DE102010032081A1

DE102010032081A1 - Nachweis lebender, zirkulierender oder disseminierter Zellen bzw. Zellbestandteile in Blut oder Knochenmark nach Filtration von Blut

Info

Publication number: DE102010032081A1
Application number: DE102010032081A
Authority: DE
Inventors: Dr. Hiltawsky Karsten; Dr. Stütz Evamaria
Original assignee: Siemens AG; Siemens Corp
Current assignee: Siemens AG; Siemens Corp
Priority date: 2010-07-23
Filing date: 2010-07-23
Publication date: 2012-01-26
Also published as: US20120021435A1

Abstract

Verfahren zum Nachweis von zirkulierenden Zellen in einer Probe einer Körperflüssigkeit, aufweisend folgende Schritte: a) Filtrieren der Probe einer Körperflüssigkeit durch eine poröse Membran b) Überführen der Membran mit den als Filterrückstand darauf befindlichen Zellen in ein Zellkulturgefäß, wobei eine Oberfläche des Zellkulturgefäßes mit einem ersten Antikörper beschichtet ist, der gegen einen ersten zellspezifischen Marker gerichtet ist c) Inkubieren der Membran in dem Zellkulturgefäß, mit einem Zellkulturmedium für einen vorbestimmten Zeitraum, wobei von den etwaig vorhandenen Zellen abgegebene zellspezifische Marker von dem ersten Antikörper gebunden werden; d) Entfernen der Membran mit den als Filterrückstand darauf befindlichen Zellen aus dem Zellkulturgefäß; e) Detektieren des gebundenen zellspezifischen Markers auf der mit dem ersten Antikörper beschichteten Oberfläche.

Description

Die Erfindung ist auf dem Gebiet der in vitro Diagnostik und betrifft ein Verfahren zum Nachweis lebender, zirkulierender oder disseminierter Zellen aus Körperflüssigkeiten (z. B. Blut, Urin) bzw. mit Flüssigkeit versetzter Gewebeproben (z. B. Knochenmark). Das erfindungsgemäße Verfahren dient insbesondere zur Gewinnung und zur Analyse von zirkulierenden Tumorzellen und findet somit bevorzugt Anwendung in der Tumordiagnostik.
Die Erfindung ermöglicht den Nachweis von Zellen oder Zellbestandteilen aus peripherem Blut oder Knochenmark durch einen funktionellen Test, nachdem das Blut oder Knochenmark durch ein spezielles Filtrationsverfahren gefiltert wurde. Bei den Zellen handelt es sich insbesondere um zirkulierende Tumorzellen (engl. circulating tumor cells, CTC), mesenchymale Stammzellen aus peripherem Blut oder Bakterien aus Blut oder anderen Körperflüssigkeiten sowie disseminierte Tumorzellen aus Knochenmark (engl. disseminated tumor cells, DTC).
Grundsätzlich kann das Verfahren aber auch auf den Nachweis von Bakterien in peripherem Blut (Sepsis-Nachweis) oder anderen Körperflüssigkeiten erweitert werden, insbesondere wenn eine Inkubationsphase zur Verbesserung der Nachweisgrenze erforderlich sein sollte.
Das Vorkommen von CTCs in peripherem Blut ist ein Hinweis auf eine mögliche Streuung von Zellen eines soliden Tumors zu einem sehr frühen Stadium, in dem mit üblichen bildgebenden Untersuchungsverfahren noch keine Metastasierung nachgewiesen werden kann (Pantel et al., 2009). Daher stellen sowohl der Nachweis als auch die Charakterisierung von CTCs in peripherem Blut vielversprechende Möglichkeiten dar, systemische Tumorzellausbreitung sehr frühzeitig zu erkennen und CTCs als prognostischen Marker zu nutzen. Dadurch könnten Prognosen und kontinuierliche Beobachtung von systemischen Therapien ausgesprochen bzw. durchgeführt werden. Weiterhin könnte die Charakterisierung und Bewertung von CTCs als diagnostisches Instrument genutzt werden, um eine geeignete Behandlung für solide Tumoren auszuwählen.
Ein systematisches Auffinden dieser Zellen in frühen Tumorstadien ist mit bisher bekannten Verfahren möglich, allerdings nur mit begrenzter Genauigkeit. Eine große Herausforderung bei der Untersuchung von Blutproben besteht in der geringen Zahl von zirkulierenden Tumorzellen. Ein Untersuchungsverfahren muss daher so empfindlich sein, dass eine Tumorzelle pro Milliliter Blut detektiert wird. Gleichzeitig muss das Verfahren sehr spezifisch sein, weil in einem Milliliter Blut unter anderem circa zehn Millionen Leukozyten vorhanden sind, welche teilweise ähnliche Eigenschaften hinsichtlich beispielsweise Größe, Zellkern etc., und zum Teil ähnliche Oberflächeneigenschaften besitzen wie zirkulierende Tumorzellen.
Da CTCs in peripherem Blut in äußerst geringen Konzentrationen vorkommen (ein paar wenige pro ml Blut, d. h. ein paar wenige epitheliale Zellen auf 1 × 10 Leukozyten und ~ 5 × 10⁹ Erythrozyten pro ml Blut; Paterlini-Brechot und Befall, 2007), ist es notwendig, die Zielzellen aufzukonzentrieren und möglichst viele störende Zellen (z. B. Erythrozyten) zu entfernen. Epitheliale Zellen im Blut verhalten sich physikalisch ähnlich wie Leukozyten, d. h. bei einer Fraktionierung des Gesamtblutes findet man CTCs in der Fraktion der Leukozyten. Zur Fraktionierung von Gesamtblut bzw. bei der Anreicherung der epithelialen Zellen oder Depletion überflüssiger Zellen werden verschiedene Methoden verwendet, wovon einige kurz genannt werden sollen (Pantel et al., 2009; Paterlini-Brechot und Benali, 2007):

– Dichtegradientenzentrifugation mit Ficoll-Hypaque, wobei mononukleäre Zellen aus der sich bildenden Interphase isoliert werden, mit oder ohne vorhergehender Negativselektion hämatopoetischer Zellen durch den Einsatz von Antikörpern gegen Leukozyten und Erythrozyten (RosetteSep^®, StemCel1 Technologies).
– Immunomagnetische Separation: entweder durch Positivselektion für epitheliale Zellen mit epithelspezifischen Antikörpern oder durch Negativselektion zur Leukozytendepletion mit leukozytenspezifischen Antikörpern
– Größenbasierende CTC-Anreicherung durch Membranfiltration, wobei die Porengröße des Membranfilters so gewählt wird, dass alle Zellen, die kleiner als Leukozyten sind, durchgespült werden und alle Zellen die gleich groß oder größer sind als Leukozyten, auf der Membran aufgefangen werden.

Viele der genannten Methoden sind bereits als Kits oder als Produkte auf dem freien Markt käuflich zu erwerben und werden alleine oder in Kombination verwendet. Alle genannten Methoden haben Vor- und Nachteile, auf die hier kurz eingegangen werden soll: Die immunomagnetische Separation zur Isolierung und Anreicherung von CTCs ist abhängig von den genannten verwendeten Antikörpern, was unter Umständen zu einem verzerrten Ergebnis führen kann. Vor allem bei einer Positivselektion über epithelspezifische Antikörper kann es zu falsch-negativen Ergebnissen kommen, da es vorkommen kann, dass Tumorzellen die üblichen epithelialen Markerantigene (z. B. EpCAM, Cytokeratine) nicht mehr exprimieren und daher der Anreicherung durch Positivselektion entgehen. Andererseits kann es zu falsch-positiven Ergebnissen kommen, da auch mögliche epitheliale, benigne Nicht-Tumorzellen, die ebenfalls unter besonderen Umständen im Blut vorkommen können, nachgewiesen werden. Detektionsmethoden der isolierten CTCs dienen neben dem Zählen vorwiegend zu deren weiteren Charakterisierung (Beschreibung). Sie umfassen sowohl immunocytologische Verfahren, indem epithelspezifische Proteine (z. B. Cytokeratine) oder tumorspezifische Proteine (z. B. Her-2 bei Brustkarzinomzellen) nachgewiesen werden, als auch Methoden auf molekularer Ebene wie der Nachweis spezifischer DNA- oder RNA-Spezies (Pantel et al., 2009; Fehm et al., 2008; Paterlini-Brechot und Benali, 2007). Ebenso kann die Anzahl von CTCs auf diese Weise ermittelt werden.
Bei der Membranfiltration entfällt das Problem der markerspezifischen Anreicherung, da quantitativ alle Zellen mit ähnlicher Größe aufgefangen werden, sofern nicht Membranporen durch Zellaggregate verstopft werden und die Filtration beeinträchtigen. Die Nachweismethoden umfassen wie die immunomagnetische Separation beschreibende (charakterisierende) immunocytologische und molekularbiologische Verfahren. Eine Rückspülung der Zellen bei Membranfiltration in ein anderes Medium ist nur sehr schwer möglich. Kahn und Kollegen beschreiben eine Wiederfindungsrate von epithelialen Zellen nach Rückspülung aus dem Membranfilter von 53–63% (Kahn et al., 2004). Allerdings können auch hier falsch-positive Ergebnisse auftreten, wenn der Nachweis nur auf die epitheliale Herkunft der Zellen beschränkt ist. Epitheliale, benigne Nicht-Tumorzellen, die ebenfalls unter besonderen Umständen im Blut vorkommen können, werden ebenfalls nachgewiesen.
Die einzige Methode, CTCs aus Blut oder Knochenmark zu isolieren, bei der die Zielzellen anschließend auf Funktionalität geprüft werden können, d. h. um zu prüfen, ob die isolierten epithelialen Zellen tatsächlich überlebensfähige, potenziell metastasierende Tumorzellen sind, ist derzeit die Isolation und Anreicherung mittels Dichtegradientenzentrifugation. Nach erfolgter Zentrifugation werden die Zielzellen, gemeinsam mit den verbleibenden Leukozyten, aus der Interphase isoliert. Eine höhere Wiederfindungsrate der Zielzellen erhält man, indem vor der Zentrifugation eine Negativselektion der hämatopoetischen Zellen mit Antikörpern gegen Leukozyten und Erythrozyten erfolgt (RosetteSep^®, StemCells Technologies). Der Nachweis der epithelialen Zellen erfolgt entweder durch die oben bereits erwähnten beschreibenden Methoden, oder ein funktioneller Test wird durchgeführt, bei dem extrazellulär spezifische Proteine nachgewiesen werden, die von lebenden, funktionsfähigen Tumorzellen sekretiert werden. Zu diesem Zweck wird die Methode EPISPOT (epithelial immunospot) angewendet. Die isolierten Zellen werden in membranbeschichtete Multititerplatten ausgesät und unter Zellkulturbedingungen kultiviert. Die sekretierten Proteine werden anschließend mit Elisa oder einer Immunfluoreszenz anchgewiesen. Allerdings stellt die Anwendung der vorangehenden Negativselektion einen erheblichen Kostenfaktor pro Nachweis dar. Außerdem lässt sich die Dichtegradientenzentrifugation mit anschließender Entnahme der Interphase nur mit erhöhtem Aufwand automatisieren.
Demgegenüber ermöglicht die vorliegende Erfindung ein zuverlässiges, kostengünstiges Verfahren zum Nachweis von (lebenden) Zellen in einer Probe, insbesondere von Tumorzellen in einer Blutprobe.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Zellen in einer Probe, aufweisend folgende Schritte:

a) Filtrieren der Probe einer Körperflüssigkeit durch eine poröse Membran mit einer Porengröße von 0,1 bis 200 μm,
b) Überführen der Membran mit den als Filterrückstand darauf befindlichen Zellen in ein Zellkulturgefäß, wobei eine Oberfläche des Zellkulturgefäßes mit einem ersten Antikörper beschichtet ist, der gegen einen ersten zellspezifischen Marker gerichtet ist, und wobei vorzugsweise die Seite der Membran mit den als Filterrückstand darauf befindlichen Zellen der beschichteten Oberfläche zugewandt ist,
c) Inkubieren der Membran in dem Zellkulturgefäß, mit einem Zellkulturmedium für einen vorbestimmten Zeitraum, wobei von den etwaig vorhandenen Zellen abgegebene zellspezifische Marker von dem ersten Antikörper gebunden werden,
d) Entfernen der Membran mit den als Filterrückstand darauf befindlichen Zellen aus dem Zellkulturgefäß,
e) Detektieren des gebundenen zellspezifischen Markers auf der mit dem ersten Antikörper beschichteten Oberfläche.

Die Membran wird erfindungsgemäß in das Zellkulturgefäß überführt und z. B. auf die mit einem ersten Antikörper beschichtete Bodenfläche aufgelegt. Bevorzugt ist die Seite der Membran mit den als Filterrückstand darauf befindlichen Zellen der beschichteten Oberfläche zugewandt, wobei auch denkbar ist, dass die Membran mit den als Filterrückstand darauf befindlichen Zellen der beschichteten Oberfläche abgewandt in dem Zellkulturgefäß angeordnet ist, so dass von den etwaig vorhandenen Zellen abgegebene zellspezifische Marker durch die Membran hindurch diffundieren und dann auf der der beschichteten Oberfläche gebunden werden.
Als Probe kommt jede flüssige Probe in Frage, welche Zellen enthaltenen kann, insbesondere Körperflüssigkeiten, z. B. Blut, Blutfraktionen, Urin, Speichel, Liquor, Lymphe, Tränenflüssigkeit, und ferner auch Spülungsflüssigkeiten von Gewebe oder Körperhöhlen, z. B. Bronchialspülungen. Auch Gewebeproben, Biopsien und Schmierproben können in einer geeigneten Flüssigkeit (z. B. Puffer, Zellkulturmedium) aufgenommen und suspendiert werden und mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung untersucht werden (z. B. Knochenmark). Ferner kommen auch Proben aus Zellkulturen in Frage, bei welchen im Probenvolumen ein bestimmter Zelltyp nachgewiesen werden soll. Das Verfahren ist prinzipiell sowohl zum Nachweis prokaryoter als auch eukaryoter Zellen geeignet.
Zellspezifische Marker sind zell- oder gewebe-spezifische Substanzen, welche durch Antikörper nachgewiesen werden können, insbesondere Peptide, Proteine, Glykoproteine oder Fragmente davon, deren Nachweis in der Probe auf das Vorhandensein eines bestimmten Zelltyps hinweist, z. B. auf das Vorhandensein von Tumorzellen. So sind beispielsweise epitheliale Marker (z. B. EpCAM) in einer Blutprobe beim gesunden Menschen nicht zu erwarten und ihr Vorhandensein deutet auf CTC hin.
Gegenüber dem bekannten EPISPOT-Verfahren (Alix-Panabières et al.), bei welchem die Zellen durch eine Gradientenzentrifugation isoliert werden, bietet das erfindungsgemäße Verfahren zahlreiche Vorteile:

– die Isolierung der Zellen durch Membranfiltration ist schneller und zuverlässiger als die Gradientenzentrifugation;
– die Größe und/oder Form der Membran kann so gewählt werden, dass diese in Größe und/oder Form im wesentlichen der beschichteten Oberfläche entspricht;
– die Zellen haften nach der Filtration , welche z. B. durch Absaugen mit Unterdruck oder in einem Zentrifugationsröhrchen (Z. B. Falcon^TM der Firma Becton Dickinson) durchgeführt werden kann, auf der Membran und stehen für weitere Analysen zur Verfügung;
– durch direktes Platzieren der Membran auf der Antikörper-beschichteten Oberfläche erhält man nach Detektion des ersten (sekretierten) zellspezifischen Markers ein Verteilungsmuster von Signalen, welches spiegelbildlich der Verteilung der (lebenden) Tumorzellen auf der Membran entspricht. Die in diesem Muster enthaltene Information kann bei einer evtl. vorzunehmenden weiteren Analyse der Zellen auf der Membran genutzt werden. Insbesondere können dadurch sekretierende (und damit lebende) von nicht-sekretierenden (und damit potenziell nicht überlebensfähigen) Tumorzellen unterschieden werden.

Dementsprechend werden gemäß einem Aspekt der Erfindung die Zellen auf der Membran weiter analysiert. Dies kann eine visuelle Analyse sein, z. B. mit Licht oder Fluoreszenzmikroskop. Die Zellen können dazu auf der Filtermembran angefärbt werden, z. B. mit einer Zellkernfärbung, spezifischen Färbungen von lebenden oder toten Zellen und ähnliches.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung weist das Verfahren den weiteren Schritt

f) nach dem Filtrieren, Detektieren eines zweiten zellspezifischen Markers auf der Membran mit den als Filterrückstand darauf befindlichen Zellen, auf.

Die Membran weist erfindungsgemäß eine Porengröße von 0,1 bis 200 μm auf. Dadurch können Zellen zurückgehalten werden, während Zellfragmente, Thrombozyten und kleinere Festbestandteile der Probe durch das Filter (die Membran) hindurch gehen. Je nach Anwendung können auch zwei bis drei Filtrationen mit absteigenden Porendurchmessern nacheinander durchgeführt werden, um besonders kleine Bestandteile (z. B. Bakterien) besser aufreinigen zu können.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung weist die Membran eine Porengröße von 2 bis 50 μm, stärker bevorzugt 5 bis 20 μm, noch stärker bevorzugt 5 bis 10 μm, auf.
Porengrößen der Größenbereiche 2 bis 50 μm, 5 bis 20 μm oder 5 bis 10 μm bieten den Vorteil, dass die Zellen davon zurückgehalten werden, jedoch teilweise in den Poren haften bleiben und so besonders gut auf der Membran haften und für weitere Analysen zur Verfügung stehen.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung erfolgt das Detektieren des ersten zellspezifischen Markers und/oder des zweiten zellspezifischen Markers durch einen Immunoassay, also mit Hilfe von Detektionsantikörpern.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist die Bodenfläche des Zellkulturgefäßes mit dem ersten Antikörper beschichtet, wobei in Schritt (b) die Membran mit der Seite mit den als Filterrückstand darauf befindlichen Zellen nach unten weisend auf die Bodenfläche aufgelegt wird.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung weist das Zellkulturgefäß eine Beabstandungseinrichtung auf, so dass die Membran mit einem Abstand von 2 mm, oder weniger, bevorzugt 1 mm oder 0,1 mm oder 0,02 mm oder weniger, zu der mit dem ersten Antikörper beschichteten Oberfläche inkubiert werden kann. Durch die Beabstandungseinrichtung kann der Abstand so gewählt werden, dass die Zellen auf der Membran einerseits mit Zellkulturmedium versorgt sind, andererseits die Diffusion des ersten zellspezifischen Markers, bevor er von dem ersten Antikörper gebunden wird, begrenzt ist.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung weist das Zellkulturgefäß eine Halteeinrichtung auf, so dass die Membran für die Dauer der Inkubation in Schritt (c) in einer vorgegebenen Position in dem Zellkulturgefäß fixiert werden kann.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der erste und/oder zweite zellspezifische Marker ein aus der Liste 1 oder 2 gewählter zellspezifischer Marker.
Bevorzugt ist die Probe eine Blutprobe.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung wird bei Verwendung einer Blutprobe vor dem Filtrieren eine Erythrozytenlyse (z. B. durch hypotone Lyse) durchgeführt, um störende Erythrozyten zu entfernen.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung weist das Verfahren den zusätzlichen Schritt:

g) nach dem Filtrieren, Anfärben von Zellen auf der Membran mit einem Farbstoff

Die Zellen können auf der Membran ungefärbt oder gefärbt auch mikroskopisch analysiert werden.
Ferner können die Zellen auch nach dem Filtrieren wieder in Zellkulturmedium aufgenommen werden und für weitere Untersuchungen kultiviert werden. So können z. B. nachgewiesene Tumorzellen kultiviert und weiter untersucht werden, um das Ansprechen auf bestimmte Arzneimittel (z. B. Zytostatika) zu überprüfen.
Die Erfindung betrifft ferner ein Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, aufweisend:

a) eine poröse Membran, deren Porengröße so gewählt ist, dass Zellen mit Zellkern zurückgehalten werden, während Erythrozyten und kleinere feste Bestandteile nicht zurückgehalten werden,
b) ein Zellkulturgefäß, wobei eine Oberfläche des Zellkulturgefäßes mit einem ersten Antikörper beschichtet ist, der gegen einen ersten zellspezifischen Marker gerichtet ist,
c) ein erster Detektionsantikörper, der gegen den ersten zellspezifischen Marker gerichtet ist, und an ein anderes Epitop als der erste Antikörper bindet,
d) ein zweiter Detektionsantikörper, der gegen einen zweiten zellspezifischen Marker gerichtet ist, zum Nachweis von Tumorzellen direkt auf der Membran.

Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist zur Detektion des ersten und/oder zweiten Detektionsantikörpers ein markierter Sekundärantikörper vorgesehen.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der erste und/oder zweite Detektionsantikörper markiert.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist der erste und/oder zweite Detektionsantikörper und/oder der etwaig vorhandene Sekundärantikörper mit einem Fluorophor oder einem Enzym markiert.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung weist das Kit ferner einen Farbstoff zum Anfärben von Zellen auf der Membran auf.
Liste 1: bevorzugte zellspezifische Marker:

– Alpha-1-Fetoprotein (AFP) bei Leberzellkarzinom und gonadalen und extragonadalen Keimzelltumoren
– Bence-Jones-Protein beim Multiplen Myelom
– Beta-HCG (beta-Untereinheit des humanen Choriongonadotropin) bei Keimzelltumoren des Ovars und nicht-seminomatösem Tumoren des Hodens
– CA 15-3 beim Brustkrebs (Mammakarzinom) oder Eierstockkrebs (Ovarialkarzinom)
– CA 19-9 und CA 50 beim Bauchspeicheldrüsenkrebs (Pankreaskarzinom)
– CA-125 beim Eierstockkrebs (Ovarialkarzinom)
– Calcitonin (humanes Calcitonin, hCT), beim medullären Schilddrüsenkarzinom
– Carcino-Embryonales Antigen (CEA) bei Darmkrebs, Pankreaskarzinom sowie Adenokarzinom der Lunge
– Cytokeratin-21-Fragment (CYFRA 21-1) und Serpin B4 (SCC) bei allen Varianten des Lungenkrebses (Bronchialkarzinoms)
– HER-2/neu
– HPV-Antikörper bzw. HPV-Antigene
– Homovanillinsäure beim Neuroblastom
– 5-Hydroxyindolessigsäure beim Karzinoid
– Katecholamine, Vanillinmandelsäure beim Phäochromozytom
– Laktat-Dehydrogenase (LDH) bei Keimzelltumoren
– Laktat-Dehydrogenase Isoenzym 1 (LDH-1) bei Keimzelltumoren; eine routinemäßige Bestimmung wird in den gängigen Leitlinien jedoch noch nicht empfohlen
– MAGE Antigene
– Metanephrine beim Phäochromozytom
– MUC1 beim nicht kleinzelligen Bronchialkarzinom (NSCLC) oder beim Mammakarzinom
– NSE beim kleinzelligen Bronchialkarzinom (SCLC), Neuroblastom sowie seminomatösen Keimzelltumoren
– Plazentare alkalische Phosphatase (PLAP) bei seminomatösen Keimzelltumoren
– PSA beim Prostatakrebs (Prostatakarzinom)
– Thyreoglobulin (Tg) in jeder Konzentration beim papillären oder follikulären Schilddrüsenkarzinom
– Thymidinkinase
– Cytokeratine, z. B. Cytokeratin 8, 18, 19

Liste 2: Zusätzliche zellspezifische Marker

– β2-Mikroglobulin (β2-M),
– CA 54-9,
– CA 72-4,
– CA 195,
– Cancer Associated Serum Antigen (CASA),
– C-Peptid,
– Cytokeratin,
– Gastrin,
– Glucagon,
– Glucose-6-phosphat-Isomerase (GPI),
– Insulin,
– Neopterin,
– nukleäres Matrixprotein 22 (NMP 22),
– Ostase,
– P53-Autoantikörper,
– Paraproteine,
– Prolaktin (PRL),
– Protein S-100,
– Serpin B4 (SCC),
– Schwangerschaftsspezifisches β1-Glykoprotein (SP-1),
– Tumor-assoziiertes Glykoprotein 12 (TAG 12),
– Thymidinkinase (TK),
– Tissue polypeptide antigen (TPA),
– Tissue polypeptide specific antigen (TPS),
– Tumor M2-PK,
– Vasoaktives intestinales Polypeptid (VIP),
– Transketolase-like-1-Protein (TKTL1)

Die Erfindung wird in Zusammenhang mit den angehängten 1 bis 7 beispielhaft beschreiben, welche zeigen:
1: eine schematische Darstellung der Membran nach der Filtration
2: eine schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Anordnung von Membran und Zellkulturgefäß mit einem vergrößerten Ausschnitt in einem ersten Funktionszustand.
3: eine schematische Darstellung des vergrößerten Ausschnitts aus 2 in einem zweiten Funktionszustand.
4: eine schematische Darstellung der Detektion des ersten zellspezifischen Markers gemäß einer ersten Ausführungsform.
5: eine schematische Darstellung der Detektion des ersten zellspezifischen Markers gemäß einer zweiten Ausführungsform.
6: eine schematische Darstellung der Detektion des zweiten zellspezifischen Markers auf der Membran mit einem zweiten Detektionsantikörper.
7: eine schematische Darstellung der Detektion des zweiten Detektionsantikörpers mit einem Sekundärantikörper.
In 1 werden epitheliale Zellen (1) durch Membranfiltration gemeinsam mit den Leukozyten (2) aus Blut auf der porösen Membran (3) isoliert. Zur Filtration können kommerziell erhältliche Filter verwendet werden (z. B. Track Etched Filter Membranes der Firma Whatman). Geeignete Membranmaterialien sind z. B. Kunststoffmembranen (z. B. Nylon, PE).
Allerdings erfolgt nach der Filtration nun keine Rückspülung oder eine andere Entfernung oder Überführung der Zellen von der Membran (3) in ein anderes Medium. Die Membran, auf der die Zellen aufgefangen wurden, wird mitsamt dem Träger (4) der Membran mit der Zell-Membran-Seite um 180° nach unten gedreht ( ). In dieser Ausrichtung wird sie in ein Gefäß (5) gesetzt (2), das am Boden folgendermaßen präpariert wurde: auf der Oberfläche (6) (Plastik, Glas, Nitrozellulose, PVDF) wurden spezifische erste Fänger-Antikörper (7) immobilisiert (kovalent oder durch hydrophile Wechselwirkungen), die gegen zellspezifische Marker gerichtet sind, die von den Zellen sekretiert werden, so dass die Zellen, die auf der nunmehr unteren Seite der Filtermembran festsitzen, in direktem Kontakt mit den Fängerantikörpern kommen. Auf diese Weise ist die Strecke, den die sekretierten tumorspezifischen Proteine über Diffusion zurücklegen, auf ein Minimum begrenzt. Dabei ist der Abstand zwischen den auf der Membran festsitzenden Zellen und den Fängerantikörpern durch die Verwendung von variabel großen Beabstandungseinrichtungen (8) flexibel wählbar, damit eine ausreichende Versorgung der Zellen durch frisches Zellkulturmedium (9) gewährleistet ist, mit welchem anschließend die Zellen überschichtet werden.
Diese Anordnung wird unter Zellkulturbedingungen inkubiert (z. B. 37°C, im Inkubator). Während der Inkubation wird im Falle von isolierten lebenden und funktionsfähigen Tumorzellen ein erster zellspezifischer Marker (10) sekretiert, der durch den am Boden immobilisierten ersten Antikörper (7) gebunden wird (3). Nach einer ausreichenden Inkubationszeit wird die Filtermembran mit den dort lokalisierten Zellen entfernt. Die Inkubationszeit kann z. B. 10 min bis 1 h, 1 h bis 24 h, 24 h bis 48 h oder länger betragen. Daran anschließend werden zwei Ansätze im Nachweisverfahren weiter verfolgt:

1. der funktionelle Test, ob die epithelialen Zellen tatsächlich überlebensfähig sind und als potenziell metastasierende Zellen spezifische Tumorproteine ins extrazelluläre Medium sekretieren (4 und 5, beispielhaft).
2. der qualitative Nachweis der epithelialen Zellen auf der Membran (6 und 7, beispielhaft).

Funktioneller Test:
Um den funktionellen Tast durchzuführen, wird das Zellkulturmedium entfernt und die an die Fängerantikörper gebundenen sekretierten Proteine (10) werden im Zellkulturgefäß über einen nachfolgenden Elisa oder Immunfluoreszenz detektiert (s. Abbildungen). Dabei bindet ein primärer Detektionsantikörper (11) an die durch die Fängerantikörper (7) immobilisierten tumorspezifischen sekretierten Proteine.
Bei der mikroskopischen Auswertung der Signale oder bei der automatisierten Auswertung der Signale in einem Scanner erkennt man über die Fläche verteilt Spots an denjenigen Stellen, über denen ursprünglich die CTCs auf der Filtermembran lokalisiert waren. Diese Spots ergeben ein bestimmtes Muster.
Qualitativer Nachweis epithelialer Zellen auf der Filtermembran:
Die auf der Filtermembran verbliebenen Zellen werden in unfixiertem (lebend) oder in fixiertem (z. B. mit Paraformaldehyd) Zustand mittels Elisa oder Immunfluoreszenz gefärbt. Dabei können als zweiter zellspezifischer Marker z. B. epitheliale Markerproteine nachgewiesen werden (z. B. EpCAM, Cytokeratine, ...) (11, 13) hier beispielsweise als Doppelfärbung dargestellt; Es können z. B. auch tumorspezifische Proteine (abhängig von der Tumorart z. B. HER-2, PSA, MUC-1, ...) nachgewiesen werden. Die verschiedenen Möglichkeiten, Proteine immunologisch nachzuweisen, sind dem Fachmann bekannt. Im Falle der Immunfluoreszenz können die Zellkerne noch mit einem Kernfarbstoff (15) gegengefärbt werden (7), um eine bessere Orientierung der Zellverteilung auf der Membran zu gewährleisten. Bei der mikroskopischen Auswertung der Signale oder bei der automatisierten Auswertung der Signale in einem Scanner erkennt man über die Fläche verteilt Spots an denjenigen Stellen, an denen epitheliale Zellen lokalisiert sind.
Im optimalen Fall erhält man ein Negativbild bzw. ein spiegelverkehrtes Muster der Signale/Spots im Vergleich zu dem Musters/der Signalverteilung, welches/welche sich bei den sekretierten Proteinen im funktionellen Test ergeben haben. Wenn die Muster der beiden Färbungen nicht übereinstimmen, ermöglicht diese Positiv-Negativ-Darstellung bzw. diese spiegelverkehrte Darstellung, epitheliale lebende Tumorzellen von epithelialen nicht-lebenden Tumorzellen zu unterschieden, da vorzugsweise überlebensfähige CTCs beim funktionellen Test durch die Sekretion eines Proteins ein Signal erzeugen. Zusätzlich können unspezifische Spots beim funktionellen Test als unspezifisch eingestuft werden, wenn sich im ”Membranspiegelbild” keine epitheliale, tumorspezifisches Protein tragende Zelle nachgewiesen werden kann.
Die Detektion der Antigen-Antikörper-Bindung ist auf verschiedene Weise möglich:
Der Detektionsantikörper (11, 13) ist an ein Fluorophor gekoppelt. Die Signalauslesung erfolgt direkt fluoreszenzmikroskopisch.
Der Detektionsantikörper ist an ein Enzym (z. B. HRP) gekoppelt, nach Zugabe eines Substrats erfolgt der Nachweis colorimetrisch, d. h. nach Zugabe eines geeigneten Substrats kommt es durch die Enzymaktivität zu einem Farbumschlag. Die Signalauslesung erfolgt z. B. lichtmikroskopisch.
Der Nachweis erfolgt durch Fluoreszenz, z. B. nach Zugabe von einem fluorophorgekoppelten Tyramid wird dieses durch das geeignete Enzym (HRP) aktiviert. Das durch die Aktivierung höchst reaktive und kurzlebige Tyramid bindet kovalent an die in nächster Nähe sich befindenden Proteine. Durch diese kovalente Bindung kann das Fluorophor in nächster Nähe der nachzuweisenden Proteine sichtbar gemacht werden (TSA; Tyramide Signal Amplification; Invitrogen). Die Signalauslesung erfolgt fluoreszenzmikroskopisch.
Der Detektionsantikörper ist an Biotin gekoppelt: nach Zugabe von Streptavidin, an welches ein Fluorophor gebunden ist und das an Biotin bindet, kann die Signalauslesung direkt fluoreszenzmikroskopisch statt finden.
Nach Zugabe von Streptavidin, an welches ein geeignetes Enzym (z. B. HRP, AP) gebunden ist und das an Biotin bindet, erfolgt eine erneute Zugabe eines geeigneten Substrats, das durch die Enzymaktivität umgesetzt wird, was zu einem Farbumschlag führt. Die Signalauslesung erfolgt lichtmikroskopisch.
Nach Zugabe von Streptavidin, an welches ein geeignetes Enzym (HRP) gebunden ist und welches an Biotin bindet, wird wieder fluorophorgekoppeltes Tyramid zugegeben und durch das geeignete Enzym (HRP) aktiviert. Das durch die Aktivierung höchst reaktive und kurzlebige Tyramide bindet kovalent an die in nächster Nähe sich befindenden Proteine. Durch diese kovalente Bindung kann das Fluorophor in nächster Nähe der nachzuweisenden Proteine sichtbar gemacht werden (TSA; Tyramide Signal Amplification; Invitrogen). Die Signalauslesung erfolgt fluoreszenzmikroskopisch.
Der Detektionsantikörper ist an nichts gekoppelt und wird mit einem spezifischen Sekundärantikörper detektiert (7):
Der Sekundärantikörper (12) ist z. B. mit einem Fluorophor (14) gekoppelt. Die Signalauslesung erfolgt direkt fluoreszenzmikroskopisch (13).
Der Sekundärantikörper ist mit einem geeigneten Enzym {z. B. HRP} gekoppelt: der Nachweis erfolgt colorimetrisch, d. h. nach Zugabe eines geeigneten Substrats kommt es durch die Enzymaktivität zu einem Farbumschlag. Die Signalauslesung erfolgt lichtmikroskopisch.
Der Nachweis erfolgt durch Fluoreszenz, d. h. nach Zugabe von fluorophorgekoppeltem Tyramid wird dieses durch das geeignete Enzym (HRP) aktiviert. Das durch die Aktivierung höchst reaktive und kurzlebige Tyramide bindet kovalent an sich in nächster Nähe befindende Proteine und kann sichtbar gemacht werden.
Die vorgestellt Methode kombiniert verschiedene bekannte Ansätze zum Nachweis seltener Zellen im Blut oder Knochenmark, wobei insbesondere die Vorteile der einzelnen Ansätze genutzt und miteinander verbunden werden:

– Durch die Membranfiltration werden quantitativ alle epithelialen Zellen bzw. Tumorzellen aus Blut isoliert.
– Verluste von Zellen, die durch eventuelle Rückspülschritte der Filtermembran o. ä. entstehen, werden ausgeschlossen.
– Trotzdem kann die Funktionalität aller isolierten Zellen ohne Verlust getestet werden.
– Die Zellen stehen nach der Inkubation zur weiteren Analyse auf der Membran zur Verfügung, z. B. für zelluläre Nachweisverfahren
– Die spiegelverkehrten Bilder der Ergebnisse des funktionellen Tests und des zellulären Nachweises stellen interne Kontrollen für falsch-positive bzw. falsch-negative Ergebnisse dar.
– Leicht zu automatisieren
– Durch Abstandhalter können die auf der Membran befindlichen und nachzuweisenden Zellen sowohl vollständig von Nährflüssigkeit umgeben werden als auch Proteine in die unmittelbare Umgebung von immobilisierten Fängerantikörpern sekretieren. Letztlich ist der Nachweis der sekretierten Proteine über immobilisierte Fängerantikörper Grundlage des vorgeschlagenen funktionellen Tests.

Literatur:
Micrometastatic spread in breast cancer: detection, molecular characterization and clinical relevance, Tanja Fehm, Volkmar Müller, Catherine Alix-Panabieres and Klaus Pantel Breast Cancer Research 2008, 10 (Suppl 1): S1
Enumeration of circulating tumor cells in the blood of breast cancer patients after filtration enrichment: correlation with disease stage, Harriette J. Kahn, Anthony Presta, Lu-Ying Yang, John Blondal, Maureen Trudeau, Lavina Lickley, Claire Holloway, David R. McCready, Daniel Maclean, and Alexander Marks, Breast Cancer Research and Treatment 2004, 86: 237–24
Cancer micrometastases, Klaus Pantel, Catherine Alix-Panabieres and Sabine Riethdorf, Nature Reviews in Clinical Oncology 2009, 6: 339–351
Circulating tumor cells (CTC) detection: Clinical impact and future directions, Patrizia Paterlini-Brechot and Naoual Linda Benali, Cancer Letters 2007, 253: 180–204
Full-length cytokeratin-19 is released by human tumor cells: a potential role in metastatic progression of breast cancer. Alix-Panabières C, Vendrell JP, Slijper M, Pellé O, Barbotte E, Mercier G, Jacot W, Fabbro M, Pantel K., Breast Cancer Res. 2009; 11(3): R39. Epub 2009 Jun 23
Bezugszeichenliste

1: epitheliale Zelle
2: Leukozyt
3: Filtermembran
4: Träger der Filtermembran
5: Zellkulturgefäß
6: Oberfläche zur Antikörperimmobilisierung
7: Fängerantikörper (Antikörper gerichtet gegen ein sekretiertes Protein; z. B. tumorspezifisches, mouse-anti-PSA)
8: Abstandshalter
9: Zellkulturmedium
10: tumorspezifisches, sekretiertes Protein (z B. PSA)
11: primärer Detektionsantikörper (Antikörper gerichtet gegen dasselbe tumorspezifische, sekretierte Protein; allerdings gegen ein anderes Epitop als der Fängerantikörper; z. B. rabbit-anti-PSA)
12: Sekundärantikörper mit Fluorophor (gerichtet gegen Detektionsantikörper (11); z. B. anti-rabbit-IgG-AlexaFluor488)
13: Detektionsantikörper gerichtet gegen ein weiteres epitheliales Markerprotein (z. B. goat-anti-CK8, vorzugsweise aus einer anderen Spezies wie der primäre Detektionsantikörper 11)
14: Sekundärantikörper mit fluoreszierendem Fluorophor (gerichtet gegen Detektionsantikörper (13); z. B. anti-goat-IgG-AlexaFluor546)
15: Zellkern, gefärbt mit Kernfarbstoff (z. B. DAPI)

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

Pantel et al., 2009 [0004]
Paterlini-Brechot und Befall, 2007 [0006]
Pantel et al., 2009 [0006]
Paterlini-Brechot und Benali, 2007 [0006]
Pantel et al., 2009 [0007]
Fehm et al., 2008 [0007]
Paterlini-Brechot und Benali, 2007 [0007]
Kahn et al., 2004 [0008]
Micrometastatic spread in breast cancer: detection, molecular characterization and clinical relevance, Tanja Fehm, Volkmar Müller, Catherine Alix-Panabieres and Klaus Pantel Breast Cancer Research 2008, 10 (Suppl 1): S1 [0061]
Enumeration of circulating tumor cells in the blood of breast cancer patients after filtration enrichment: correlation with disease stage, Harriette J. Kahn, Anthony Presta, Lu-Ying Yang, John Blondal, Maureen Trudeau, Lavina Lickley, Claire Holloway, David R. McCready, Daniel Maclean, and Alexander Marks, Breast Cancer Research and Treatment 2004, 86: 237–24 [0062]
Cancer micrometastases, Klaus Pantel, Catherine Alix-Panabieres and Sabine Riethdorf, Nature Reviews in Clinical Oncology 2009, 6: 339–351 [0063]
Circulating tumor cells (CTC) detection: Clinical impact and future directions, Patrizia Paterlini-Brechot and Naoual Linda Benali, Cancer Letters 2007, 253: 180–204 [0064]
Full-length cytokeratin-19 is released by human tumor cells: a potential role in metastatic progression of breast cancer. Alix-Panabières C, Vendrell JP, Slijper M, Pellé O, Barbotte E, Mercier G, Jacot W, Fabbro M, Pantel K., Breast Cancer Res. 2009; 11(3): R39. Epub 2009 Jun 23 [0065]

Claims

Verfahren zum Nachweis von Zellen in einer Probe einer Körperflüssigkeit, aufweisend folgende Schritte: a) Filtrieren der Probe einer Körperflüssigkeit durch eine poröse Membran mit einer Porengröße von 0,1 bis 200 μm, b) Überführen der Membran mit den als Filterrückstand darauf befindlichen Zellen in ein Zellkulturgefäß, wobei eine Oberfläche des Zellkulturgefäßes mit einem ersten Fänger-Antikörper beschichtet ist, der gegen einen ersten zellspezifischen Marker gerichtet ist, c) Inkubieren der Membran in dem Zellkulturgefäß, mit einem Zellkulturmedium für einen vorbestimmten Zeitraum, wobei von den etwaig vorhandenen Zellen abgegebene zellspezifische Marker von dem ersten Antikörper gebunden werden, d) Entfernen der Membran mit den als Filterrückstand darauf befindlichen Zellen aus dem Zellkulturgefäß, e) Detektieren des gebundenen zellspezifischen Markers auf der mit dem ersten Antikörper beschichteten Oberfläche.
Verfahren nach Anspruch 1, aufweisend den zusätzlichen Schritt: f) nach dem Filtrieren, Detektieren eines zweiten zellspezifischen Markers auf der Membran mit den als Filterrückstand darauf befindlichen Zellen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Detektieren des ersten zellspezifischen Markers und/oder des zweiten zellspezifischen Markers durch einen Immunoassay erfolgt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Bodenfläche des Zellkulturgefäßes mit dem ersten Fänger-Antikörper beschichtet ist und in Schritt (b) die Membran mit der Seite der Membran mit den als Filterrückstand darauf befindlichen Zellen nach unten weisend auf die Bodenfläche aufgelegt wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Zellkulturgefäß eine Beabstandungseinrichtung aufweist, so dass die Membran mit einem Abstand von 2 mm oder weniger zu der mit dem ersten Antikörper beschichteten Oberfläche inkubiert werden kann.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Zellkulturgefäß eine Halteeinrichtung aufweist, so dass die Membran für die Dauer der Inkubation in Schritt (c) in einer vorgegebenen Position in dem Zellkulturgefäß fixiert werden kann.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der erste und/oder zweite zellspezifische Marker ein aus der Liste 1 oder 2 gewählter zellspezifischer Marker ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Zelle eine Tumorzelle ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, aufweisend den zusätzlichen Schritt: g) nach dem Filtrieren, Anfärben von Zellen auf der Membran mit einem Farbstoff.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Seite der Membran mit den als Filterrückstand darauf befindlichen Zellen der beschichteten Oberfläche zugewandt ist.
Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 9, aufweisend: a) eine poröse Membran mit einer Porengröße von 0,1 bis 200 μm, b) ein Zellkulturgefäß, wobei eine Oberfläche des Zellkulturgefäßes mit einem ersten Fänger-Antikörper beschichtet ist, der gegen einen ersten zellspezifischen Marker gerichtet ist, c) einen ersten Detektionsantikörper, der gegen den ersten zellspezifischen Marker gerichtet ist, und an ein anderes Epitop als der erste Antikörper bindet,
Kit nach Anspruch 11, ferner aufweisend d) einen zweiten Detektionsantikörper, der gegen einen zweiten zellspezifischen Marker gerichtet ist, zum Nachweis von Zellen direkt auf der Membran.
Kit nach Anspruch 11 oder 12, wobei zur Detektion des ersten und/oder zweiten Detektionsantikörpers ein markierter Sekundärantikörper vorgesehen ist.
Kit nach Anspruch 11 oder 12, wobei der erste und/oder zweite Detektionsantikörpers markiert ist.
Kit nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei der erste und/oder zweite Detektionsantikörpers und/oder der etwaig vorhandene Sekundärantikörper mit einem Fluorophor oder einem Enzym markiert sind.
Kit nach einem der Ansprüche 9 bis 14, ferner aufweisend einen Farbstoff zum Anfärben von Zellen auf der Membran.