CN108700518B - 用于生物样品的自动分析工具 - Google Patents

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Abstract

描述了用于利用多个荧光试剂以自动方式来分析多个生物样本的系统和方法。该系统可以包括两个光学系统——荧光成像系统和光学猝灭系统。这两个系统可以横向彼此邻近放置，并且通常在包含样本的微量滴定板的井之一下面放置。可以利用一系列荧光试剂来对其中包含的生物样本染色，其中在染色之间使荧光猝灭。通过样本相对于成像系统的精确定位，可以利用多个连续施加的试剂来对样本成像。

Description

用于生物样品的自动分析工具
技术领域
本发明涉及用于分析生物样品的工具和方法。
背景技术
与一个或多个抗体缀合的荧光染料通常用于免疫荧光分析。在过去的二十年里，已经开发了在抗体、荧光染料、流式细胞仪、流式分选仪和荧光显微镜方面的大量变体以实现对靶细胞的特异性检测和隔离。
针对感兴趣抗原的荧光染料缀合物被用来检测组织的细胞结构并且对其成像。在这些技术中，连续消除荧光信号和重染色允许具有与同时使用标记和检测的标准程序相比的更高的复用电位。例如，US 7741045 B2、EP 0810 428 B1或DE 10143757公开了通过对缀合的荧光部分的光或化学破坏来消除荧光信号。
在前面提到的技术中，结果得到的荧光信号被收集为图像。通过连续地消除荧光信号和用不同荧光染料缀合物重染色，检测到不同的抗原，结果得到同一样品的多个图像，其示出样品的不同部分（抗原）。利用这些技术收集的信号的质量高度依赖于图像的分辨率、处置步骤的精度和步骤之间需要的时间（在其期间操作样本）。由于费力的处置步骤，已知的技术允许经过一系列染色的特定生物样本的非常有限数量的图像。因此，需要一种针对生物样品的染色、成像和对染色的消除的循环的自动程序以用于分析建议。
发明内容
这里描述的是一种允许在计算机控制下原位对生物样本进行顺序分析的系统。该设备允许大量荧光试剂到同一生物样本的顺序施加，以及由成像机构经过透明支撑件对样本的观察。该成像机构可以是荧光成像系统，其与数据收集计算机相组合可以形成利用一系列各种试剂染色的生物样本的视觉图像。在试剂中的每一个之间，可以通过横向邻近于荧光成像系统设置的第二光学系统来使荧光猝灭，该荧光成像系统利用足够的光辐照样本以禁用或破坏发荧光部分。
因此，该系统可以包括多个样本和多个试剂，每一个都包含在微量滴定板的分离井中。可以包括自动流体处置系统，其中机器人控制的移液管从多个试剂器皿之一取出一定量的特定试剂，并且将所述量沉积到包含特定生物样本的特定样本井中。
该多个微量滴定井可以由塑料的一次性微量滴定板来提供，在该塑料的一次性微量滴定板中形成有小的射流井。该井中的每一个都可以包含不同的化合物，诸如试剂、具有检测部分的抗原识别部分（诸如具有荧光染料的抗体、抗生素）、生物营养素、毒素、着色剂、氧化剂。备选地，该一次性物可以包括多个功能化的、分段的区域，其中附贴生物活性结构。
因此，本发明的目的是一种用于分析利用至少一个荧光染料染色的生物样本的自动系统，包括：
- 荧光系统，其包括用于从荧光染料获得的荧光信号的激发单元和检测单元；
- 用于保持包含具有荧光染料的至少一个生物样本的至少一个容器的孔径；
- 使荧光信号猝灭的猝灭单元；
- 将流体供应到容器中和/或从容器移除流体的流体处置物；
- 在限定工作平面的至少两个正交维度上移动孔径、荧光系统、猝灭单元和流体处置系统中的至少一个的机构；以及
- 以及控制单元，其以自动方式执行包括荧光染料的激发、荧光信号的检测和收集以及荧光信号的猝灭的例程。
本发明的另一目的是一种用于分析生物样本的自动方法，包括：
- 将具有荧光染料的至少一个生物样本保持在台架上的孔径中的容器中；
- 利用荧光系统激发荧光染料并且检测从荧光染料获得的荧光信号；
- 在限定工作平面的至少两个正交维度上移动孔径、台架、荧光系统和猝灭单元中的至少一个直到生物样本邻近于猝灭单元为止；以及利用猝灭单元来使荧光信号猝灭。
优选地在如本文中公开的用于分析生物样本的自动系统中执行根据本发明的自动方法。
附图说明
参考下面的图来描述各种示例性细节，其中：
图1是自动分析工具的简化平面视图；
图2是具有设置在其中的一次性样本保持器的自动分析工具的简化侧视图；
图3是示出自动移液系统的自动分析工具的简化侧视图；
图4是荧光成像系统的简化侧视图；
图5是具有反馈控制的光学猝灭系统的简化侧视图；
图6是具有激光源和谐振腔反射镜的光学猝灭系统的简化侧视图；
图7是具有经过生物样本的多次传递的光学猝灭系统的一个实施例的简化侧视图；
图8是具有经过生物样本的多次传递的光学猝灭系统的另一实施例的简化侧视图；
图9是具有经过生物样本的多次传递的光学猝灭系统的另一实施例的简化侧视图；以及
图10是示出用于使用用于生物样品的自动工具的方法的简化流程图。
应该理解的是，该绘图不一定按照比例，并且相似的数字可以指代相似的特征。
具体实施方式
本发明的系统和方法被设计用于利用多个荧光试剂以自动方式来分析多个生物样本。在该系统中，机器人控制的移液管系统可以从多个流体器皿之一取出一定量的荧光试剂，该多个流体器皿中的每一个都保持不同的试剂。然后该机器人控制的移液管系统可以将所述量的试剂递送至多个样本保持射流井中的具体一个。该流体样本井还可以包含缓冲流体，以及生物样本。可以将该多个试剂存储在微量滴定板90的试剂器皿中，而可以将多个样本存储在微量滴定板92的样本井中。因此，如在本文中使用的，参考数字90指代将试剂存储在器皿中的一次性微量滴定板，并且参考数字92指定将分离的生物样本存储在井中的一次性微量滴定板。
荧光试剂。
在本发明中使用的荧光试剂包括可选地通过间隔区分子连接的荧光部分和抗原识别部分。
适当的荧光部分是免疫荧光技术（例如流式细胞术或荧光显微术）的领域中已知的那些。有用的荧光部分可能是基于蛋白质的（诸如藻胆蛋白质）、聚合的（诸如聚芴材料）、小有机分子染料（诸如氧杂蒽，比如荧光素或罗丹明、花青、恶嗪、香豆素、丫啶类、恶二唑、芘类、吡咯甲川）或金属有机络合物（诸如Ru、Eu、Pt络合物）。除了单分子实体之外，还可以将荧光蛋白质或小有机分子染料的簇团、以及纳米颗粒（诸如量子点、上变换纳米颗粒、金纳米颗粒、染色的聚合物纳米颗粒）用作荧光部分。
在本发明的另一变体中，该荧光试剂包括使荧光部分和抗原识别部分分离的酶催化可降解间隔区。为了消除荧光发射，该猝灭单元可以提供使间隔区降解的适当的酶，由此从抗原识别部分（即从生物样本）释放荧光部分。可以通过清洗来从样本移除释放的颜料。适当的荧光试剂和酶被公开在欧洲专利申请EP15200338.0中，并且包括例如作为酶催化间隔区的多糖、蛋白质、肽、缩肽、聚酯、核酸、葡聚糖、普鲁兰、菊粉、直链淀粉、纤维素、半纤维素、木聚糖、葡甘露聚糖、果胶、壳聚糖、或甲壳素以及作为酶的水解酶、裂解酶或还原酶。
该荧光部分可以经由可选间隔区共价或非共价地偶联至抗原识别部分。本领域技术人员已知用于共价或非共价缀合的方法。在荧光部分、抗原识别部分或可选间隔区之间的共价键的情况下，可以使用荧光部分、抗原识别部分或间隔区之一上的活化基团与相应其他单元上的功能团的直接反应。
抗原识别部分。
术语“抗原识别部分”指代针对在细胞样本的细胞上表达的标记的任何种类的抗体或片段抗体或片段抗体衍生物。该术语涉及完全地全抗体、片段抗体或片段抗体衍生物（例如Fab、
Figure 562313DEST_PATH_IMAGE001
、
Figure 636711DEST_PATH_IMAGE002
、sdAb、scFv、di-scFv、纳米抗体）。这样的片段抗体衍生物可以通过重组程序来合成，其包括包含这些种类的分子的共价和非共价缀合物。抗原识别部分的另外的示例是靶向TCR分子的肽/MHC络合物、细胞粘附受体分子、针对共刺激分子的受体、人工工程结合分子（例如，靶向例如细胞表面分子的肽或适体）。
在本发明的方法中使用的荧光试剂可以包括高达100种（优选地1-20种）抗原识别部分和/或检测部分。
优选地，在本发明中使用的荧光试剂包括针对由细胞内的生物样品（靶细胞）（比如IL2、FoxP3、CD154）或由细胞外的生物样品（靶细胞）（比如CD3、CD14、CD4、CD8、CD25、CD34、CD56和CD133）表述的抗原的荧光部分和抗体。
生物样本。
该生物样本包括可以被荧光试剂的抗原识别部分检测/识别的靶部分。生物样本可以源自任何样品，比如整个动物、器官、组织切片、细胞聚集体或无脊椎动物（例如秀丽隐杆线虫、黑腹果蝇）、脊椎动物（例如斑马鱼、有爪蟾蜍）和哺乳动物（例如小家鼠、智人）的单个细胞。生物样本可以具有组织切片、细胞聚合体、悬浮细胞或粘附细胞的形式。细胞可以是活的或死的。这些试剂中的每一个都可以包含在分离的流体器皿中，以使得每个流体器皿都包含试剂、具有检测部分的抗原识别部分、具有荧光染料的抗体、抗生素、生物营养素、毒素、着色剂和氧化剂中的至少一种。
该试剂中的每一个都可以通过流体处置系统被取出并且被施加于正通过系统进行成像的生物样本，如在下面将进一步描述的。
荧光系统。
经由调整至荧光试剂的适当波长的光（比如，用于R-藻红蛋白（R-PE）的激发的520-560nm的绿光）的辐照来执行荧光激发。因此，该激光单元提供在具体荧光团吸收的光谱范围内的电磁辐射。然后荧光团发射可以与激发辐射分开检测的红移波长（移位通常是大约20nm）的荧光。荧光显微镜激发单元的典型实现方式包含白色光源（诸如弧光灯、氙灯或金属卤化物灯）以及连续滤波器，其用以生成激发所需的光谱带。还使用激光器或发光二极管。
猝灭单元。
在本文中可互换地使用术语“猝灭”和“脱色”，并且它们应该被理解成意指作为荧光团或其到加标记的生物样本的附着的化学或辐射变化的结果，从该加标记的生物样本的荧光缩减。因此，该猝灭系统可以进一步包括改变试剂的荧光能力或其到生物样本的附着的化学或辐射中的至少一种的源。
该猝灭单元可以使用被具体荧光团吸收的波长的光来提供对样本的高强度辐照。对于大量通常使用的染料，生成蓝色（450-500nm）、绿色（520-560nm）和红色（630-650nm）的组合的LED是足够的。较高强度的辐射降低猝灭所需的时间。通过对于R-PE使用约300 mW/cm2，获得粗略30秒的荧光信号的指数式衰减的半衰期。因此荧光信号至起始信号的1-5%的减小需要约3分钟。这可以对不同的荧光团同时进行，例如FITC（激发470nm、发射520nm）、R-PE（激发530nm、发射580nm）、APC（激发630nm、发射660nm）。在该实施例中，猝灭单元还可以是与激发单元相同的部件。
因此，猝灭单元可以设有发射不同波长的猝灭辐射的多于一个光源。例如，猝灭单元可以设有2-5个光源，它们具有在350-850nm（优选地450-650nm）的范围内的组合发射光谱。光源的发射可以在光学上组合以同时或随后辐照样本。例如，猝灭单元可以设有在450-500nm（蓝色）、520-560nm（绿色）和630-650nm（红色）的范围内发射的三个光源。在仅提供一个光源的另一实施例中，发射在范围350-850nm（优选地450-650nm）内的光。独立光源的优点在于：样本暴露于仅使荧光染料猝灭（消除）所必要的辐射，从而避免了样本不必要地暴露于具有其他波长的辐射。可以通过比如反射镜的适当设备或比如光纤的光波导来组合独立光源的辐射。
在一个优选实施例中，该猝灭单元可以包括荧光检测器，其监测荧光信号的衰减作为猝灭数据。该猝灭单元可以包括针对所有光源的一个荧光检测器或单独地针对每一个光源的荧光检测器。控制单元可以基于相应的猝灭数据利用一个或多个反馈回路来控制猝灭单元中的每个光源。为了方便起见，荧光的消除可以在最高发射波长处测量，但计算两个波长之间的发射光谱的积分也是合适的。在本发明的该变体中，该控制单元和/或猝灭单元被配置成使得当荧光发射没有通过猝灭被消除在预定义阈值以下时，重复猝灭过程。例如，认为当荧光发射被减小至起始荧光发射的小于5%（优选地小于1%）时，实现荧光发射的猝灭。在同时提供多于一个荧光试剂的变体中，荧光发射的减小基于测得的荧光发射中的每一个。
猝灭单元可以进一步设有用以使样本的单位表面积的辐射和/或辐射强度均匀的装置。不均匀脱色导致某些区域受到较少辐照，即比其他区域更少脱色。此类更少脱色的区域在样本的最终图像中是可见的/可检测的，或者需要附加的辐照以进行脱色，这是耗时的和/或可能引起样本的已经脱色的区域的损坏。在第一实施例中，猝灭单元设有用来使猝灭单元的光散射的扩散器装置。通过使光散射，消除可能引起不均匀脱色的单位表面积的任何不均匀辐射分布。可以将毛玻璃、特氟隆、全息物品、乳色玻璃或灰色玻璃用作扩散器材料。
在用来使辐射和/或辐射强度均匀的另一实施例中，猝灭单元或样本支架或可移动台架10可以设有振动装置，即，使它们在工作平面的一个或两个维度上轻微来回移动，例如在至多+-1mm的范围内。
此外，在猝灭单元包括辐照比样本大小更小的区域的光源的情况下，有可能使猝灭单元和/或可移动台架10在x-y工作平面中、在样本支架的区域内或者在样本的表面区域内移动。优选地，该猝灭单元和/或可移动台架10在x-y工作平面中、在样本的区域内以线、圆圈或网格状的方式移动。该移动优选地处在微处理器的控制下。
在本发明的还有另一实施例中，该猝灭单元和/或光源设有光学滤波器，其保护样本免受具有不适合于猝灭但适合于在样本中诱导热量的波长的任何辐射。优选地，该光学滤波器从用于猝灭的光中移除基本上所有具有小于400nm和/或大于900nm的波长的辐射。该实施例具有下面的优点：样本在同时移除可能另外不希望地增加样本的温度的IR辐射时暴露给仅使荧光染料猝灭（消除）所必要的辐射。
在本发明的另一变体中，该猝灭单元提供例如通过氧化脱色来消除荧光染料的化学物质。从上面提到的关于“Multi Epitope Ligand Cartography”、“Chip-basedCytometry”或“Multioymx”技术的公开物得知用于脱色的必要化学物质。
一次性样本支架。
本发明的自动系统的容器可以包括多个流体井，每一个都包含独立的生物样本。优选地，该容器是滴定板。
如在本文中使用的，可互换地使用术语“滴定板”、“多井滴定板”和“微量滴定板”，并且它们两个都应该被理解成意指包含多个小井或凹陷的结构，所述小井或凹陷中的每一个都可以被用来与其他井或凹陷分离地保持液体或样品。这二者尤其指代根据ANSI SBS1-2004的设备。
图2是用于生物样品的具有安装在孔径20和22中的一次性样本支架90和92的自动分析工具1的平面视图。如先前提到的，在后面的描述中，微量滴定板90可以包含试剂并且微量滴定板92可以包含样本。一次性样本支架90和92可以是已知尺寸的刚性塑料结构，多个流体井可以形成到其中。实际上，一次性物90和92二者可以是具有标准形状因子的多井滴定板，例如其中形成有96个小流体井。
一次性物90和92可以备选地是在其上使生物样本固定的玻璃载片。在其他实施例中，一次性物90和92可以包括在透明支撑件（诸如塑料）上的不同、独立区中的功能化表面。该支撑件可以是玻璃载片或可以保持生物样品并且通过荧光成像系统30和/或荧光猝灭系统40成像的任何其他透明表面。一次性物可以进一步包括透明和非透明部分，其中生物样本位于透明部分上，并且非透明部分反射或吸收光。因此，生物样本可以位于透明部分上并且非透明部分反射或吸收荧光信号。
可以选择或涂覆该一次性物90和92的材料以降低光吸收。可以选取不透明或光学吸收性材料，或者可以使用例如金属或TiO2的CVD（化学气相沉积）来使透明材料涂覆有反射膜（反射而不是吸收）。
自动系统。
本发明的系统可以包括：测量荧光信号的荧光系统，用于将包含至少一个生物样本的一次性物保持在荧光系统上的孔径，提供猝灭光以使来自生物样本的荧光信号猝灭的猝灭系统，可以将流体供应到容器中和/或从容器移除流体的流体处置系统，用于在限定工作平面的至少两个正交维度上移动孔径、荧光系统、猝灭单元和流体处置系统中的至少一个的机构，以及以自动方式执行包括荧光染料的激发、荧光信号的检测和收集以及荧光信号的猝灭的例程的控制单元。
如以后公开的，该控制单元将荧光信号收集作为利用荧光染料染色的生物样本的图像。
该流体处置系统可以是能够使流体在流体贮器之间转移的系统。该流体处置系统可以包括保持多种试剂的多个流体器皿，以及气动压力或真空源，以使得可以从至少一个容器中撤出流体并且将流体插入另一个容器中。
该流体处置系统可以提供荧光染料、使荧光信号猝灭的化合物、清洗流体和针对生物样本的缓冲物中的至少一个。优选地，该流体处置系统包括设置在台架上的机器人控制的移液管系统，其中移液系统可沿着与工作平面正交的z轴移动。
然而，应该理解的是，本发明的实施例可以包括其中样本可相对于光学系统30和40移动的系统以及其中光学系统30和40可相对于样本移动的实施例。为了清楚解释起见，关于在图1-9中描绘的实施例描述本发明，其中样本在可移动台架10上相对于成像系统30和猝灭系统40移动。应该理解的是，还预想备选的实施例，其中例如光学系统相对于生物样本移动。因此，装置可以包括用于在至少两个正交维度上移动孔径和荧光系统中的至少一个以便对生物样本成像的机构。
图1是用于生物样品的自动分析工具1的一个实施例的平面视图。包括在该工具中的是两个孔径20和22形成到其中的可移动台架10。该可移动台架10可以由轻质且易于加工的任何刚性材料（诸如铝）制成。没有在图1中示出的是例如调整可移动台架10在所示出的两个正交方向上的定位的多个电机，诸如步进电机。这两个正交方向（在图1中标记X方向和Y方向）为自动分析工具1限定可移动x-y平面。在这里该平面被称为工作平面。该可移动台架10可以在微处理器、控制单元或计算机110的控制下在x-y工作平面中移动。该计算机或控制单元110可以依据所需的速度和精度在工作平面中以+/-约1至200微米的精度在x或y方向上移动孔径20或22。
图1中还示出的是制冷单元50，其为生物样品、缓冲物、以及可移动台架10的材料、其自身提供制冷。因此，该系统可以进一步包括使工作平面冷却并且包括生物样本的冷却单元。图1中还示出的是冷藏外壳，比如绝缘盒或帷幕60，其可以被放置在两个孔径20和22以及制冷单元50之上。该冷藏外壳可以被形成为任何最低程度地多孔的柔性材料（诸如透明聚脂薄膜）的帷幕。如下面描述的，该外壳可以被放置在孔径20和22上以保持生物样本周围的环境冷藏。因此，自动系统可以进一步包括温度控制单元，其将生物样本的温度控制到约10-40℃之间的设定点。
直接在孔径20、22下面的可以是两个光学系统30和40。这两个光学系统可以分别是荧光成像系统30和荧光脱色系统40。将在下面进一步描述这两个光学系统——荧光成像系统30和荧光脱色系统40的细节。该光学系统30和40通常位于孔径20或22中的至少一个下面。为了说明的目的，在图1中这些孔径是空的，但是当分析工具在操作中时，孔径20和22可以保持生物样品样本（于22中）并且保持许多试剂（于20中），或者反过来，如将接下来描述的那样。图1中没有示出的是光学成像系统30或荧光脱色系统40所需的附加结构。这些附加结构可以包括附加透镜、反射镜、检测器、源和其他光学部件。下面将进一步讨论这些附加结构。
应该指出的是，可以直接邻近于荧光脱色系统40来设置该荧光成像系统30。
图1中没有示出的是步进电机、齿轮、轴承以及用来实现可移动台架10在x-y平面中的可重复精确运动的其他机构部分。此类部件是容易可得的，并且适当的尺寸和其他机械特性将取决于应用的细节。还没有示出的是各种阻尼机构，诸如弹簧、减震器和橡胶保险杠。此类部件可以被用来使自动分析工具1从周围环境因素（比如冲击和振动）隔离。
该可移动台架10可以被移动以调整一次性物92或92的单个井相对于其他部件的精确定位。例如，一次性物92可以在样本操纵期间直接位于荧光成像系统30和/或荧光猝灭系统40上面。在其他时间，一次性物90可以在试剂取出期间直接位于液体处置系统（示出为移液管70）下面，如将在下面关于图3描述的。在样本操纵期间，该可移动台架可以移动以使特定样本井定位在光学装置上面，或者在荧光成像系统30上面或者在荧光猝灭系统40上面。实际上，一次性物92可以被定位成使得可以精确地对多井滴定板90或92中的井中的任一个的内容的显微图像成像。
与图1类似，制冷单元50可以使多井滴定板90和92以及其中保持的流体冷却。比如帷幕的基本上无孔外壳60可以限制空气到周围环境中的移动，由此帮助使多井滴定板90或92中的生物样品保持冷却。
图3作为示出可移动台架10以及直接保持在多井滴定板90上面的可操纵移液管70的侧视图。移液管70可以由位置控制器、移液管台架80来保持和控制，并且在微处理器或计算机的指挥下移动。移液管台架80可以在Z方向上将移液管70移动到微量滴定板90中的多个滴定井中的任一个中。多个井中的每一个都可以包含不同的化合物并且可以包括试剂、具有检测部分的抗原识别部分、具有荧光染料的抗体、抗生素、生物营养素、毒素、着色剂、氧化剂中的至少一种。
该移液管70因此可以是设置在台架上的机器人控制的移液管系统，其中移液系统可沿着与工作平面正交的z轴移动，并且被配置成将不同化合物施加于生物样本。
在本发明的另一实施例中，该处置系统包括用于清洁移液管系统的外部以防粘附流体的装置。该清洁系统应移除粘附至移液管（70）的所有物质以避免样本之间的交叉污染。为了该目的，至少应该清洁移液管的已接触液体或样本和/或被插入样本容器中的部分。在该实施例的第一变体中，可以通过清洁箱或清洁液体来实现清洁移液管70的外表面以防粘附流体。为了该目的，移液管台架80可以至少设有从移液管70移除材料的清洁箱。该清洁箱可以由适合于吸收液体的任何材料（比如棉织物或薄纸）制成。
在该实施例的第二变体中，通过利用使用的清洁液体清洗移液管70的外部表面来实现对移液管70的清洁。在本发明的该实施例中，移液管台架80设有针对移液管70的套管或引导，所述移液管70可以利用经过套管的至少一个孔口提供和移除的清洁液体来冲洗。通过经过所述套管或引导来指引移液管70，使移液管70移动经过清洁液体的储器或者经过清洁液体流，由此确保移液管70仅与新鲜、未被污染的清洁液体接触。例如在EP 2944373A1中公开了设有套管的此类移液管台架。
因为可移动台架10在X和Y方向上可移动，所以移液管70仅需要Z方向的运动来取出在多井滴定板90的器皿中的任何器皿中保持的试剂中的任何试剂。在取出特定试剂时，可移动台架10被移位和定位以使得多井滴定板90中的期望或适当井被直接定位在移液管70下面。然后将管70降至多井滴定板90的特定井中，并且将试剂沉积在多井滴定板90的适当井中。
因此，为了利用特定试剂对特定样品染色，可能使该可移动台架10移动以将多井滴定板90中的特定井直接定位在移液管70下面。控制器80然后将移液管70降至保持在多井滴定板90的指定井中的流体试剂中。移液管台架80可以促使将吸力施加到移液管70的头部，以便汲取预定量的保持在微量滴定板90的井中的流体。然后从井中撤出移液管70。
微处理器110然后可以将可移动台架10移位至其中包含在多井滴定板92上的特定井中的期望或适当样品直接定位在移液管70下面的位置中。然后通过控制器80将移液管70降至井中。将压力施加至移液管70的头部以将移液管70的内容排出至保持生物样品的微量滴定板92的指定井中。然后可以培育现在染色的样品。在培育之后，可以如下面描述的那样对染色的生物样品进行成像。
图4是荧光成像系统30的概念视图。荧光成像物30可以包括光学光源32（诸如LED源），其生成在某一波长带中的辐射。该辐射可以撞击分色镜38，其将辐射反射到物镜34中。该物镜34可以使光成形、聚焦或准直。然后该辐射撞击在微量滴定板92的特定井上。该多井滴定板井92可以包括缓冲流体150和生物样品140。依据生物样品140的性质，它可以粘附至多井滴定板92中的井的底部，或者它可以漂浮或悬浮在缓冲流体150中。
如果生物样品140是例如一个细胞，则它可能已经与着色剂或试剂组合。该着色剂或试剂可以是与抗体缀合的荧光团。该抗体可能与在细胞的膜上发现的表面标记或抗原结合，并且该荧光团可能在被适当波长的光辐照时发射荧光光子。因此，光源32可能发射该波长的光以激发荧光团，其然后发射荧光光子。该分色镜38可以将来自光源的辐射反射到加标记的生物样品140上，但是该分色镜38可以将荧光光子透射在检测器36中，如在图4中示出的那样。
因此，分色镜38可以被设计为反射处在激光器或光源32的波长处的光，但是透射在从生物样本140发射的荧光的波长处的辐射。光学检测器36可以是任何像素化的数字检测器，诸如它是CCD相机或微通道板。物镜34可以是在z轴上可移动的或可调整的，以便将生物样品140上的适当斑点聚焦到检测器36上。控制单元xx可以收集荧光信号作为利用荧光染料染色的生物样本的图像。
图5是荧光猝灭系统40的概念侧视图。包括在荧光猝灭系统40中的可以是光源42，物镜44将所述光源42聚焦到生物样品140上。如之前那样，该生物样品可能被淹没在多井滴定板92中的井中的缓冲流体150中。
光源42可能是LED或激光器，但是在任何情况下，所发射的辐射的波长被选取成与附贴至生物样品140的荧光部分或标签的吸收带重叠。当施加该辐射时，具有所附贴的标签的生物样品140可能具有通过辐射分解、解离或破坏的荧光标签。因此，该猝灭系统40可以包括光学猝灭系统，其通过光的照射来破坏试剂的荧光，并且包括LED光源和物镜。
在任何情况下，附贴至生物样本140的荧光标签可以整体地或部分地停止荧光。因此，从多井滴定板92中的生物样本140发射的荧光将减少。可以通过其输出端耦合至计算机48的另一光学检测器46来检测该降低的荧光。
计算机48可以生成控制辐射源42的幅度的信号。光学检测器46可以是相同类型的或不同的那个光学检测器36。因此，光学检测器46可以是任何像素化的数字检测器，诸如它是CCD相机或微通道板。
因此，该猝灭系统可以包括荧光检测器，其监测由光的照射引起的试剂的荧光信号的衰减作为猝灭数据。该控制单元可以基于猝灭数据利用反馈回路来控制猝灭系统。因此，该控制单元可以指挥猝灭系统继续施加猝灭辐射直到达到预定义的荧光阈值为止。
在检测到来自生物样品140的连续荧光（如由检测器46所测得的）时，计算机48将增加或继续施加到光学光源42的电流以增加或继续施加到生物样品140的辐射量。仅当所有的荧光辐射都停止从生物样品140发射或下降到某一预定的阈值以下时，计算机48可以中断到光学光源42的驱动信号。例如，可以测量在最高发射的波长处的荧光的消除，但是计算发射光谱的积分也是适合的。在本发明的该变体中，控制单元和/或猝灭单元被配置成使得当荧光发射没有通过猝灭被消除在预定义阈值以下时，重复猝灭过程。例如，认为当荧光发射被减小至起始荧光发射的小于5%（优选地小于1%）时，实现了对荧光发射的猝灭。因此，在一些实施例中，该荧光猝灭系统40可以具有计算机控制的反馈机构，其确定对生物样本140的照射的猝灭过程何时可以中断。
荧光猝灭系统40中的另一元件可以是反射器49，其可以被设置在微量滴定板92上面。反射器49可以使从光源42发射的猝灭辐射经过生物样品140反射回去。通过使辐射传递某一附加的时间，荧光信号的猝灭可能更加有效或高效。因此，该猝灭系统可以进一步包括至少一个反射镜，其将猝灭辐射的不被生物样本或荧光染料吸收的部分反射回到生物样本中。
如先前提到的，在这里描述的实施例中，在工作x-y平面中移动台架10以使生物样品140的特定斑点或特征定位在荧光成像系统30的成像区域中。类似地，然后通过在x-y工作平面中移动可移动台架10来使斑点或特征定位在荧光猝灭系统40上面。然而，应该理解的是，这仅仅是示例性的，并且该光学系统30和40可以备选地相对于生物样品140移动。换言之，不是相对于荧光成像系统30和荧光猝灭系统40来定位x-y工作平面，而是可以相对于生物样品140来定位荧光成像系统30和荧光猝灭系统40。
图6是荧光猝灭系统50的另一实施例的概念视图。与荧光猝灭系统40相比，在荧光猝灭系统50中光源42可能是诸如激光器52之类的相干源。该激光器52可以发射在某一具体波长或波长窄带处的光。如之前关于图5那样，该辐射可以从分色镜58反射并且经过物镜54反射到生物样品140上。该反射然后可以被设置在多井滴定板92上面的附加反射器反射。该光学反射器59然后可以使激光辐射第二次经过生物样品140反射回。与光学反射器49一样，这可以增加荧光信号的光学猝灭的有效性。然而，在图6的激光实施例中，反射镜59和分色镜58可以形成谐振腔并放大由激光源52发射的激光辐射。如之前那样，该谐振腔可以通过将辐射的多次传递提供到基本上相同斑点上的样本来增强辐射源42的有效性。
图7是光学猝灭系统60的另一实施例的概念侧视图。并且光学猝灭系统60，再次地使辐射源62经过物镜64聚焦并且聚焦至多井滴定板90中。光源62可以是发光二极管（如图4中的LED 42）或激光器（如图5中的激光源52）。当进入多井滴定板92时，该辐射可以通过多井滴定板92的透明玻璃基底支撑件170。该透明基底170可以支撑生物样品140。生物样品140可以在多井滴定板92的特定井的底部处，但是淹没在流体（诸如缓冲流体150）中。在多井滴定板92的特定井的顶部处的可以是盖玻片160。该盖玻片可以搁在流体以及微量滴定井92的顶部上。盖玻片160的使用可以避免在多井滴定板92的特定井中的流体柱的顶部处的形成流体半月板。在空气/液体边界处形成的半月板可以具有圆顶形状，其能够干扰经过那里的光的直接透射干扰，并且因此干扰生物样品140的成像。
可以用透明或半透明盖板来覆盖包含具有荧光染料的至少一个生物样本的容器。透明或半透明盖板可以例如是盖玻片，其是透明的或设有对于荧光信号透明但是对于猝灭辐射有反射性的涂层。如在图7中示出的，来自光源62的辐射可以通过物镜64并且进入淹没在缓冲流体150中的生物样品140，它可以行进经过两个透明表面170，经过样品，并且经过光学盖玻片160。在该点处，辐射可以撞击在光学反射器69上。光学反射器69可以被设置在微量滴定井92上面，并且被取向成使得反射不直接与传入的辐射反平行，而是代替地具有某一角偏移使得反射横向行进某一距离直到撞击在第二光学反射器69’上为止。辐射再次从光学反射器69’反射回到光学反射器69。利用每次传递，辐射还横向行进某一距离。因此，在遇到横向屏障或辐射被熄灭或吸收之前，实现辐射经过样品的多次传递。与上面描述的双传递一样，这些多次传递可以增强对附贴至生物样品140的荧光标签的猝灭操作的有效性，并且可以实现荧光的完全猝灭。
图8是光学猝灭系统70的另一实施例的概念侧视图。如在光学猝灭系统60中那样，辐射源72经过物镜74聚焦并且聚焦到一次性物92中，该一次性物92可以是多井滴定板或玻璃载片。光源72可以是发光二极管（如图4中的LED 42）或激光器（如图5中的激光源52）。当进入一次性物92时，该辐射可以通过一次性物92的透明玻璃基底支撑件170。该透明基底170可以支撑生物样品140。生物样品140可以在一次性物92的特定井的底部处，但是淹没在流体（诸如缓冲流体150）中。如在图7中，在一次性物92的特定井顶部处的可以是盖玻片160。该盖玻片可以搁在流体以及一次性物92的顶部上。
与以前的实施例一样，来自光源72的辐射可以通过物镜74并且进入淹没在缓冲流体150中的生物样品140中。因此，该辐射可以行进经过两个透明表面170，经过样品，并且经过光学盖玻片160。在该点处，辐射可以撞击在光学反射器69上。光学反射器69可以被设置在微量滴定井92上面，并且关于表面160和170成角度。以这种方式，来自光源72的光可以横向反射某一距离，撞击在另一反射器69上。以相反的指向设置该反射器，以使得水平行进的辐射在垂直方向上反射，并且因此反射回经过透明表面160和170，并且在第二次传递中反射回经过生物样品140。在第二次传递之后，该辐射被从两个光学反射器69’反射出，所述两个光学反射器69’可以与光学反射器69相同，但是被设置在光学反射器69下面并且横向邻近于光学反射器69。该辐射再次向侧向反射，并反射回经过生物样品140。利用每次通道，辐射还沿横向行进某一距离。因此，在遇到横向屏障或辐射被熄灭或吸收之前，实现辐射经过样品的多次传递。与上面描述的双传递一样，这些多次传递可以增强对附贴至生物样品140的荧光标签的猝灭操作的有效性，并且可以实现荧光的完全猝灭。因此，如上面描述的，多个反射镜可以被用于创建生成猝灭光经过样本的许多传递的系统，比如Herriott型或White型多反射单元或振荡器。
虽然在图8中示出四个反射器（69和69’），但是应该理解的是，可以将这里描述的概念扩展至任何数目的反射器和传递。
图9是光学猝灭系统80的另一实施例的概念侧视图。如在光学猝灭系统60和70中那样，辐射源82经过物镜84聚焦并且聚焦到多井滴定板92中。光源82可以是发光二极管（如图4中的LED 42）或激光器（如图5中的激光源52）。当进入多井滴定板92时，该辐射可以通过多井滴定板92的透明玻璃基底支撑件170。该透明基底170可以支撑生物样品140。生物样品140可以在多井滴定板92的特定井的底部处，但是淹没在流体（诸如缓冲流体150）中。在多井滴定板90的特定井的顶部处的可以是盖玻片160。该盖玻片160可以搁在流体以及微量滴定井92的顶部上。
与以前的实施例一样，来自光源82的辐射可以通过物镜84并且经过部分透射表面69进入淹没在缓冲流体150中的生物样品140中。如之前那样，该辐射然后可以行进经过透明表面170，经过样品，并且经过光学盖玻片160。在该点处，辐射可以撞击在第二部分透射光学反射器69”上。光学反射器69”可以被设置在微量滴定井92上面，与辐射的路径正交并且平行于光学反射器69。因为两个光学反射器69和69”是部分反射且部分透射的，所以它们在结合相干辐射源（诸如激光器82）使用时可以形成光学谐振器。因此，反射器69”相对于反射器69的位置中的精细调整可能对在谐振器内流通的辐射量并且因此对荧光猝灭系统80的猝灭有效性有引人注目的效果。因此，在光子经过端部反射器69离开谐振器或光子被熄灭或吸收之前，实现辐射经过样品的多次传递。与上面描述的双传递一样，这些多次传递可以增强对附贴至生物样品140的荧光标签的猝灭操作的有效性，并且可以实现荧光的完全猝灭。
因此，该光学猝灭系统可以进一步包括激光光源和在一次性物上面和下面的两个反射镜，其为激光光源限定谐振腔。
应该理解的是，这些实施例中的任一个和所有也可以与荧光检测器和计算机耦合，如关于图5中图示实施例描述的那样。因此，该光源42、52、62、72和82可以处在反馈控制下直到实现荧光信号的完全猝灭为止。
本发明的方法。
已经描述了示例性荧光成像系统30和示例性荧光猝灭系统40的部件，接下来将描述使用该装置的方法。应该理解的是，该方法可以利用先前描述的实施例中的部件中的任何和所有。下面将总体概述该方法，之后是如在图10中图示的具体算法。
本发明的系统实现对靶部分（比如由荧光试剂识别的生物样品上的抗原）的检测、定位和成像。利用本发明的系统，细胞可以被固定然后与荧光试剂接触。抗体被生物样品上的（例如细胞表面上的）相应抗原识别，并且在移除未结合的荧光试剂并且激发荧光部分之后，通过荧光试剂的荧光发射来检测抗原的位置。
通过具有针对荧光辐射的波长的足够分辨率和灵敏度的数字成像设备来实现对靶部分的定位。可以在具有或不具有光学放大（例如利用荧光显微镜）的情况下使用该数字成像设备。结果得到的图像例如以RAW、TIF、JPEG、或HDF5格式存储在适当的存储设备（比如硬盘驱动器）上。
为了检测不同的抗原，提供不同荧光试剂，其包括具有相同或不同荧光部分的不同抗原识别部分。因为限制了对具有不同波长的荧光发射的并行检测，所以按顺序单独地或者以小组（2-10个）一个接一个地利用荧光试剂。在该变体中，可以利用适当数目的检测器。优选地，通过利用滤波器掩蔽除了一个荧光发射之外的所有，使用仅一个检测器来按顺序检测各种荧光试剂的荧光发射。
在本发明的一个变体中，通过捕获在微腔中或者通过粘附来固定样本的生物样品——尤其是细胞的悬浮液。
总的来说，可以在若干变体中执行本发明的方法。例如，可以通过在检测到用荧光试剂标记的靶部分之前例如利用缓冲物清洗来移除没有被靶部分识别的缀合物。
在本发明的一个变体中，同时或按随后的染色序列提供至少两个荧光试剂，其中每种抗原识别部分都识别不同的抗原。
可以监测荧光发射的消除以便优化过程时间。在本发明中，当荧光发射被减小至起始荧光发射的小于5%（优选地小于1%）时，实现荧光发射的消除。为了方便起见，荧光的消除可以在最高发射的波长处测量，但计算发射光谱的积分也是合适的。在同时提供多于一个荧光试剂的变体中，荧光发射的减小基于测得的荧光发射中的每一个。
该系统和方法还可以包括两个光学系统——荧光成像系统30和光学猝灭系统40。这两个系统可以横向彼此邻近放置，并且通常在包含样本的微量滴定板92的井之一下面放置。换言之，该猝灭单元的光源可以横向邻近于荧光系统设置。备选地，该猝灭系统可以设置在工作平面上面。该微量滴定板90和92可以放置在可移动台架10的孔径中，该可移动台架10使井相对于流体处置系统70或者光学系统30和40移动。
通常，利用保持在微量滴定板90中的试剂之一对保持在微量滴定板92中的多个生物样本染色。通过将微量滴定板90的适当流体井定位在移液物70下面，可以通过向移液管70施加吸力来撤出试剂。然后通过使x-y台架横向移位直到适当的井在移液管70下面来将该试剂递送至适当的生物样本。将试剂递送至生物样本。
在培育之后，可以通过移动可移动x-y台架以将样本带到荧光成像系统30的视场中来由荧光成像系统30对样本成像。然后横向移位x-y工作平面，以使得该生物样本放置在荧光猝灭系统40的照射区中。然后通过光学辐射、氧化或酶催化降解和后续清洗来使荧光猝灭。在充分猝灭之后，可选地对样本成像以达到校正/控制目的，然后向样本施加另一试剂，并且重复该过程。可以重复该顺序的步骤直到已经将大量的试剂施加于至少一个生物样本为止。
应该理解的是，可以酌情添加附加的步骤，诸如添加缓冲物、清洗、添加或撤出流体、冷藏和加热。
图10是用于使用上面关于图1-9描述的用于分析生物样品的自动分析工具的特定方法的简化流程图。该方法在步骤S10中开始并且继续至步骤S20。在步骤S20中，利用至少一种荧光试剂来对样品染色，并且培育该样品。在该实施例中，在两种荧光试剂（诸如FITC和PE）之后施加DAPI。在培育期间，这些试剂可以被生物样品吸收。在步骤S30中，清洗样品。在该步骤中，可以通过移液管来将附加的缓冲物添加至井。随后通过移液管来撤出过量的流体。在步骤S40中，然后将样品定位在荧光成像系统上，并且获得DAPI图像。该图像可以标识样品中的突出结构（诸如细胞核、线粒体等等）。这些突出结构可以用作地标，以便允许成像系统在成像步骤和猝灭步骤之间重新定位一次性物之后将样本定位在完全相同的位置。
然后在步骤S50中，该荧光成像系统可以被配置成对FITC和PE荧光成像。在这些条件下获取的图像可以指示样品与缀合于FITC或PE荧光团的抗体的结合。在后续步骤S60中，询问是否所有标记都已经被成像的问题。如果这样的话，该过程在步骤S70中结束。如果剩下附加的标记，则在步骤S80中样品被脱色或者荧光被猝灭。可以通过一次性物的横向机械移位来完成该脱色步骤，以使得该样本被定位在猝灭系统上。
因此，该例程可以包括在施加不同的化合物之间通过猝灭系统进行的对荧光信号的猝灭。可以通过在计算机控制下定位先前标识的特征或地标来对该样本重新定位。该计算机可以使工作平面移动以使得在不同化合物的重复施加、渲染生物样本的比较视图以及其与施加的不同化合物的相互作用中显示相同的特征。
然后再次对DAPI成像以便使样本关于在步骤S40中取得的图像重新定位，并且再次取得FITC和PE的荧光图像。如果荧光已经猝灭或熄灭，则该方法返回到步骤S20，在步骤S20中施加新的着色剂并且培育样本。
在本发明的一个变体中，可能不通过对样本的DAPI染色而是通过向包含样本的容器提供荧光标记的颗粒/斑点或圆点来实现对样本的重新定位。当样本是微腔中的隔离细胞时，该变体尤其有用。
还在图9的流程图中示出的是循环，其中荧光尚未完全猝灭，并且重复该循环。该方法与图4中示出的实施例最密切地对应，其中荧光猝灭系统40在反馈控制下。在步骤S110中，测量该荧光来看它是否已降到阈值水平以下。如已经公开的，荧光的消除可以在最高发射波长处测量，但计算发射光谱的积分也是合适的。在本发明的该变体中，该控制单元和/或猝灭单元被配置成使得当荧光发射没有通过猝灭消除在预定义阈值以下时，重复该猝灭过程。例如，认为当荧光发射被减小至起始荧光发射的小于5%（优选地小于1%）时，实现荧光发射的猝灭。如果这样的话，该过程返回至步骤S20。如果不是这样的话，在步骤S80中重复该猝灭过程。
更一般地，该自动方法可以包括将具有荧光染料的至少一个生物样本保持在台架上的孔径中的容器中，激发荧光染料并且利用荧光系统对从荧光染料获得的荧光信号成像，在限定工作平面的至少两个正交维度上移动孔径、台架、荧光系统和猝灭单元中的至少一个直到生物样本邻近于猝灭单元为止，利用猝灭单元来使荧光信号猝灭，以及在猝灭之后对生物样本成像。该自动方法可以进一步包括利用流体处置系统将一系列流体转移到保持生物样本的容器中，以及利用该系列流体以自动方式执行包括荧光染料的激发、荧光信号的检测和收集以及荧光信号的猝灭的例程。
虽然已经结合上面概述的示例性实现方式描述了各种细节，但是在查看前述公开内容时，各种备选方案、修改、变化、改进和/或实质等价物（无论是已知的，还是目前未预见的或可能目前未预见的）都可能变得明显。此外，意图使与具体方法、尺寸、材料使用、形状、制造技术等等有关的细节仅是说明性的，并且本发明不限于此类实施例。诸如顶部、底部、左、右、后前等等的描述符是任意的，因为应该理解的是，系统和方法可以以任何取向来执行。因此，意图使上面阐述的示例性实现方式是说明性的而非限制性的。

Claims (20)

1.一种用于分析利用至少一个荧光染料染色的生物样本的自动系统，包括：
利用荧光染料染色的至少一个生物样本；
沿x-方向和y-方向横向可移动的台架，用于保持至少一个生物样本，其中生物样本利用荧光染料染色，该横向x-y-方向限定工作平面；
其中荧光检测器在检测器的视野中检测从生物样本上的荧光染料获得的第一荧光信号，并监测来自生物样本的荧光信号的衰减作为猝灭数据，和
荧光系统，包括产生第一辐射的至少一个光源，并且其中第一辐射通过将其辐射撞击在视野上来激发生物样本上的荧光染料；
包括第二光源的猝灭系统，其通过施加由第二光源产生的第二辐射来减弱第一荧光信号；
具有非暂态存储器的计算机可读介质，其中非暂态存储器编码有用于控制器进行如下操作的指令：将台架横向移动到第一位置；将第一辐射施加到至少一个生物样本；测量第一荧光信号；施加第二辐射，并测量第一荧光信号的衰减以产生猝灭数据，并使用猝灭数据通过反馈回路来调整第二辐射的持续时间和强度，并存储与第一位置相关的猝灭数据。
2.根据权利要求1所述的自动系统，进一步包括流体处置系统，所述流体处置系统向所述生物样本提供生物活性化合物，其中所述生物活性化合物包括荧光染料、使荧光信号猝灭的化合物以及清洗流体和缓冲物中的至少一个，其中所述流体处置系统将这些生物活性化合物转移到生物样本。
3.根据权利要求1所述的自动系统，其中所述控制器收集来自所述检测器的荧光信号作为利用荧光染料染色的生物样本的图像。
4.根据权利要求2所述的自动系统，其中所述流体处置系统包括设置在台上的机器人控制的移液系统，其中所述移液系统能够沿着与所述检测器的工作平面正交的z轴移动，并且供应所述生物样本到样本阶段。
5.根据权利要求2所述的自动系统，进一步包括至少一个附加流体容器，其包含试剂、具有检测部分的抗原识别部分、具有荧光染料的抗体、抗生素、生物营养物、毒素、着色剂和氧化剂中的至少一个，由此来自至少一个附加流体容器的抗原识别部分被提供给生物样本。
6.根据权利要求1所述的自动系统，其中所述台架进一步包括用于保持所述生物样本的容器，所述容器具有多个流体孔，每个流体孔含有单独的生物样本，其中用于保持所述生物样本的容器是滴定板。
7.根据权利要求6所述的自动系统，其中所述容器包括透明和不透明部分，其中具有荧光染料的生物样本位于透明部分上并且不透明部分反射或吸收荧光信号，其中透明部分允许通过第一和第二辐射。
8.根据权利要求1所述的自动系统，其中所述第二辐射由具有光束角的发光二极管产生，并且其中所述发光二极管设置为照射在所述检测器的视场之外的所述生物样本。
9.根据权利要求8所述的自动系统，进一步包括至少一个反射镜，该反射镜设置为将由所述发光二极管产生的所述第二辐射的未被所述生物样本或所述荧光染料吸收的部分反射回到所述生物样本中，以使荧光猝灭。
10.根据权利要求8所述的自动系统，其中所述荧光系统进一步包括荧光检测器，其监测来自所述工作平面中的所述生物样本的荧光信号的衰减，作为猝灭数据。
11.根据权利要求10所述的自动系统，其中所述控制器被配置为控制所述第二辐射的强度和持续时间以减弱所述第一荧光信号直到所述第一荧光信号达到预定水平，并且所述控制器将所述第一荧光信号和猝灭数据存储为与图像中的第一位置相关。
12.根据权利要求1所述的自动系统，其中所述控制器在可移动台架上以+/-1-200微米的精度沿x或y方向移动所述生物样本。
13.根据权利要求1所述的自动系统，进一步包括：温度控制单元，通过冷却或加热所述生物样本的外壳将所述生物样本的温度保持在10-40℃。
14.根据权利要求1所述的自动系统，其中所述检测器在视场中检测从所述荧光染料获得的荧光信号，其中所述视场是所述检测器在静止时能够观察到的生物样本的一部分。
15.根据权利要求11所述的自动系统，其中在获得与图像中的第一位置相关的第一数据之后，控制器将检测器相对于生物样本移动到至少一个生物样本上方的第二位置以获得与第二位置相关的第二数据，并构建包括第一数据和第二数据的图像，直到检测器检测到从整个生物样本的荧光染料获得的所有荧光信号，这是通过经过移位检测器和生物样本中的至少一个而在整个生物样本上顺序移位检测器的视野，将检测器/样本的相对位置与生物样本的已知位置进行比较。
16.根据权利要求1所述的自动系统，其中所述控制器被配置为还将所述检测器、所述猝灭系统和所述荧光系统移动到所述生物样本上的多个点并且在所述多个点中的每一个处重复数据的收集直到数据包括至少一个生物样本中的整个感兴趣区域，并且控制器处理数据以形成至少一个生物样本的图像。
17.根据权利要求1所述的自动系统，其中所述控制器被配置为通过增加或继续被施加到所述生物样本的辐射直到荧光信号停止从所述生物样本发射来使荧光信号猝灭。
18.一种用于分析生物样本的自动方法，包括：
将具有荧光染料的至少一个生物样本保持在容器中的第一位置；
利用来自荧光系统的第一辐射照射具有荧光染料的生物样本；
利用具有视场的检测器检测从荧光染料获得的荧光信号；
在检测荧光信号之后通过如下步骤，利用来自荧光系统的第二辐射使荧光信号猝灭：使用基于荧光信号的反馈回路以增加或继续被施加到生物样本的第二辐射的量，直到荧光信号停止从生物样本发射；
测量第一荧光信号的衰减以产生猝灭数据，并使用猝灭数据利用反馈回路来调整第二辐射的持续时间和强度，
存储与第一位置相关的猝灭数据，以及
在定义工作平面的至少两个正交维度上将视场、台架、荧光系统和生物样本中的至少一个移动到工作平面内的第二位置，直到生物样本的新视野与荧光系统相邻。
19.根据权利要求18所述的自动方法，进一步包括：
在猝灭后对生物样本进行成像。
20.根据权利要求18所述的自动方法，进一步包括：
利用流体处置系统将一系列流体转移到保持生物样本的容器中；和
利用该系列流体以自动方式执行包括荧光染料的激发、荧光信号的检测和收集以及荧光信号的猝灭的例程。
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