DE69516401T2

DE69516401T2 - Verfahren und vorrichtung zum nachweis spezifischer zielzellen in spezialisierten und gemischten zellpopulationen und lösungen, die gemischte zellpopulationen enthalten

Info

Publication number: DE69516401T2
Application number: DE69516401T
Authority: DE
Inventors: Oystein Fodstad; Kleppe Hoifodt; D. Rye
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-03-10
Filing date: 1995-03-10
Publication date: 2001-01-04
Anticipated expiration: 2015-03-11
Also published as: NO180658C; WO1995024648A1; NO180658B; ES2147607T3; JPH09510779A; HUT75370A; NO940866D0; EP0749580B2; AU2086495A; SK115196A3; PL316209A1; EP0749580B1; FI963533A; DE69516401T3; ATE191973T1; PL177483B1; HU9602432D0; DE69516401D1; EP0749580A1; FI963533A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein immunmagnetisches Verfahren zum Nachweis spezifischer Zielzellen in Zellpopulationen und Lösungen von Zellpopulationen. Die Erfindung betrifft außerdem ein Kit und eine Apparatur, womit das Verfahren mit verschiedenen Zellpopulationen durchgeführt werden kann.
In der Biologie, Biochemie und angrenzenden Fachgebieten werden dringend Verfahren benötigt, wobei chemische Einheiten aneinander gekoppelt werden. Solche Verfahren werden für die Erforschung von normalen und auch von abnormen Zellpopulationen immer wichtiger. Insbesondere wenn feste Träger verwendet werden, können die Zellen immobilisiert, nachgewiesen und isoliert sowie gereinigt werden. Ferner kann der Zellgehalt durch eine Reihe komplizierter Verfahren untersucht werden. Außerdem ist es wichtig, daß die Zellen in lebensfähigen Formen isoliert werden können.
Die Affinitätsbindung ist ein hochentwickeltes Verfahren, wodurch chemische/biochemische Einheiten aneinander gekoppelt werden können. In einem solchen Verfahren binden die Bindungspartner eines Paars, die z. B. an die zu verknüpfenden Substanzen gekoppelt sind, aneinander, wenn sie miteinander in Kontakt gebracht werden. Einer der Bindungspartner in einer solchen Verknüpfung kann ein Molekül auf der Zelloberfläche darstellen. Verschiedene solche Bindungspartner-Systeme sind bekannt, z. B. Antigen-Antikörper-, Enzym-Rezeptor-, Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen auf Zellen und die Biotin-Avidin-Bindung, von denen am häufigsten die Antigen- Antikörper-Bindung eingesetzt wird.
Wenn solche Verfahren zum Isolieren spezifischer Zellen verwendet werden, die noch weiter untersucht werden sollen, ist es erforderlich, daß die Zellen ihre Funktion wieder aufnehmen können, wenn man sie den ursprünglichen Bedingungen aussetzt. Das ist nicht immer der Fall, auch wenn ein Verfahren angewendet wird, bei dem physiologische Bedingungen bereitgestellt werden, so daß die isolierten spezifischen Zellen sich in ausreichender Zahl entwickeln und sie weiter charakterisiert werden können.
Verfahren sind bekannt, wobei einer der Bindungspartner an einen unlöslichen Träger gekoppelt wird, z. B. an paramagnetische Partikel, und wobei die Isolierung von Zielzellen in einer gemischten Zellpopulation als eine negative Isolierung oder als eine positive Isolierung durchgeführt wird. In einem negativen Isolierungsverfahren können die unerwünschten Zellen aus dem Zellpräparat entfernt werden, indem die Zellen mit Antikörper-beschichteten Partikeln inkubiert werden, die für die unerwünschten Zellen spezifisch sind. Nach der Inkubation kann der Zellen-Antikörper-Partikel-Komplex anhand der Partikel entfernt werden, so daß die gewünschten Zielzellen zurückbleiben. Dieses Verfahren führt häufig zu keinem zufriedenstellenden Ergebnis, da die gewünschten Zellen mehr oder weniger gereinigt in der Zellpopulation verbleiben und da außerdem der Zweck des Isolierungsverfahrens darin besteht, die spezifischen Zielzellen zu untersuchen und/oder weitere Studien damit durchzuführen. Versuche wurden unternommen, wobei Partikel für eine positive Isolierung eingesetzt wurden, um die gewünschten Zielzellen aus der gemischten Zellpopulation zu entfernen. Diese Verfahren waren jedoch auf bestimmte Zielzellen gerichtet und sind nicht für alle Zielzellen- Systeme geeignet. Kürzlich wurde ein Verfahren zur positiven Isolierung vorgeschlagen, das das Hapten/Anti-Hapten-Kopplungssystem umfaßt (WO 91/01368), hierbei handelt es sich um ein Verfahren zum Verbinden von Zielzellen mit einem unlöslichen Träger, indem die Fähigkeiten von Hapten, Anti-Hapten-Antikörpern und Anti-Zellen- Antikörpern aneinander zu binden genutzt werden, so daß eine Verknüpfung zwischen dem unlöslichen Träger, d. h. dem Partikel, und der Zielzelle, konstruiert wird, die mindestens aus Hapten und Anti-Hapten-Antikörper oder aus Kombinationen von Hapten und Anti-Hapten-Antikörpern und Anti-Anti-Hapten-Antikörpern oder sekundären Anti- Zellen-Antikörpern besteht. Die spätere Spaltung des Komplexes erfolgt, indem er wieder mit einem Hapten oder einem Hapten-Analogon in Kontakt gebracht wird. Somit besteht die konstruierte Bindungseinheit immer aus einem Hapten und zusätzlich aus einem oder mehreren Elementen. Das Verfahren bezieht sich auf nicht-spezifizierte Zielzellen und auf das Isolieren von Zielzellen und das Freisetzen des unlöslichen Trägers.
Ferner beschreibt WO 91/09938 die Verwendung einer Kombination aus positiver und negativer Selektion zum Isolieren und möglicherweise Züchten spezifischer Zellen, d. h. hämatopoetischer Vorläuferzellen im Knochenmark, wobei das Verfahren auf das Entfernen der Partikel angewiesen ist. WO 92/04961 umfaßt ein Verfahren und eine komplizierte Vorrichtung zum Abscheiden von Zellen oder verschiedenen Molekülen aus einem nicht-magnetischen Testmedium unter Verwendung von kolloidalen magnetischen Partikeln. In diesem Verfahren werden kleine (kleiner als um ("sub micron")) Partikel eingesetzt, da es erforderlich ist das Ausfällen der Partikel in der Lösung zu vermeiden, wobei für dieses Verfahren eine komplizierte Apparatur benötigt wird, in der ein Mittel zur magnetischen Verstärkung im Testmedium immergiert wird. Dies kann eine ungünstige Wirkung auf die Zellen haben.
In "Application of Magnetic Beads in Bioassays", B. Haukanes und C. Kvam, Bio/Technology 11 : 60-63, 1993, werden verschiedene Verfahren beschrieben, wobei magnetische Partikel dazu verwendet werden, um Tumorzellen aus Knochenmark zu entfernen, Lymphoidzellen aus peripherem Blut zu isolieren und DNA, RNA und DNA- bindende Proteine zu isolieren. Alle beschriebenen Verfahren weisen Spezifitäten auf, die für den vorliegenden Zweck zum Nachweis von ausschließlich Zielzellen ungeeignet sind. Die vorstehenden Verfahren binden außer an die Zielzellen noch an sonstige Zellen, dies ist auf eine Kreuzreaktivität und eine unspezifische Anlagerung des Antikörper-Partikel-Komplexes zurückzuführen.
Außerdem werden eine Mehrschacht ("multiwell")-Filtervorrichtung für den Test von Mengen im Mikroliter-Bereich (EP-A-0 098 534), ein Filterstreifen und zusammengesetzte Einheiten zum Filtern von Mengen einer Flüssigkeit im Mikroliter-Bereich (EP- A-0 339 769) und eine Testkasette beschrieben, die eine im wesentlichen rechteckige Basisplatte, eine im wesentlichen rechteckige Deckplatte und vier Seitenwände aufweist (EP-A-0 131 934). Keine der vorstehenden Apparaturen kann für den vorliegenden Zweck verwendet werden, da bei ihnen die beschriebenen Porengrößen zu klein sind, um nur die Partikel-Zellen-Rosetten zurückhalten zu können, wie es im vorliegenden Fall gewünscht wird. Außerdem sind die Filter nicht so gestaltet, daß mit ihnen mehrere Tests an den zurückgehaltenen Zellen durchgeführt werden können, ohne daß sie aus dem Filtermedium entnommen werden müssen.
Eine einfache Verknüpfung wird benötigt, mit der eine Zielzelle an einen unlöslichen Träger gekoppelt werden kann, wobei keine Verbindungen einer weniger spezifischen Hapten-Gruppe beteiligt sein sollen, und die auf den Nachweis von spezifischen Zielzellen gerichtet ist, wobei ein Minimum an unspezifischer Zellanlagerung vorliegt, und die eine spätere Spaltung zwischen dem unlöslichen Träger und der spezifischen Zielzelle unnötig macht.
In einer schwebenden Anmeldung durch einen der Anmelder (WO 94/07139, angemeldet am 10. September 1993) wird ein Verfahren zum Nachweis spezifischer Zielzellen für diagnostische Zwecke beschrieben, bei dem es keine Probleme mit einer unspezifischen Bindung an normale Zellen gibt. Hierbei handelt es sich um empfindliche Nachweisverfahren für eine Vielzahl von Zelltypen, so daß eine große Zahl von Zellen einfach unter dem Mikroskop abgesucht werden kann, wobei die Verfahren schnell und einfach sind. Außerdem eignen sich die Verfahren zum Isolieren von Zellen für biochemische, biologische und immunologische Untersuchungen sowie für die Erforschung spezifischer Gene auf Nucleotid- oder Proteinebene, ferner zum Kultivieren der Zellen, ohne daß eine Spaltung des Zellen-Partikel-Komplexes erforderlich ist. Je doch sind Verbesserungen erforderlich, z. B. sollte das Abtrennen der Partikel- gebundenen Zielzellen in der Zielzellen-Suspension von ungebundenen Kügelchen, unspezifisch gebundenen sonstigen Zellen und ungebundenen sonstigen Zellen verbessert werden, so daß es einfach durchzuführen ist, nicht viel Zeit erfordert und die Zielzellen-Partikel-Komplexe so erhalten werden, daß weitere Analysen damit durchgeführt werden können, z. B. mikroskopische Untersuchungen und Züchten in einem Kulturmedium.
Diese Aufgaben werden durch die vorliegenden Erfindung erfüllt und durch das Verfahren, die Apparatur und das Kit erläutert, und sie sind in den beiliegenden Patentansprüchen dargestellt.
Das Verfahren zum immunmagnetischen Nachweis von Zielzellen in einer gemischten Zellpopulation und in physiologischen Lösungen, die Zellpopulationen enthalten, ist für den Nachweis geeignet, es kann jedoch auch für eine positive Isolierung von spezifischen Arten von sowohl normalen als auch pathogenen Zellen eingesetzt werden. Das Verfahren stellt eine Verknüpfung zwischen einer spezifischen Zielzelle und einem unlöslichen Träger, z. B. paramagnetischen Partikeln, her, die aus einem oder zwei Elementen besteht. Das Partikel ist entweder mit einem Anti-Zellen-Antikörper murinen oder menschlichen Ursprungs beschichtet, der gegen die spezifischen Antigen- Determinanten in den Membranen der gewünschten Zielzellen gerichtet ist, oder die Partikel sind mit einem polyklonalen Anti-Maus- oder Anti-Mensch-Antikörper beschichtet, der an die Fc-Teile des spezifischen Anti-Zellen-Antikörpers binden kann, der gegen die Antigen-Determinanten in den Membranen der Zielzellen gerichtet ist. Anstatt zum Beschichten der Partikel den polyklonalen Anti-Maus/Anti-Mensch-Antikörper zu verwenden, kann auch ein monoklonaler Anti-Maus/Anti-Mensch-Antikörper der Ratte eingesetzt werden. Bei Verwendung dieses letzteren Antikörpers kann, teilweise aufgrund seines monoklonalen Ursprungs, eine spezifischere Bindung an den Anti-Zellen- Antikörper erhalten und die Gefahr möglicher Kreuzreaktionen mit anderen Zellen in Lösungen wie Blut reduziert werden. Außerdem kann die Spezifität des Verfahrens entscheidend gesteigert werden, wenn die Inkubation der Zellsuspension mit einem milden Detergens und/oder einem zweiten Satz von Antikörpern oder Antikörperfragmenten erfolgt, die vorher mit fluoreszierenden Mitteln, Metallkolloiden, Radioisotopen, Biotin- Komplexen oder bestimmten Enzymen, die eine Sichtbarmachung erlauben, markiert oder nicht damit markiert wurden.
Ferner kann das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung deutlich verbessert und vereinfacht werden, indem die Suspension der Zielzellen-Partikel-Komplexe in die Filtervorrichtung für Zellen oder den Zellabscheider gemäß der vorliegenden Erfindung überführt wird und die Gesamtzahl der Zielzellen unter dem Mikroskop bestimmt oder die Zielzellen in einem Kulturmedium auf physiologischer Basis gezüchtet werden, so daß sie auf das Vorliegen von spezifischen biochemischen und biologischen Merkmalen getestet werden können.

Zeichnungen

Fig. 1.1 zeigt eine perspektivische Ansicht einer Ausführungsform der Filtervorrichtung für Zellen oder des Zellabscheiders, die teilweise zusammengesetzt ist.
Fig. 1.2 zeigt eine perspektivische Ansicht einer anderen Ausführungsform des Zellabscheiders, die teilweise zusammengesetzt ist.
Fig. 2 zeigt eine perspektivische Ansicht einer Version der Mehrschacht- Anordnung ("multiwells") des Zellabscheiders, wobei das Membranfilter von den Multiwells abgenommen ist.
Fig. 4 zeigt eine perspektivische Ansicht einer Version der Vorrichtung einer Kulturschale mit Deckel für die Mehrschacht-Anordnung des Zellabscheiders und/oder das Membranfilter.
Fig. 4a zeigt eine Seitenansicht der Mehrschacht-Anordnung in der Kulturschale.
Fig. 5 zeigt eine perspektivische Ansicht einer Version des Filtratsammelbehälters des Zellabscheiders.
Fig. 6 zeigt Melanom-Partikel-Zielzellen-Komplexe, die auf einer Filtervorrichtung für Zellen unter Verwendung des beschriebenen Verfahrens eingefangen wurden.
Im Folgenden ist eine genauere Beschreibung des Verfahrens dargestellt, wobei Krebszellen als Zielzellen für den Nachweis und die mögliche Isolierung verwendet werden. Das Verfahren ist jedoch nicht auf Krebszellen beschränkt, und die Beschreibung soll das Verfahren keinesfalls auf diesen bestimmten Anwendungsbereich einschränken, denn das Verfahren ist für einen weiten Bereich von zytologischen Forschungsgebieten geeignet.
Bei der Behandlung von Krebspatienten ist die Bestimmung des Stadiums der Krankheit ("Staging") für die Wahl der richtigen Therapie für den jeweiligen Patienten von größter Wichtigkeit, wobei festgestellt wird, ob der Krebs lokalisiert vorliegt oder ob eine metastatische Ausbreitung auf andere Gewebe erfolgt ist. Bösartige Zellen verbreiten sich durch ein direktes Eindringen in das umgebende Gewebe, über die Lymphgefäße oder durch ein Verteilen von Tumorzellen mit dem Blut auf entfernte Organe, einschließlich Knochenmark, Zentralnervensystem und zerebrospinale Flüssigkeit.
Der Nachweis von metastatischen Tumorzellen beruhte bis vor kurzem auf morphologischen Verfahren, wobei licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen von biopsierten Tumorproben, von Abstrichen von Knochenmark und peripherem Blut sowie von Objektträgern durchgeführt wurden, die nach der Zyto-Zentrifugation verschiedener Körperflüssigkeiten angelegt wurden. Seit der Einführung von monoklonalen Antikörpern, die Antigene erkennen, die hauptsächlich auf der Oberfläche verschie dener Zelltypen von bösartigen Zellen exprimiert werden, wurden metastatische Zellen in zunehmendem Maße auch durch Verfahren der Immunzytochemie und Immunfluoreszenz identifiziert. Hierfür wurden die aus biopsierten Tumorproben nach der Zyto- Zentrifugation hergestellten Objektträger mit monoklonalen Antikörpern behandelt und deren Bindung an die Tumorzellen kolorimetrisch oder durch Fluoreszenz sichtbar gemacht. Für das letztere Verfahren ist ein Fluoreszenzmikroskop erforderlich, alternativ kann eine Zellsuspension hergestellt und ein Durchflußzytometer verwendet werden.
Die früheren Verfahren haben den Nachteil, daß sie eine eingeschränkte Empfindlichkeit und/oder Spezifität aufweisen, außerdem sind sie normalerweise arbeits- und zeitaufwendig, wobei auch ein großes Maß an Erfahrung erforderlich ist. Für durchflußzytometrische Untersuchungen ist außerdem eine teure Apparatur nötig.
Die morphologischen Verfahren zum Nachweis von Tumorzellen in Blut und Knochenmark sind weniger empfindlich als Verfahren, die Immunzytochemie und Immunfluoreszenz umfassen. Dabei sind die letzeren Verfahren jedoch in Fällen ungeeignet, wenn die Tumorzellen weniger als 1% der Gesamtzahl der kernhaltigen Zellen darstellen. Mit der Durchflußzytometrie kann man eine bessere Empfindlichkeit erhalten als mit den mikroskopischen Verfahren, jedoch ist hierfür eine hohe Zellzahl erforderlich, und außerdem können verschiedene technische Schwierigkeiten auftreten. So kann es durch die Aggregation von Zellen zu Problemen kommen, und außerdem ist es mit dem Verfahren nicht möglich, zwischen markierten Tumorzellen und unspezifisch fluoreszierenden normalen Zellen zu unterscheiden.
Die Erfindung ermöglicht einen sehr empfindlichen Nachweis von z. B. metastatischen Tumorzellen, da ein großes Volumen und eine hohe Zahl von Zellen einfach unter dem Mikroskop abgesucht werden kann und die daran gekoppelten magnetischen Kügelchen leicht zu erkennen sind. Durch das beschriebene Verfahren und die beschriebene Apparatur wird ein fester Träger und eine dauerhafte Vorrichtung bereitgestellt, die einfach unter dem Mikroskop betrachtet werden kann, ferner wird die Untersuchung und Quantifizierung der gesamten Probe und nicht nur von kleinen Fraktionen davon möglich gemacht und außerdem können für die Analyse große Probenvolumina eingesetzt werden, wobei die Vorrichtung auch anhand der herkömmlichen densitometrischen Technologie automatisch gescannt werden kann. Die verwendeten monoklonalen Antikörper binden mit einer ausreichenden Spezifität an z. B. Tumorzellen und nicht an andere Zellen als die Zielzellen, die in gemischten Zellsuspensionen, wie Blut, Knochenmark und in anderen Tumormanifestationen vorliegen, so daß alle Zellen mit daran gekoppelten Kügelchen die Zielzellen darstellen. Außerdem ist das Verfahren schnell und einfach und kann durch eine beliebige Person durchgeführt werden, die Zugang zu einem herkömmlichen Mikroskop hat.
Das neue Verfahren umfaßt die Bindung von monoklonalen Antikörpern, die z. B. murinen oder menschlichen Ursprungs sind und die spezifisch Antigene erkennen, die auf Tumorzellen und nicht auf den in Frage kommenden normalen Zellen vorliegen, oder die für andere Zwecke spezialisierte Subpopulationen von normalen Zellen erkennen, an paramagnetische Partikel entweder direkt oder an Kügelchen, die zuerst mit Antikörpern beschichtet werden, die spezifisch die entsprechenden Antikörper oder den Fc-Teil von IgG-Antikörpern erkennen, die an die Tumorzellen binden. Die zellbindenden Antikörper können Antikörper des IgG- oder IgM-Typs sein, oder sie können ein Fragment eines IgG- oder IgM-Antikörpers darstellen. Beispiele von verwendeten Anti- Zielzellen-Antikörpern können solche sein, die gegen Gruppen von Antigen- Determinanten gerichtet sind, z. B. CD56/NCAM-Antigen (MOC-1), Cluster 2-Epithel- Antigen (MOC31), Cluster 2 (MW 40 kD)-Antigen (NrLul0) (Myklebust et al., Br. J. Cancer Suppl. 63 : 49-53, 1991), HMW-Melanom-assoziiertes Antigen (9.2, 27) (Morgan et al., Hybridoma 1 : 27-36, 1981), 80 kd, Sarkom-assoziiertes Antigen (TP1 & TP3) (Cancer Res. 48 : 5302-5309, 1988), Muzin-Antigene (Diel et al., Breast Cancer Res. Treatm., 1991) oder EGF-Rezeptor-Antigen (425.3) (Merck), außerdem der Anti-Pan- Mensch-Antikörper (Bruland et al., unveröffentlicht), der zum Nachweis von menschlichen Zellen unter tierischen Zellen geeignet ist. Der Antikörper 425.3 ist gegen Antigene in sowohl normalen als auch bösartigen Zellen gerichtet. Antikörper können außerdem gerichtet sein gegen Wachstumsfaktor-Rezeptoren, z. B., den EGF-Rezeptor, PDGF (A und B)-Rezeptor, Insulin-Rezeptor, Insulin-ähnlichen Rezeptor, Transferrin- Rezeptor, die NGF- und FGF-Rezeptoren, die Gruppe von Integrinen, andere Adhäsionsmembran-Moleküle und MDR-Proteine, sowohl in normalen Zellen als auch in abnormen Zellen, und gegen Antigene, die auf Subpopulationen normaler Zellen vorliegen, außerdem gegen onkogene Produkte, die auf den Membranen von normalen und bösartigen Zellen und auf bösartigen Zellen alleine exprimiert werden, z. B. Neu/erb B2/HER2. Bei den bösartigen Zellen kann es sich um Brust-, Ovar- und Lungenkarzinomzellen, Melanom-, Sarkom-, Glioblastomzellen, Krebszellen des Gastrointestinaltrakts und des retikuloentothelialen Systems handeln, oder die Zielzellen können mit nicht-neoplastischen Krankheiten in Zusammenhang stehen, z. B. mit kardiovaskulären, neurologischen, Lungen-, Autoimmun-, gastrointestinalen, urogenitalen, retikuloendothelialen Krankheiten oder anderen Störungen. Ferner kann die bösartige Zellpopulation im Knochenmark oder im peripheren Blut vorliegen, sie kann aus Pleura- oder peritonealen Ergüssen und anderen Körperflüssigkeiten, wie Urin, zerebrospinaler Flüssigkeit, Sperma, Lymphe, oder von soliden Tumoren in normalen Geweben oder Organen stammen, z. B. Leber, Lymphknoten, Milz, Lunge, Pankreas, Knochengewebe, Zentralnervensystem, Prostata, Haut und Schleimhäute. Eine vollständigere Aufstellung der Antigen-Determinanten und der entsprechenden Antikörper oder Antikörperfrag mente, die in dem vorliegenden verbesserten Verfahren verwendet werden, findet sich in Tabelle 1 (vgl. Anhang).

Methoden

Das Verfahren umfaßt die direkte Kopplung der Antikörper an die paramagnetischen Partikel, oder die Kopplung kann über die Kopplung an Oberflächen-gebundene Antikörper erfolgen, wie polyklonale Anti-Maus-Antikörper, monoklonale Anti-Maus- Antikörper der Ratte oder monoklonale Anti-Mensch-Antikörper, die spezifisch den Fc- Teil der jeweiligen Antikörper erkennen. Die mit Antikörpern beschichteten paramagnetischen Kügelchen werden sodann mit der zu untersuchenden Zellsuspension gemischt und 5-10 Minuten bis 2 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten, bei 0 bis 25ºC, vorzugsweise bei 4ºC, unter leichtem Rühren inkubiert. Das vorliegende Verfahren kann auch in einer anderen Reihenfolge der Schritte durchgeführt werden, wobei die freien Zielzellen-Antikörper zu der Zellsuspension zugegeben und 5-10 Minuten bis 2 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten, bei 0 bis 20ºC, vorzugsweise bei 4ºC, unter leichtem Rühren inkubiert werden. Die vorher mit Anti-Maus- oder Anti-Mensch-Antikörpern beschichteten paramagnetischen Partikel werden sodann zu der wie vorstehend beschrieben inkubierten Zellsuspension zugefügt und die resultierende Suspension einer weiteren Inkubation von 5-10 Minuten bis 2 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten, bei 0 bis 25ºC, vorzugsweise bei 4ºC, unter leichtem Rühren unterworfen. Das vorliegende Verfahren kann auch in einer geänderten Anzahl von Schritten durchgeführt werden, wobei die freien Zielzellen-Antikörper zu der Zellsuspension gleichzeitig und zusammen mit den vorher beschichteten paramagnetischen Partikeln zugegeben und einer Inkubation von 5-10 Minuten bis 2 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten, bei 0 bis 25ºC, vorzugsweise bei 4ºC, unter leichtem Rühren unterworfen werden. Die Zahl der zur Zellsuspension zugefügten Antikörper-beschichteten Kügelchen sollte zwischen dem 0,5- und 10-fachen Wert der Zahl der Zielzellen liegen. Wenn diese Zahl unbekannt ist, sollte die zugegebene Menge der beschichteten Kügelchen 1 bis 10% der Gesamtzahl der Zellen betragen. Für spezifische Zwecke und in den Fällen, wenn die Dichte der Zielzellen niedrig ist, z. B. bei bösartigen Zellen, oder wenn die Zielzellen eine sehr kleine Fraktion der gesamten Zellzahl darstellen (etwa 1%), können die Zielzellen von den sonstigen Zellen in einem magnetischen Feld positiv abgetrennt werden. Die isolierten Zielzellen in der Zellsuspension können sodann in eine Vorrichtung zur Zellzählung überführt werden, und die Zahl der Zellen mit daran gekoppelten Kügelchen kann unter dem Mikroskop bestimmt werden. Das vorliegende Verfahren kann auch durchgeführt werden, wobei dies bevorzugt ist, indem die isolierte Zielzellen-Suspension in die in dieser Anmeldung beschriebene Filtervorrichtung für Zellen überführt wird und die Gesamtzahl der isolierten Zielzellen unter dem Mikroskop betrachtet wird. Die in der Filtervorrichtung isolierten Zielzellen können fixiert und gefärbt werden, wodurch die Betrachtung unter dem Lichtmikroskop erleichtert wird. Für spezifische Zwecke und in Fällen, wenn die isolierten Zielzellen funktionell aktiv sein sollen, kann ein Kulturmedium auf physiologischer Basis zu der Filtervorrichtung für Zellen zugegeben und eine nicht festgelegte Zeit bei 37ºC inkubiert werden. Die isolierten Zielzellen können gezüchtet und anschließend auf das Vorliegen von spezifischen biochemischen und biologischen Merkmalen charakterisiert werden. Außerdem können die Zielzellen auf das Vorliegen von spezifischen biochemischen und biologischen Merkmalen charakterisiert werden. Von besonderer Wichtigkeit ist die Verwendung solcher Zellen für molekularbiologische Untersuchungen. Im Gegensatz zu den vorstehend zitierten Verfahren nach dem Stand der Technik ermöglicht das vorliegende Verfahren Untersuchungen und die Züchtung der Zielzellen, ohne daß die Kopplung von paramagnetischem Partikel und Zielzelle aufgespalten werden muß. Aus mehreren Gründen ist es von Interesse, spezifische Gene in einer reinen Population von Zielzellen auf DNA-, mRNA- und Proteinebene zu untersuchen, sowohl in Tumorbiopsien als auch in Tumorzellen, die im Blut, im Knochenmark und in anderen Körperflüssigkeiten, z. B. Urin, zerebrospinaler Flüssigkeit, Sperma, Lymphe, vorliegen oder die aus ansonsten normalen Geweben und Organen stammen, z. B. Leber, Lymphknoten, Milz, Lunge, Pankreas, Knochengewebe, Zentralnervensystem, Prostata, Haut und Schleimhäuten, sowie auf anderen Gebieten der zytologischen Forschung. Bei den Verfahren nach dem Stand der Technik gelten die Signale, die auf Southern-, Northern- und Western-Blots erhalten werden, sowohl für die normalen als auch für die Tumorzellen in der Biopsie. Wenn dagegen zuerst eine Einzelzell- Suspension aus dem Tumormaterial hergestellt wird und die Tumorzellen dann positiv immunmagnetisch nachgewiesen und abgeschieden werden, würden die an diesem Material durchgeführten Genstudien nur die Ergebnisse der Zielzellen darstellen. Dies betrifft auch z. B. bösartige Zellen, die in Säugergeweben vorliegen, z. B. in Knochenmark, peripherem Blut, Pleura- und peritonealen Ergüssen und anderen Körperflüssigkeiten, z. B. Urin, zerebrospinaler Flüssigkeit, Sperma und Lymphe. Auch Untersuchungen, bei denen die Verfahren der Polymerasekettenreaktion ("polymerase chain reaction", PCR) eingesetzt werden, zeigen eine erhöhte Spezifität und Reproduzierbarkeit, wenn sie mit den reinen Tumorzellpopulationen durchgeführt werden, die durch das neue Verfahren erhalten werden.
Die Anwendung der neuen Verfahrensschritte kann abhängig von der zu untersuchenden Gewebeart unterschiedlich sein.
a) Das Gewebe aus soliden oder Nadel-Tumorbiopsien wird mechanisch oder unter milder enzymatischer Behandlung zu einer Einzelzell-Suspension zubereitet, zu welcher die primären spezifischen Antikörper oder Antikörperfragmente direkt oder nach Waschen der Zellsuspension mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung oder Kul turmedium mit oder ohne Serum, wie fetales Kälberserum, Rinder-, Pferde-, Schweine-, Ziegen- oder menschliches Serum, zugegeben werden.
b) Wenn das Material eine Probe von Pleura- oder Asziteserguß, zerebrospinaler Flüssigkeit, Urin, Lymphe oder Körperflüssigkeiten ist, wie z. B. Ergüssen in den Gelenken von Patienten mit verschiedenen Formen von Arthritis, erfolgt die Zugabe der spezifischen Antikörper oder Antikörperfragmente zu den Proben entweder direkt oder nach einer Zentrifugation mit oder ohne Waschen, bevor oder nachdem die Zellen in den Proben abzentrifugiert und wieder in Suspension gebracht werden.
c) Wenn das Material aus Blut oder Knochenmark-Aspirat besteht, erfolgt die Zugabe der spezifischen Antikörper oder Antikörperfragmente zu den Proben entweder direkt oder nach Zentrifugation mit oder ohne Waschen, bevor oder nachdem die Zellen in den Proben abzentrifugiert und wieder in Suspension gebracht werden, oder eine Fraktion einkerniger Zellen kann durch Gradientenzentrifugation auf z. B. "Lymphoprep" vor dem Waschen, dem Resuspendieren und dem Zugeben der geeigneten Antikörper oder Antikörperfragmente hergestellt werden.
Die Bedingungen des Verfahrens für a) und b) stehen fest, wie aus den Ergebnissen der nachstehend beschriebenen erfolgreichen Experimente ersichtlich ist.
Für c) wurde gefunden, daß die Ergebnisse durch viele Faktoren beeinflußt werden, die in Einzelheiten untersucht wurden. Hierzu zählen die Antikörper-Konzentration, das Verhältnis der Zahl der paramagnetischen Partikel zu der Zellzahl, die Inkubationszeiten und Volumina, die Art des Inkubationsmediums und der pH-Wert. Das Verhältnis der Partikel zu den einkernigen Zellen sollte in allen Experimenten im Bereich von 0,5/1 bis 2/1 liegen, abhängig von der Bindungsaffinität der primären spezifischen Antikörper oder Fragmente.
Ein Hauptproblem war die unspezifische Kopplung von Partikeln, die entweder mit Schaf- oder Ratten-Anti-Maus-Antikörpern alleine oder außerdem mit den spezifischen Antikörpern beschichtet waren, an normale Blut- oder Knochenmarkzellen. Experimente haben gezeigt, daß die unspezifische Bindung ohne das Vorliegen der spezifischen Antikörper gleich hoch ist, dies macht deutlich, daß das Problem nicht durch eine Kreuzreaktivität, d. h. indem Antikörper mit normalen Zellen reagieren, verursacht wird. Die Möglichkeit, daß die weniger als optimale Spezifität durch Ionenbindung verursacht werden könnte, wurde ausgeschlossen. Eine andere Möglichkeit bestand darin, daß Subpopulationen von normalen Zellen der B-Linie sich an die Partikel-Antikörper- Komplexe anlagern könnten. Wenn die B-Zellen jedoch aus der Zellsuspension vor der Zugabe der spezifischen Antikörper/Antikörper-Partikel-Komplexe immunmagnetisch entfernt wurden, konnte auf diese Weise ihre Spezifität trotzdem nicht verbessert werden.
Das Problem mit dem Verfahren, das an isolierten einkernigen Fraktionen aus Knochenmark und peripherem Blut angewendet wurde, das darin bestand, daß möglicherweise auch einige sonstige Zellen an die paramagnetischen Partikel binden, wurde umgangen oder behoben. So wurde mit Schaf-Anti-Maus-Antikörper-beschichteten Partikeln alleine oder zusammen mit spezifischen Antikörpern die Zahl der Partikel, die sich unspezifisch an eine kleine Fraktion von einkernigen Blut- oder Knochenmarkzellen anlagerten, von einem Durchschnitt von 10 auf etwa 1 reduziert, und parallel dazu fiel die Fraktion der normalen Zellen mit Partikeln von 1 bis 2% auf 0,5 bis 1% oder weniger ab.
Anhaltspunkte wurden deutlich, daß die Ursache des Problems in den hydrophoben Kräften liegen könnte, die mit den an die paramagnetischen Partikel gebundenen Antikörpern zusammenhängen. Somit werden die Verfahren zur Verminderung dieser Hydrophobie beansprucht. Ein solches Verfahren besteht aus der Vor-Inkubation der Antikörper-beschichteten Partikel und der Zellsuspension mit milden Detergentien in geeigneten Konzentrationen, z. B. Tween 20 in Konzentrationen von weniger als 0,1% für 30 Minuten bei 4ºC. Wenn die Selektion der Zielzellen erforderlich ist, sollte die Zellsuspension eine niedrige Konzentration des Detergens enthalten, z. B. 0,01% Tween 20 . In verschiedenen Experimenten konnte durch dieses Verfahren das Problem der unspezifischen Bindung, die bei den einkernigen Zellfraktionen aus Blut oder Knochenmark auftrat, fast vollständig behoben oder zumindest sehr stark abgeschwächt werden.
Die weitere Verbesserung, sofern sie erforderlich erscheint, kann zusammen mit dem Degergens-Schritt wie folgt eingesetzt werden:
Nach Inkubation der Zellsuspension mit den primären Antikörpern oder den Antikörperfragmenten und den Antikörper-beschichteten paramagnetischen Partikeln, wie vorstehend beschrieben, wird die Zellsuspension mit einem zweiten Satz von Antikörpern oder Antikörperfragmenten inkubiert, die gegen andere extrazelluläre oder gegen intrazelluläre Determinanten der Zielzellen gerichtet sind, mit oder ohne Vorbehandlung mit Fixiermitteln für Zellen, wie Formaldehyd oder Alkoholen. Diese Antikörper oder ihre Fragmente sollten vorher mit fluoreszierenden Mitteln, Metallkolloiden, Radioisotopen, Biotin-Komplexen oder Enzymen, wie Peroxidase und alkalischer Phosphatase, markiert worden sein, so daß sie durch bekannte Verfahren unter dem Mikroskop und/oder in einer geeigneten Zählvorrichtung sichtbar gemacht werden können.
Die Zielzellen werden durch das letztere Verfahren sichtbar gemacht und weisen außerdem auf ihrer Oberfläche gebundene Partikel auf, somit können sie gezählt werden.
Um die Unterscheidung zwischen sonstigen Zellen und Zielzellen zu erleichtern, kann die Zellsuspension oder ein Teil davon vor dem zweiten Sichtbarmachungs-Schritt entweder einer Zytospin-Zentrifugation unterworfen werden, oder Teile der Suspension werden an beschichtete Glasobjektträger gekoppelt, worauf die Partikel-gebundenen Zellen sodann in einer dünnen Schicht aufgebracht werden, so daß die doppelt- "gefärbten" Zellen leichter zu erkennen sind.
Ein alternatives Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, mit dem die Unterscheidung zwischen den sonstigen Zellen und den Zielzellen weiter erleichtert werden kann, umfaßt die Filtervorrichtung für Zellen, wobei die gesamte Zellsuspension nach den Schritten zur Selektion der Zielzellen direkt in die Filtervorrichtung für Zellen überführt werden kann. Die freien ungebundenen Kügelchen, die unspezifisch gebundenen sonstigen Zellen und alle ungebundenen sonstigen Zellen werden durch das Filter durchlaufen, während die gebundenen Zielzellen auf dem Filter verbleiben und sichtbar gemacht werden können. Das Filter mit den isolierten Zielzellen kann aus der Vorrichtung entnommen und die Zellen fixiert und gefärbt werden, wobei bekannte immunhistochemische Verfahren eingesetzt werden können, sodann kann die Betrachtung unter dem Mikroskop erfolgen. Nachdem das Filter aus der Vorrichtung entnommen wurde, kann es wie ein herkömmlicher mikroskopischer Objektträger gemäß den bekannten und üblichen Verfahren der Immunhistochemie behandelt werden.
Für bestimmte Zwecke kann das Filter entweder aus der Vorrichtung entnommen werden oder es kann in der Vorrichtung verbleiben, und ein Kulturmedium kann zugefügt werden, z. B. ein bekanntes Kulturmedium mit oder ohne Agarose, so daß sich die auf dem Filter liegenden isolierten Zielzellen vermehren können.
Kits, die in dem neuen Verfahren eingesetzt werden sollen, enthalten z. B. vorher beschichtete paramagnetische Partikel, die für jeden monoklonalen Antikörper hergestellt werden können. In einer anderen Ausführungsform enthalten die Kits paramagnetische Partikel, die einerseits mit einem IgG-Isotyp-spezifischen Anti-Maus- oder Anti- Mensch-Antikörper und andererseits mit Antikörpern beschichtet sind, die unterschiedliche Zielzellen, z. B. Tumorzellen, betreffen. In einer dritten Ausführungsform enthält das Kit paramagnetische Partikel, die mit spezifischen Anti-Fc-Antikörpern beschichtet sind, z. B. polyklonalen Anti-Maus- oder monoklonalen Ratten-Anti-Maus-, oder Anti-Maus- oder Anti-Mensch-Antikörpern, die an den Fc-Teil der Zielzellen-betreffenden Antikörper binden können, welche an spezifische Anti-Zielzellen-Antikörper gebunden sind. In einer vierten Ausführungsform enthalten die Kits verschiedene Partikel mit paramagnetischer oder nicht-magnetischer Natur, die mit einem Zielzellen-Antigen oder einer Gruppe von Zielzellen-Antigenen beschichtet sein können oder nicht beschichtet sein können, so daß diese Partikel beim Durchlaufen des Verfahrens in der Filtervorrichtung für Zellen eingefangen werden, wodurch sie als Kontrolle wirken, indem sie zeigen, daß alle Aspekte der Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen in dem Verfahren korrekt arbeiten. Diese Partikel können zu der Zellsuspension in einem Stadium vorher oder wäh rend des Verfahrens zugefügt werden, oder die Partikel können als eine getrennte "Zellsuspension" eingesetzt werden, die genauso durch das gleiche Verfahren bearbeitet wird wie die Zellsuspension, welche die abzutrennenden Zielzellen umfaßt. In einer weiteren Ausführungsform enthält das Kit andere spezifische Antikörper oder Antikörperfragmente, die gegen Antigene/Rezeptoren innerhalb oder auf den gewünschten Zielzellen gerichtet sind, wobei die Antikörper oder Antikörperfragmente an Peroxidase, alkalische Phosphatase oder andere Enzyme konjugiert sind, und außerdem die entsprechenden Substrate für solche Enzyme, oder wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment zusammen mit spezifischen Farben oder mit gebundenen Enzymen, wie Peroxidase und alkalische Phosphatase, an nicht-paramagnetische Partikel gebunden ist.

Apparatur

Das neue Merkmal des Verfahrens betrifft eine Filtervorrichtung für Zellen, die auch als ein Mehrschacht-Zellabscheider bezeichnet werden kann, diese kann Teil des Kits sein, oder sie kann nicht Teil des Kits sein, wie beschrieben wird. Die Vorrichtung betrifft eine Mehrschacht-Zellabscheider-Anordnung, die zum Auftrennen von gemischten Populationen von unterschiedlich großen Zellen verwendet wird, z. B. von Zellen, die im Blut oder im Knochenmark vorliegen. Die resultierenden Zellen können direkt auf der Membran unter dem Mikroskop oder in automatischen Scannern betrachtet werden. Die vorliegende Erfindung kann in Kombination mit herkömmlichen Zellisolierungs- Techniken anhand von magnetischen Partikeln eingesetzt werden, wodurch ein schnelles, empfindliches und einfaches Verfahren zum Absuchen von großen Zahlen von Proben mit einem großen oder kleinen Volumen auf das Vorliegen von Tumorzellen innerhalb von einer bis vier Stunden bereitgestellt wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Mehrschacht-Zellabscheider- Anordnung bereitgestellt, umfassend einen oben offenen Filtratsammelbehälter, der ein Anschlußteil für einen Vakuumschlauch aufweisen kann oder nicht und der eine abnehmbare und wegwerfbare Mehrschacht-Anordnung mit einem Membranfilter zum Abscheiden von Zellen aufweist, das die Unterseite dieser Mehrschacht-Einheit darstellt. Für diese Vorrichtung kann auch ein Deckel oder Überzug bereitgestellt werden. Der Filtratsammelbehälter und der Deckel können aus einem Material bestehen, das für eine Sterilisation bei hohen Temperaturen geeignet ist, oder sie können aus einem transparenten oder undurchsichtigen Kunstsstoffmaterial bestehen, das von den Kunststoffartikeln der Gewebekultur bekannt ist.
Das Membranfilter zum Abscheiden von Zellen kann Poren mit einer regelmäßigen und gleichbleibenden Form und Größe umfassen, wie sie bei Nylon-Monofilament- Membranen vorliegen, dieses bildet den Boden der einzelnen Schächte. Das Membranfilter zum Abscheiden von Zellen kann an den Mikroschächten so befestigt sein, daß es nach dem Zellabscheidungs-Verfahren entnommen werden kann, wodurch die Untersuchung erleichtert wird. Die Membran zum Abscheiden von Zellen kann außerdem eine Karte oder einen Kunststoffrahmen umfassen, wodurch die Untersuchung nach dem Entfernen von den Mikroschächten erleichtert wird.
Der Fitratsammelbehälter kann einen Rahmen umfassen, in welchen entnehmbare Streifen aus mehr als einem Schacht eingesetzt werden können.
Der Fitratsammelbehälter kann ähnlich wie eine herkömmliche 96-Schacht-Platte gebaut sein, wobei er entsprechend konstruiert ist, daß die Membran zum Abscheiden von Zellen, der Sammelbehälter und das Anschlußteil für Unterdruck untergebracht werden können.
Die Erfindung kann außerdem einen oberen Deckel oder Überzug umfassen.
Eine wegwerfbare Kulturschale mit Deckel wird in der Vorrichtung bereitgestellt, in die die Mikroschacht-Streifen eingesetzt und keimfrei kultiviert werden können. In die Kulturschale sind Vertiefungen oder Kerben eingearbeitet, mit denen das Positionieren des Mikroschacht-Streifens entsprechend der Lage im Filtratsammelbehälter erleichtert und eine Bewegung des Mikroschacht-Streifens während der Kultur verhindert wird. Die beschriebenen Vertiefungen oder Kerben können auch dazu dienen oder nicht dazu dienen, die Lage der Membran zum Abscheiden von Zellen nach dem Entfernen von dem Mikroschacht-Streifen zu bestimmen.
Die Erfindung wird durch die folgende Beschreibung mit Bezug auf die Figuren der beiliegenden Zeichnungen weiter erläutert, wobei eine Form der Mikroschacht- Zellabscheider-Anordnung gezeigt wird, die lediglich ein Beispiel darstellen soll.
Mit Bezug auf die Fig. 1 bis 5 der Zeichnungen ist ersichtlich, daß die Mikroschacht-Zellabscheider-Anordnung 20 aus einem Deckel oder Überzug 21 und einem Filtratsammelbehälter 22, der ein Anschlußteil 23 für Unterdruck aufweisen kann oder nicht, und außerdem entnehmbaren Mehrschacht-Streifen 24 besteht, die mit einem abnehmbaren Membranboden 25 mit einer Unterlage 25a versehen sind.
Die Fig. 1.1. und 1.2. zeigen zwei alternative Ausführungsformen der Erfindung, die teilweise zusammengesetzt sind.
Der Filtratsammelbehälter 22 kann in gewisser Weise ähnlich gebaut sein wie eine herkömmliche 96-Schacht-Platte mit entnehmbaren Schacht-Streifen, wobei die Anordnung so erfolgen kann, daß ein oder mehrere Streifen von Schächten hineinpassen.
Die Mehrschacht-Anordnung 24 kann wie dargestellt in Doppelstreifen oder als einzelner Streifen oder als mehrere Streifen angeordnet sein.
Die Mehrschacht-Anordnung 24 wird so in den Filtratsammelbehälter 22 eingesetzt, daß nur eine Ausrichtung möglich ist, dies kann durch Führungszapfen 28 oder Kerben 29 erreicht werden.
Das Membranfilter 25 zum Abscheiden von Zellen wird an der Unterseite der Mehrschacht-Anordnung befestigt und bildet den Boden der Schächte. Das Membranfilter 25 wird so an der Unterseite der Mehrschacht-Anordnung 24 befestigt, daß diese voneinander getrennt werden können, ohne daß das Membranfilter 25 oder die Unterlage 25a des Membranfilters verformt wird.
Das Membranfilter 25 kann unter dem Mikroskop betrachtet werden, oder es kann durch ein densitometrisches oder ähnliches Verfahren gescannt werden.
Das Membranfilter 25 kann Poren mit einer regelmäßigen und gleichbleibenden Form und Größe umfassen, wie sie bei Nylon-Monofilament-Membranen vorliegen, dieses Filter stellt den Boden der einzelnen Schächte dar und kann eine Porengröße von 5 bis 75 um, vorzugsweise 20 um aufweisen.
Die Mehrschacht-Anordnung 24 innerhalb des Filtratsammelbehälters 22 oder ohne einen solchen kann auch aus einem für die Gewebekultur geeigneten Material bestehen, das zur Auswertung in Scannern für herkömmliche 96-Schacht-Platten oder in Plattenlese-Apparaturen eingesetzt werden kann.
Die Kulturschale 26 und der Kulturschalen-Decket 27 können auch aus einem für die Gewebekultur geeigneten Material bestehen. Auf diese Weise ist es möglich, das Kulturmedium sowohl von oben in die Mehrschacht-Anordnung als auch unten in die Kulturschale 26 einzufüllen.
Alle Größenangaben in den Figuren stellen Beispiele dar, wobei die Vorrichtung 20 zum Abscheiden von Zellen durch diese Angaben in keiner Weise eingeschränkt werden soll. Außerdem soll die Erfindung nicht auf das vorstehende Beispiel beschränkt sein, vielmehr sind zahlreiche Variationen möglich, ohne daß vom Umfang der Erfindung abgewichen wird. Das vorliegende Verfahren wird im Folgenden durch Modellexperimente, Beispiele der Nützlichkeit des neuen Verfahrens und Beispiele von praktischen Anwendungen erläutert. Diese Beispiele sollen die Erfindung in keiner Weise einschränken.

Modellexperimente

1. Binden von Antikörper-Kügelchen-Komplexen an Tumorzellinien

Die Konzentrationen des Antikörpers und die optimalen Bedingungen für das Binden der Komplexe aus Antikörpern und paramagnetischen Partikeln an die Tumorzellen wurden bestimmt, hierfür wurden viele verschiedene Krebszellinien eingesetzt. Die paramagnetischen Kügelchen wurden an die Zellen gebunden, indem entweder die spezifischen Antikörper an Schaf-Anti-Maus-Antikörper (SAM)-beschichtete paramagnetische Partikel angelagert wurden oder indem die Zellen zuerst mit den spezifischen Antikörpern inkubiert wurden, sie dann gewaschen wurden und anschließend eine zweite Inkubation mit SAM-beschichteten Partikeln folgte. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in den Tabellen 2a und 2b dargestellt (siehe Anhang), in denen + bedeu tet, daß an alle Zellen mehrere Kügelchen gebunden sind, (+) bedeutet, daß entweder eine geringere Anzahl von Kügelchen an jede Zelle gebunden ist oder daß nicht alte Tumorzellen auf ihrer Oberfläche gekoppelte Kügelchen aufwiesen, was bedeutet, daß keine Bindung erfolgt ist, und (-) zeigt eine sehr schwache Bindung an.

2. Nachweis von Tumorzellen in der einkernigen Fraktion von Knochenmark oder peripherem Blut

Modellexperimente wurden durchgeführt, indem spezifische Antikörper und SAM-beschichtete paramagnetische Partikel entweder zu den einkernigen Zellen oder zu einer Zellsuspension zugefügt wurden, wobei eine unterschiedliche Zahl von Krebszellen aus in vitro-gezüchteten Zellinien zu den mononuleären Zellen zugegeben wurde. In einigen Experimenten wurden entweder die einkernigen Zellen oder die bösartigen Zellen vorher mit einem fluoreszierenden Farbstoff gefärbt, so daß die zwei Zelltypen unterschieden werden konnten. In allen Experimenten wurden nicht-bindende primäre Antikörper und/oder Schaf-Anti-Maus-Antikörper-beschichtete Kügelchen getrennt als Kontrollen eingesetzt. Weitere Experimente wurden ohne die Herstellung einer einkernigen Zellfraktion aus peripherem Blut durchgeführt. Dabei wurde gefunden, daß beim Abscheiden von Zellen auf diese Weise das Ausmaß der unspezifischen Bindung im Vergleich zu den durch "Lymphoprep" aufgetrennten Blutfraktionen reduziert war.

3. Abscheiden und Sichtbarmachen von Antikörper-Kügelchen-Komplexen mit Tumorzellinien unter Verwendung der Filtervorrichtung für Zellen

Die Tumorzell-Suspensionen und die mit Blut oder Knochenmark-Suspensionen gemischten fluoreszierend markierten Tumorzellen wurden zubereitet und behandelt, wie in den Modellexperimenten 1 und 2 beschrieben, und sie wurden auf die Filtervorrichtung für Zellen aufgetragen. Nach dem Waschen, Fixieren und Färben der Zellen auf dem Filter in der Vorrichtung wurde das Filter unter dem Mikroskop betrachtet. Die Ergebnisse der Tumorzell-Suspension alleine zeigten, daß die Komplexe aus Antikörper-Kügelchen und Tumorzellen eindeutig isoliert auf dem Filter vorlagen. Die Ergebnisse der fluoreszierend markierten Tumorzell-Suspension zusammen mit Blut oder Knochenmark zeigten, daß auch die Komplexe aus Antikörper-Kügelchen und Tumorzellen eindeutig isoliert auf dem Filter vorlagen (Fig. 6). Weitere Experimente, mit denen die Empfindlichkeit des Verfahrens getestet wurde, machten deutlich, daß unter Verwendung dieses Verfahrens 100 Tumorzellen nachgewiesen werden konnten, die gemischt in einer Suspension von 10&sup7; Blut- oder Knochenmarkzellen vorlagen.

4. Wachstum der abgeschiedenen Zellen, die unter Verwendung der Filtervorrichtung für Zellen isoliert wurden

Die Tumorzell-Suspensionen wurden behandelt und isoliert, wie in den Modellexperimenten 1 und 2 beschrieben, sie wurden auf eine Filtervorrichtung aufgetra gen und das Filter anschließend in einem halbfesten Medium inkubiert, das in einem 20 % Kälberserum umfassenden Kulturmedium 0,3% Agarose enthielt. Die Zellen wurden in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2; bei 37ºC inkubiert. Die Tumorzellen zeigten die Fähigkeit sich zu teilen und zu wachsen.
In verschiedenen Experimenten wurde eine gewisse unspezifische Bindung an die einkernigen Zellen beobachtet, wobei gefunden wurde, daß sie nicht mit der Art des spezifischen Antikörpers zusammenhing und daß sie mit SAM-beschichteten Partikeln alleine genauso ausgeprägt auftrat. Das Ausmaß dieser unspezifischen Bindung variierte von fast 0% bis zu einem Wert zwischen 0,5 und 2%. Diese unspezifische Bindung konnte durch eine milde Behandlung mit einem Detergens (Tween 20 ) fast vollständig verhindert werden, durch diese Behandlung wurde das Problem der hydrophoben Wechselwirkungen der Zellen abgeschwächt.

Beispiele der Nützlichkeit des Verfahrens

1. Nachweis der mikrometastatischen neoplastischen Krankheit in Blut und Knochenmark

Eine frühe und zuverlässige Diagnose der Ausbreitung von Krebszellen auf das Blut und/oder das Knochenmark gewinnt immer mehr an Bedeutung, um eine optimale Therapie auswählen zu können, die bei vielen Krebsarten, einschließlich der in Anwendungsbeispiel 1 beschriebenen Karzinome, zur Heilung führen kann. Ähnliche Verfahren wurden für das maligne Melanom, Sarkom, Neuroblastom und verschiedene andere Krebserkrankungen eingeführt, oder sie sind in der Entwicklung.

2. Nachweis von bösartigen Zellen in Pleura- oder Aszitesergüssen und Urin

Die Beschaffenheit solcher Ergüsse kann ein wichtiges diagnostisches Problem darstellen, insbesondere wenn eine geringe Zahl von Krebszellen zusammen mit normalen reaktiven Zellen oder Epithelzellen vorliegt. In verschiedenen Fällen konnte mit dem neuen Verfahren rasch eine eindeutige Diagnose gestellt werden, und zwar in Fallen, bei denen die herkömmliche zytologische Untersuchung negativ oder nicht eindeutig war. Ähnlich vorteilhaft war das Verfahren in Fällen von Krebs der Nieren oder des Harntrakts und der Blase.

3. Nachweis von neoplastischen Zellen in der zerebrospinalen Flüssigkeit

Seit die systemische Behandlung vieler Krebsarten verbessert wurde, nimmt die Häufigkeit von Fällen von Gehirnmetastasen mit Symptomen signifikant zu, weshalb der frühe Nachweis einer solchen Ausbreitung immer wichtiger wird. Bei Verwendung des neuen Verfahrens kann auch eine kleine. Zahl von bösartigen Zellen einfach identifiziert werden, so daß bereits in einem frühen Stadium der intrakranialen Tumormanifestationen therapeutisch eingegriffen werden kann.

4. Diagnose von Krebs in Biopsiegewebe

Wenn ein Krebs vermutet wird und Gewebebiopsien durch operative Verfahren oder z. B. durch Nadelbiopsien erhalten werden, kann durch das neue Verfahren, das mit den hergestellten Zellsuspensionen durchgeführt wird, eine viel einfachere und schnellere Diagnose erfolgen als mit herkömmlichen morphologischen oder immunhistochemischen oder zytochemischen Verfahren. Durch die Verwendung der geeigneten Antikörper kann zwischen verschiedenen möglichen Krebsarten unterschieden werden.

5. Identifizierung von prognostischen Indikatoren

Da die Expression von verschiedenen Membranmolekülen bei etlichen Krebsarten mit der Progression der malignen Erkrankung in Zusammenhang steht, kann das vorstehende Verfahren zum Identifizieren von prognostischen Indikatoren eingesetzt werden, wie z. B. in Anwendungsbeispiel 2 beschrieben wird.

6. Indentifizieren von Zellen, die spezifische Krankheiten oder die Progression oder das Stadium der Krankheit anzeigen

Bei verschiedenen Arten von rheumatoiden Erkrankungen (z. B. rheumatoider Arthritis) und außerdem bei allergischen, Autoimmun- und kardiovaskulären Leiden ist es für die Diagnose und für die Bestimmung des Stadiums der Krankheit wichtig, das systemische oder lokale Vorliegen von spezifischen Subpopulationen von Zellen zu identifizieren. Deshalb ist ein schneller Nachweis solcher Zellpopulationen mit dem neuen Verfahren von großer diagnostischer und therapeutischer Wichtigkeit.

7. Nachweis von Subpopulationen normaler Zellen

Für verschiedene Zwecke ist es wichtig, die Fraktion einer bestimmten Subpopulation von normalen Zellen in einer Population nachzuweisen. Dies trifft z. B. bei Leberbiopsien zu, wobei die Identifizierung von Zellen, die das Gallenepithel-Antigen exprimieren, von Wichtigkeit sein kann. Genauso kann die Identifizierung und Isolierung von spezifischen Endothelzellen aus einer Zellsuspension, die aus verschiedenen normalen Geweben hergestellt wurde, erforderlich sein.

8. Isolierung und Wachstum von selektierten Zellen

Bei vielen der vorstehend erwähnten Zwecke ist es möglicherweise erforderlich, daß für die Untersuchung eine größere Population von Zellen zur Verfügung steht. Durch das vorliegende Verfahren unter Verwendung der Filtervorrichtung für Zellen können die Bedingungen bereitgestellt werden, wodurch die positiv selektierten Zielzellen vermehrt werden können, ohne daß freie ungebundene Partikel oder andere unspezifisch gebundene Zellen vorliegen.
Verschiedene der in den Abschnitten 1 bis 6 erwähnten Zellmembran-Moleküle können auch als Ziele für eine Immuntherapie eingesetzt werden, wobei unterschiedliche Arten von aktivierten Killer-Zellen oder z. B. Immuntoxine eingesetzt werden. Indem die Expression solcher Moleküle durch das neue Verfahren identifiziert wird, kann bestimmt werden, in welchen Fällen solche Therapieansätze anzuraten sind.

Beispiele einer praktischen Anwendung des Verfahrens

Beispiel 1

Zur Diagnose von verbreiteten Krebszellen im Blut und/oder im Knochenmark in einem frühen Stadium haben wir in dem neuen Verfahren die Anti-Karzinom-Antikörper MOC-31, NrLul0, BM2, BM7, 12H12 und MLuC1 eingesetzt, hierbei wurde bestimmt, ob in solchen Körperflüssigkeiten eine mikrometastatische Erkrankung an Brust-, Lungen-, Kolorektal- und Prostatakrebs empfindlich identifiziert werden kann oder nicht. Die mit diesen Antikörpern erhaltenen erfolgreichen Ergebnisse haben signifikante Auswirkungen auf die Klinik.

Beispiel 2

Bei verschiedenen Krebsarten wurde gezeigt, daß die Expression vieler Zellmembran-Moleküle mit der Progression der malignen Erkrankung in Zusammenhang steht. Durch den Nachweis der Bindung solcher Moleküle an die entsprechenden Antikörper kann somit eine Information von hohem prognostischem Wert erhalten werden. Zu diesen Antigenen zählen eine große Zahl von Adhäsionsmolekülen, Kohlenhydrat- Antigenen, Glykolipiden, Wachstumsfaktor Rezeptoren und Karzinom-Markern, wie nachstehend angeführt. Wir haben mit dem neuen Verfahren die Bindung von Partikel- Antikörper-Komplexen an CD44-Varianten, E-Cadherin, Leγ, CEA, EGF-r, den Transferrin-Rezeptor, das MUC-1-Epitop, LUBCRU-G7-Epitop, Prostatakarzinom-Antigen, UJ13A-Epitop, 2-Mikroglobulin, HLA-Antigene und den Apoptose-Rezeptor identifiziert.

Beispiel 3

Zwei Liter Pleuraerguß wurden von einem Patienten erhalten, von dem vermutet wurde, daß er an einem malignen Melanom litt. Nach der Zentrifugation wurden die Zellen in einem Volumen von 2 ml RPMI mit 10% fetalem Kälberserum suspendiert, mit dem Anti-Melanom-Antikörper 9.2.27 (10 g/ml) 30 Minuten bei 4ºC inkubiert, gewaschen und mit Dynabeads SAM M450/IgG 2A erneut 30 Minuten bei 4ºC inkubiert. Die Zellsuspension wurde sodann unter dem Mikroskop untersucht, wobei die Fraktion von Zellen bestimmt wurde, auf deren Oberfläche paramagnetische Zellen gekoppelt waren. Die Diagnose eines malignen Melanoms wurde bestätigt, da etwa 10% der Zellen eine signifikante Zahl von gebundenen Partikel-Rosetten aufwiesen.

Beispiel 4

Biopsiertes Gewebe wurde aus einem subkutanen Tumor entnommen, bei dem die klinischen Zeichen entweder auf ein kleinzelliges Lungenkarzinom oder auf ein malignes Melanom hinwiesen. Aus der Biopsie wurde eine Einzelzell-Suspension hergestellt und diese in zwei Fraktionen aufgeteilt, eine davon wurde mit dem Anti-Melanom- Antikörper 9.2.27 und die andere mit dem Anti-Karzinom-Antikörper MOC-31 inkubiert (beide mit 10 g/ml). Die Inkubation wurde wie im vorstehenden Beispiel durchgeführt. Keine der mit dem Melanom-Antikörper inkubierten Zellen band an Kügelchen, wohingegen alle mit MOC-31 inkubierten Tumorzellen positiv waren.

Beispiel 5

Das biopsierte Gewebe von einem Patienten, bei dem ein malignes Melanom vermutet wurde, wurde untersucht, indem eine Einzelzell-Suspension hergestellt, diese mit dem Anti-Melanom-Antikörper 9.2.27 inkubiert und anschließend das Verfahren wie vorstehend durchgeführt wurde. Die meisten Zellen waren positiv, wobei eine große Zahl von Partikel-Rosetten an ihren Membranen gekoppelt vorlag.

Beispiel 6

Ein Pleuraerguß von einer Brustkrebspatientin wurde untersucht, wobei festgestellt werden sollte, ob Tumorzellen in der Flüssigkeit nachzuweisen waren. Ein Liter der Flüssigkeit wurde zentrifugiert, die Zellen resuspendiert und in getrennten Gläschen mit jedem von drei verschiedenen Anti-Karzinom-Antikörpern (MOC-31, 2E11, 12H12) inkubiert. Nach Abschluß des Verfahrens wurde wie im vorstehenden Beispiel gefunden, daß die meisten Zellen in allen drei Fällen an die Antikörper-beschichteten Partikel banden.

Beispiel 7

Eine Knochenmark-Suspension, die von einer Brustkrebspatientin stammte, wurde untersucht, wobei festgestellt werden sollte, ob möglicherweise mikrometastatische Tumorzellen vorlagen. Nach der Herstellung von einkernigen Zellen wurden diese mit den gleichen drei Anti-Karzinom-Antikörpern inkubiert, die auch im vorstehenden Beispiele verwendet wurden, wobei in diesem Fall die Antikörper jedoch zuerst an DynabeadsTM SAM IgG-paramagnetische Partikel gekoppelt wurden. Nach einer Inkubation mit diesen direkt beschichteten Partikeln wurde die Zellsuspension unter dem Mikroskop untersucht, wobei sich zeigte, daß eine große Zahl von Zellen positiv war, bei denen mehrere Partikelrosetten an ihrer Membran gekoppelt vorlagen. Ähnliche Experimente wurden mit verschiedenen Pleura- oder Aszitesergüssen und mit Knochenmark von Brustkrebspatientinnen durchgeführt.

Beispiel 8

Die menschlichen Brustkrebszellen T47D wurden verschiedene Zeitspannen mit Hoechst-Fluoreszenz-Farbstoff inkubiert und die Lebensfähigkeit der markierten Zellen ermittelt. Anschließend wurden unterschiedliche Zahlen von markierten Brustkrebszellen zu 1 · 10&sup6; Knochenmarkzellen zugefügt, die von gesunden Freiwilligen erhalten worden waren. In unterschiedlichen Experimenten wurden verschiedene Konzentrationen von paramagnetischen monodispersen Partikeln (Dynabeads P450) zugefügt, die mit einzelnen Anti-Karzinom-Antikörpern (NrLul0, MOC31 oder 12H12) beschichtet waren. Nach 30 Minuten Inkubation auf Eis wurden Proben der verschiedenen Teströhrchen in einer Zählkammer unter einem Licht- und Fluoreszenzmikroskop untersucht. Wenn das Verhältnis von Tumorzellen zu den kernhaltigen Zellen insgesamt niedrig war, wurde die Zellsuspension einem magnetischen Feld ausgesetzt, und die Zellen mit daran gekoppelten Partikeln wurden vor der Untersuchung unter dem Mikroskop isoliert. Dabei wurde gefunden, daß bei einem optimalen Verhältnis von 1 bis 10 paramagnetischen Kügelchen pro Tumorzelle in dem Zellgemisch alle Tumorzellen 2 bis 15 Kügelchen gekoppelt an ihrer Oberfläche aufwiesen. Die Empfindlichkeit des Nachweisverfahrens lag etwa bei einer Zielzelle pro 10&sup4; kernhaltigen Zellen. In Kontrollexperimenten mit markierten Tumorzellen unter Verwendung von Antikörpern, von denen bekannt ist, daß sie eine gewisse Kreuzreaktivität zu normalen Zellen aufweisen, wurde diese Kreuzreaktivität mit den Antikörper-beschichteten paramagnetischen Partikeln bestätigt In Experimenten mit Kügelchen, die nicht mit Tumorassoziierten Antikörpern beschichtet waren, band keine der Zielzellen an die Kügelchen.
Ähnliche Experimente wurden sowohl mit anderen Brustkrebs-Linien als auch mit einer kleinzelligen Lungenkarzinom-Zellinie durchgeführt. In diesen Experimenten wurden eine ähnliche Empfindlichkeit und eine ähnliche Spezifität erhalten.

Beispiel 9

Pleura- und Aszitesergüsse von Patientinnen mit Brustkrebs und Ovarialkarzinom wurden zentrifugiert, die gleichen beschichteten paramagnetischen Partikel wie in Beispiel 1 wurden zugefügt, inkubiert und in einem Magnetfeld eingeengt, anschließend wurde die Suspension unter dem Lichtmikroskop untersucht. Typischerweise wiesen Zellen, die eindeutige morphologische Merkmale von Tumorzellen besaßen, gekoppelte Kügelchen auf, während keine der wenigen normalen Zellen an die Antikörperbeschichteten Kügelchen banden. In zwei Fällen mit Pleuraerguß ergab eine unabhängige morphologische Untersuchung kein Vorliegen von Tumorzellen, wohingegen unter Verwendung von Antikörper-beschichteten Kügelchen eine signifikante Zahl bösartiger Zellen nachgewiesen wurde. In einigen Fällen wurden Tumorzellen in einem magnetischen Feld abgeschieden und auf Gewebekulturflaschen überführt, die ein speziell für die Kultur von Brustkrebszellen hergestelltes Wachstumsmedium enthielten, das Ziel dieses Vorgehens war, aus diesen Kulturen permanente Zellinien anzulegen. Gleichzeitig wurden Zellen von malignen Ergüssen direkt ohne eine positive Selektion mit magnetischen Kügelchen gezüchtet. Im letzteren Fall konnte keine Zellinie etabliert werden, wohingegen in mehr als 50% der Fälle, in denen positiv selektierte Tumorzellen verwendet wurden, erfolgreich Zellinien angelegt werden konnten.

Beispiel 10

In einigen Fällen wurden Knochenmark und peripheres Blut, die von Patientinnen mit Brustkrebs erhalten wurden, mit dem vorliegenden Verfahren untersucht, indem Antikörper-beschichtete paramagnetische Kügelchen zugegeben wurden, hierauf folg ten 30 Minuten Inkubation bei 4ºC und Einengen in einem magnetischem Feld, sodann wurde die Suspension unter dem Lichtmikroskop untersucht. In beiden Fällen wurde eine Bindung der paramagnetischen Kügelchen an Tumorzellen nachgewiesen, die 0,1 bis 1% der kernhaltigen Zellen im Knochenmark und im Blut ausmachten, dies waren Zellen, die durch kein anderes Verfahren nachgewiesen werden konnten.

Beispiel 11

Antikörper gegen Wachstumsfaktor-Rezeptoren oder andere Genprodukte, die auf der Oberfläche von spezifischen Zellpopulationen exprimiert werden, können zum Identifizieren und positiven Selektieren dieser Zellen eingesetzt werden. Mit Kügelchen, die mit Anti-Transferrin-Rezeptor-Antikörpern beschichtet waren und die in dem neuen Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt wurden, wurde gezeigt, daß sie ein schnelles, einfaches und empfindliches Verfahren zum Identifizieren von Zellen, die den Transferrin-Rezeptor exprimieren, darstellen.

Beispiel 12

Für verschiedene Zwecke ist das Isolieren spezifischer Populationen von normalen Zellen erforderlich. Endothelzellen, welche die Kapillaren oder kleinen Gefäße in normalem und tumorösem Gewebe auskleiden, konnten aus den aus den entsprechenden Geweben hergestellten Zellsuspensionen positiv selektiert werden. Das Verfahren umfaßte die Verwendung von Kügelchen, die mit einem Antikörper beschichtet waren, der gegen Strukturen gerichtet war, die auf den Endothelzellen, nicht jedoch auf den anderen normalen Zellen im Zellgemisch exprimiert wurden.

Beispiel 13

Menschliche Zellen, die in immundefiziente Nager injiziert wurden, wurden in Zellsuspensionen nachgewiesen, die aus Tumor-Xenotransplantaten und verschiedenen Wirtsorganen/Geweben unter Verwendung von magnetischen Partikeln hergestellt wurden, die mit einem Anti-Pan-Mensch-Antikörper beschichtet waren.

Beispiel 14

Tumorzellinien von Brustkrebs- und Melanompatienten wurden aus einer gemischten Population von Blut- und Knochenmarkzellen abgeschieden und unter Verwendung der hier beschriebenen Filtervorrichtung für Zellen filtriert. Nach Zugabe von Kulturmedium und anschließender Inkubation konnten die selektierten Tumorzellen auf dem Filter in Abwesenheit von freien ungebundenen Partikeln oder anderen unspezifisch gebundenen Zellen wachsen. Tabelle 1 Aufstellung der anwendbaren Antigene und Beispiele der entsprechenden Antigen-bindenden Antikörper Tabelle 2a Ergebnisse der Antikörper-Bindung mit unterschiedlichen Zellinien Tabelle 2b Ergebnisse der Antikörper-Bindung mit unterschiedlichen Zellinien

Claims

1. Verfahren zum Nachweis und zum Abscheiden spezifischer Zielzellen in bzw. aus Zellsuspensionen aus gemischten Zellpopulationen in flüssigen Systemen, die gemischte Zellpopulationen enthalten, oder in bzw. aus Suspensionen von Zellen gleicher Art (mit Ausnahme von normalen und bösartigen hämatopoietischen Zellen in Blut und Knochenmark), die aus festen Geweben hergestellt werden, umfassend:

- Beschichten von paramagnetischen Partikeln oder Kugeln mit Antikörpern oder Antikörperfragmenten, die gegen Membranstrukturen gerichtet sind, die auf den Zielzellen, jedoch nicht auf den sonstigen Zellen des Zellgemisches spezifisch exprimiert werden,

- Mischen der an die Partikel oder Kugeln gekoppelten Antikörper mit der die Zielzellen enthaltenden Zellsuspension,

- Inkubieren des Gemisches aus der Zellsuspension und den an die Partikel oder Kugeln gekoppelten Antikörpern 5-10 Minuten bis 2 Stunden lang, vorzugsweise 30 Minuten lang bei 0-25ºC, vorzugsweise bei 4ºC unter leichtem Rühren,

- Färben oder sonstiges Sichtbarmachen des Zellen-Partikel-Komplexes in den Zellsuspensionen,

- Untersuchen und Zählen der gefärbten und ungefärbten Partikel-Zielzellen- Komplexe in der Zellsuspension mit einem Mikroskop oder einer geeigneten Zählvorrichtung für Zellen/Partikel,

dadurch gekennzeichnet,

daß die auf diese Weise erhaltene Zielzellensuspension auf eine Filtervorrichtung für Zellen oder auf einen Zellabscheider (20) überführt wird, in der bzw. dem die Zellsuspension in einen kleinen Schacht (microwell) gegeben wird, wobei ein zum Zurückhalten der Partikel-Zielzellen-Komplexe geeignetes Membranfilter verwendet wird, wahlweise unter Verwendung einer Saugvorrichtung, und wobei die Filter mit den isolierten Zielzellen aus der Filtervorrichtung für Zellen entfernt und sodann fixiert, gefärbt und unter dem Mikroskop betrachtet werden, und daß das Membranfilter Nylon-Monofilament- Membranen mit Poren von regelmäßiger und gleichbleibender Form und Größe umfaßt, die das Abscheiden von Partikel-Zielzellen-Komplexe aus dem Gemisch erlauben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper oder Antikörperfragmente polyklonale Anti-Maus-Antikörper oder monoklonale Anti- Maus-Antikörper von Ratte oder Anti-Mensch-Antikörper sind, die an die Fc-Abschnitte der Antikörper binden können, die gegen die Membranstruktur gerichtet sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellsuspension, die Zielzellen mit freien, an die Zielzellen assozierenden Antikörpern enthält, 5 Min. bis 2 Std. lang bei einer Temperatur zwischen 0ºC und 20ºC unter leichtem Rühren inkubiert und vor Zugabe der mit Anti- Fc-Antikörpern beschichteten paramagnetischen Partikel oder Kugeln gewaschen werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch 30 Min. lang inkubiert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch bei einer Temperatur von 4ºC inkubiert wird.

6. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Färbung oder zum sonstigen Sichtbarmachen des Zellen-Partikel-Komplexes die Zellsuspensionen unbehandelt gelassen oder alternativ mit Formalin, Alkohol oder anderen Fixiermitteln vorbehandelt werden und mit anderen Antikörpern oder Antikörperfragmenten, die an in den Zielzellen vorhandene extrazelluläre oder intrazelluläre Moleküle binden und die zuvor mit Peroxidase, alkalischer Phosphatase oder anderen Enzymen behandelt wurden, die durch Zugabe von geeigneten Substraten und Inkubation die Bindung sichtbarmachen können.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper oder die Antikörperfragmente biotinyliert sind und die Bindung durch Inkubation mit Avidin, das mit Peroxidase, alkalischer Phosphatase oder anderen Enzymen komplexiert ist, durch Zugabe von für das jeweilige Enzym geeigneten Substraten und Inkubation sichtbar gemacht wird.

8. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das inkubierte Gemisch aus paramagnetischen Partikeln, Antikörpern und Zellen einem magnetischen Feld ausgesetzt wird.

9. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß möglicherweise mit den antikörperbeschichteten Partikeln in Verbindung stehende hydrophobe Kräfte durch 30-minütige Vorinkubation der antikörperbeschichteten Partikel und der Zellsuspension mit milden Detergentien in geeigneten Konzentrationen bei 4ºC reduziert werden.

10. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper oder Fragmente davon gegen Antigene in normalen lebenden Zellen gerichtet sind, beispielsweise in Leberhepatozyten, Kupffer-Zellen, Endothelzellen des Typs 1 und 2, Clara-Zellen der Lunge, Endothelzellen spezifischer Organe, pankreatischen exokrinen und endokrinen Zellen, Tubuluszellen der Niere, Epithelzellen der Blase, Glia- und Ependymzellen des Hirns, Epithelzellen der Blase und Prostata, Ziliarzellen der Atemwege, verschiedenen Unterpopulationen von Schleimhautzellen des Gastrointestinaltraktes, Zellen der Hypophyse und anderen endokrinen Zellen in verschiedenen hormonerzeugenden Organen.

11. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Zielzellen-Antikörper mit in Unterpopulationen von normalen Zellen vorhandenen Antigenen und mit onkogenen Produkten, die auf der Membran von Zellen aus normalen Geweben exprimiert werden, reagiert.

12. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein Antikörper gegen den EGF-Rezeptor, den PDGF(A und B)-Rezeptor, Insulin-Rezeptoren, Insulin-Rezeptor-ähnliche Rezeptoren, den Transferrin-Rezeptor, den NGF- oder den FGF-Rezeptor ist.

13. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper gegen Integrine oder andere Membranadhäsionsproteine oder gegen MDR-Proteine aus normalen Zellen gerichtet ist.

14. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper oder Fragmente davon gegen Antigen oder Rezeptoren in Zellen mit abnormalen Entwicklungsmustern, vorzugsweise zum Beispiel primäre und metastatische Krebszellen, gerichtet sind.

15. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielzellen assozierenden Antikörper solche des IgG- Isotyps sind oder F(ab')2- oder (ab)-Fragmente oder IgM oder IgM-Fragmente sind.

16. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellsuspension aus Knochenmark, periphärem Blut, Pleuraexudaten, peritonealen Exudaten, Urin, zerebrospinaler Flüssigkeit, Sperma, Lymphe, Leber, Lymphknoten, Milz, Lunge, Bauchspeicheldrüse, Knochengewebe, dem zentralen Nervensystem, Prostata, Haut und Schleimhaut stammt.

17. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper, die Antikörperfragmente oder Kombinationen derselben gegen Antigene oder Antigen-Subtypen wie in Tabelle 1 aufgelistet, gegen Rezeptoren für Wachstumsfaktoren und in der Membran von bösartigen Zellen exprimierte onkogene Produkte, Insulin- Rezeptoren, Insulin-Rezeptor-ähnliche Rezeptoren, FGF-Rezeptoren oder Kombinationen davon gerichtet sind.

18. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein Antikörper ist, der mit Antigenen reagiert, die in abnormalen Zellen vorhanden sind, beispielsweise in Zellen aus Brust-, Ovarien- oder Lungenkarzinom, Melanom-, Sarkom- und Glioblastomzellen sowie Krebszellen des Gastrointestinal- und Urogenitaltraktes oder des retikuloendothelialen Systems, und/oder mit Zielzellen, die mit nicht- neoplastischen Krankheiten einhergehen, wie etwa unter anderem mit kardiovaskulären, neurologischen, Lungen-, Autoimmun-, gastrointestinalen, urogenitalen und retikuloendothelialen Krankheiten.

19. Filtervorrichtung oder Abscheider für Zellen (20) zum Trennen von Partikel- Zielzellen-Komplexen von nichtgebundenen Kugeln und nichtgebundenen sonstigen Zellen einer Zellsuspension von gemischten Zellpopulationen, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung einen Filtratsammelbehälter (22) mit einem oder mehreren Führungszapfen (28), einem Deckel (21) und einem Anschlußteil (23) für Unterdruck umfaßt, der mehrere, eine Führungskerbe (29) aufweisende Mehrschachteinheiten (multiwell units) (24) enthält, deren Unterseite offen ist und die mit einem Membranfilter (25) zum Abscheiden von Zellen und einer an der Unterseite der Mehrschachteinheit (24) abnehmbar befestigten Membranunterlage (25a) versehen sind, wobei das Membranfilter Nylon-Monofilament-Membranen mit Poren von regelmäßiger und gleichbleibender Form und Größe umfaßt, um das Abscheiden der Partikel- Zielzellen-Komplexe aus dem Gemisch zu ermöglichen.

20. Filtervorrichtung für Zellen (20) nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Porengröße der Nylon-Monofilament-Membranen zwischen 5 um und 75 um liegt.

21. Filtervorrichtung für Zellen (20) nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Porengröße der Nylon-Monofilament-Membranen 20 um ist.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, bei dem die resultierenden magnetisch angesammelten Zellen und/oder durch Anwendung der Filtervorrichtung für Zellen (20) isolierten Zellen biologischen, biochemischen und immunologischen Untersuchungen unterzogen werden, unter anderem auch einer Charakterisierung spezifischer Gene auf DNA-, mRNA- und Proteinebene, einschließlich Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) und Reverse- Transkriptase-PCR.

23. Verfahren zum Nachweis spezifischer Zielzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 18, bei dem die abgeschiedenen Komplexe aus paramagnetischen Partikeln und Zielzellen zur Etablierung von in vitro-Zellkulturen eingesetzt werden.

24. Verfahren zum Nachweis spezifischer Zielzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 18 und 23, bei dem die abgeschiedenen Komplexe aus paramagnetischen Partikeln und Zielzellen oder die etablierten in vitro-Zellkulturen in immundefiziente Tiere eingespritzt werden, vorzugsweise zur Etablierung von menschlichen xenogenen Tumortransplantaten in Tieren.

25. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß er folgendes umfaßt:

- spezifische Antikörper oder Antikörper-Fragmente, die gegen Antigen- Rezeptoren auf Zielzellen gerichtet sind, wobei der Antikörper oder das Antikörperfragment unmitelbar oder über Anti-Fc-Antikörper an im Kit vorhandene paramagnetische Partikel gebunden ist, und

- andere spezifische Antikörper oder Antikörperfragmente, die gegen Antigene/Rezeptoren in oder auf den Zielzellen gerichtet sind, wobei die Antikörper oder Antikörperfragmente mit Biotin, Peroxidase, alkalischer Phosphatase oder anderen Enzymen konjugiert sind, oder wobei die Antikörper oder Antikörperfragmente an nicht-paramagnetische Partikel mit spezifischen Farben oder mit gebundenen Enzymen wie etwa Peroxidase oder alkalischer Phosphatase gebunden sind, und

- eine Filtervorrichtung für Zellen nach einem der Ansprüche 19 bis 21, und

- als Standard verwendete paramagnetische oder nicht-paramagnetische Partikel, die mit spezifischem Zielzellenantigen oder mit einer Gruppe von Antigenen beschichtet sind.

26. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß er umfaßt:

- paramagnetische Partikel, die mit spezifischen Anti-Fc-Antikörpern, vorzugsweise mit polyklonalen Anti-Maus-Antikörpern oder monoklonalen Anti- Maus-Antikörpern von Ratte oder Anti-Mensch-Antikörpern, die an die Fc-Abschnitte von mit Zielzellen assozierenden Antikörpern binden können, und spezifischen freien Zielzellen-Antikörpern beschichtet sind, und

- andere spezifische Antikörper oder Antikörperfragmente, die gegen Antigen/Rezeptoren in oder auf den Zielzellen gerichtet sind, wobei die Antikörper oder Antikörperfragmente mit Biotin, Peroxidase, alkalischer Phosphatase oder anderen Enzymen konjugiert sind, oder wobei die Antikörper oder Antikörperfragmente an nicht-paramagnetische Partikel mit spezifischen Farben oder mit gebundenen Enzymen wie etwa Peroxidase oder alkalischer Phosphatase gebunden sind, und

- eine Filtervorrichtung für Zellen nach einem der Ansprüche 19 bis 21, und