 이들은, (1) 대물렌즈가 배치된 방향으로부터 경계면 쪽으로 광이 공급되는 구조와, (2) 대물렌즈의 반대 방향으로부터 경계면 쪽으로 광이 공급되는 구조이다.
상술한 (1)의 구조는 미국 특허 공개 번호 제2002-97489호에서 제공된다. 이 구조를 도 4에 예시하였다. 이러한 구조를 역위 현미경(inverted microscope)이라고 하며, 대물렌즈들 중 가장 말단의 렌즈(151)와, 시편(145)과, 덮개유리(147)와, 유침 오일(149)이 도시되어 있다. 대물렌즈들 중 가장 말단의 렌즈(151)는 굴절율 n1을 갖는 유침 오일(immersion oil)(149)에 접해 있다.
굴절율 n2를 갖는 시편(145)은 덮개유리(147) 위에 놓여져 있다. 여기광(140)은 광원(illuminator)으로부터 입사되어, 유침 오일(149)을 통과하며, 덮개유리(147)를 거쳐 시편(145)과의 경계면에서 전반사 된다. 덮개유리(147)의 굴절율은 유침 오일(149)의 굴절율과 거의 동일하다. 에버네센트 파는 덮개유리(147)의 표면으로부터 생성되며, 덮개유리(147)에 인접한 시편 분자들로부터 형광이 방출된다. 방출된 형광은 대물렌즈(151) 하단에 배치된 다이크로매틱(dichromatic) 필터 및 방출(emission) 필터(도시되지 않음)를 거쳐 이미지 처리 장치에서 초점을 맺는다.
그러나 이러한 알려진 형광 측정 시스템은 유침 오일(149)을 포함하며, 매우 복잡하고 높은 개구수를 갖는 대물렌즈(151)를 필요로 한다. 또한 광 스펙트럼의 선별적 선택을 하는 컬러 필터 등의 구성 요소를 필요로 하기 때문에, 여기 및 형광 파장의 범위가 다른 다수의 형광 물질이 분포된 경우에 구별된 이미지를 컬러 영상을 이용하여 동시 처리하여 그 각각에 대한 정보를 얻을 수 있도록 하는 등의 작동이 불가능하다. 또한, 여기광의 조사 및 형광 방출광의 포집이 동일한 대물렌즈(151)를 사용하여 이루어지기 때문에, 대물렌즈(151)의 구성 재료로부터 발생하는 고유 형광(autofluorescence)과, 대물렌즈(151) 내부와 표면에 분포하는 산란원 등에 의한 밝은 부위들(hot spots)에 의한 광학적 잡음이 야기되어 현미경의 감도가 떨어지는 요인이 된다.
상술한 (2)의 구조는 미국 특허 제6,255,083호에 개시되어 있으며, 도 5에 그 구조를 나타내었다. 본 현미경은 파장 가변(tunable wavelength)을 갖는 가스 레이저를 광원(201)으로 사용하며, 여기광 만을 걸러내기 위해 우선 레이저 라인 필터(210)를 통과시킨다. 그 이후, 레이저 광은 덮개 슬립(203)의 바로 아래에 위치한 용융 실리카 재질의 직각 프리즘(fused-silica right angle prism)(202)로 입사한다. 시편인 관측하고자 하는 분자들은 덮개 슬립(203) 위에 위치한 완충제 용액(buffer solution)(204) 안에 놓인다.
프리즘(202)으로 입사된 레이저 광(240)은 굴절되어, 용융 실리카 직각 프리즘(202)과 완충제 용액(204) 사이의 임계각을 초과하는 각도로 입사한다. 따라서 레이저 광은 프리즘(202) 내에서 완전 내부 반사(TIR)되며, 완충제 용액(204)의 경계면에 인접한 영역에서 에버네센트 파가 발생한다. 이러한 에버네센트 파에 의해 시편(110)에서 발생한 형광(255)은 완충제에 직접 담겨진 대물렌즈(205)를 통해 포집되고, 파장에 따라 상을 부분적으로 분리하는 다-파장 뷰어(multi-wavelength viewer)(207)를 통해 카메라(208)에 객체의 상(image)을 투사한다.
상술한 완전 내부 반사를 이용하는 두 종류의 형광 현미경은, 에버네센트 파를 이용하여 단 분자층(monolayer) 정도의 범위 내에 존재하는 관측 대상들을 여기시켜 그로부터 방출되는 형광 방출광을 이용하는 방식을 사용하고 있으며, 미세한 영역의 관측에 적합하여, 세포 및 분자 생물학의 연구를 위해 좋은 수단을 제공하나, 상술한 바와 같이 에버네센트 파는 그 세기가 낮으므로, 검출되는 광의 감도가 지극히 낮다는 문제점이 있고, 항상 경계면 근처에 존재하는 미세 객체들만이 관측된다는 문제점을 갖고 있어, 일정 부피 내에 분포된 마이크로 객체들의 관측용으로는 적합하지 않다는 문제점을 갖고 있다.
또한, 상술한 종래 기술의 바이오 칩 등 마이크로 객체 측정 장치의 또 다른 문제점으로는, 각종 광학 잡음 제거와, 서로 다른 형광 방출광 파장을 갖는 수종의 형광 염료에 대응하는 광학 필터를 사용하여야 하는 점에 따라, 측정 장치가 복잡해지고 그 크기가 불필요하게 커지는 문제점을 들 수 있다.
본 발명은 이와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 광학적 잡음을 감소시키고, 보다 감도 높은 이미지를 얻을 수 있어 형광 물질의 농도, 양 및 위치 등에 관한 정확한 정보를 얻는 것이 가능하며, 나아가서, 여기 및 형광 파장의 범위가 다른 다수의 형광 물질이 분포된 경우에도 구별된 이미지의 동시 처리가 가능하여 그 각각에 대한 정보를 용이하게 얻을 수 있도록 하는 새로운 형광 현미경 장치 및 이를 사용한 시료 관측 방법을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 기존의 바이오 칩 등 마이크로 객체 측정 장치의 또 다른 단점인, 각종 광학 잡음 제거와, 수종의 광학 필터를 사용하여야 함에 따라 측정 장치가 복잡해지고 크기가 커지는 문제점을 개선하기 위해, 광학 잡음의 발생이 적어 소량의 형광 염료 측정도 용이하며, 광학 필터를 사용하지 않고 수종의 형광 염료로부터 방출되는 형광 이미지를 동시 측정하는 것이 가능한 새로운 구조의 바이오 칩 관측 장치를 제공하고자 하는 것이다.
또한, 본 발명은 상술한 에버네센트 파를 이용하는 형광 현미경과는 달리, 단분자층 뿐만이 아니라 일정 부피 내에 분포된 마이크로 객체를 여기시켜 그로부터의 형광 이미지를 높은 감도로 얻는 것이 가능하도록 하는 새로운 방식의 형광 현미경을 제공하고자 하는 것이다. 따라서, 본 발명은 상술한 종래 기술의 TIRFM 방식과는 달리, 에버네센트 장(field)의 작용 지역에서가 아니라, 시편의 전체 두께에 걸쳐 발생하는 마이크로 객체의 여기에 의한 형광을 이용하며, 본 발명자는 이러한 본 발명의 여기 방식을 '공간 여기 TIRFM(Space excitation TIRFM)' 또는 이를 줄여 'TIRFM-SE'로 명명한다.
이와 같은 목적을 달성하기 위한, 본 발명의 한 측면에 따른 형광 현미경은: 대물 렌즈; 형광 물질을 포함하는 하나 이상의 미세 객체를 수용하며, 상기 형광 물질을 여기 시키기 위한 여기 광의 경로를 제공하며, n1의 굴절율을 갖는 제1 매질부; 및 상기 제1 매질부와 상기 대물 렌즈 사이의 위치에 설치되며, 상기 제1 매질부와 접한 경계면에서 상기 제1 매질부를 통해 입사된 상기 여기 광을 전반사하며, n3의 굴절율을 갖는 제3 매질부를 포함하며,
여기서, 상기 제3 매질부와 상기 제1 매질부의 굴절율은, n1 > n3 의 관계를 만족하며, 상기 여기 광의 상기 경계면에 대한 입사각은 임계각 이상이며, 상기 제1 매질부 내의 상기 여기 광의 통과 경로 내에 존재하는 상기 미세 객체에 포함된 형광 물질이 여기 되어 방출하는 형광을 상기 대물렌즈에 의하여 포착함으로써 상기 미세 객체를 관측하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 한 측면에 의한 형광 현미경은: 대물 렌즈; 형광 물질을 포함하는 하나 이상의 미세 객체를 수용하며, 상기 형광 물질을 여기 시키기 위한 여기 광의 경로를 제공하며, n1의 굴절율을 갖는 제1 매질부; 상기 제1 매질부의 표면 중, 상기 대물렌즈를 향하는 표면을 덮으며, n4의 굴절율을 갖는 제4 매질부; 및 상기 제4 매질부와 상기 대물 렌즈 사이에 위치하며, 상기 제4 매질부와 접한 경계면에서 상기 제1 매질부 및 제4 매질부를 통해 입사된 상기 여기 광을 전반사하며, n3의 굴절율을 갖는 제3 매질부를 포함하며,
여기서, 상기 제3 매질부, 상기 제1 매질부 및 상기 제4 매질부의 굴절율은, 의 관계를 만족하며, 상기 여기 광의 상기 제4 매질부와 제3 매질부의 경계면에 대한 입사각은 임계각 이상이며, 상기 제1 매질부 내의 상기 여기 광의 통과 경로 내에 존재하는 상기 미세 객체에 포함된 형광 물질이 여기 되어 방출하는 형광을 상기 대물렌즈에 의하여 포착함으로써 상기 미세 객체를 관측하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 제4 매질부는 덮개유리이며, 상기 제4 매질부와 상기 제1 매질부 사이를 광학적으로 연결시켜주기 위한 유침 매질(optical coupling fluid)층을 제5 매질부로 더 포함하며, 상기 제5 매질부는 n5의 굴절율을 가지며, 의 관계를 만족하는 것일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 형광 현미경은: 상기 대물 렌즈가 포집한 형광에 의한 객체의 상을 화상으로 제공하는 영상 처리부; 적어도 입사면, 접촉면 및 출사면을 갖는 프리즘; 상기 프리즘의 입사면으로 여기광을 제공하는 광원; 및 상기 프리즘의 상기 접촉면 위에 형성되어 상기 형광 물질을 포함하는 하나 이상의 미세 객체를 포함하는 시편을 탑재 가능하도록 하는 광학적 연결부를 더 포함하는 것일 수 있다.
바람직하게는 본 발명의 형광 현미경은, 상기 프리즘의 출사면에 설치되며, 상기 전반사 된 여기광을 흡수하는 흡수체를 더 포함할 수 있다.
여기서, 상기 광학적 연결부는 탄성 재료로 제작되어 상기 탑재된 시편과 광학적 접촉을 용이하도록 하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 한 측면에 의한 형광 현미경을 사용한 관측 방법은: 형광 물질을 포함하는 하나 이상의 미세 객체를 수용하는 매질을 통하여 상기 형광 물질을 여기 시키기 위한 여기 광을 통과시키는 단계; 상기 여기 광이 대물렌즈에 도달하지 못하도록 상기 여기 광을 전반사 시키는 단계; 및 상기 전반사된 여기 광이 다시 상기 하나 이상의 미세 객체를 수용하는 매질을 통과하도록 하는 단계를 포함하며, 여기서, 상기 여기 광의 통과 경로 내에 존재하는 상기 미세 객체에 포함된 형광 물질이 여기 되어 방출하는 형광을 상기 대물렌즈에 의하여 포착함으로써 상기 미세 객체를 관측하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 형광 현미경은 바이오 칩 등 마이크로 시편의 형광 측정을 위해 완전 내부 반사(전반사)를 이용한 여기 방식을 사용하여 여기광과 형광 방출 광의 경로를 분리하며, 여기광이 시편을 중심으로 대물렌즈 및 광 처리부의 반대쪽에서 조사되도록 구성함에 따라, 여기광의 조사에 의해 대물렌즈 등에서 발생하는 불필요한 형광 및 산란 등을 효과적으로 차단하고, 대물 렌즈와 시편 사이에 필요한 작업 공간을 줄이고, 광 처리부 등 측정부에서는 형광 방출광 만이 도달하게 되므로 여기 광 차단용 필터 및 차폐 필터 등이 불필요하게 되어 장치가 매우 간단해지면서도 고감도를 구현할 수 있다.
또한, 상술한 공간 여기 방식을 사용함으로써 바이오 칩 등 마이크로 객체로부터 발생하는 소량의 형광 감도를 획기적으로 높일 수 있으며, 광학 필터를 사용하지 않아 다색의 형광 염료들을 한 화면에서 동시에 관측 가능하게 됨으로써 장비를 보다 간소화하고 측정의 효율을 높였다.
이하에서는 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명한다.
도 7은 본 발명의 한 바람직한 실시예에 따른 형광 현미경의 세부 구조를 도시한다. 도시된 바와 같이, 형광물질을 포함하는 관측하고자 하는 마이크로 객체(유기 분자, 섬유질, DNA, 염색체, 세포 등)는 n1의 굴절율을 갖는 제1 매질(301)에 포함되어 있으며, 제1 매질의 한쪽 면에 접하여 그 하부를 지지하고 굴절율 n2를 갖는 제2 매질(302)이 존재한다. 제2 매질(302)의 굴절율 n2는 제1 매질(301)의 굴절율 n1과 같거나 비슷하도록 조정하는 것이 가능하나, 반드시 그러할 필요는 없으며, 굴절율이 같거나 비슷하도록 조정된 경우에는 도 7에 도시된 바와 같이 제1 매질 및 제2 매질의 경계에서는 입사 광의 굴절이 거의 일어나지 않게 된다.
제1 매질의 다른 한 면은 대물렌즈(325)와 제1 매질 사이에 존재하는 n3의 굴절율을 갖는 제3 매질(303)(일반적으로 공기 매질)과 접하고 있다. 여기서, 각 매질들의 굴절율은 다음과 같은 부등식을 만족시킨다.
여기서, 제1 매질(301)과 제3 매질(303)의 경계면에 입사하는 광선의 입사각은 임계 반사각인 θc 보다 크거나 같아야 한다. 즉, 다음의 관계를 만족하여야 한다.
θ > θc = sin-1 (n3/n1)
이 경우, 제2 매질(302)로 비스듬히 입사하는 광선은 실제적으로 광선 방향의 큰 변화 없이, 제2 매질(302) 및 제1 매질(301)의 경계면을 가로지르며, 제1 매질(301) 및 제3 매질(303)의 경계면에서 완전 내부 반사를 하게 된다. 따라서, 제1 매질(301) 내에서는 완전 내부 반사 이전 및 이후의 광 경로 내에 존재하는 마이크로 객체(320)에 포함된 형광물질에 의해 형광이 방출된다. 대물렌즈(325)는 조사된 광에 의해 방출된 형광을 포집하고, 카메라 등을 포함하는 광 처리부에서 시편의 형광 화상을 형성한다.
제3 매질(303)과 경계면을 형성하는 제1 매질(301)의 표면이 충분히 고르고 매끄럽지 않은 경우에 표면에서의 여기광의 굴절 및 산란 때문에 두 매질의 경계에서 광의 누설이 발생할 수 있다. 누설된 광은 바람직하지 않은 기생광(stray light)으로, 대물렌즈에 입사하여 형광 화상의 명암 대비를 낮추며, 실제의 마이크로 객체로부터의 형광에 따른 것이 아닌 거짓 상을 형성한다. 이러한 누설광이 발생할 가능성을 줄이기 위해 도 8에 도시한 바와 같이, 제1 매질(401)의 상부 표면에 유침 매질(optical coupling fluid) 층(405)을 도포하고(n5의 굴절율을 가짐), 그 상부에 n4의 굴절율을 갖는 덮개유리(404)를 덮을 수 있다.
이 경우, 선택된 유침 매질(405)의 굴절율 n5와 덮개유리(404)의 굴절율 n4은 동일하거나 근사하도록 하여, 거의 광학적으로 동질의 매질이 되도록 할 수 있다. 즉, 가 되도록 설정할 수 있다.
도 9에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 형광 현미경의 전체 구성을 예시적으로 나타내었다. 본 실시예의 형광 현미경 장치는, 광원(411), 프리즘(430)에 의해 시편으로 여기광을 공급한다. 프리즘(430)의 상부면(433)과 슬라이드(402)의 경계에는, 굴절율을 맞추어 광학적으로 원활히 접촉시켜주는 물질 (optical coupling material)층(450)을 형성하고, 프리즘의 다른 한 면(436)에는 전반사 되어 온 여기광의 역 반사를 줄이기 위해 광흡수체(437)가 설치되었다.
슬라이드(402) 위의 제1 매질(401) 안에는 현미경에 의해 관측하고자 하는 마이크로 객체(420)가 위치하며, 덮개유리(404)에 의해 가볍게 덮여 진다. 덮개유리(404)의 밑 부분은 유침 오일 등 광학 연결 매체(optical coupling fluid)(405)를 통해 제1 매질(401)에 접촉된다. 광학 연결 매체(405)의 역할은 시료 표면의 미세한 요철 등 고르지 않은 부분을 채우고 접촉하는 매질들의 굴절율을 서로 맞추어 주는 것이다. 덮개유리(404)의 상부 표면은 공기 매질(403)을 사이에 두고, 대물렌즈(425)의 맨 앞 렌즈와 이격되어 있다.
제1 매질(401), 제2 매질인 슬라이드(402), 광학 연결 매질(450), 프리즘(430)의 굴절율은 서로 같도록 선택하는 것이 바람직하며, 제4 매질인 덮개유리(404)와 제3 매질인 공기(403)와의 경계면으로 입사하는 여기광 광선의 입사각은 입사 임계각 보다 커야 한다. 제3 매질(403)과의 경계면에서 완전 내부 반사되는 입사광 및 반사광은 마이크로 객체(420)를 지나면서, 부분적으로 마이크로 객체(420) 내의 형광 분자들에 흡수되어 형광을 발산하도록 한다. 이 경우에 시료 표본의 전체 두께에서 형광물질이 여기될 수 있게 되어, 시료의 표면 등 일부 영역이 아닌, 여기광이 지나가는 공간 전체에서 형광 물질의 여기가 일어나게 된다.
대물렌즈(425)에 의해, 마이크로 객체로부터 나오는 형광이 포집되어 상을 형성하며, CCD 카메라 등을 포함하는 영상 수신부(415)로 인입된다. 영상 수신부(415)는 기록 장치와 연결되어 영상 처리 및 분석을 통해 텔레비전 화면의 저장, 처리 및 분석을 하는 영상 처리부(416)와 접속된다.
제3 매질(403)과의 경계면에서 반사된 광선은 광학 잡음 발생을 억제시키기 위해 프리즘의 한 면에 설치된 광흡수체(437)에 의해 흡수된다.
이러한 본 발명의 형광 현미경은, 종래 기술의 형광 현미경에서 일반적으로 사용하는 여기 및 차폐 광 필터를 사용하지 않음으로써 여기광 스펙트럼의 세기 감쇠를 가져오지 않는다. 또한, 대물렌즈를 포함하는 형광 방출광의 경로에 광 스펙트럼을 선택적으로 선택하는 필터 등의 광학 요소가 존재하지 않으며, 백색광을 광원으로 하고, 수신부에 컬러 CCD 카메라와, 컬러 영상 신호 영상화 등 처리가 가능하다. 파장 뷰어(multi-wavelength viewer)를 사용함으로써, 여러 형광 물질로부터 방출되는 형광 이미지를 동시에 관측 및 기록할 수 있다. 이러한 실시예의 구성에서는, 형광 물질들 각각이 최적의 여기를 할 수 있도록 광원으로부터 자동적으로 적절한 여기 파장이 선택되며, 다 파장 뷰어(multi-wavelength viewer)를 통해 각 형광물질 자신의 형광 스펙트럼들을 통한 개별적 형광 상이 형성될 수 있다.
또한, 프리즘(430)과 슬라이드(402) 사이에, 건조한 상태에서도 원활한 광학적 접촉을 형성하는 탄성 재료로 이루어진 유침 매질(450)이 사용될 수 있다. 이것은 슬라이드(402)와 프리즘(430)의 접촉 시, 유침 오일을 얇게 칠하거나, 이를 제거하는 작업이 필요 없도록 하여, 작업의 편이성을 증가시킨다.
이하에서는 본 발명의 상기 실시예의 형광 현미경을 실제로 구현하고, 이를 사용하여 실제 마이크로 객체를 관측한 결과를 예시한다. 광원으로는, 250Watt의 단 파장 아크 수은 램프(모델명: DRSha-250-3M)와, 개구수 0.36의 석영 광섬유로 구성된 광원 시스템 또는 반도체 레이저(모델명: VM 65014, 655 H M, 25 mW, 제조원: MIDWEST LASER PRODUCTS)가 사용되었다. 대물렌즈로는 WILD HEERBRUGG 사의 Macroscope M-420 장비에 사용되는 Macrozoom 1:5를 사용하였다. 프리즘은 굴절율 1.51, 꼭지각 90도의 각도를 갖는 유리 재질로 제작되었다. 프리즘의 상부 면은 상술한 유침 매질(450)의 역할을 하는 탄성 플라스틱 재료가 덮여 졌다. 영상 수신 장치로는 칼라 CCD 시스템인 OTV-S6(Olympus), 또는 단색의 고감도 CCD 카메라시스템인 "Photometrics CoolSNAPE (ROPER SCIENTIFIC, GMBH.)" 가 사용되었다. 이를 통하여 얻어진 영상은 프레임그래버 FG/PCI-2을 통해 화면의 디지털 처리, 분석 등을 거쳐 컴퓨터 모니터에 매핑(mapping)된다. 여기광을 조사하는 광경로와 형광을 수신하는 광경로에 여기 및 차폐 필터는 설치되지 않았다.
관측은 다양한 표본 배치 방식과 객체를 사용하여 이루어졌다. 시료 표본은 a) 표본 표면이 공기 매질에 직접 접하도록 놓여지는 경우(즉, 위의 도 7과 같은 경우)와, b) 표본 표면이 유침 오일을 통해 덮개유리로 살짝 덮어져 있는 경우(즉, 위의 도 8과 같은 경우)에 대하여 각각 관측되었다.
적용례 1:
연구 객체인 다색 형광 표본과 유사한, 빨간 및 녹색 형광 염료를 사용하여, 프리즘의 면에 직접적으로 선의 형태로 표시한 경우의 영상을 도 10에 나타내었다. 광섬유를 통한 백색 광원을 사용하여 광을 조사하였으며, 광 필터는 사용되지 않았다. 도 10에는, 칼라 카메라 OTV-S6를 사용하여 기록된 화상으로서, (a) 덮개유리를 사용하지 않은 경우(왼쪽 화면)와, (b) 덮개유리를 사용한 경우(오른쪽 화면)를 나타낸다. 이러한 결과를 통해, 본 발명에서 제안된 형광 현미경이 여러 색깔의 형광물질을 동시에 관측하고 기록하는데 사용될 수 있음을 확인할 수 있다.
적용례 2 :
결핵 치료를 위한 항생제에 내성을 갖는 결핵균 진단을 위한 올리고뉴클레오타이드 마이크로칩(Oligonucleotide Microchip)을 본 발명의 형광 현미경을 사용하여 관측하였다. 사용된 마이크로칩은 50개의 셀로 구성되며, 각 셀의 지름이 약 100 um로, 현미경 슬라이드 위에 있는 겔에 형성되어졌다. 셀 안에는 다양한 올리고뉴클레오타이드를 갖는 DNA 보합결합(hybridization)에 의하여 만들어진 분자들이 위치하며, 형광 라벨이 붙어 있다.
셀의 형광 밝기는 셀에 고정된(immobilized) 뉴클레오타이드의 성분에 의존한다. 형광 마커로써 염료 Cy5가 사용되었으며, 여기광으로는 반도체 레이저 VM 65014가 사용되었다. 형광 수신은 고감도 단색 카메라인, Photometrics CoolSNAPE가 사용되었다. 도 11에는, (a) 덮개유리를 사용하지 않은 경우(즉, 상술한 도 7과 같은 경우)(왼쪽 화면)와, (b) 덮개유리를 사용한 경우(즉, 상술한 도 8과 같은 경우)(오른쪽 화면)를 도시하였다.
본 발명에서 제안된 방식에 의해 여기 및 수신 광 경로에 광 필터를 설치함이 없이 생체 마이크로칩의 형광 측정이 가능하게 된다. 겔 표면의 흠 등 결함에 위해 발생하는 광학 잡음을 제거하기 위해 덮개유리를 사용한 경우가 관측된 형광화질이 더 우수하였다.
상기 실시예와 도면은 발명의 내용을 상세히 설명하기 위한 목적일 뿐, 발명의 기술적 사상의 범위를 한정하고자 하는 목적이 아니며, 이상에서 설명한 본 발명은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하므로 상기 실시예 및 첨부된 도면에 한정되는 것은 아님은 물론이며, 후술하는 청구범위뿐만이 아니라 청구범위와 균등 범위를 포함하여 판단되어야 한다.
본 발명의 형광 현미경 및 이를 사용한 시료 관측 방법에 의하여, 광학적 잡음을 감소시키고, 보다 감도 높은 이미지를 얻을 수 있어 형광 물질의 농도, 양 및 위치 등에 관한 정확한 정보를 얻는 것이 가능하며, 나아가서, 여기 및 형광 파장의 범위가 다른 다수의 형광 물질이 분포된 경우에도 구별된 이미지의 동시 처리가 가능하여 그 각각에 대한 정보를 일거에 용이하게 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 형광 현미경을 사용할 경우, 종래 기술의 형광 현미경에서 일반적으로 사용하는 여기 및 차폐 광 필터를 사용하지 않음으로써 여기광 스펙트럼의 세기 감쇠를 가져오지 않아 보다 감도를 높일 수 있으며, 장치가 더욱 간단해지는 장점을 얻을 수 있다.
도 1은 종래 기술의 형광 현미경의 한 예를 도시한다.
도 2는 종래 기술의 형광 현미경의 다른 한 예로서, 여기 광과 형광 방출광의 경로를 분리한 예를 도시한다.
도 3은 종래 기술의 형광 현미경의 또 다른 한 예로서, 완전 내부 반사를 이용한 형광 측정(TIRFM)의 작용 원리를 도시한다.
도 4는 완전 내부 반사를 이용한 종래 기술의 형광 현미경의 한 예로서 역위 현미경(inverted microscope)의 구조를 나타낸다.
도 5는 완전 내부 반사를 이용한 종래 기술의 형광 현미경의 다른 한 예를 나타낸다.
도 6은 도 5의 형광 현미경의 세부 구조를 도시한다.
도 7은 본 발명의 형광 현미경의 한 실시예의 세부 구조를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 형광 현미경의 다른 한 실시예의 세부 구조를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 형광 현미경의 한 실시예의 전체 구성을 나타낸다.
도 10은 본 발명의 형광 현미경의 실시예에 의해 관측된 영상의 예시이다.
도 11은 본 발명의 형광 현미경의 실시예에 의해 관측된 영상의 다른 예시이다.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
401: 제1 매질부 402: 제2 매질부
403: 제3 매질부 404: 덮개 유리
405: 광학적 연결 매체 411: 광원
415: 수신부 416: 영상 처리부
420: 마이크로 객체 425: 대물렌즈
430: 프리즘 433: 접촉면
436: 출사면 437: 흡수체
450: 광학적 연결부

Claims (7)

  1. 대물 렌즈;
    형광 물질을 포함하는 하나 이상의 미세 객체를 수용하며, 상기 형광 물질을 여기 시키기 위한 여기 광의 경로를 제공하며, n1의 굴절율을 갖는 제1 매질부; 및
    상기 제1 매질부와 상기 대물 렌즈 사이의 위치에 설치되며, 상기 제1 매질부와 접한 경계면에서 상기 제1 매질부를 통해 입사된 상기 여기 광을 전반사하며, n3의 굴절율을 갖는 제3 매질부를 포함하며,
    여기서, 상기 제3 매질부와 상기 제1 매질부의 굴절율은, n1 > n3 의 관계를 만족하며,
    상기 여기 광의 상기 경계면에 대한 입사각은 임계각 이상이며,
    상기 제1 매질부 내의 상기 여기 광의 통과 경로 내에 존재하는 상기 미세 객체에 포함된 형광 물질이 여기 되어 방출하는 형광을 상기 대물렌즈에 의하여 포착함으로써 상기 미세 객체를 관측하는 것을 특징으로 하는
    형광 현미경.
  2. 대물 렌즈;
    형광 물질을 포함하는 하나 이상의 미세 객체를 수용하며, 상기 형광 물질을 여기 시키기 위한 여기 광의 경로를 제공하며, n1의 굴절율을 갖는 제1 매질부;
    상기 제1 매질부의 표면 중, 상기 대물렌즈를 향하는 표면을 덮으며, n4의 굴절율을 갖는 제4 매질부; 및
    상기 제4 매질부와 상기 대물 렌즈 사이에 위치하며, 상기 제4 매질부와 접한 경계면에서 상기 제1 매질부 및 제4 매질부를 통해 입사된 상기 여기 광을 전반사하며, n3의 굴절율을 갖는 제3 매질부를 포함하며,
    여기서, 상기 제3 매질부, 상기 제1 매질부 및 상기 제4 매질부의 굴절율은, 의 관계를 만족하며,
    상기 여기 광의 상기 제4 매질부와 제3 매질부의 경계면에 대한 입사각은 임계각 이상이며,
    상기 제1 매질부 내의 상기 여기 광의 통과 경로 내에 존재하는 상기 미세 객체에 포함된 형광 물질이 여기 되어 방출하는 형광을 상기 대물렌즈에 의하여 포착함으로써 상기 미세 객체를 관측하는 것을 특징으로 하는
    형광 현미경.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 제4 매질부는 덮개유리이며,
    상기 제4 매질부와 상기 제1 매질부 사이를 광학적으로 연결시켜주기 위한 유침 매질(optical coupling fluid)층을 제5 매질부로 더 포함하며,
    상기 제5 매질부는 n5의 굴절율을 가지며, 의 관계를 만족하는
    형광 현미경.
  4. 제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서,
    상기 대물 렌즈가 포집한 형광에 의한 객체의 상을 화상으로 제공하는 영상 처리부;
    적어도 입사면, 접촉면 및 출사면을 갖는 프리즘;
    상기 프리즘의 입사면으로 여기광을 제공하는 광원; 및
    상기 프리즘의 상기 접촉면 위에 형성되어 상기 형광 물질을 포함하는 하나 이상의 미세 객체를 포함하는 시편을 탑재 가능하도록 하는 광학적 연결부를 더 포함하는
    형광 현미경.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 프리즘의 출사면에 설치되며, 상기 전반사 된 여기광을 흡수하는 흡수체를 더 포함하는
    형광 현미경.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 광학적 연결부는 탄성 재료로 제작되어 상기 탑재된 시편과 광학적 접촉을 용이하도록 하는 것인
    형광 현미경.
  7. 형광 현미경을 사용한 관측 방법에 있어서,
    형광 물질을 포함하는 하나 이상의 미세 객체를 수용하는 매질을 통하여 상기 형광 물질을 여기 시키기 위한 여기 광을 통과시키는 단계;
    상기 여기 광이 대물렌즈에 도달하지 못하도록 상기 여기 광을 전반사 시키는 단계; 및
    상기 전반사된 여기 광이 다시 상기 하나 이상의 미세 객체를 수용하는 매질을 통과하도록 하는 단계를 포함하며,
    여기서, 상기 여기 광의 통과 경로 내에 존재하는 상기 미세 객체에 포함된 형광 물질이 여기 되어 방출하는 형광을 상기 대물렌즈에 의하여 포착함으로써 상기 미세 객체를 관측하는 것을 특징으로 하는
    형광 현미경을 사용한 관측 방법.
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