DE10143757A1

DE10143757A1 - Methode zur Darstellung von Merkmalen in Geweben

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Publication number: DE10143757A1
Application number: DE2001143757
Authority: DE
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-09-06
Filing date: 2001-09-06
Publication date: 2003-03-27

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung von Merkmalen in Geweben.

Description

Die vorliegende Anmeldung betrifft Methoden zur transienten Darstellung koinzidenter biochemischer, geno- und phänotypischer Merkmale in unbegrenzter Anzahl in Geweben (Zellen und der sie umgebenden extrazellulären Matrix) am Ort ihrer Primärlokalisation (in situ)

1. Problemstellung

Gewebe bestehen aus komplexen dreidimensionalen Verbänden von in einer extrazellulären Matrix eingebetteten Zellen. Die einzelne Zelle ist die kleinste, selbständig lebensfähige Einheit eines Gewebes (z. B. Organ). Die Gesamtheit der geno- und phänotypischen Merkmale oder Merkmalskombinationen (= koinzidente Merkmale) der Einzelzellen und die biochemischen Eigenschaften der von ihnen gebildeten Matrix bestimmt die Eigenschaften und Funktionen eines Gewebes. Typischerweise setzen sich Gewebe nicht aus merkmalsgleichen (homogenen) Zellen zusammen.
Vielmehr bestehen sie aus einzelnen Zellen mit sehr unterschiedlichen biochemischen, geno- und phänotypischen Eigenschaften innerhalb einer ebenfalls aus sehr unterschiedlichen Bestandteilen aufgebauten Matrix. Dieses Phänomen wird als Heterogenität bezeichnet und findet sich sowohl in gesundem als auch in krankhaft veränderten Geweben.
Erkranktes Gewebe unterscheidet sich von gesundem durch spezifische Veränderungen bestimmter biochemischer, geno- und phänotypischen Merkmale oder Merkmalskombinationen seiner einzelnen Zellen sowie Veränderungen der Beschaffenheit der extrazellulären Matrix. Wie beim gesunden Gewebe, bestimmt die Gesamtheit der geno- und phänotypischen Merkmale oder Merkmalskombinationen (= koinzidente Merkmale) der Einzelzellen und die biochemischen Eigenschaften der von ihnen gebildeten Matrix die Eigenschaften und Funktionen eines erkrankten Gewebes. Auch das erkrankte Gewebe zeigt eine deutliche Heterogenität hinsichtlich der geno- und phänotypischen Merkmale oder Merkmalskombinationen seiner Zellen und der Beschaffenheit seiner extrazellulären Matrix.
Die Muster von biochemischen, geno- und phänotypischen Merkmalen oder Merkmalskombinationen erlauben eine spezifische Diagnostik an Geweben, etwa die Erkennung von Krebs oder Entzündungen.
Beispiele für diagnostisch relevante Merkmale auf Genebene sind bestimmte Onkogene und Tumorsuppressorgene, wie Her-2/neu, c-myc oder n-myc (Onkogene) und APC, RB oder p53 (Tumorsuppressorgene). Beispiele für diagnostisch relevante Proteine (phänotypische Merkmale) sind c-erbB2, Östrogen- und Progesteronrezeptoren beim Mammakarzinom oder kappa- und lambda-Leichtketten bei Plasmozytomen.
Beispiele für diagnostisch relevante Bestandteile der extrazellulären Matrix sind Matrixproteasen, denen unter anderem beim Mammakarzinom eine prognostische Bedeutung zukommt. Weiterhin lassen sich in der extrazellulären Matrix eine Vielzahl von Erregern (z. B. Bakterien) nachweisen, so daß die Rolle der Erregerdiagnostik in situ zunehmend wichtig wird. Neben zahlreichen anderen extrazellulären Substanzen seien auch noch bestimmte Typen von Amyloid, Kollagene oder Fibrine genannt, die in der Entzündungspathologie wichtig sind.
Die Erfassung dieser Merkmale kann beispielsweise mikroskopisch in sehr dünnen (histologischen) Gewebeschnitten erfolgen. Die biochemischen, geno- und phänotypischen Merkmale von Geweben können mit bestimmten Methoden, die eine direkte oder indirekte Erfassung der Moleküle, die diese Merkmale bedingen in den Einzelzellen und innerhalb ihrer extrazellulären Matrix sowie eines Gewebes am Ort ihrer primären Lokalisation (in situ) dargestellt und quantifiziert werden. Alternativ können z. B. (zytologische) Zellpräparationen, die aus einzelnen Zellen oder Zellgruppen mit assoziierter extrazellulärer Matrix bestehen, verwandt werden.
Gebräuchliche Methoden, die eine Erfassung bestimmter Merkmale am Ort ihrer primären Lokalisation (in situ) erlauben, sind z. B. die Immunhistochemie und die in situ Hybridisierung.
Die Immunhistochemie basiert darauf, daß spezifische Antikörper oder Antikörperfragmente, die gegen bestimmte molekulare zelluläre bzw. extrazelluläre Gewebebestandteile gerichtet sind, mit Gewebeschnitten inkubiert werden. Befindet sich das gesuchte Molekül (= Antigen, respektive Epitop) im untersuchten Gewebe, können sich die Antikörper fest daran binden. Der an das Antigen gekoppelte Antikörper kann über Detektionsverfahren, qualitativ und quantitativ erfaßt werden.
Der Begriff Antikörper schließt in den nachfolgenden Ausführungen auch immer Teile/Fragmente von Antikörpern wie z. B. Fab Fragmente oder Antikörperfragmente vom scFv Format (insbesondere auch humane) mit ein.
Die dem Fachmann bekannten und erfindungsgemäß verwendeten Methoden der Immunhistochemie sind z. B. die direkte Immunhistochemie, die indirekte Immunhistochemie, die doppelt indirekte Immunhistochemie, die PAP- Methode (Peroxidase-Anti-Peroxidase), die APAAP-Methode (Alkalische Phosphatase-Anti-Alkalische Phosphatase), die ABC-Methode (Avidin-Biotin- Komplex), die LAB/LSAB-Methode (Labeled (Strept)Avidin-Biotin), die indirekte komplementverstärkte Methode, sowie die EPOS-Methode (Enhanced Polymer One Step Staining) (siehe z. B. Höfler H, Noll S, Müller KM, Schaub-Kuhnen in: Praxis der Immunhistochemie, Urban und Fischer 2000). Die in situ Hybridisierung ist eine Methode, bei der spezifische Nukleinsäure-Sequenzen (DNA, RNA) in Zellen nachgewiesen werden. Dabei wird eine mit der gesuchten Zielsequenz komplementäre Nukleinsäurekette an die Zielsequenz in der Gewebeprobe angelagert (hybridisiert). Die angelagerte Nukleinsäurekette wird über ähnliche wie bei der Detektion von Antikörper-Antigen-Komplexen üblichen Nachweisverfahren qualitativ und quantitativ erfaßt.
Die Immunhistochemie, die in situ Hybridisierung oder andere Methoden werden üblicherweise zum Nachweis von nur einem bestimmten biochemischen, geno- und phänotypischen Merkmal am Ort seiner primären Lokalisation (in situ) innerhalb einer Zelle, einer extrazellulären Matrix und des aus diesen Bestandteilen bestehenden Gewebes eingesetzt.
Die Darstellung mehrerer biochemischer, geno- und phänotypischer koinzidenter Merkmale innerhalb einer Zelle, einer extrazellulären Matrix und des aus diesen Bestandteilen bestehenden Gewebes am Ort ihrer Primärlokalisation (in situ) kann durch Immunhistochemie, die in situ Hybridisierung oder andere Methoden entweder in simultaner oder in sequentieller Darstellung dieser Merkmale erreicht werden.
Simultane Darstellung bestimmter biochemischer, geno- und phänotypischer koinzidenter Merkmale bedeutet hierbei die gleichzeitige Inkubation/Hybridisierung von mehreren Antikörpern und/oder mehreren spezifischen Nukleinsäuresequenzen sowie deren Detektion in einem Gewebe oder in Einzelzellen in einem Versuchsansatz mit dem Ziel der Detektion mehrerer bestimmter koinzidenter Merkmale in situ.
Sequentielle Darstellung bestimmter biochemischer geno- und phänotypischer koinzidenter Merkmale bedeutet hierbei eine Abfolge an Inkubationen/Hybridisierungen jeweils eines oder mehrerer Antikörper oder einer oder mehrerer spezifischen Nukleinsäuresequenzen innerhalb eines Experiments sowie deren Detektion in ein und demselben Gewebe in mehreren nacheinandergeschalteten Versuchsansätzen mit dem Ziel der Erfassung mehrerer bestimmter koinzidenter Merkmale in situ. Voraussetzung für eine sequentielle Darstellung ist entweder die Reversibilität der Darstellung eines Einzelmerkmals oder eine Art der Detektion, die eine Unterscheidung der Einzelmerkmale in den nacheinandergeschalteten Versuchsansätzen erlaubt.
Die Anzahl der darstellbaren koinzidenten biochemischen, geno- und phänotypischen Merkmale am Ort ihrer primären Lokalisation (in situ) innerhalb eines Gewebes, seiner Einzellen und der extrazellulären Matrix ist bei der herkömmlichen Immunhistochemie und der in situ Hybridisierung mit ihren jeweiligen Detektionsverfahren begrenzt.
Die Begrenzung der Anzahl der immunhistochemisch darstellbaren koinzidenten phänotypischen und biochemischen Merkmale am Ort ihrer primären Lokalisation (in situ) innerhalb eines Gewebes, seiner Einzellen und der extrazellulären Matrix sind vor allem bedingt durch:

1. Mögliche Kreuzreaktionen der Primärantikörper untereinander.
2. Kreuzreaktionen verschiedener Detektionssysteme untereinander und mit bestimmten Primärantikörpern.
3. Kolokalisation der Antigene respektive Epitope (Farbüberlagerungen bei der Detektion).
4. Begrenzte Anzahl von Farbstoffen und Farbstoffkombinationen der Detektionssysteme zur Abgrenzung der Einzelmerkmale.
5. Irreversibiliät bestimmter Detektionsverfahren, die ein sequentielles Vorgehen unmöglich machen weil Einzelmerkmale (Antigene respektive Epitope) zwischen der nacheinandergeschalteten Versuchsansätzen nicht unterschieden werden können.

Die wichtigsten Gründe einer Begrenzung der Anzahl der durch in situ Hybridisierung darstellbaren Merkmale am Ort ihrer primären Lokalisation (in situ) innerhalb eines Gewebes, seiner Einzellen und der extrazellulären Matrix sind:

1. Mögliche Kreuzreaktionen der Nukleinsäuresequenzen.
2. Kreuzreaktionen verschiedener Detektionssysteme untereinander und mit den primären Nukleinsäuresequenzen.
3. Kolokalisation der zu detektierenden Zielsequenzen (Farbüberlagerungen).
4. Begrenzte Anzahl von Farbstoffen und Farbstoffkombinationen der Detektionssysteme zur Abgrenzung der Einzelmerkmale.
5. Irreversibiliät bestimmter Detektionsverfahren, die ein sequentielles Vorgehen unmöglich machen weil Einzelmerkmale (Zielsequenzen) zwischen der nacheinandergeschalteten Versuchsansätzen nicht unterschieden werden können.

In WO 00/20641 wird der simultane Nachweis von genotypischen (Her2/neu, Zentromer 17) und phänotypischen (Her-2/neu Protein und zytomorphologische Merkmale) im Gewebe beschrieben. Diese Erfindung bezieht sich auf Kombination von der Fluoreszenz in situ Hybridisierung für die Darstellung der genotypischen Merkmale und der Immunhistochemie sowie einer HEMA-Färbung für die phänotypischen Merkmale. Die Erfindung zielt daher nicht auf die Darstellung von vielen bzw. einer unbegrenzten Anzahl biochemischer, geno- und phänotypischer Merkmale. Die Art der dort beschriebenen Detektion ist irrversibel, was die Erfassung einer unbegrenzten Anzahl von Merkmalen in einer Zelle nicht zuläßt. Nicht erkannt wurde die Notwendigkeit, für bestimmte Fragestellungen auch die Beschaffenheit der extrazellulären Matrix gleichzeitig zu erfassen.
In US 5759781 und WO 99/62926 sollen eine große Anzahl von genotypischen Merkmalen durch FISH in einem simultanen Ansatz dargestellt werden. Das Verfahren bezieht sich auf kombinatorisch fluoreszenzmarkierte Nukleinsäuresequenzen. Es handelt sich hierbei um Fluoreszenzfarbstoffe (FITC, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7), die in bestimmten Mischungsverhältnissen zur Markierung der Nukleinsäuresequenzen verwendet werden. Die Mischungsverhältnisse müssen so sein, daß die Markierungen bei der Detektion unterscheidbar sind. Es handelt sich um einen simultanen Ansatz. Es kann nur eine begrenzte Anzahl von Markierungen erreicht werden, weil die Anzahl der Ausgangsfarbstoffe begrenzt ist. Der Ansatz ist simultan, nicht sequentiell. Die Methode bezieht sich hauptsächlich auf zytogenetische Präparationen (Metaphasechromosomen), so daß eine komplexe Heterogenität von Merkmalen nicht erkannt werden kann. Nicht erkannt wurde die Notwendigkeit auch Proteine beipielsweise durch die Immunhistochemie bzw. die Beschaffenheit der extrazellulären Matrix zu erfassen, so daß eine komplexe Beschreibung der Gewebe möglich ist.
US-A 6165734 beschreibt ein Verfahren, welches Immunhistochemie, Fluoreszenz in situ Hybridisierung und Morphologie in einem Gewebe kombiniert. Das Verfahren beschränkt sich jedoch auf die Erfassung einer begrenzten Anzahl an Merkmalen. Die Art der Detektion von Immunhistochemie, Fluoreszenz in situ Hybridisierung und morphologischer Färbung ist irreversibel und erlaubt deshalb nicht die Darstellung einer unbegrenzten Anzahl an Merkmalen. Nicht erkannt wurde die Notwendigkeit, für bestimmte Fragestellungen auch die Beschaffenheit der extrazellulären Matrix gleichzeitig zu erfassen.
US-A 5994089 beschreibt ein Verfahren zur simultanen Analyse von Populationen in Zellsuspensionen mittels Durchflußzytometrie. Hierbei kommt eine Kombinationen von mehreren Fluorochromen in unterschiedlicher Intensität zur Darstellung der Merkmale zum Einsatz. Die Grenzen der Durchflußzytometrie liegen jedoch darin, daß nicht oder nur teilweise Bestandteile der extrazellulären Matrix miterfaßt werden können. Weiterhin ist ein sequentielles Vorgehen mit der Durchflußzytometrie nicht möglich, weil Einzelzellen wie in US-A 5994089 nicht wieder aufgefunden werden können.

2. Aufgabe der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf die Darstellung einer unbegrenzten Anzahl von bestimmten koinzidenten biochemischen, geno- und phänotypischen Merkmalen am Ort ihrer primären Lokalisation (in situ) innerhalb einer Zelle, und innerhalb einer extrazellulären Matrix und des gesamten aus diesen Bestandteilen bestehenden Gewebes. Die Erfindung zielt daher auf die Beschreibung einer komplexem (gesamten) Heterogenität von koinzidenten Merkmalen in krankhaft verändertem und gesundem Gewebe.
Die Erfindung unterscheidet sich somit von den herkömmlichen Methoden mit denen nur eine begrenzte Anzahl an geno- und phänotypischen Merkmalen am Ort ihrer primären Lokalisation (in situ) innerhalb von Zellen erfaßt werden. Die herkömmlichen Methoden erlauben keine Erfassung einer unbegrenzten Anzahl von geno- und phänotypischen Merkmalen am Ort ihrer primären Lokalisation (in situ). Außerdem wurde das Problem der Heterogenität von Geweben nicht zureichend erkannt, da nicht gleichzeitig die extrazelluläre Matrix nur unzureichend miterfaßt wurde und somit auch die komplexe heterogene Gesamtheit des Gewebes zureichend erkannt werden kann.

3. Lösung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde eine unbegrenzte Anzahl koinzidenter biochemischer, geno- und phänotypischer Merkmale in einem Gewebe, seinen Einzellen und seiner extrazellulären Matrix am Ort ihrer Primärlokalisation (in situ) durch ein kombiniertes simultanes und sequentielles Vorgehen darzustellen.

3.1. Transiente Markierung eines Antikörpers

Es wird an einen bestimmten Antikörper, der gegen ein bestimmtes Antigen respektive Epitop (Merkmal) gerichtet ist, ein bestimmter Farbstoff mit dem Ziel einer Detektion dieses Merkmals so gebunden, daß die Bindung entweder reversibel ist, indem sie physikalisch, chemisch oder enzymatisch aufgehoben werden kann oder der Farbstoff direkt physikalisch, chemisch oder enzymatisch zerstört werden kann. Diese nur vorübergehende Bindung des Farbstoffs zur Detektion des Merkmals wird als transiente Detektion bezeichnet. Die transiente Detektion ermöglicht die Detektion des Antigens (Merkmais) am Ort seiner Primärlokalisation (in situ) und ermöglicht durch ihre Reversibilität eine unbegrenzte Anzahl von nachgeschalteten Detektionen. Die transiente Detektion grenzt sich somit durch eine gewollte Reversibiltät der Detektion von den herkömmlichen irreversiblen Detektionsverfahren der Immunhistochemie ab.
Beispielsweise sollen diagnostisch relevante Antikörper (u. a.: c-erbB2, Progesteronrezeptoren, Östrogenrezeptoren, verschiedene Matrixproteasen) transient markiert und zur simultanen und sequentiellen in situ Darstellung beim Mammakarzinom eingesetzt werden. c-erbB2 ist u. a. der als Prognosefaktor beim Mammakarzinom bedeutsam. Der Nachweis von c- erbB2 ist Voraussetzung für eine Therapie, die sich gegen das Onkoprotein in den Tumorzellen richtet und bei mit Patienten mit einem Mammakarzinom durchgeführt werden kann. Auch bestimmte Hormonrezeptormoleküle wie Östrogenrezeptoren oder Progesteronrezeptoren werden von einem bestimmten Anteil von Mammakarzinomen exprimiert. Wie bei c-erbB2, ist die Quantifizierung dieser Rezeptoren im Tumorgewebe Voraussetzung für eine Therapie der Patienten. Durch Bestimmung von Matrixproteasen lassen sich bestimmte prognostische Aussagen treffen. C-erbB2, Östrogenrezeptoren und Progesteronrezeptoren sowie Matrixproteasen werden deshalb heute routinemäßig immunhistochemisch (in situ) an Tumorgeweben von Mammakarzinomen bestimmt. Aufgrund der oben beschriebenen Grenzen der Immunhistochemie wird herkömmlicherweise jede Untersuchung in Form von parallelen aufwendigen Einzeluntersuchungen an mehreren aufeinander folgenden Gewebeschnitten von einem Tumorgewebe durchgeführt. Eine Bestimmung aller Merkmale zusammen in einem Tumorgewebeschnitt kann nach herkömmlichem Vorgehen nicht durchgeführt werden.
Für die Diagnose von zahlreichen Tumoren ist oftmals der Nachweis von vielen Merkmalen notwendig; die in sehr aufwendigen Einzeluntersuchungen an aufeinanderfolgenden Tumorgewebeschnitten herkömmlicherweise durchgeführt werden müssen. Der untersuchende Pathologe muß dann nach der Darstellung der Einzelmerkmale nach koinzidenten Merkmalen in dem Tumorgewebe suchen, indem er aus den in situ Einzeldarstellungen der Tumorgewebeschnitte durch Kombination und Rekonstruktion der Einzelergebnisse auf das Tumorgewebe als ganzes rückschließt. Beispiele für den Nachweis von zahlreichen Merkmalen zur Diagnosestellung sind undifferenzierte Tumoren, in denen durch Immunhistochemische Darstellung bestimmter Merkmale (Marker) zunächst eine grobe Klassifikation des Tumorgewebes erreicht werden kann, um dann in sich anschließenden weiteren immunhistochemischen Untersuchungen zunehmend verfeinert zu werden. So können zunächst immunhistochemisch epitheliale Tumoren (z. B. Nachweis von BerEP4, CK panAE1/AE3, CK pa-LU5, CK5/8, CK6, CK7, CK13, CK14, CK18, CK19, CK20, CA12.5, CA15.3, CA19.9, CRP, EMA, HEA125, Hep Par 1, MUC2, TTF, Villin) von mesenchymalen Tumoren abgegrenzt werden (z. B. Nachweis von Calretinin, CD31, Desmin, Faktor VIII RA, GFAP, HMB45, Inhibin, Melan-A, Myoglobin, Myo D1, NF pan, CD99/MIC2, Sm-Aktin, S-100, Vimentin). Nachfolgend kann dann weiter differenziert werden mit beispielsweise gewebsspezifischen Antikörpern (z. B. Nachweis von Thyreoglobulin, PSA, PSP, PLAP, Pankreas Lipase), zellzyklus assoziierten Antikörpern (z. B. Nachweis von MIB-1, P53), onkofetalen Antikörpern (z. B. AAT, AFP, CEA, HPL) oder Entzündungsmarkern (C3, C5, Amyloid A). Zur Klassifikation von Lymphomen sind z. B. folgende Antikörper gebräuchlich: CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD15, CD20, CD23, CD30, CD35, CD38, CD43, CD45/LCA, CD45ROOPD4, CD56, CD57, CD61, CD68, CD79a, CD117, CD138, ALK1, Bcl-2, Bcl-6, Cyclin D1, DBA.44, Gylcophorin C, Lysozym, MAC387, MPO, NP57, TdT, Tia-1, VS38, IgA, IgD, IgG, IgM, kappa, lambda, p27. Ein weiteres Beispiel für die aufwendige Darstellung von phänotypischen Merkmalen ist die Klassifikation von Tumoren des Neuroendokrinen Systems: Hyophysentumoren (Nachweis von Chromogranin A, Synaptophysin, NSE, PHE5, ACTH, alpha-HCG, beta- HCG, beta-FSH, beta-LH, beta-TSH, Calcitonin, C-Peptid, Bombesin, Gastrin, Glucagon, Insulin, Neurotensin, Parathormon, PGP9.5, PP, Prolactin, Substanz P, Serotonin, Somatostatin, VIP), Neuroendokrine Tumoren des Gastronintestinaltraktes (Nachweis von Chromogranin A, Synaptophysin, NSE, PHE5, Calcitonin, C-Peptid, Bombesin, Gastrin, Glucagon, Insulin, Neurotensin, PGP9.5, PP, Substanz P, Serotonin, Somatostatin, VIP) oder neuroendokrine Tumoren der Lunge (Nachweis von Mib-1, Chromogranin A, Synaptophysin, NSE, PHE5, ACTH, alpha-HCG, beta-HCG, beta-FSH, beta- LH, beta-TSH, Calcitonin, C-Peptid, Bombesin, Gastrin, Glucagon, Insulin, Neurotensin, Parathormon, PGP9.5, PP, Prolactin, Substanz P, Serotonin, Somatostatin, VIP). Herkömmlicherweise wird für jeden zu untersuchenden Antikörper in einem eigenen Untersuchungsgang eine Darstellung an aufeinanderfolgenden Tumorschnitten des jeweiligen Patienten durchgeführt.
Bei den Farbstoffen, die zur transienten Markierung von Antikörpern eingesetzt werden sollen handelt es sich beispielsweise um die Fluorochrome FITC, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 and Cy7, Texas Red, Fluorescein, Phycocrytherin, Rhodamine, Phycocyanin, Dansyl, Umbelliferon, SPECTRUM GREEN, SPECTRUM ORANGES und Derivate. Weitere Farbstoffe, die für eine transiente Detektion eingesetzt werden sollen sind DAB (Diaminobenzidine) oder Fast Red®.

3.2. Transiente Markierung eines Nukleinsäuresequenz

Es wird an eine bestimmte Nukleinsäuresequenz, die sich komplementär zu einer bestimmten Zielsequenz (Merkmal) verhält, ein bestimmter Farbstoff mit dem Ziel einer Detektion dieses Merkmals so gebunden, daß die Bindung entweder reversibel ist, indem sie physikalisch, chemisch oder enzymatisch aufgehoben werden kann oder der Farbstoff direkt physikalisch, chemisch oder enzymatisch zerstört werden kann. Diese nur vorübergehende Bindung des Farbstoffs zur Detektion des Merkmals wird als transiente Detektion bezeichnet. Die transiente Detektion ermöglicht die Detektion des Antigens (Merkmals) am Ort seiner Primärlokalisation (in situ) und ermöglicht durch ihre Reversibilität eine unbegrenzte Anzahl von nachgeschalteten Detektionen. Die transiente Detektion grenzt sich somit durch eine gewollte Reversibiltät der Detektion von den herkömmlichen irreversiblen Detektionsverfahren der in situ Hybridisierung ab.
Ein klinisch relevantes Beispiel für eine DNA-Nukleinsäuresequenz, die transient markiert werden soll ist HER-2/neu. Der Nachweis einer HER-2/neu Genamplifikation ist Voraussetzung für eine (Immun)-Therapie, die sich gegen das Onkoprotein richtet und bei Patienten mit einem Mammakarzinom durchgeführt werden kann. Weitere Beispiele für DNA- Nukleinsäuresequenzen die transient markiert werden sollen sind Cyclin D1, c-myc oder c-met. Der koinzidente Nachweis von Amplifikationen hat statistisch hochsignifikante prognostische Bedeutung für Patienten mit einem Mammakarzinom (Cuny et al., Cancer Research 60 (2000), 1077-83). Neben dem Nachweis von bestimmten genlocusspezifischen Nukleinsäuresequenzen sollen auch Nukleinsäuresequenzen, die sich komplementär zu zentromerischen und perizentromerischen Regionen aller Chromosomen verhalten, transient markiert werden. Mit solchen Sonden kann der Nachweis von numerischen Veränderungen entweder des gesamten Chromosomensatzes (aller Chromosomen) oder von Kombinationen bestimmter Chromosomen durchgeführt werden. Durch solche Untersuchungen lassen sich bestimmte prognostische oder diagnostische Aussagen treffen. Weitere wichtige Beispiele sind der Nachweis von bestimmten Translokationen, etwa bei bestimmten Leukämien oder bei Lymphomen.
Bei den Farbstoffen, die zur transienten Markierung von Nukleinsäuresequenzen eingesetzt werden sollen handelt es sich beispielsweise um die Fluorochrome FITC, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 and Cy7, Texas Red, Fluorescein, Phycocrytherin, Rhodamine, Phycocyanin, Dansyl, Umbelliferon, SPECTRUM GREEN, SPECTRUM ORANGE und Derivate.
Weitere Farbstoffe, die für eine transiente Detektion eingesetzt werden sollen sind DAB (Diaminobezidin) oder Fast Red®.

3.3. Aufhebung der transienten Markierung eines Antikörpers

Nach der Erfassung eines bestimmten Antigens (Merkmals) durch den transient gebundenen Farbstoff am Ort der Primärlokalisation im Gewebe wird die transiente Markierung chemisch, physikalisch oder enzymatisch aufgehoben. Der ungebundene (freie) Farbstoff im Gewebe wird chemisch, physikalisch oder enzymatisch entfernt.
Zur chemischen Aufhebung der transienten Markierung des Antikörpers werden Reagenzien mit folgenden Zielen eingesetzt:

1. Aufhebung der Bindung zwischen Antikörper und Antigen.
2. Aufhebung der Bindung zwischen Antikörper und Farbstoff.
3. Zerstörung des Farbstoffs.

Hierbei muß wenigstens eines der angebenen Ziele mittels der Reagenzien erreicht werden. Es eignet sich hierfür beispielsweise eine Inkubation des Gewebes für 30 Minuten in Formamid bei 70°C. Die physikalische Aufhebung der transienten Markierung kann beispielsweise durch Einsatz von UV-Licht erreicht werden. Ziel ist hierbei die Zerstörung des lichtempfindlichen Fluorochroms (Bleaching). Das Gewebe mit dem transient fluoreszenzmarkierten Antikörper wird hierbei für 30 Minuten unter einer UV- Lichtquelle (Wellenlänge, Leistung) exponiert. Eine andere Möglichkeit ist die Exposition mit einem UV-Laser (LSM 510), der das Gewebe abrastert und dabei das Fluorochrom zerstört.
Die enzymatische Aufhebung der transienten Bindung erfolgt mit Hilfe eines substratspezifischen Enzyms. Das Substrat dieses Enzyms sind spezifische Bestandteile der Bindung zwischen Antikörper und Fluorochrom. Beispiele für substratspezifische Enzyme sind bestimmte fragmentspezifische Antikörper, deren Substrat ein Fragment des Antikörpers (z. B. Fc-Fragmente) darstellen und so gezielt die Aufhebung der Bindung zwischen Antikörper und Fluorochrom bewirken können.

3.4. Aufhebung der transienten Markierung einer Nukleinsäuresequenz

Nach der Erfassung einer bestimmten Nukleinsäuresequenz (Merkmals) durch den transient gebundenen Farbstoff am Ort der Primärlokalisation im Gewebe wird die Bindung des Farbstoffs chemisch, physikalisch oder enzymatisch aufgehoben oder der Farbstoff selbst spezifisch zerstört. Der ungebundene (freie) Farbstoff im Gewebe wird chemisch, physikalisch oder enzymatisch entfernt.
Zur chemischen Aufhebung der transienten Markierung der Nukleinsäuresequenz werden Reagenzien mit folgenden Zielen eingesetzt:

1. Aufhebung der Hybridisierung zwischen Zielsequenz und transient markierter Nukleinsäuresequenz.
2. Aufhebung der Bindung zwischen transient markierter Nukleinsäuresequenz und Farbstoff.
3. Zerstörung des Farbstoffs.

Hierbei muß wenigstens eines der angebenen Ziele mittels der Reagenzien erreicht werden. Es eigenen sich hierfür beispielsweise eine Inkubation des Gewebes für 30 Minuten in Formamid bei 70°C oder Inkubation des Gewebes für 30 Minuten in Citratpuffer (2XSSC, pH7) bei 70°.
Die physikalische Aufhebung der transienten Markierung kann beispielsweise durch Einsatz von UV-Licht erreicht werden. Ziel ist hierbei die Zerstörung des lichtempfindlichen Fluorochroms (Bleaching). Das Gewebe mit dem transient fluoreszenzmarkierten Antikörper wird hierbei für 30 Minuten unter eine UV- Lichtquelle (Wellenlänge, Leistung) exponiert. Eine andere Möglichkeit ist die Exposition mit einem UV-Laser (LSM 510), der das Gewebe abrastert und dabei das Fluorochrom zerstört.
Die enzymatische Aufhebung der transienten Bindung erfolgt mit Hilfe eines substratspezifischen Enzyms. Das Substrat dieses Enzyms ist die Bindung zwischen Antikörper und Fluorochrom.

3.5. Simultane Inkubation von mehreren transient markierten Antikörpern

Zur Detektion von mehreren Antigenen (Merkmalen) können mehrere Antikörper durch den Einsatz unterscheidbarer transient gebundener Farbstoffe dargestellt werden. Hierbei werden in einem simultanen Vorgehen mehrere Antikörper inkubiert und mittels transienter Detektion in einem Gewebe erfaßt.

3.6. Simultane Hybridisierung von mehreren transient markierten Nukleinsäuren

In Abhängigkeit der Farbkontraste, die zur differentiellen Bilderfassung von mehreren Nukleinsäuresequenzen (Merkmalen) nötig sind, können mehrere Antikörper, an die jeweils ein unterschiedlicher Farbstoff transient gebunden ist gleichzeitig (simultan) in einem Gewebe inkubiert werden.

3.7. Sequentielle Inkubation von mehreren transient markierten Antikörpern

Ein bestimmter transient an einen Antikörper gebundener Farbstoff ermöglicht die wiederholte Anwendung dieses transient gebundenen Farbstoffes in einer Abfolge von Inkubationen in ein und demselben Gewebe (sequentielles Vorgehen).

3.8. Sequentielle Inkubation von mehreren transient markierten Nukleinsäuresequenzen

Ein bestimmter transient an eine Nukleinsäuresequenz gebundener Farbstoff ermöglicht die wiederholte Anwendung dieses transient gebundenen Farbstoffes in einer Abfolge von Hybridisierungen in einem und demselben Gewebe (sequentielles Vorgehen).

Beispiele

Die Erfindung ermöglicht z. B. die Herstellung eines Kits von Diagnose- und Prognosefaktoren beim Mammakarzinom zur Quantifizierung von beispielsweise c-erbB2, Progesteron- und Östrogenrezeptoren, verschiedenen Matrixproteasen, sowie angiogenese-assozierten Markern mit transient markierten Antikörpern. Soll nun z. B. mit drei verschiedenen Fluorochromen (z. B. mit Cy2, Cy3 und Cy5) transient detektiert, so werden in einem ersten Schritt simultan c-erbB2 (z. B. transient mit Cy2 markiert), Progesteronrezeptor (z. B. transient mit Cy3 markiert) und Östrogenrezeptor (z. B. transient mit Cy5 markiert) inkubiert. Hierauf erfolgt die Erfassung des detektierten Merkmals am Ort ihrer Primärlokalisation (in situ) im Zellkern oder der äußeren Zytoplasmamembran. Nach der Erfassung wird die transiente Markierung der Antikörper ausgelöscht (chemisch, physikalisch oder enzymatisch). Danach werden der nächsten Antikörper (transient markiert) inkubiert, die gleichen Zellen mit ihren Merkmalen in situ erfaßt mit nachfolgender Auslöschung der transienten Markierung. Dieses sequentielle Vorgehen wird so lange fortgesetzt bis alle Merkmale erfaßt sind. Mit Mitteln der Bildanalyse können die erfaßten Merkmale quantifiziert werden und schließlich so analysiert werden, daß alle Merkmale den untersuchten Einzelzellen zugeordnet werden können ("Sequentielle Bilderfassung und Datenanalyse"). Das so erfaßte und quantifizierte individuelle Muster bildet dann die Grundlage einer individualisierten Therapie des Patienten. Je nach Ausmaß der Expression von c-erbB2, Östrogen- und Progesteronrezeptoren können dann im Patienten verbleibende Tumorzellen mit verschiedenen antitumoralen Substanzen in Abhängigkeit des individuellen Befundmusters behandelt werden (Herceptin, antihormonelle Therapie, Chemotherapie, Radiotherapie, Anti-Angiogenese, Proteaseninhibitoren).
Die Erfindung ermöglicht z. B. die Herstellung eines Kits mit transient markierten Antikörpern zur Diagnostik von neuroendokrinen Tumoren. Es werden hierbei beispielsweise fünfzehn Antikörper, die zur Diagnose eines Hypophysentumors nötig sind (z. B. Chromogranin A, Synaptophysin, NSE, PHE5, ACTH, alpha-HCG, beta-HCG, beta-FSH, beta-LH, beta-TSH, Calcitonin, C-Peptid, Bombesin, Gastrin, Glucagon, Insulin, Neurotensin, Parathormon, PGP9.5, PP, Prolactin, Substanz P, Serotonin, Somatostatin, VIP) transient markiert. Dabei werden drei Fluorochrome verwendet (Cy2, Cy3 und Cy5). Mit jedem dieser drei Fluorochrome werden jeweils drei der insgesamt fünfzehn zu bestimmenden Antikörper transient markiert. Die Bestimmung der koinzidenten Merkmale erfolgt dann mit den transient markierten Antikörpern durch ein kombiniertes simultanes und sequentielles Vorgehen. Es werden dabei simultan jeweils drei Antikörper, die transient mit Cy2, Cy3 und Cy5 markiert sind auf das Gewebe inkubiert. Hierauf erfolgt die Erfassung der detektierten Merkmale am Ort ihrer Primärlokalisation (in situ). Nach der Erfassung wird die transiente Markierung der Antikörper ausgelöscht (chemisch, physikalisch oder enzymatisch). Danach werden die nächsten drei Antikörper, die wiederum transient mit Cy2, Cy3 und Cy5 markiert sind inkubiert, mit nachfolgender Erfassung in situ. Dieses Vorgehen wir nun sequentiell fortgesetzt bis alle Antikörper inkubiert und erfaßt worden sind. Mit Mitteln der Bildanalyse können die erfaßten Merkmale quantifiziert werden und schließlich so analysiert werden, daß alle Merkmale den untersuchten Einzelzellen, der extrazellulären Matrix und dem Gewebe insgesamt zugeordnet werden. Das so erfaßte Muster dieser phänotypischen Merkmale führt dann zur Diagnose des neuroendokrinen Tumors. Darüber hinaus kann durch die beschriebene Darstellung der koinzidenten Merkmale ein individuelles Merkmalsmuster des jeweils untersuchten Tumors erhoben werden, das eine individualisierte Therapie des Patienten zuläßt, wie beispielsweise die Gabe von bestimmten antihormonalen Substanzen im Falle einer nicht möglichen vollständigen Resektion des Tumors.
Die Erfindung ermöglicht z. B. die Herstellung eines Kits mit transient markierten Antikörpern zur Diagnostik von Tumoren des Weichgewebes. Es werden hierbei z. B. achtzehn Antikörper, die beispielsweise zur Diagnose und Prognoseabschätzung eines Sarkoms nötig sind (Calretinin, CD31, desmin, Faktor VIII RA, GFAP, HMB45, Inhibin, Melan-A, Myoglobin, MyoD1, NF pan, CD99, Sm-Aktin, S-100, Vimentin) transient markiert. Dabei werden drei Fluorochrome verwendet (Cy2, Cy3 und Cy5). Mit jedem dieser drei Fluorochrome werden jeweils drei der insgesamt achtzehn zu bestimmenden Antikörper transient markiert. Die Bestimmung der koinzidenten Merkmale erfolgt dann mit den transient markierten Antikörpern durch ein kombiniertes simultanes und sequentielles Vorgehen. Es werden dabei simultan jeweils drei Antikörper, die transient mit Cy2, Cy3 und Cy5 markiert sind auf das Gewebe inkubiert. Hierauf erfolgt die Erfassung der detektierten Merkmale am Ort ihrer Primärlokalisation (in situ). Nach der Erfassung wird die transiente Markierung der Antikörper ausgelöscht (chemisch, physikalisch oder enzymatisch). Danach werden die nächsten drei Antikörper, die wiederum transient mit Cy2, Cy3 und Cy5 markiert sind inkubiert, mit nachfolgender Erfassung in situ. Dieses Vorgehen wir nun sequentiell fortgesetzt bis alle Antikörper inkubiert und erfaßt worden sind. Mit Mitteln der Bildanalyse können die erfaßten Merkmale quantifiziert werden und schließlich so analysiert werden, daß alle Merkmale den untersuchten Einzelzellen, der extrazellulären Matrix und dem Gewebe insgesamt zugeordnet werden. Das so erfaßte Muster dieser phänotypischen Merkmale führt dann zur Diagnose des neuroendokrinen Tumors. Darüber hinaus kann durch die beschriebene Darstellung der koinzidenten Merkmale ein individuelles Merkmalsmuster des jeweils untersuchten Tumors erhoben werden, der eine individualisierte Therapie des Patienten zuläßt, wie beispielsweise eine Radiotherapie oder kombinierte Radio- und Chemotherapie.

Weitere Aspekte

Nachfolgend werden noch drei weitere wichtige Aspekte aufgeführt, welche in Zusammenhang mit besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung stehen:

1. Manipulation von Geweben nach transienter in situ Darstellung von koinzidenten, geno- und phänotypischen Merkmalen in Zellen und ihrer extrazellulären Matrix

Mit der beschriebenen Methode können in situ beispielsweise Zellen identifiziert werden, die durch eine bestimmte Kombination an koinzidenten Merkmalen charakterisiert sind. Die charakterisierten Zellen könnten dann mit der Methode der Mikrodissektion oder Methoden der Mikromanipulation entfernt und mit anderen nicht-in situ Verfahren analysiert oder anderweitig verarbeitet werden. Zur Entnahme der markierten Einzelzellen, Zellgruppen oder von Bestandteilen der extrazellulären Matrix können die in der molekularen Pathologie gebräuchlichen Dissektionsmethoden mit den zuvor beschriebenen Verfahren kombiniert werden. Als besonders bevorzugte Entnahmemethoden sind hier zu nennen die Laser-Mikrodissektion (Einzelzellen oder subzelluläre Bestandteile), Entnahme mit einem Mikromanipulator (Einzelzellen oder subzelluläre Bestandteile) oder die manuelle Dissektion (größere Zellgruppen).

2. "Sequentielle Bilderfassung und Auswertung"

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren die Bilderfassung der (transient) in situ dargestellten unbegrenzten Anzahl von Merkmalen, welche auch sequentiell erfolgt. Das bedeutet, daß bei jedem Erfassungsschritt der detektierten Merkmale jeweils die gleichen Zellen unter annähernd gleichen Aufnahmebedingung erfaßt werden müssen. Nur so können die Daten anschließend in die gleichen Zellen projiziert werden. Dies geschieht zunächst über die räumliche Festlegung der Gewebeareale, die erfaßt werden sollen. Hierzu werden den Arealen Koordinaten des Mikroskopisches zugewiesen, die so bei jedem Erfassungsschritt wieder aufgefunden werden können, so daß jeweils die gleichen Zellen mit ihrer extrazellulären Matrix erfaßt werden. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist hierbei die dreidimensionale Erfassung des Gewebes. Die biochemischen, geno- und phänotypischen Merkmale können in ganz unterschiedlichen zellulären Kompartimenten lokalisiert sein, z. B. dem Zellkern oder dem Zytoplasma, an Zellorganellen, an verschiedenen Membranen usw. Die räumliche Auflösung ist ferner wichtig zur Quantifizierung bestimmter Merkmale, z. B. von FISH-Signalen beim Nachweis von Translokationen. Ein Gerät, die sich für eine solche Erfassung eignet ist z. B. ein Laser Scanning Mikroskop.

3. Internes Kontrollsystem

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfaßt dieses ein internes Kontrollsystem welches eine exakte Interpretation der erhaltenen Ergebnisse erleichtert. Dieses Kontrollsystem wird nachstehend beschrieben:
Bei dem Kontrollsysten handelt es sich um eine interne Kontrolle, welche gleichzeitig mit dem Testgewebe auf dem selben Träger, mit den selben Reagenzien, nach den selben Protokollen zur Versuchsdurchführung und mit der selben Erfassung mitgeführt wird.
Hierbei handelt es sich um ein quantitativ und qualitativ genau hinsichtlich bestimmter geno- und phänotypischer Merkmaledefiniertes Gemisch aus Einzelzellen von quantitativ und qualitativ genau definierten Zellinien. Dieses Gemisch wird gleichzeitig mit dem Testgewebe untersucht. Die an dem quantitativ und qualitativ genau definierten Einzelzellgemisch erhobenen Messwerte dienen als Referenzwerte für die am Testgewebe erhobenen Messwerte.
Nachfolgend ist ein veranschaulichendes Beispiel eines Kontrollsystems für Östrogenrezeptoren, Progesteronrezeptoren, Her-2/neu und Cytokeratin beschrieben.
Für das quatitativ und qualitativ genau definierte Zelliniengemisch werden für jedes zu untersuchende Merkmal jeweils Zellinien ausgewählt. Die diese Merkmal in unterschiedlicher Ausprägung aufweisen. Hierbei ist unter unterschiedlicher Ausprägung zu verstehen, dass das Ausmass der Expression des Merkmals in Grade eingeteilt wird: stark (+++), mäßig (++), schwach (+) und fehlend (-). Die somit qualitativ (Merkmal und Ausmass der Expression)definierten Zellinien werden dann in exakt definierten Mengen von Einzelzellen miteinander vermischt, dies erfolgt z. B. durch Durchflußzytometrie.
Das nun qualitativ (s. o.) und quantitativ (jeweilige Anzahl an Einzelzellen) definierte Zellgemisch kann z. B. die folgende Zusammensetzung aufweisen:

- Östrogenrezeptoren (25% der Zellen +++, 25% der Zellen ++, 25% der Zellen + und 25% der Zellen -),
- Progesteronrezeptoren (25% der Zellen +++, 25% der Zellen ++, 25% der Zellen + und 25% der Zellen -),
- Her-2/neu (25% der Zellen +++, 25% der Zellen ++, 25% der Zellen + und 25% der Zellen -) und
- Cytokeratin (25% der Zellen +++, 25% der Zellen ++, 25% der Zellen + und 25% der Zellen -).

Dieses Zellgemisch wird nun in eine Matrix eingebracht (z. B. Fibrinmatrix oder Agarmatrix) welche dann wie das Testgewebe fixiert und letztendlich in Paraffinblöcken eingebettet werden kann. Schnitte des Testgewebes werden dann zusammen mit Schnitten der Zellinienkontrolle auf einen Träger aufgebracht und das erfindungsgemäße Verfahren wird simultan am Testgewebe und an den Schnitten der Zellinienkontrolle durchgeführt. Nach erfolgter Darstellung der Merkmale werden Messungen am Testgewebe und an der Kontrolle vorgenommen, die Reaktion kann anhand der bekannten Parameter der Kontrolle beurteilt werden, welche zugleich die Referenzwerte für das Testgewebe darstellt.

Claims

1. Verfahren zur in situ Bestimmung von mindestens zwei koinzident auftretenden biochemischen und/oder genotypischen und/oder phänotypischen Merkmalen in einem Gewebe und/oder der extrazellulären Matrix mit mindestens zwei Nachweisagentien, gegebenenfalls zusätzlich markiert mit einer signalgebenden oder signal erzeugenden Einheit welche gegebenenfalls über einen Linker gebunden wird, wobei mindestens eines der Nachweisagentien oder eine der signalgebenden oder signalerzeugenden Einheiten gegebenenfalls mit Linker wieder entfernt wird, zusätzlich gegebenenfalls Manipulation der Einzelzelle und gegebenenfalls umfassend sequentielle Bilderfassung und Datenanalyse.

2. Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend ein internes Kontrollsystem zum Erhalten von Referenzwerten für das jeweilige Testgewebe.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Nachweisagens und/oder die signalgebende oder signalerzeugende Einheit gegebnenfalls mit dem Linker chemisch, physikalisch oder enzymatisch entfernt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei mindestens ein Nachweisagens ein histochemisches Färbemittel umfaßt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei mindestens ein Nachweisagens eine komplementäre Nukleinsäuresequenz umfaßt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei mindestens ein Nachweisagens ein Lektin umfaßt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei mindestens ein Nachweisagens einen Antikörper oder Fragmente eines Antikörpers umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Nachweisagens einen ersten gegen das Merkmal gerichteten Antikörper und einen zweiten mit einer signalgebenden oder signalerzeugenden Einheit markierten gegen diesen ersten Antikörper gerichteten Antikörper umfaßt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die signalgebende Einheit einer der (Fluoreszenz)farbstoffe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus FITC, TRITC, Allophycocyanin, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5., Cy7, Texas Red, Fluorescein, Phycoerythrin, Phycocyanin, Rhodamin, Dansyl, Umbelliferon, Spectrum Green, Spectrum Orange uns deren Derivate, DTAF, Diaminobenzidin (DAB) und Fast Red® ist. .

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die signalerzeugende Einheit ein Einzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Peroxidase und alkalischer Phosphatase ist.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei mindestens ein Nachweisagens transient mit der signalgebenden oder der signalerzeugenden Einheit markiert ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die zu bestimmenden Merkmale ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Vorhandensein von viralen, bakteriellen mycotischen oder parasitären Erregern, Antigenen, Epitopen, Proteinen, Amyloidtypen, Kollagenen, Fibrinen, Chromosomen, Genen, Onkogenen, Tumorsupressorgenen und Nucleinsäuresequenzen.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die zu verwendenden Antiköper oder Antikörperfragmente gegen mindestens eines der folgenden Merkmale: Progesteronrezeptoren, Östrogenrezeptoren, Matrixproteasen, kappa-Leichtketten, lambda-Leichtketten, c-erbB2, BerEP4, CK panAE1/AE3, CK pa-LU5, CK5/8, CK6, CK7, CK13, CK14 CK18, CK19, CK20, CA12.5, CA15.3, cA19.9, CRP, EMA, HEA125, Hep Par 1, MUC2, TTF, Villin, Calretinin, CD31, Desmin, Faktor VIII RA, GFAP, HMB45, Inhibin, Melan-A, Myoglobin, Myo D1, NF pan, CD 99/MIC2, Sm-Aktin, S- 100, Vimentin, Thyreoglobulin, PSA, PSP, PLAP, Pankreas Lipase, MIB-1, P53, AAT, AFP, CEA, HPL, C3, C5, Amyloid A, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD15, CD20, CD23, CD23, CD30, CD35, CD38, CD43, CD45/LCA, CD45ROOPD4, CD56, CD57, CD61, CD68a, CD79a, CD117, CD138, ALK1, Bcl-6, Cyclin D1, DBA.44, Glycophorin C, Lysozym, MAC387, MPO, NP57, TdT, Tia-1, VS38, IgA, IgD, IgG, IgM, p57, Chromogranin A, Synaptophysin, NSE, PHE5, ACTH, alpha-HCG, beta- HCG, beta-LH, beta-TSH, Calcitonin, C-peptid, Bombesin, Gastrin, Glucagon, Insulin, Neurotensin, Parathormon, PGP9.5, PP, Prolactin, Substanz P, Serotonin, Somastatin, VIP, Mib-1, Adrenocorticotropes Hormon (ACTH), Aktin, Albumin, Alkalische Phosphatase, ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase), alpha-1-Antichymotrypsin, alpha-1-Antitrypsin, alpha- 1-Fetoprotein, alpha-1-Mikroglobulin, alpha-1 saures Glykoprotein, alpha-2 Makroglobulin, alpha Laktalbumin, Amyloid A-Komponente, ALC (anaplastisches großzelliges Lymphom, Androgenrezeptor, Antithrombin III, APO-1/FAS-Antigen, Apolipoprotein E, Aspergillus, AUA1-Antigen, B29- Protein, B-Lymphozytenantigen, B-Zellantigene, Bak, Bax, Bcl-1/PRAD-1- Genprodukt, Bcl-2-Onkroprotein, Bcl-6, Bcl-x, Ber-EP4, Beta-2- Mikroglobulin, Beta-Amyloid, Biotin, Blutgruppenantigen A, Blutgruppenantigen H, BrdU, c-erbB-2 Onkroprotein, c-kit-Genprodukt, C1- Esteraseinhibitor, C1q-Komplement, C3-Komplement, C3b-Rezeptor, CR2, C4c-Komplement, C5-Komlement, CA15-3, CA19-9, CA125, Calcitonin, Caldesmon, Calponin, Caspase3, Cathepsin D, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD37, CD38, CD40, CD41, CD42, CD43, CD44, CD45, CD49, CD50, CD54, CD56, CD61, CD62, CD64, CD66, CD68, CD69, CD70, CD71, CD74, CD75, CD79, CD85, CD86, CD91, CD94, CC95, CD99 (MIC-Genprodukte), CD103, CD105, CD106, CD117, CD153, CD163, CEA, Chlamydia pneumoniae, Cholinesterase EC, Choriongonadotropin, Chromogranin A, CMV, Coeruloplasmin, Collagen IV, CPP32, CR1, CR2, CR3, CR4, Cyclin B1, Cyclin D1, Cyclin D3, Cystatin C, Cytokeratin, Cytokeratin 7, Cytokeratin 8, Cytokeratin 10, Cytokeratin 13, Cytokeratin 17, Cytokeratin 18, Cytokeratin 19, Cytokeratin 20, Cytokeratin, Cytomegalievirus, Desmin, E-Selektion, EBV, EGFR, EGP-2, EMA, Embryonal-Karzinom, Endoglin, Enterovirus, Ep-CAM, Epithel-assoziertes Antigen (MOC-31), Epstein-Barr Virus, Estrogen-Rezeptor, Escherichia coli, Faktor VIII-assoziertes Antigen, Fas- Antigen, Fascin, Fc Gamma Rezeptor, FDC, Ferritin, Fibronektin, Follikelstimulierendes Hormon (FSH), Gastrin, Gastrin-releasing-Peptid (GRP), Glattmuskelaktin, Gliafaserprotein, Glucagon, GLUT1, Glutathion-S- Transferase, Gylcophorin A, Granulozyten-assoziertes Antigen (Lewis-X), Helicobacter pylori, Hepatitis B-Core-Antigen, Hepatitis B- Oberflächenantigen, Her-2/neu, Herpes-simplex-Virus Typ1, Herpes- simplex-Virus Typ2, Histiozytäres Antigen (MAC387), Hitzeschockprotein 70, HLA-ABC-Antigen, HLA-DR-Antigen, Östrogenrezeptor, Progesteronrezeptor, Humanes Papillomvirus, Humanes Immundefizienz- Virus, ICAM-1, IgA, IgG, IgD, IgE, IgM, Insulin, Intregrin, Inter-alpha- Trysininhibitor, Kappa leichte Ketten, Ki-1-antigen, Ki-67-Antigen, Kollagen IV, L-Selektin, Laktoferrin, Lambda leichte Ketten, Laminin, LECAM-1, Luminales Epithelantigen, Luteinisierendes Hormon, Lysozym, MAC-1, MART-1, Mastzellen-Tryptase, Mcl-1, MDM2-Protein, Melan-A, MRP8, MRP14, Mycobacterium bovis, Myeloisches Antigen, Myeloperoxidase, MyoD1, Myogenin, Myoglobulin, Myosin, N-CAM, Neurofilamentprotein, Neuronenspezifische Enolase, Neutrophilen-Elastase, NGFR, NKH1, Orosomucoid, p21, p27, p30, p53-Protein, p75-Gykoprotein, P- Glykoprotein, P-Komponente, P-Selektin, Pankreaspolypetid, Papillomvirus, Parathormon, Parvovirus B19, PCNA, PECAM-1, PGP9.5, PLAP, Plazentalaktogen (hPL), PML-Protein, Pneumozystis carinii, Präalbumin, Prion-Protein, Prolaktin, saure Prostataphosphatase, Prostatspezifisches Antigen, Protein 150,95, Protein C, Protein S, Prothrombin, pS2, Retinoblastomgenprodukt, Rhizimucor, Rotavirus, S100- Proteinfamilie, Sarkomer-Aktin, Schwangerschaftsassoziertes Plasmaprotein A (PAPP-A), Serotonin, Somatostatin, Stammzellfaktor- Rezeptor, Synaptophysin, TAG-72, Teranektin, TGF-beta, Thomsen- Friedenreich-Antigen, Thrombomodulin, Thyreoglobulin, Thyreotropin, Topoisomerase II, Toxoplasma gondii, TTF-1, Ubiquitin, UlexEuropaeus- Lectin, VCAM-1, Vimentin, Von Willbreand-Faktor, Wachstumshormon (hGH) oder Wilms Tumor Protein 1 gerichtet sind.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die zu verwendenden komplementären Nukleinsäuresequenzen gegen mindestens eines der follgenden Merkmale: HER-2/neu, Cyclin D1, c-myc APC, RB, p53 oder c- met HPV Typ6, HPV Typ11, HPV Typ16, HPV Typ 18, HPV Typ31, HPV Typ33, Histon H3 mRNA, Beta Aktin mRNA, C-MYC (8q24.12-q24.13), 20q13, EGFR (7p21), p16 (9p21), BCR Gen (22q), n-myc (2p24.1), RB1 (13q14), Androgenrezeptor (Xq12), p53 (17p13.2), Zentromersonden für die Zentromere 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, X oder Y gerichtet sind.

15. Verwendung des Verfahrens nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Bestimmung von biochemischen und/oder genotypischen und/oder phänotypischen Merkmalskombinationen eines Gewebes oder einer extrazellulären Matrix.

16. Verfahren nach Anspruch 15, umfassend Nachweisagentien gegen mindestens zwei der folgenden Merkmale: Calretinin, CD31, Desmin, Faktor VII RA, GFAP, HMB45, Inhibin, Melan-A, Myoglobin, MYOD1, NF pan, CD99, Sm-Aktin, S-100 EMA, Cytokeratin, Cytokeratin 7, Cytokeratin 8, Cytokeratin 10, Cytokeratin 13, Cytokeratin 17, Cytokeratin 18, Cytokeratin 19, Cytokeratin 20, Mib-1 und Vimentin zur Diagnostik von Weichteiltumoren/Sarkomen, weiterhin gegebenenfalls zusätzlich umfassend ein internes Kontrollsystem, umfassend ein quantitativ und qualitativ hinsichtlich seiner Merkmale genau definiertes Zelliniengemisch zur Ermittlung von Referenzwerten für das Testgewebe oder die zu testende extrazelluläre Matrix.

17. Verfahren nach Anspruch 15, umfassend Nachweisagentien gegen mindestens zwei der folgenden Merkmale: Chromogranin A, Synaptophysin, NSE, PHE5, ACTH, alpha-HCG, beta-HCG, beta-FSH, beta-LH, beta-TSH, Calcitonin, C-Peptid, Bombesin, Gastrin, Glucagon, Isulin, Neurotensin, Parathormon, PGP9.5, PP, Prolactin, Substanz P, Serotonin, Somatostatin, Cytokeratin 7, Cytokeratin 8, Cytokeratin 10, Cytokeratin 13, Cytokeratin 17, Cytokeratin 18, Cytokeratin 19, Cytokeratin 20, Mib-1, S-100 und VIP zur Diagnostik von neuroendokrinen Tumoren, weiterhin gegebenenfalls zusätzlich umfassend ein internes Kontrollsystem, umfassend ein quantitativ und qualitativ hinsichtlich seiner Merkmale genau definiertes Zelliniengemisch zur Ermittlung von Referenzwerten für das Testgewebe oder die zu testende extrazelluläre Matrix.

18. Verfahren nach Anspruch 15, umfassend Nachweisagentien gegen mindestens zwei der folgenden Merkmale: c-erbB2, progesteronrezeptoren, Östrogenrezeptoren, Matrixproteasen, HER-2/neu, Cylin D1, c-myc, c-met Mib-1, Cytokeratin 7, Cytokeratin 8, Cytokeratin 10, Cytokeratin 13, Cytokeratin 17, Cytokeratin 18, Cytokeratin 19, Cytokeratin 20 und angiogense-assozierte Merkmale zur Diagnostik von Mammakarzinomen, weiterhin gegebenenfalls zusätzlich umfassend ein internes Kontrollsystem, umfassend ein quantitativ und qualitativ hinsichtlich seiner Merkmale genau definiertes Zelliniengemisch zur Ermittlung von Referenzwerten für das Testgewebe oder die zu testende extrazelluläre Matrix.

19. Verfahren nach Anspruch 15, umfassend Nachweisagentien gegen mindestens zwei der folgenden Merkmale Ber EP4, CK panAE1/AE3, CK pa-LU5, CK5/8, CK6, CK7, CK13, CK14, CK18, CK19, CK20, CA12.5, CA15.3, CA19.9, CRP, EMA, HEA125, Hep Par 1, MUC2, TTF, Villin, Calretinin, CD31, Desmin, Faktor VIII RA, GFAP, HMB45, Inhibin, Melan A, Myoglobin, Myo D1, NF pan, CD99/MIC2, SM-Aktin, S-100, Vimentin, Immunglobuline, Cytokeratin 7, Cytokeratin 8, Cytokeratin 10, Cytokeratin 13, Cytokeratin 17, Cytokeratin 18, Cytokeratin 19, Cytokeratin 20, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD37, CD38, CD40, CD41, CD42, CD43, CD44, CD45, CD49, CD50, CD54, CD56, CD61, CD62, CD64, CD66, CD68, CD69, CD70, CD71, CD74, CD75, CD79, CD85, CD86, CD91, CD94, CC95, CD99 (MIC- Genprodukte), CD103, CD105, CD106, CD117, CD153, CD163, kappa Leichtketten, lambda Leichtketten, zur Abgrenzung von epithelialen von mesenchymalen Tumoren, weiterhin gegebenenfalls zusätzlich umfassend ein internes Kontrollsystem, umfassend ein quantitativ und qualitativ hinsichtlich seiner Merkmale genau definiertes Zelliniengemisch zur Ermittlung von Referenzwerten für das Testgewebe oder die zu testende extrazelluläre Matrix..

20. Verfahren nach Anspruch 15, umfassend Nachweisagentien gegen mindestens zwei der nachfolgenden Merkmale CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD11, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD37, CD38, CD40, CD41, CD42, CD43, CD44, CD45, CD45/LCA, CD45ROOPD4, CD49, CD50, CD54, CD56, CD57, CD61, CD62, CD64, CD66, CD68, CD69, CD70, CD71, CD74, CD75, CD79, CD79a, CD85, CD86, CD91, CD94, CC95, CD99 (MIC-Genprodukte), CD103, CD105, CD106, CD117, CD138, CD153, CD163, EMA, Cytokeratin 7, Cytokeratin 8, Cytokeratin 10, Cytokeratin 13, Cytokeratin 17, Cytokeratin 18, Cytokeratin 19, Cytokeratin 20, ALK1, Bcl-2, Bcl-6, Cyclin D1, DBA.44, Glycophorin C, Lysozym, MAC387, MPO, NP57, TdT, Tia-1, VS38, IgA, IgG, IgM, kappa, lambda und p27 zur Klassifikation von Lymphomen, weiterhin gegebenenfalls zusätzlich umfassend ein internes Kontrollsystem, umfassend ein quantitativ und qualitativ hinsichtlich seiner Merkmale genau definiertes Zelliniengemisch zur Ermittlung von Referenzwerten für das Testgewebe oder die zu testende extrazelluläre Matrix.