CN113109314A - 多荧光信号检测系统和方法 - Google Patents

Abstract

本说明书实施例公开了一种多荧光信号检测系统及方法，包括：激发光源，被配置为将激发光束射入至待测样品的表面使待测样品发出多荧光信号，多荧光信号包括至少两个荧光信号，不同荧光信号对应不同的波长区间；光学检测器件，用于获取多荧光信号；设置于光学检测器件与待测样品之间的光学镜头，光学镜头被配置为使待测样品发出的多荧光信号汇聚至光学检测器件；以及设置于光学检测器件与光学镜头之间和/或所述待测样品和所述光学器件之间的多波段滤波片，多波段滤波片具有与至少两个荧光信号，不同荧光信号对应波长区间相对应的至少两个透射区间；其中，光学检测器件基于多荧光信号生成多荧光图像。

Description

多荧光信号检测系统和方法

技术领域

本说明书涉及体外诊断技术领域，特别涉及一种多荧光信号检测系统和方法。

背景技术

在生物细胞水平的检测或分析应用中，往往可以通过荧光成像的方式来分析被标记细胞的状态。例如，在荧光成像技术中，包含荧光标记物的待测样品(如，被荧光染料标记的细胞等)在激发光源的照射下可以发出荧光信号，从而荧光信号检测装置能够采集荧光信号生成对应的荧光信号图像，以便根据荧光图像分析被标记细胞的状态。

然而，在实际运用的过程中，为了分析荧光标记物的不同属性往往需要进行多荧光成像，如AOPI活率检测方法。而荧光信号检测装置在一次检测中往往只能获取单一的荧光信号，通过多次荧光信号采集才能获得多荧光信号，进而组合出多荧光图像，这种方式导致荧光信号检测装置的结构复杂，成本较高，难以应用推广。因此，有必要提出一种结构简单，成本较低，并且能够同时获取多荧光图像的多荧光信号检测系统。

发明内容

本说明书实施例之一提供一种多荧光信号检测系统，包括：激发光源，被配置为将激发光束射入至待测样品使待测样品发出多荧光信号，多荧光信号包括至少两个荧光信号，不同荧光信号对应不同的波长区间；光学检测器件，用于获取多荧光信号；设置于光学检测器件与待测样品之间的光学镜头，光学镜头被配置为使待测样品发出的多荧光信号汇聚至光学检测器件；以及设置于光学检测器件与光学镜头之间和/或所述待测样品和所述光学器件之间的多波段滤波片，多波段滤波片具有与至少两个波长区间相对应的至少两个透射区间；其中，光学检测器件基于多荧光信号生成多荧光图像。

在一些实施例中，系统还包括放置待测样品的样品区，样品区包括基底，基底包括第一透光介质。

在一些实施例中，激发光源与光学检测器件分别设置于基底的不同侧。

在一些实施例中，激发光束相对于基底的入射角被配置为：激发光束经第一透光介质折射后偏离光学镜头。

在一些实施例中，激发光源与光学检测器件分别设置于基底的相同侧。

在一些实施例中，上述系统还包括设置于多波段滤波片和光学镜头之间的二向色镜，二向色镜用于反射激发光束，并透射多荧光信号。

在一些实施例中，二向色镜与多波段滤波片之间呈第一预设夹角。

在一些实施例中，待测样品至少包括AO荧光染料和PI荧光染料。

在一些实施例中，上述系统还包括设置于激发光源与待测样品之间的激发滤光片。

本说明书实施例之一提供一种多荧光信号检测方法，包括：使用单一激发光源照射多荧光细胞样本，使多荧光细胞样本发射第一多荧光信号；使用多波段滤光片对第一多荧光信号进行滤波，生成第二多荧光信号；以及使用光学检测器件获取第二多荧光信号，并基于第二多荧光信号生成多荧光细胞图像；其中，第一多荧光信号包括至少两个荧光信号，不同荧光信号对应不同的波长区间。

附图说明

本说明书将以示例性实施例的方式进一步说明，这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的，在这些实施例中，相同的编号表示相同的结构，其中：

图1是根据本说明书的一些实施例所示的多荧光信号检测系统的结构示意图；

图2是根据本说明书的一些实施例所示的激光光束入射基底的光路示意图；

图3是根据本说明书的一些实施例所示的多荧光信号检测系统的结构示意图；

图4是根据本说明书的一些实施例所示的多荧光信号检测系统的结构示意图；

图5是根据本说明书的一些实施例所示的多荧光信号检测方法的流程示意图。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例或实施方式进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本说明书相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本说明书的一些方面相一致的装置和方法的例子。

在本说明书使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本说明书。在本说明书和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。

应当理解，本说明书以及权利要求书中使用的“第一”“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。同样，“一个”或者“一”等类似词语也不表示数量限制，而是表示存在至少一个。除非另行指出，“前部”、“后部”、“下部”和/或“上部”等类似词语只是为了便于说明，而并非限于一个位置或者一种空间定向。“包括”或者“包含”等类似词语意指出现在“包括”或者“包含”前面的元件或者物件涵盖出现在“包括”或者“包含”后面列举的元件或者物件及其等同，并不排除其他元件或者物件。

本说明书一个或多个实施例的多荧光信号检测系统可以应用于各种需要荧光检测的检测任务中，如细胞内外荧光标记物质检测、荧光标记细胞的存活率检测、荧光标记蛋白活性检测、荧光标记药物分析等。在一些实施例中，多荧光信号检测系统可以获取不同荧光标记物的多荧光图像，如荧光标记细胞的多荧光图像、荧光标记蛋白的多荧光图像、荧光标记糖类的多荧光图像、荧光标记药物的多荧光图像等。

在一些实施例中，多荧光信号检测系统可以包括激发光源和光学检测器件。在进行荧光检测时，利用激发光源照射需要检测的包含荧光标记物的待测样品，使其吸收能量发出荧光信号，光学检测器件可以获取荧光信号并生成对应的荧光图像。然而，在实际运用中，为了分析荧光标记物的不同属性，待测样品中往往需要包括多种荧光标记物，荧光信号检测系统需要采集荧光标记物发出的多荧光信号。在一些实施例中，荧光信号检测系统可以通过切换不同的荧光信号检测光路，以分别提取需要的单一荧光信号，进而将提取的所有荧光信号生成对应的多荧光图像。然而，通过切换不同的荧光信号检测光路的方式实现多荧光信号的检测，会导致荧光信号检测系统的结构复杂、成本较高，难以实现广泛地应用推广。

本说明书实施例提供的多荧光信号检测系统，仅包括一个激发光源、一个光学检测器件以及设置在激发光源与光学检测器件之间的光学镜头和多波段滤波片，使得光学镜头可以聚拢多荧光信号，并可以通过多波段滤波片过滤多荧光信号使光学检测器件直接获取需要的多荧光信号，生成多荧光图像。如此，多荧光信号检测系统无需设置多个检测光路即可生成多荧光图像，结构简单、成本较低，增加了应用推广的可能性。

并且，本说明书实施例中可以使用单个激发光源照射荧光标记物，并利用多段滤波片同时获取需要的多荧光信号，可以改善因反复连续照射荧光标记物导致其发出的荧光信号减弱的问题，提高了荧光成像的效率。

应当理解的是，本说明书的多荧光信号检测系统的应用场景仅仅是本说明书的一些示例或实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图将本说明书应用于其它类似情景。

图1是根据本说明书一些实施例所示的多荧光信号检测系统100的结构示意图。

在一些实施例中，参见图1，多荧光信号检测系统100可以包括激发光源110、光学检测器件120、光学镜头130以及多波段滤波片140。其中，光学镜头130和多波段滤波片140设置在激发光源110和光学检测器件120之间。在一些实施例中，多波段滤波片140可以设置在光学镜头130和光学检测器件120之间，需要检测的待测样品200可以设置在光学镜头130与激发光源110之间。在一些实施例中，多波段滤波片140也可以设置在激发光源110和光学镜头130之间，需要检测的待测样品200可以设置在多波段滤波片140与激发光源110之间。

在一些实施例中，激发光源110可以向包含多种荧光标记物的待测样品200发出激发光束。待测样品200在照射后可以发出多荧光信号，多荧光信号可以包括多个荧光信号，不同荧光信号对应不同的波长区间。在一些实施例中，激发光源110可以向待测样品200发出激发光束，以使待测样品200发出多荧光信号。在一些实施例中，光学镜头130还可以使该多荧光信号汇聚至光学检测器件120，以使得光学检测器件120获取的多荧光图像更清晰。在一些实施例中，多波段滤波片140可以设置在光学镜头130和光学检测器件120之间，光学镜头130可以先将多荧光信号汇聚至多波段滤波片140，再传播至光学检测器件120。多波段滤波片140具有与多个波长区间相对应的多个透射区间，多波段滤波片140可以透过多荧光信号中与多个透射区间对应的波段的光线，并阻挡多荧光信号中处于透射区间以外的波段的光线。透过多波段滤波片140的多荧光信号将传输给光学检测器件120，光学检测器件120可以采集多荧光信号并生成对应的多荧光图像。在一些实施例中，多波段滤波片140也可以设置在激发光源110和光学镜头130之间，待测样品200发出的多荧光信号先经过多波段滤波片140后，再通过光学镜头130汇聚至光学检测器件120。

在一些实施例中，多荧光信号检测系统100可以包括激发光路和检测光路。在一些实施例中，激发光路可以是激发光源110发出的激发光束射入至待测样品200的光路。在一些实施例中，检测光路可以是待测样品200发出的多荧光信号射入至光学检测器件120的光路。

在一些实施例中，激发光源110为能够自行发出激发光束的物体。例如，激发光源110可以为通过金属气化发出激发光束的光源，如超高压汞灯。又例如，激发光源110也可以为通过电弧发出激发光束的光源，如弧光灯。又例如，激发光源110还可以为通过特定物质的燃烧发出激光光束的光源，如火焰光源。激发光源110发出的激发光束可以用于激发待测样品200产生多荧光信号。

在一些实施例中，激发光源110可以为普通单色光源，其能够发出波长在预设光谱范围内的光线集合。例如，激发光源110可以为普通蓝色光源，其可以发出波长范围为400nm-500nm的蓝色光束。在一些实施例中，光谱范围也称为光谱波段，是光束中光谱波长上下限之间所确定的波长区间。在一些实施例中，预设光谱范围可以为450nm-490nm。优选地，预设光谱范围可以为465nm-485nm。优选地，激发光束的峰值波长可以大约为470nm。

在一些实施例中，激发光源110可以为激光光源，其能够发出预设波长的激光光束。例如，激发光源110可以为蓝色激光光源，可以发出波长为450nm的蓝色激光光束。在一些实施例中，激光光束的预设波长可以为480nm。在一些实施例中，激光光束的预设波长可以为488nm。

在一些实施例中，激发光源110为普通单色光源时，多荧光信号检测系统100可以包括设置在激发光源110与待测样品200之间的激发滤光片150。

在一些实施例中，激发滤光片150为只允许预设波长范围的光束通过的滤光片。在一些实施例中，激发滤光片150可以用于过滤激发光源110发出的激发光束，避免其他波长的光线进入激发光路，保证照射到荧光标记物的激发光束的单色度。在一些实施例中，激发滤光片150的预设波长范围可以根据待测样品200中的荧光标记物的激发光谱选择。在一些实施例中，待测样品可以是AO/PI荧光标记物，激发滤波片的预设波长范围为420nm-485nm。在一些实施例中，待测样品可以是AO/PI荧光标记物，激发滤波片的预设波长范围为465nm-485nm。

由于普通单色光源发出的激发光束是多种光线的集合，其中，激发光束可能包括其他波段的光线，利用激发滤光片150可以滤除激发光束中的其他波段的光线，从而确保激发光束的单色度，提高荧光成像质量。

在一些实施例中，在激发光源110为激光光源的情况下，多荧光信号检测系统100可以不设置激发滤波片。由于激光光源具有良好的单色性，其发出的激发光束是一种预设波长的光线，激发光束的单色度高，无需设置激发滤光片150滤除其他光线，能够确保荧光成像的质量。

在一些实施例中，荧光标记物可以是荧光素、荧光染料或者荧光蛋白。在一些实施例中，待测样品200可以为多种荧光标记物与被测量物体的结合体。例如，待测样品200可以是被多种荧光染料标记的被测量物体。

在一些实施例中，被测量物体可以包括但不限于细胞样本、蛋白样本、抗体样本、糖类样本或药物样本等。在一些实施例中，可以根据被测量物体的种类对待测样品200进行分类。例如，待测样品200可以包括：多荧光标记细胞、多荧光标记蛋白质、多荧光标记抗体等。

在一些实施例中，荧光染料是指吸收某一波段的激发光束后能发射出另一波段的荧光信号的物质。在一些实施例中，荧光染料可以用于与被测量物体结合形成荧光标记物，从而可以根据荧光标记物发出的荧光信号确定被测量物体的位置、数量、状态等信息。在一些实施例中，荧光染料可以包括但不限于异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、藻红蛋白(P-phycoerythrin，PE)、碘化丙啶(propidium iodide，PI)、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)、噻唑橙(Thiazole Orange，TO)以及吖啶橙(acridine orange，AO)等。例如，FITC染剂可以与相应抗体结合，发出绿色荧光信号，从而可以根据FITC染剂标记的抗体产生的荧光信号，确定相应抗体的数量。再例如，AO荧光染料与PI荧光染料可以用于确定细胞的存活状态。

在一些实施例中，待测样品200至少包括AO荧光染料和PI荧光染料。在一些实施例中，待测样品200可以是由AO/PI标记的细胞样本。AO荧光染料可以透过正常细胞膜与存活的细胞结合，并且AO荧光染料标记的细胞可以发出黄绿色荧光信号。而PI荧光染料无法透过细胞膜，只能与凋亡细胞结合，并且PI荧光染料标记的细胞可以发出红色荧光信号。如此，根据AO荧光染料和PI荧光染料标记的细胞发出的多荧光信号，可以确定细胞的存活状态。

在一些实施例中，不同的荧光染料需要的激发光束的波长区间不同。在一些实施例中，待测样品200可以是由AO/PI标记的细胞样本，其需要的激发光束的波长区间与AO荧光染料及PI荧光染料的激发峰相对应。在一些实施例中，AO荧光染料的最强激发峰约为501nm，PI荧光染料的最强激发峰约为535nm。在一些实施例中，激发光束的波长区间可以同时覆盖AO和PI两种荧光染料的最强激发峰。例如，激发光束的波长区间可以是450nm-550nm。在一些实施例中，激发光束的波长区间可以不覆盖AO和PI两种荧光染料的最强激发峰，而是位于AO和PI两种荧光染料的最强激发峰附近(如±50nm、±80nm等)。例如，激发光束的波长区间可以是510nm-520nm。在一些实施例中，激发光束也可以是单一波长的光波，其波长可以位于AO和PI两种荧光染料的最强激发峰附近(如±50nm、±80nm等)。例如，激发光束的波长可以是488nm。

在一些实施例中，不同的荧光染料发出的荧光信号的性质也存在不同。在一些实施例中，荧光染料发出的荧光信号具有相应的发射波段和最强发射峰。发射波段可以是荧光染料发出的荧光信号所对应的波长范围。最强发射峰可以是荧光染料发出的荧光信号中能量最强的光线所对应的波长。例如，AO荧光染料发出的AO荧光信号与PI荧光染料发出的PI荧光信号的性质不同。AO荧光信号的发射波段大致为500nm-530nm，最强发射峰约为525nm。而PI荧光信号的发射波段大致为575nm-620nm，最强发射峰为624nm。

在一些实施例中，多荧光信号检测系统100还可以包括样品区，该样品区可以用于放置荧光标记物。在一些实施例中，样品区可以为机械载物平台，用于承载放置有待测样品200的培养器皿(例如，培养皿、波片等)。在一些实施例中，样品区可以本身包含容置空间，用于放置待测样品200。

在一些实施例中，样品区可以包括用于放置待测样品200或者放置有待测样品200的培养器皿的基底160。在一些实施例中，待测样品200或培养器皿放置于基底160的上表面。在一些实施例中，基底160至少可以透过部分光线，待测样品200发出的荧光信号可以透过基底160传输给光学镜头130。在一些实施例中，样品区也可以不包括基底160，而是包括用于固定培养器皿的夹具，检测待测样品200时，只需将有待测样品200的培养器皿固定在基底160即可。

在一些实施例中，基底160可以包括第一透光介质，待测样品200发出的多荧光信号可以透过第一透光介质进行传输。在一些实施例中，第一透光介质可以为具有良好透光性的材料，如玻璃、塑料、琼脂等材料。在一些实施例中，第一透光介质可以反射和/或折射入射第一透光介质的光线(如激发光束、多荧光信号等)。在一些实施例中，根据第一透光介质的折射率，可以判断入射第一透光介质的光线的折射和反射情况。在一些实施例中，第一透光介质的折射率可以在预设范围内。在一些实施例中，第一透光介质的折射率范围可以为1.3～1.8。在一些实施例中，第一透光介质的折射率范围可以为1.4～1.8。在一些实施例中，第一透光介质的折射率范围可以为1.5～1.8。在一些实施例中，激发光束入射到待测样品200时，产生多荧光信号，激发光束的一部分会透过待测样品200或从待测样品200边缘射入至第一透光介质。当激发光束射入第一透光介质时，激发光束的一部分会发生反射而朝向激发光源110所在的一侧传播，激发光束的另一部分会发生折射而朝向激发光源110相反的一侧传播。待测样品200发出的多荧光信号通过散射的方式发射，其中一部分多荧光信号射入至第一透光介质后，被光学镜头130收集并汇聚到光学检测器件120。

在一些实施例中，光学检测器件120可以为能够根据捕获的光线生成对应的图像的器件，如相机、感光片等成像器件。在一些实施例中，光学检测器件120可以获取多荧光信号，并基于多荧光信号生成带有多种颜色的多荧光图像，以便后续根据多荧光图像分析待测样品200的属性。例如，AOPI检测方法中，光学检测器件120可以获取AO荧光信号以及PI荧光信号，并生成对应的AO/PI荧光图像。在一些实施例中，根据AO/PI荧光图像中的多种颜色可以分析多荧光标记细胞(AO/PI标记细胞)中细胞的存活状态。

在一些实施例中，激发光源110和光学检测器件120的数量可以分别为一个。在一些实施例中，激发光源110发出的激发光束的波长范围可以覆盖多种荧光染料的最强激发峰，一个激发光源110可以同时激发多种荧光染料发出荧光信号。仅设置一个激发光源110能够减少待测样品200的照射时长，防止出现待测样品200因照射时间过长导致的多荧光信号减弱的现象，从而提高了荧光成像的效率和质量。在一些实施例中，光学检测器件120可以是能够采集光信号并生成彩色图像的器件，一个光学检测器件120即可生成多荧光信号的彩色图像。仅设置一个光学检测器件120可以实现多荧光信号的采集，无需设置多个检测光路即可生成多荧光图像，能够简化多荧光信号检测系统100的结构，降低生产成本，方便后续应用推广。

在一些实施例中，激发光源110和光学检测器件120可以分别设置在基底160的不同侧。参见图1和图3所示，激发光源110和光学检测器件120设置在基底160的不同侧，实现激发光束和多荧光信号在传输过程中不重叠，避免多荧光信号受到激发光束的干扰，保证多荧光信号的纯度，提高多荧光图像的质量。并且，还能够简化多荧光信号检测系统100的检测光路，避免多荧光信号在传输过程中的衰减，提高荧光成像的效率。

在一些实施例中，通过控制激发光束的入射角和第一透光介质的折射率，可以控制激发光束透过基底160后的传播方向。在一些实施例中，激发光束相对于所述基底160的入射角被配置为：激发光束经第一透光介质折射后偏离光学镜头130。通过该方式，可以使得光学镜头130不会接收到激发光束中的光线，进而使激发光束无法进入检测光路或被光学检测器件120接收。

在一些实施例中，参见图2，通过调整激发光源110发射端与基座的相对位置，可以调整激发光束入射基底160的角度。在一些实施例中，激发光源110发出的激发光束a以第一入射角射入第一透光介质，激发光束a在入射第一透光介质后，一部分激发光束b发生反射现象，另一部分激发光束c发生折射现象。在一些实施例中，折射后的激发光束c可以偏离光学镜头130。如此，反射后的激发光束和折射后的激发光束都无法进入光学镜头130，能够避免光学镜头130采集到激发光束导致检测光路中的多荧光信号受到干扰，从而可以提高荧光成像的质量。

在一些实施例中，激发光路可以被配置于第二透光介质中。在一些实施例中，第二透光介质的折射率小于第一透光介质。在一些实施例中，第二透光介质可以是空气。在一些实施例中，第二透光介质的折射率大于第一透光介质。在一些实施例中，第二透光介质可以是具有良好透光性的材料，如玻璃、塑料、琼脂、石英等材料。在一些实施例中，当第二透光介质的折射率大于第一透光介质时，激发光束从第二透光介质中入射第一透光介质的入射角可以大于或等于全反射临界角。如此，入射第一透光介质的激发光束在激发待测样品200后可以全部在基底160处发生反射，避免激发光束进入光学镜头130。

在一些实施例中，光学镜头130可以设置在待测样品200与光学检测器件120之间。在一些实施例中，光学镜头130可以设置在基底160与光学检测器件120之间。在一些实施例中，光学镜头130还可以包括具有汇聚光线功能的光学元件，如凸透镜。在一些实施例中，光学镜头130可以包括具有汇聚光线功能的镜组。例如，光学镜头130可以包括凸透镜和凹透镜组合，能够汇聚多荧光信号的更多光线。在一些实施例中，光学镜头130可以具备光学放大功能。在一些实施例中，光学镜头130可以具备光学显微功能。光学镜头130还可以有其他实现方式，本说明书实施例对此不作具体限定。光学镜头130可以将待测样品200发出的多荧光信号进行聚拢、放大，并将汇聚后的多荧光信号传输给光学检测器件120，从而提高多荧光信号的信号强度，避免多荧光信号在传输过程中衰减导致无法成像，提高荧光成像的效率。

在一些实施例中，多波段滤波片140可以允许多个不同波长区域(如，透射区间)的光通过多波段波片，而阻断其他波长的光通过多波段波片。在一些实施例中，多波段滤波片140可以允许多荧光信号透过而阻挡其他信号，从而使光学检测器件120可以同时收集多个荧光信号，以便在一次荧光检测中生成多荧光图像。在一些实施例中，多波段滤波片140可以为包裹有多波段滤波膜的玻片。在一些实施例中，多波段滤波片140可以为涂覆有多波段滤波材料的玻片。多波段滤波片140的透射区间还可以有其他实现方式，本说明书实施例对此不作具体限定。

在一些实施例中，多波段滤波片140的透射区间即为多波段滤波片140允许通过的光所在的波长区域，透射区间可以根据多荧光信号所在的波长区域确定。在一些实施例中，多波段滤波片140的透射区间可以与待测样品200的各荧光染料的发射波段对应。例如，多荧光信号可以包括AO荧光信号和PI荧光信号，则多波段滤波片140的透射区间可以包括500nm-530nm和575nm-620nm。在一些实施例中，多波段滤波片140的透射区间也可以与待测样品200的各荧光染料的最强发射峰对应。

通过设置多波段滤波片140可以实现同时透过多荧光信号中的多个荧光波段的光线，使得一个光学检测器件120即可同时接收多荧光信号中的多个波段的光线，简化了检测光路的结构，降低了多荧光信号检测系统100的成本。

图3是根据本申请的一些实施例所示的多荧光信号检测系统300的结构示意图。

参见图3，在一些实施例中，通过调整激发光源110的发射端与基底160的相对位置，可以调整激发光束入射基底160的角度，使得激发光源110发出的激发光束d可以垂直入射基座。激发光束在入射基座后，可以直接透过基座的第一透光介质进行传输，该方式能够简化检测光路，避免多荧光信号在传输过程中衰减导致无法成像，提高荧光成像的效率。

在一些实施例中，基底160还可以包括滤光膜层，滤光膜层的透射区间与激发光束d的波长区间不重合。

在一些实施例中，滤光膜层为改变光谱成分的膜层，其可以仅允许波长处于透射区间之内的光线透过，禁止波长在预设透射区间之外的光线透过。在一些实施例中，滤光膜层的透射区间与激发光束d的波长区间不重合，即激发光束d的波长不在透射区间内，滤光膜层可以阻止入射到基底160的激发光束d透过，避免光学镜头130收集到激发光束d中的光信号导致多荧光信号受到干扰，从而可以提高荧光成像的质量。

在一些实施例中，滤光膜层可以采用涤纶树脂(polyethylene terephthalate，PET)制成，也可以采用聚乙烯(polyethylene，PE)制得。滤光膜层还可以采用其他材料制成，本说明书实施例对此不作具体限定。

图4是根据本申请的一些实施例所示的多荧光信号检测系统400的结构示意图。

在一些实施例中，参见图4，多荧光信号检测系统400可以包括激发光源110、光学检测器件120、光学镜头130、基底160、二向色镜170以及多波段滤波片140。在一些实施例中，激发光源110与光学检测器件120可以分别设置在基底160的相同侧。在一些实施例中，光学镜头130和多波段滤波片140依次设置在待测样品200和光学检测器件120之间，光学镜头130设置在靠近待测样品200的一端，多波段滤波片140设置在靠近光学检测器件120的一端。二向色镜170可以设置在光学镜头130与多波段滤波片140之间，激发光源110可以设置在二向色镜170的侧面。

在一些实施例中，二向色镜170是一种可以改变部分光谱光路方向的光学元件，其可以使特定波长区域的光几乎完全透过，而使另一特定波长区域的光几乎完全被反射。在一些实施例中，二向色镜170可以为覆盖二向分光膜的玻片。在一些实施例中，二向分光膜可以设置在玻片的靠近激发光源110的一侧，以便经过二向色镜170反射的激发光束可以照射至待测样品200的基底160。

在一些实施例中，二向色镜170可以用于反射激发光束，并透射多荧光信号。

在一些实施例中，参见图4，激发光束入射二向色镜170后，二向色镜170可以反射激发光束使其照射到待测样品200的基底160上，激发光束的反射光线可以为图4所示的光线e。多荧光信号入射二向色镜170后，二向色镜170可以透射多荧光信号使其传输到光学检测器件120，多荧光信号的透射光线可以为图4所示的光线f。在一些实施例中，二向色镜170反射的特定波长区域可以根据激发光束的波长区域确定，二向色镜170透射的特定波长区域可以根据多荧光信号的波长区域确定。例如，激发光束的波长区域为465nm-485nm，AO荧光信号的波长区域为500-530nm和PI荧光信号的波长区域为575-620nm的波长区域，则二向色镜170可以反射波长区域为490nm以下的光束，以及透过波长区域为490nm以上的光束。二向色镜170的透射和反射性质还可以有其他实现方式，本说明书实施例对此不作具体限定。

在一些实施例中，二向色镜170与多波段滤波片140之间可以呈第一预设夹角。优选地，第一预设夹角可以处于40°-50°的范围。优选地，第一预设夹角可以为45°。如此，激发光束在入射二向色镜170后，二向色镜170可以反射激发光束并使其照射至放置待测样品200的基底160上，从而实现待测样品200的基态到激活态的变化。

在一些实施例中，激发光源110与光学检测器件120可以分别设置在基底160的相同侧，通过该设置，一方面，激发光束的入射侧与多荧光信号的出射侧相同，从而可以通过重叠激发光束和多荧光信号的传输路径的方式，减少检测光路的占用空间，缩小多荧光信号检测系统400的体积，提高了多荧光信号检测系统400的便携性；另一方面，激发光束从光学检测器件120所在一侧射入基底160后，可以从另一侧射出，避免了激发光束进入检测光路，从而提高多荧光图像的成像质量。

图5是根据本申请的一些实施例所示的多荧光信号检测方法的流程示意图。

在一些实施例中，流程500可以包括以下步骤：

步骤510，使用单一激发光源照射多荧光细胞样本，使所述多荧光细胞样本发射第一多荧光信号。

在一些实施例中，单一激发光源可以是激发光源110，激发光源110的具体描述可以参看上述图1中的相关描述，此处不再赘述。多荧光细胞样本可以为被多种荧光标记物标记的细胞样本。例如，多荧光细胞样本可以是被AO荧光染料和PI荧光染料标记的双荧光细胞样本。在一些实施例，第一多荧光信号可以为多荧光细胞样本中多种荧光标记物发出的多荧光信号。在一些实施例中，第一多荧光信号包括至少两个荧光信号，不同荧光信号对应不同的波长区间，即第一多荧光信号可以包括多个不同波长的荧光信号。例如，在AOPI测试方法中，第一多荧光信号可以包括AO荧光信号和PI荧光信号。

在一些实施例中，使用单一激发光源发出激发光束照射多荧光细胞样本，可以使得多荧光细胞样本中的多种荧光标记物吸收能量，多种荧光标记物可以从基态变为激发态，从而在多种荧光标记物从激发态变为基态时，多种荧光标记物能够同时发出多个荧光信号，即第一多荧光信号。

在一些实施例中，第一多荧光信号还可以包含有部分激发光束的光学信号。在一些实施例中，第一多荧光信号还可以包含有部分环境光信号。

步骤520，使用多波段滤光片对所述第一多荧光信号进行滤波，生成第二多荧光信号。

在一些实施例中，多波段滤波片的具体描述可以参看上述图1中的相关描述，此处不再赘述。第二多荧光信号可以为经过多波段滤波片滤波的多荧光信号，相比于第一多荧光信号，第二多荧光信号的纯度更高，干扰信号更少。例如，在AOPI测试方法中，第二多荧光信号可以包括经过多波段滤波片过滤后的AO荧光信号和PI荧光信号。

在一些实施例中，多波段滤光片对第一多荧光信号进行滤波，可以阻止第一多荧光信号中的波长在多波段滤光片的透射区间之外的光线通过，允许第一多荧光信号中的波长在多波段滤光片的透射区间之内的光线通过。例如，多波段滤波片的透射区间可以包括500-530nm和575-620nm，则第一多荧光信号中的AO荧光信号和PI荧光信号可以通过多波段滤光片，第二多荧光信号可以包括过滤后的AO荧光信号和PI荧光信号。

步骤530，使用光学检测器件获取所述第二多荧光信号，并基于所述第二多荧光信号生成多荧光细胞图像。

在一些实施例中，光学检测器件的具体描述可以参看上述图1中的相关描述，此处不再赘述。在一些实施例中，多荧光细胞图像可以为根据上述多荧光信号生成的带有多种颜色的图像，其能够反映多荧光细胞样本被标记的状态或属性。例如，根据AO荧光信号和PI荧光信号可以生成的AOPI荧光图像，基于AOPI荧光图像上的不同颜色，可以反应对应的细胞的存活状态。若AOPI荧光图像上细胞呈现红色，则说明细胞处于凋亡状态。若AOPI荧光图像上细胞呈现黄绿色，则说明细胞处于活跃状态。

在一些实施例中，光学检测器件可以通过内置的光敏元件获取第二多荧光信号，并将第二多荧光信号从光信号转换为电信号，从而生成多荧光细胞图像。在一些实施例中，光学检测器件可以根据第二多荧光信号的大小，模拟光学影像的明亮程度生成多荧光细胞图像。多荧光细胞图像还可以有其他生成方式，本说明书实施例对此不作限定。

在一些实施例中，通过多荧光信号检测系统100多荧光细胞图像后可以通过图像识别算法对图像中不同颜色的细胞进行识别，从而确定多荧光细胞样本的属性或状态。

本说明书实施例可能带来的有益效果包括但不限于：(1)无需设置多个检测光路即可生成多荧光图像，结构简单、成本较低，增加了应用推广的可能性。(2)无需反复进行荧光检测，可以在一次荧光检测中同时获取包含两个荧光通道信息的细胞图像，提高了荧光成像的效率。(3)单个激发光源可以减少照射时长，防止出现待测样品因照射时间过长导致的多荧光信号减弱的现象，从而提高了荧光成像的效率。

需要说明的是，不同实施例可能产生的有益效果不同，在不同的实施例里，可能产生的有益效果可以是以上任意一种或几种的组合，也可以是其他任何可能获得的有益效果。

上文已对基本概念做了描述，显然，对于本领域技术人员来说，上述详细披露仅仅作为示例，而并不构成对本说明书的限定。虽然此处并没有明确说明，本领域技术人员可能会对本说明书进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本说明书中被建议，所以该类修改、改进、修正仍属于本说明书示范实施例的精神和范围。

同时，本说明书使用了特定词语来描述本说明书的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本说明书至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此，应强调并注意的是，本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外，本说明书的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。

Claims (10)

1.一种多荧光信号检测系统，其特征在于，包括：

激发光源，被配置为将激发光束射入至待测样品使所述待测样品发出多荧光信号，所述多荧光信号包括至少两个荧光信号，不同荧光信号对应不同的波长区间；

光学检测器件，用于获取所述多荧光信号；

设置于所述光学检测器件与所述待测样品之间的光学镜头，所述光学镜头被配置为使所述待测样品发出的多荧光信号汇聚至所述光学检测器件；以及

设置于所述光学检测器件与所述光学镜头之间和/或所述待测样品和所述光学镜头之间的多波段滤波片，所述多波段滤波片具有与至少两个所述波长区间相对应的至少两个透射区间；

其中，所述光学检测器件基于所述多荧光信号生成多荧光图像。

2.根据权利要求1所述的多荧光信号检测系统，其特征在于，所述系统还包括放置所述待测样品的样品区，所述样品区包括基底，所述基底包括第一透光介质。

3.根据权利要求2所述的多荧光信号检测系统，其特征在于，所述激发光源与所述光学检测器件分别设置于所述基底的不同侧。

4.根据权利要求3所述的多荧光信号检测系统，其特征在于，所述激发光束相对于所述基底的入射角被配置为：

所述激发光束经所述第一透光介质折射后偏离所述光学镜头。

5.根据权利要求2所述的多荧光信号检测系统，其特征在于，所述激发光源与所述光学检测器件分别设置于所述基底的相同侧。

6.根据权利要求5所述的多荧光信号检测系统，其特征在于，所述系统还包括设置于所述多波段滤波片和所述镜头之间的二向色镜，所述二向色镜用于反射所述激发光束，并透射所述多荧光信号。

7.根据权利要求5所述的多荧光信号检测系统，其特征在于，所述二向色镜与所述多波段滤波片之间呈第一预设夹角。

8.根据权利要求1所述的多荧光信号检测系统，其特征在于，所述待测样品至少包括AO荧光染料和PI荧光染料。

9.根据权利要求1所述的多荧光信号检测系统，其特征在于，还包括设置于所述激发光源与所述待测样品之间的激发滤光片。

10.一种双荧光细胞图像获取方法，其特征在于，所述方法基于权利要求1-9任一项所述的多荧光信号检测系统实现，所述方法包括：

使用单一激发光源照射多荧光细胞样本，使所述多荧光细胞样本发射第一多荧光信号；

使用多波段滤光片对所述第一多荧光信号进行滤波，生成第二多荧光信号；以及

使用光学检测器件获取所述第二多荧光信号，并基于所述第二多荧光信号生成多荧光细胞图像；

其中，所述第一多荧光信号包括至少两个荧光信号，不同荧光信号对应不同的波长区间。

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