PL177483B1 - Sposób, urządzenie i zestaw do wykrywania swoistych komórek docelowych w zawiesinach komórkowych - Google Patents

Abstract

1. Sposób wykrywania swoistych komórek docelowych w zawiesinach komórkowych mieszanych populacji komórek oraz w plynnych ukladach zawierajacych mieszane populacje komórek, a takze w zawiesinach pojedynczych komórek przygotowanych z tkanek stalych, za wyjatkiem zdrowych i nowotworowych komórek hemopoetycznych we krwi i szpiku kostnym, przy uzyciu czastek paramagnetycznych pokrytych przeciwcialami skierowanymi przeciwko swoistym epitopom na komórkach docelowych, znamienny tym, ze obejmuje nastepujace etapy: 1.1 pokrywania, wedlug procedury znanej per se, czastek paramagnetycznych albo inaczej perelek albo a) przeciwcialami albo fragmentami przeciwcial skierowanych przeciwko strukturom blonowym specyficznie ekspresjonowanym na komórkach docelowych a nie na komórkach niedocelowych w mieszaninie komórek, badz tez b) przeciwcialami, korzystnie poliklonalnymi anty-mysimi albo monoklonalnymi anty-mysimi przeciwcialami szczurzymi albo przeciwcialami anty-ludzkimi, zdolnymi do wiazania fragmentów Fc przeciwcial, skierowanych przeciwko strukturom blonowym, i 1.2.1 mieszania przeciwcial wiazacych komórki docelowe (mysich albo ludzkich), które sa przylaczone do czastek albo perelek, z zawiesina komórek, zawierajaca komórki docelowe, albo 1.2.2 mieszania zawiesiny komórek zawierajacej komórki docelowe z wolnymi przeciwcialami wiazacymi komórki docelowe i inkubowania tej mieszaniny przez 5-10 min. do 2 godz, korzystnie przez 30 min., w temperaturze pomiedzy 0°C a 20°C, korzystnie 4°C przy delikatnym wirowaniu i plukania i dodawania czastek paramagnetycznych lub perelek wstepnie pokrytych przeciwcialami przeciwko Fc; 1.3 inkubowania obu mieszanin z 1.2.1 i 1 2 2 przez 5-10 min. do 2 godz, korzystnie przez 30 min., w temperaturze pomiedzy 0°C a 25°C, korzystnie 4°C przy delikatnym wirowaniu, i; 1.4.1 jezeli populacja komórek docelowych zawarta jest we krwi albo aspiratach szpiku kostnego, sily hydrofobowe zwiazane z czastkami pokrytymi przeciwcialami mozna zmniejszyc poprzez wstepna inkubacje czastek pokrytych przeciwcialami oraz zawiesiny komórek z lagodnymi detergentami w odpowiednich stezeniach, przez 30 min w 4°C lub; 1.4.2 jezeli jest pozadane zabarwienie lub uwidocznienie kompleksu komórka-czastka zawiesiny komórkowe, nie poddane lub poddane wstepnej obróbce formalina alkoholem badz innym utrwalaczem mozna inkubowac, z innymi przeciwcialami albo fragmentami przeciwcial wiazacymi zenwatrzkomórkowe albo wewnatrzkomórkowe czasteczki obecne na komórkach docelowych, przy czym stosowane przeciwciala sa wczesniej wyznakowane peroksydaza, fosfataza zasadowa albo innymi enzymami umozliwiajacymi dodatkowe uwidocznienie wiazania przez dodanie i inkubacje z odpowiednimi substratami, alb o ;................................ PL PL PL PL PL

Description

W biologii, biochemii i zbliżonych dziedzinach istnieje znaczne zapotrzebowanie na sposoby, w których łączy się ze sobą substancje chemiczne. Sposoby takie mają coraz większe znaczenie w badaniach dotyczących populacji komórek tak normalnych jak i nienormalnych. Zwłaszcza w przypadku zastosowania stałych podłoży, komórki można unieruchomić, wykryć i izolować oraz oczyszczać. Co więcej, zawartość komórkową można zbadać przy zastosowaniu wielu specjalistycznych sposobów. Ważna jest również zdolność do izolacji komórek w postaci żywotnej.

Wiązanie z powinowactwem jest wyrafinowanym sposobem łączenia ze sobą całości chemicznych/biochemicznych. W sposobie takim para wiążących się ze sobą partnerów, które na przykład związane są z substancjami, które mają zostać połączone, wiąże się ze sobą po doprowadzeniu do ich wzajemnego kontaktu. Jeden z wiążących się partnerów w takim wiązaniu można przedstawić jako cząstkę na powierzchni komórki. Znanych jest kilka takich układów wiązania partnerów, takich jak interakcje antygen-przeciwciało, enzym-receptor, ligand-receptor na komórkach oraz wiązanie biotyny z awidyną, z których najczęściej stosuje się wiązanie antygeny z przeciwciałem.

Gdy takie sposoby stosuje się do izolacji swoistych komórek, które poddaje się różnym badaniom, konieczne jest, by komórki te mogły podjąć ponownie swoją funkcję po powrocie do warunków początkowych. Nie zawsze do tego dochodzi, chociaż proponuje się sposób dla zapewnienia warunków fizjologicznych takich, iż izlolowane swoiste komórki mogą rozwijać się w liczbie wystarczającej dla późniejszej ich charakteryzacji.

177 483

Znane są w stanie techniki sposoby, w których jeden z wiążących się partnerów przyłączony jest do nierozpuszczalnego podłoża, takiego jak cząstki paramagnetyczne, i w których izolację komórek docelowych z mieszanej populacji komórek przeprowadza się jako izolację negatywną albo izolację pozytywną. W procedurze izolacji negatywnej niepożądane komórki można usunąć z preparatu komórek poprzez inkubację komórek z cząstkami pokrytymi przeciwciałem, swoistym dla niepożądanych komórek. Po inkubacji, kompleks komorka/przeciwciało/cząstka można usunąć dzięki zastosowaniu cząstek, pozostawiając pożądane komórki docelowe. Wynik jest często niezadowalający, ponieważ komórki pożądane pozostają w populacji komórek, mniej lub bardziej oczyszczonej, jak również ponieważ zamierzeniem procedury izolacyjnej jest zbadanie i/lub przeprowadzenie dalszych badań na swoistych komórkach docelowych. Poczyniono próby zastosowania cząstek do izolacji pozytywnej, w której pożądane komórki docelowe usuwa się z populacji komórek mieszanych. Procedury te jednak były nakierowane na pewne komórki docelowe i nie nadają się dla wszystkich układów komórek docelowych. Proponowany ostatnio (W091/01368) układ procedury izolacji pozytywnej, wykorzystującej wiązanie hapten/antyhapten dotyczy sposobu łączenia komórek docelowych z nierozpuszczalnym podłożem przy zastosowaniu zdolności haptenu, przeciwciał przeciwhaptenowych oraz przeciwciał przeciwkomórkowych do wiązania się ze sobą, a tym samym konstruowania wiązań pomiędzy nierozpuszczalnym podłożem, tj. cząstką, a -komórką docelową, składających się przynajmniej z heptenu i przeciwciała przeciwhaptenowego albo połączeń haptenu i przeciwciał przeciwhaptenowych oraz przeciwciał przeciw- przeciwhaptenowych albo wtórnych przeciwciał przeciwkomórkowych. Późniejsze rozszczepienie kompleksu przeprowadza się poprzez jego ponowną ekspozycję na hapten albo analog haptenu. W ten sposób skonstruowane wiązanie zawsze składa się z heptenu z dodatkiem 1 albo więcej elementów. Sposób ten nakierowany jest na niespecyficzne komórki docelowe i nakierowany jest na izolację komórek docelowych i uwolnienie nierozpuszczalnego podłoża.

Co więcej, WO91/0938 przedstawia zastosowanie połączenia pozytywnej i negatywnej selekcji dla celów izolacji i możliwie hodowli swoistych komórek, tj. hemopoetycznych komórek progenitorowych w szpiku kostnym i zależy od usunięcia cząstek. W092/04961 obejmuje sposób i skomplikowane urządzenie do oddzielania komórek albo innych cząstek z niemagnetycznego środowiska badaczego poprzez zastosowanie koloidalnych cząstek magnetycznych. W sposobie tym stosuje się małe (mniejsze niż mikrometr cząstki, ponieważ konieczne jest uniknięcie precypitacji cząstek w roztworze i sposób ten wymaga koniecznie skomplikowanego urządzenia, w którym zespół wzmacniający pole magnetyczne zanurzony jest w środowisku badawczym. Może to mieć niekorzystny wpływ na komórki.

W pracy „Application of Magnetic Beads in Bioassays”, B. Haukanes i C. Kvam, Bio/Technology, 11:60-63, 1993, opisano kilka metod zastosowania cząstek magnetycznych do usuwania komórek nowotworowych ze szpiku kostnego, izolacji komórek limfoidalnych z krwi obwodowej oraz izolacji DNA, RNA i białek wiążących DNA. Wszystkie opisane sposoby mają swoistości, które nie są dogodne dla niniejszego celu wykrywania wyłącznie komórek docelowych. Powyższe sposoby będą, oprócz komórek docelowych wiązać również komórki niedocelowe z uwagi na reaktywność krzyżową i nieswoistą adhezję kompleksów przeciwciało-cząstka.

Opisano również urządzenie do filtracji wielostudzienkowej dla testów na objętościach mikrolitrowych (EP-A-0 098 534), pasek filtra oraz złożone zestawy do filtrowania mikrolitrowych ilości płynu (EP-A-0 339 769) oraz wkład testowy, który ma zasadniczo prostokątną płytę podstawy, zasadniczo prostokątną płytę górną oraz cztery ścianki boczne (EP-A-0 ł3ł 934). Żadne z powyższych urządzeń nie nadaje się do zastosowania w niniejszym celu dlatego, iż rozmiary porów w nich są zbyt małe dla niniejszych celów zatrzymywania jedynie rozetek cząstka-komórka. Co więcej, filtry te nie są zaprojektowane do stosowania w kilku badanich zatrzymanych komórek bez usuwania ich z medium filtra.

ΠΊ 483

Istnieje potrzeba prostego wiązania dla połączenia komórki docelowej z nierozpuszczalnym podłożem, które nie wykorzystywałoby związków o raczej nieswoistej grupie haptenowej i które nakierowane byłoby na wykrywanie swoistych komórek docelowych, z minimalnym wiązaniem komórek nieswoistych, oraz które uczyniłoby zbędnym późniejsze rozszczepianie nierozpuszczalnego podłoża i swoistej komórki docelowej.

W zgłaszanym równolegle opisie patentowym jednego ze zgłaszających (WO94/07139, zgłoszony 10 września 1993) przedstawiony jest sposób wykrywania swoistych komórek docelowych do celów diagnostycznych bez problemów z nieswoistym wiązaniem do normalnych komórek. Są to czułe sposoby wykrywania dla różnych typów komórek, tak iż można poddać skriningowi pod mikroskopem dużą liczbę komórek, a procedura jest szybka i prosta. Co więcej, sposoby te można zastosować do izolacji komórek w badaniach biochemicznych, biologicznych i immunologicznych oraz dla badania swoistych genów na poziomie nukleotydów albo białek, w dodatku do hodowania komórek, bez potrzeby rozszczepiania kompleksów komórki-cząstki. Istnieje jednak zapotrzebowanie na ulepszenia w takiej izolacji komórek docelowych związanych z cząstkami w zawiesinie komórek docelowych, od niezwiązanych perełek, od nieswoiście związanych komórek innych niż docelowe oraz niezwiązanych komórek innych niż docelowe, co jest łatwe do wykonania, nie wymaga czasu i daje kompleksy komórek docelowych z cząstkami nadające się do przeprowadzenia dalszej analizy, takiej jak na przykład badania mikroskopowe i wzrost w pożywce hodowlanej.

Cele te osiągnięto w niniejszym wynalazku, opisanym jako sposób, urządzenie i zestaw znamienne cechami przedstawionymi w dołączonych zastrzeżeniach patentowych.

Sposób wykrywania swoistych komórek docelowych w zawiesinach komórkowych mieszanych populacji komórek oraz w płynnych układach zawierających mieszane populacje komórek, a także w zawiesinach pojedynczych komórek przygotowanych z tkanek stałych, za wyjątkiem zdrowych i nowotworowych komórek hemopoetycznych we krwi i szpiku kostnym, przy użyciu cząstek paramagnetycznych -pokrytych przeciwciałami skierowanymi przeciwko swoistym epitopom na komórkach docelowych, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

1.1 pokrywania, według procedury znanej per se, cząstek paramagnetycznych albo inaczej perełek albo a) przeciwciałami albo fragmentami przeciwciał przeciwko strukturom błonowym specyficznie ekspresjonowanym na komórkach docelowych a nie na komórkach niedocelowych w mieszaninie komórek, bądź też b) przeciwciałami, korzystnie poliklonalnymi anty-mysimi albo monoklonalnymi anty-mysimi przeciwciałami szczurzymi albo przeciwciałami anty-ludzkimi, zdolnymi do wiązania fragmentów Fc wspomnianych przeciwciał, skierowanych przeciwko strukturom błonowym; i

1.2.1 mieszania przeciwciał wiążących komórki docelowe (mysich albo ludzkich), które są przyłączone do wspomnianych cząstek albo perełek, z zawiesiną komórek, zawierającą komórki docelowe, albo

1.2.2 mieszania zawiesiny komórek zawierającej komórki docelowe z wolnymi przeciwciałami wiążącymi komórki docelowe i inkubowania tej mieszaniny przez 5-10 min. do 2 godz., korzystnie przez 30 min., w temperaturze pomiędzy 0°C a 20°C, korzystnie 4°C przy delikatnym wirowaniu i płukania i dodawania cząstek paramagnetycznych lub perełek wstępnie pokrytych przeciwciałami przeciwko Fc;

1.3 inkubowania obu mieszanin s 1.2.1 i 1.2.2 prz2z 5-r0 min.do 2 godz., gorzystkir przez 30 min., w temperaturze pomiędzy 0°C a 25°C, korzystnie 4°C przy delikatnym wirowaniu, i;

1.4.1 jeżeli pżpulaoja komókek doeklowych bawartajest we ltrwe albw ^piontech azpiku kostnego, siły hydrofobowe związane z cząstkami pokrytymi przeciwciałami można zmniejszyć poprzez wstępną inkubację cząstek pokrytych przeciwciałami oraz zawiesiny komórek z łagodnymi detergentami w odpowiednich stężeniach, przez 30 min w 4°C lub;

177 483

1.4.2 jeżeli jest pożądane zabarwienie lub uwidocznienie kompleksu komórka-cząstka zawiesiny komórkowe, nie poddane lub poddane wstępnej obróbce formaliną, alkoholem bądź innym utrwalaczem można inkubować, innymi przeciwciałami albo fragmentami przeciwciał wiążącymi zewnątrzkomórkowe albo wewnątrzkomórkowe cząsteczki obecne na komórkach docelowych, przy czym stosowane przeciwciała są wcześniej wyznakowane peroksydazą, fosfatazą zasadową albo innymi enzymami umożliwiającymi dodatkowe uwidocznienie wiązania przez dodanie i inkubację z odpowiednimi substratami, albo;

1.4.3 fragmenty przeciwciał mogą być biotynowe, a wiązanie uwidacznia się, po inkubacji z awidyną skompleksowa]^^ z peroksydazą, fosfatazą zasadową albo innymi enzymami, z dodatkiem i inkubacją z odpowiednimi substratami, albo;

1.5. poddawania mU^owanej hCoszamny an^tok paramagcetyCiglycZ-przzciwciaSkomórek (1.3) działaniu pola magnetycznego, jeśli gęstość komórek docelowych jest niska, albo jeśli stosunek komórek docelowych/komórek całkowitych w mieszaninie komórkowej jest niski (<1%), a następnie

1.5.1 badania i zliczania zabarwionych i nlózabαawionyah kompleksów cząstkakomórka docelowa w zawiesinie komórkowej, przy zastosowaniu mikroskopu i/lub odpowiedniego urządzenia liczącego komórki/cząstki, albo

1.5.2 przenoszenia zawiesiny izolowanych komórek docelowych do urządzenia filtrującego komórki albo rozdzielacza komórek (20), w którym zawiesinę komórek wprowadza się do mikaostudzieoki, przy zastosowaniu filtra błonowego dogodnego dla zatrzymania kompleksów cząstka/komórka docelowa, przy użyciu bądź bez ssania, usunięcia filtrów z wyizolowanymi komórkami docelowymi ze wspomnianego urządzenia filtrującego komórki dla utrwalenia i wybawienia znanymi metodami immuoohistochemicznzmi oraz oglądania pod mikroskopem albo dodawania pożywki hodowlanej dla celów rozmnożenia wyizolowanych kompleksów komórek docelowych umiejscowionych na filtrze w celu scharakteryzowania swoistych cech biochemicznych i biologicznych, albo;

1.6 jeżeli stosunek komórko docelsave/kowórki całkowite w zawiwsmiekomóreo w/eosć >1% obejmuje etap badania i liczenia komórek docelowych w ioóubowansj mieszcnioió cząstek paramagnetycznych, przeciwciał oraz mieszaniny komórek (1.3), albo, w przypadku gdy przeciwciała bądź fragmenty przeciwciał skoniugowane są z cząstkami niópcrcmcgnetyazozmi, które można uwidocznić bezpośrednio z uwagi na kolor albo poprzez cótywcaSę enzymatyczną,

1.6.1 zastosowania mkaoskopu i/lub odpowiedniego urządzenia liczącego komórki/cząstki albo,

1.6.2 przenoszenia zawiesiny izolowanych komórek docelowych do urządzenia flltruSąaógo komórki albo rozdzielacza komórek i przeprowadzania sposobu według 1.5.2 powyżej.

Urządzenie do filtrowania komórek albo rozdzielacz komórkowy do oddzielania kompleksów cząstka-komórka docelowa od perełek niózwiązcozch i niózwiązanzch komórek niedoaólowzah w zawiesinie komórkowej mieszanych populacji komórkowych, obejmuje studzienki z otworami po obu stronach, przy czym nad jednym z otworów umiejscowiony jest zespół filtrujący, do którego przytwierdzony jest materiał filtrujący, tworząc obszar filtrowania, który zawiera pudełko zbiorcze filtratu z balcóm/balccml wiodącymi, z pokrywką z częścią dla dołączenia podciśnienia, zawierające wiele jednostek wlelostudzlóoóowych z wrębem wiodącym, z filtrem błonowym rozdzielacza komórek oraz podparcie błony odłączalnie umocowanymi na dnie jednostki wielosaudziónóowsj. Korzystnie, pory w filtrze błonowym są regularne i jednorodne pod względem kształtu i rozmiaru, jak w błonach Sódnowłóólóoóowych z nylonu o rozmiarach porów w zakresie od 10 pm do 75 pm, korzystnie 20 pm.

Zestaw do wykrywania swoistych komórek docelowych w zawiesinach komórkowych mieszanych populacji komórek oraz w płynnych układach zawierających mieszane populacje komórek, a także w zawiesinach pojedynczych komórek przygotowanych z tkanek stałych, za

177 483 wyjątkiem zdrowych i nowotworowych komórek hemopoetycznych we krwi i szpiku kostnym przy użyciu cząstek paramagnetycznych pokrytych przeciwciałami skierowanymi przeciwko swoistym epitopom na komórkach docelowych zawiera:

1) swoiste przeciwciała albo fragmenty przeciwciał nakierowane na receptory antygenowe na pożądanych komórkach docelowych, przy czym przeciwciało albo fragment przeciwciała jest związany z dołączonymi cząstkami paramagnetycznymi, bezpośrednio lub przez przeciwciała przeciw Fc, lub .

2) cząstki paramagnetyczne wstępnie pokiytre swoistymi przeciwciałami anty-Fc, korzystnie poliklonalnymi anty-mysimi, albo monoklonalnymi szczurzymi anty-mysimi, albo anty-ludzkimi przeciwciałami, zdolnymi do związania fragmentów Fc przeciwciał wiążących komórki docelowe, oraz swoiste wolne przeciwciała dla komórek docelowych, i/lub

3) inne swoiste przeciwciała albo fragmenty przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom/receptorom wewnątrz albo na pożądanych komórkach docelowych, przy czym przeciwciała albo fragmenty przeciwciał skoniugowane są z biotyną , peroksydazą,, fosaatazą zasadową albo enzymami, albo przeciwciała albo fragmenty przeciwciał związane są z nieparamagnetycznymi cząstkami o specyficznych kolorach albo ze związanymi enzymami takimi jak peroksydaza i fosfataza zasadowa, i/lub

4) urządzenie filtrujące zawierające pudełko zbiorcze filtratu z bolcem/bolcami wiodącymi, z pokrywką, z częścią dla dołączenia podciśnienia, zawierające wiele jednostek wielostudzienkowych z wrębem wiodącym, z filtrem błonowym rozdzielacza komórek oraz podparciem błony odłączalnie umocowanymi na dnie jednostki wielostudzienkowej, przy czym pory w filtrze błonowym korzystnie są regularne i jednorodne pod względem kształtu i rozmiaru, jak w, błonach jednowłókienkowych z nylonu, o rozmiarach porów w zakresie od 10 pm do 75 pm korzystnie 20 pm, oraz

5) cząstki paramagnetyczne albo nieparamagnetyczne wstępnie opłaszczone swoistym antygenem komórek docelowych albo grupą antygenów stanowiące wzorzec.

Sposób immunomagnetycznego wykrywania komórek docelowych w mieszanej populacji komórek i roztworach fizjologicznych zawierających populacje komórek nadaje się do wykrywania, ale może być również zastosowany do pozytywnej izolacji swoistych typów tak normalnych, jak i patologicznych komórek. Sposób wytwarza wiązanie pomiędzy swoistą komórką do celową a nierozpuszczalnym podłożem, takim jak cząstki paramagnetyczne, które składają się z jednego lub dwóch elementów. Cząstka jest albo pokryta przeciwciałami przeciwkomórkowymi pochodzenia mysiego bądź ludzkiego, nakierowanymi przeciwko swoistym determinantom antygenowym na błonach pożądanych komórek docelowych, albo też cząstki pokryte są poliklonalnym przeciwciałem przeciw-mysim albo przeciw-ludzkim, zdolnym do wiązania fragmentów Fc specyficznego przeciwciała przeciwkomórkowego, skierowanego przeciwko determinantom antygenowym w błonach komórek docelowych. Zamiast stosowania poliklonalnego przeciwciała przeciw-mysiego/przeciw-ludzkiego do pokrycia cząstek, można zastosować monoklonalne szczurze przeciwciało przeciwmysie/przeciw-ludzkie. To ostatnie przeciwciało, częściowo z powodu pochodzenia monoklonalnego, może dać bardziej specyficzne wiązanie z przeciwciałem przeciwkomórkowym i zmniejszyć ryzyko możliwej reakcji krzyżowej z innymi komórkami w roztworach, takich jak krew. Co więcej, inkubacja zawiesiny komórkowej z łagodnym detergentem i/lub drugim zestawem przeciwciał albo fragmentów przeciwciał, wstępnie wyznakowanych bądź nie środkami fluorescencyjnymi, metalokfloidami, radioizotopami, kompleksami biotyny albo pewnymi enzymami umożliwiającymi uwidocznienie dramatycznie zwiększy specyficzność metody. Co więcej, według niniejszego wynalazku, sposób może być zasadniczo ulepszony i uproszczony poprzez przeniesienie zawiesiny kompleksów komórek docelowych/cząstek do urządzenia filtrującego komórki albo rozdzielacza komórek według niniejszego wynalazku, a całkowita liczba komórek docelowych widzianych mikroskopowo albo wyhodowanych w fizjologicznej zasadowej

177 483 pożywce hodowlanej może być scharakteryzowana pod względem obecności specyficznych cech biochemicznych i biologicznych.

Na rysunkach:

Figura 1.1 przedstawia rzut perspektywiczny przykładowego wykonania urządzenia filtrującego komórki albo rozdzielacza komórkowego, częściowo zestawionego.

Figura 1.2 przedstawia rzut perspektywiczny innego przykładowego wykonania rozdzielacza komórkowego, częściowo zestawionego.

Figura 2 przedstawia rzut perspektywiczny jednej z wersji studzienek rozdzielacza komórkowego z filtrem błonowym oddzielonym od studzienek.

Figura 4 przedstawia rzut perspektywiczny jednej z wersji naczynia hodowlanego z układem pokrywek dla studzienek rozdzielacza komórkowego i/lub filtra błonowego.

Figura 4a przedstawia widok z boku układu studzienek w naczyniu hodowlanym.

Figura 5 przedstawia rzut perspektywiczny jednej z wersji pudełka zbiorczego filtratu komórkowego.

Figura 6 przedstawia rozterki komórek czerniaka/cząstek uwięzione na urządzeniu filtracyjnym komórek przy zastosowaniu opisanego sposobu.

Poniżej przedstawiono bardziej szczegółowy opis sposobu, przy zastosowaniu komórek raka jako komórek docelowych dla wykrywania i możliwej izolacji. Sposób jednakże nie jest ograniczony do komórek raka, a opis nie ograniczy sposobu do tej szczególnej dziedziny użytku, albowiem sposób jest użyteczny w dużym zakresie obszarów badań cytologicznych.

W leczeniu pacjentów z nowotworami, ocena stopnia zaawansowania choroby na podstawie tego, czy jest ona lokalna czy też doszło do uogólnienia na drodze przerzutów do innych tkanek ma kluczowe znacznie dla doboru alternatywy terapeutycznej dla poszczególnych pacjentów. Komórki nowotworu złośliwego rozprzestrzeniają się drogą bezpośredniej inwazji otaczającej tkanki, poprzez naczynia limfatyczne albo przenoszenie komórek nowotworu przez krew do odległych narządów, w tym do szpiku kostnego oraz ośrodkowego układu nerwowego i płynu mózgowo-rdzeniowego.

Wykrywanie komórek przerzutowych nowotworu opierało się aż do niedawna na metodach morfologicznych przy użyciu mikroskopii świetlnej i elektronowej na bioptatach nowotworu, na rozmazach szpiku kostnego i krwi obwodowej oraz preparatach przygotowanych po wirowaniu cytologicznym różnych płynów ustrojowych. Od chwili pojawienia się przeciwciał monoklonalnych, rozpoznających antygeny ekspresjonowane przede wszystkim na powierzchni różnych typów komórek nowotworowych, rozpoznawanie komórek nowotworów obejmowało, w coraz większym stopniu, także immunocytochemię i immunofluorescencję. A zatem, preparaty przygotowane z bioptatów nowotworów albo z wirowania cytologicznego poddawano działaniu przeciwciał monoklonalnych, a związanie tych z komórkami nowotworu uwidaczniano kolorymetrycznie albo fluorescencją. Ta druga metoda wymaga zastosowania mikroskopu fluorescencyjnego, alternatywnie przygotowania zawiesiny komórkowej i zastosowania cytometru przepływowego.

Wadą poprzednich sposobów jest ograniczona czułość i specyficzność i zwykle są pracochłonne i czasochłonne, wymagając ponadto dużego stopnia biegłości. Badania cytometrią przepływową wymagają również drogiego wyposażenia.

Metody morfologiczne wykrywania komórek nowotworowych we krwi i szpiku kostnym są znacznie mniej czułe niż metody wykorzystujące immunocytochemię i immunofluorescencję. Te metody są jednak również nieodpowiednie w przypadkach, gdy komórki nowotworu stanowią mniej niż 1% całkowitej liczby komórek jądrzastych. Cytometria przepływowa może zapewnić lepszą czułość niż sposoby wykorzystujące zastosowanie mikroskopu, ale wymaga dostępności dużej liczby komórek, a ponadto sprawia kilka trudności technicznych. I tak, agregacja komórek może spowodować problemy, a metoda ta nie zapewnia możliwości odróżnienia wyznakowanej komórki nowotworowej i nieswoiście fluoryzującej komórki normalnej.

177 483

Wynalazek pozwala na bardzo czułe wykrywanie na przykład komórek nowotworów przerzutowych, albowiem duże objętości i wysokie liczby komórek można łatwo przeglądać pod mikroskopem, a dołączone perełki magnetyczne są łatwo rozpoznawalne. Opisany sposób i urządzenie zapewniają solidne wsparcie i stały zapis, który łatwo daje się przeglądać pod mikroskopem, umożliwia oszacowanie oraz ilościową ocenę całej próbki, a nie tylko małych jej części oraz umożliwia zastosowanie dużych objętości boαlizowboaj próbki, ponadto urządzenie może być skanowane automatycznie dzięki konwencjonalnej technice densetomatcecznej. Stosowane przeciwciała monoklonalna wiążą się z wystarczającą swoistością do, na przykład, komórek nowotworowych, a nie do komórek innych niż komórki docelowe w mieszanych zawiesinach komórek, takich jak krew, szpik kostny i inne umiejscowienia nowotworów, tak że wszystkie komórki z doczepionymi kuleczkami przedstawiają sobą komórki docelowe. Dodatkowo, procedura jest szybka i prosta i może być przeprowadzona przez każdego badacza z dostępem do tradycyjnego mikroskopu.

Nowy sposób obejmuje związanie przeciwciał mono^o^lnych, np. pochodzenia mysiego bądź ludzkiego, które swoiście rozpoznają antygeny obecne na komórkach nowotworowych, a nie na komórkach normalnych, albo, dla innych celów, na swoistych subpopulacjach komórek normalnych, z cząstkami paramagnetycznymi, czy to bezpośrednio albo do perełek pokrytych najpierw przeciwciałami rozpoznającymi swoiście odpowiednie przeciwciała, czyli fragment Fc przeciwciał IgG, które wiążą się z komórkami nowotworowymi. Przeciwciała wiążące się z komórkami mogą być typu IgG albo IgM albo stanowić fragment ab IgG lub IgM. Przykładami zastosowanych przeciwciał przeciw komórkom docelowym mogą być te skierowane przeciwko grupom determinant antygenowych, na przykład antygenowi CD56/NCAM (MOC-1), antygenowi nabłonkowemu Cluster2 (MOC31), antygenowi Cluster 2 (c.c. - 40 kD) (NrLuIO) (Myklebust i in., Br. J. Cbocer Suppl. 63, 49-53, 1991), wesokocząsteczkowemu antygenowi skojarzonemu z czecoibkiam (HMW-malboomaαssociated antygen) (9.2, 27) (Morgan i in., Hebridoma, 1, 2736, 1981),, 80 kD, antygenowi skojarzonemu z mięsakiem (Tp1 & TP3) (Cancer Res. 48, 5302-5309, 1988), antygenowi mucynowemu (Diel i in., Bcabst Cancer Res, Treatm., 1991) albo antygenowi receptora dla EGF (425.3) (Merck), obok przeciwciała anti-pao-humbo (Bruland i in., nie publikowane), które jest dogodne do wykrywania komórek ludzkich wśród komórek zwierzęcych. Przeciwciało 425.3 skierowane jest przeciwko antygenom komórek tak normalnych, jak i nowotworowych. Przeciwciała mogą ponadto być skierowane przeciwko receptorom czynników wzrostowych, na przykład receptorowi dla EGF, receptorowi dla PDGF (A i B), receptorowi insuliny, receptorowi czeooikb insulino-podobnego. receptorowi dla trboseeryny, receptorom dla NGF i FGF, grupie integryn, innym błonowym cząsteczkowym adhezyjnym oraz białkom MDR tak w normalnych jak i nienormalnych komórkach, a także antygenom obecnym w subpopulacjach komórek normalnych, w dodatku do produktów ookoganów, ekspresjonowanych na błonach normalnych i nowotworowych komórek i wyłącznie na komórkach nowotworowych, na przykład Neu/erb B2/HER2. Jeśli chodzi o komórkach nowotworowe, mogą być to komórki raków sutka, jajnika i płuc, czerniaka, mięsaka, glejaka wielopostbciowago, komórek nowotworowych z przewodu pokarmowego i układu sibteczkowo-śródbłonkowago, albo też komórki docelowe mogą być skojarzone z chorobami nienowotworowymi, takimi jak choroby układu sercowonaczyniowego, neurologiczne, płuc, autoimmunologiczne, przewodu pokarmowego, układu moczowo-płciowego, siateczko wo-śródbłonkowego i inne. Co więcej, populacja komórek nowotworowych może być umiejscowiona w szpiku kostnym, krwi obwodowej, może pochodzić z wysięku do opłucnej lub otrzewnej oraz innych przedziałów płynów ustrojowych, takich jak mocz, płyn mózgowo-rdzeniowy, nasienie, członka albo z twardych guzów w normalnych tkankach i narządach, na przykład wątrobie, węzłach chłonnych, śledzionie, płucach, trzustce, tkance kostnej, ośrodkowym układzie nerwowym, gruczole krokowym, skórze i błonach śluzowych. Pełniejsza lista daterminbot antygenowych i odpowiednich

177 483 przeciwciał albo fragmentów przeciwciał stosowanych w niniejszym ulepszonym sposobie przedstawiona jest w tabeli 1 (patrz dodatek).

Metodologia

Sposób polega na dołączeniu przeciwciał bezpośrednio do cząstek paramagnetycznych, albo też dołączenie może zachodzić poprzez dołączenie do powierzchniowo związanych przeciwciał, takich jak poliklonalne przeciwciała przeciw-mysie, monoklonalne szczurze przeciwciała anty-mysie albo monoklonalne przeciwciała anty-ludzkie, swoiście rozpoznające fragment Fc wspomnianych pojedynczych przeciwciał. Pokryte przeciwciałami perełek paramagnetycznych miesza się następnie z zawiesiną badanych komórek i inkubuje przez 510 min. do 2 godz., korzystnie przez 30 min. w 0-25°Ć, korzystnie w 4°C, delikatnie wstrząsając. Niniejszy sposób można również przeprowadzić w zmienionej kolejności etapów, tak że wolne przeciwciała dla komórek, docelowych dodaje się do zawiesiny komórek, inkubuje przez 5-10 min. do 2 godz., korzystnie przez 30 min w 0-20°C, korzystnie w 4°C, delikatnie wstrząsając. Cząstki paramagnetyczne, wstępnie pokryte przeciwciałami przeciw-mysimi albo przeciw-ludzkimi dodaje się następnie do inkubowanej zawiesiny komórek, jak opisano powyżej, mieszaninę wynikową poddaje się dalszej inkubacji przez 510 min. do 2 godz., korzystnie przez 30 min w 0-25°C, korzystnie w 4°C, delikatnie wstrząsając. Niniejszy sposób można również przeprowadzić przy zmniejszonej liczbie etapów, tak że wolne przeciwciała dla komórek docelowych dodaje się do zawiesiny komórek w tym samym czasie i wraz ze wstępnie pokrytymi cząstkami paramagnetycznymi i poddaje inkubacji przez 5-10 min. do 2 godz., korzystnie przez 30 min w 0-25°C, delikatnie wstrząsając. Liczba pokrytych przeciwciałami perełek dodawanych do zawiesiny komórek powinna wynosić 0.5-10 razy liczba komórek docelowych. Gdy liczba ta jest nieznana, liczba dodawanych pokrytych perełek powinna wynosić 1-10% całkowitej liczby komórek. Dla celów specjalnych i w przypadkach, gdzie gęstość komórek docelowych jest niska, na przykład w przypadku komórek nowotworowych, albo też komórki docelowe stanowią bardzo niewielką część całkowitej liczby komórek (około 1%), komórki docelowe można pozytywnie oddzielić od komórek niedocelowych w polu magnetycznym. Izolowane komórki docelowe w zawiesinie komórkowej można następnie przenieść do urządzenia liczącego komórki, a liczbę komórek z doczepionymi kuleczkami można ustalić pod mikroskopem. Niniejszy sposób można, i zaleca się, również przeprowadzić przenosząc zawiesinę izolowanych komórek docelowych do urządzenia filtrującego komórki opisanego w niniejszym opisie patentowym, a całkowitą liczbę izolowanych komórek docelowych obejrzeć pod mikroskopem. Izolowane komórki docelowe w urządzeniu filtrującym można utrwalić i zabarwić dla ułatwienia oglądu w mikroskopie świetlnym, dla celów specjalnych i w przypadkach, gdy wymaga się, by izolowane komórki docelowe były funkcjonalnie aktywne, do urządzenia filtrującego komórki można dodać fizjologicznie uzasadowioną pożywkę hodowlaną i poddać je inkubować przez czas nieokreślony w 37°C. Izolowane komórki docelowe mogą wzrastać, a następnie można je scharakteryzować na obecność specyficznych cech biochemicznych i biologicznych. Szczególnie ważne będzie zastosowanie takich komórek do badań biologii molekularnej. W przeciwieństwie do cytowanych powyżej metod znanych ze stanu techniki, niniejszy sposób umożliwia badanie i hodowlę komórek docelowych bez przeprowadzania rozszczepiania związania paramagnetycznych cząstek z komórek docelowych. Dla kilku celów interesujące jest zbadanie specyficznych genów w czystej populacji komórek docelowych na poziomie DNA, mRNA i białka, tak w bioptatach z nowotworów, jak również w komórkach nowotworowych obecnych we krwi, szpiku kostnym i innych płynach ustrojowych, na przykład w moczu, płynie mózgowo-rdzeniowych, nasieniu, chłonce, albo w innych poza tym normalnych tkankach i narządach, na przykład w wątrobie węzłach chłonnych, śledzionie, płucach, trzustce, tkance kostnej, ośrodkowym układzie nerwowym, gruczole krokowym, skórze i błonach śluzowych, a także w innych obszarach aktywności badawczej w dziedzinie cytologii. W sposobach znanych ze stanu techniki, sygnały uzyskiwane w Southern Northern i Western błotach odpowiadają komórkom normalnym, jak również komórkom nowotworowym w bioptacie. Jeśli przygotuje się najpierw zawiesinę pojedynczych komórek z

177 483 materiału z guza, a komórki nowotworowe następnie pozytywnie wykryje się immunomagnetycznie i oddzieli, wszelkie badania genetyczne przeprowadzone na tym materiale będą reprezentować jedynie komórki docelowe. Dotyczy to także na przykład komórek nowotworowych obecnych w tkankach ssaków, na przykład w szpiku kostnym, obwodowej krwi, wysiękach opłucnowych i otrzewnych oraz w innych płynach ustrojowych, na przykład w moczu, płynie mózgowo-rdzeniowych, nasieniu i chłonce. Badania wykorzystujące metodologię reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) również zwiększą swoją specyficzność i wiarygodność, gdy przeprowadzi się je na czystych populacjach komórek nowotworowych, uzyskanych według nowego sposobu.

Zastosowanie etapów nowego sposobu może różnić się w zależności od typu badanych tkanej.

a) Tkankę z twardej bądź igłowej biopsji guza przygotowuje się mechanicznie albo z łagodnym trawieniem enzymatycznym aż do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek, do której to dodaje się pierwotne, swoiste przeciwciała albo fragmenty przeciwciał bezpośrednio, albo po przepłukaniu zawiesiny komórek roztworem soli w buforze fosforanowym albo pożywce hodowlanej z bądź bez surowicy, takiej jak surowica płodowa bydlęca, surowica bydlęca, końska, świńska, kozia bądź ludzka.

b) Jeżeli materiał jest próbką wysięku z opłucnej albo z wodobrzusza, płynu mózgowordzeniowego, moczu, chłonki albo płynów ustrojowych takich jak wysięki stawowe u pacjentów z różnymi postaciami zapalenia stawów, swoiste przeciwciała albo fragmenty przeciwciał dodaje się albo bezpośrednio do próbek albo po odwirowaniu z bądź bez płukania przed lub po odwirowaniu komórek w próbkach i przywróceniu ich do zawiesiny.

c) Jeżeli materiał składa się z krwi albo aspiratu szpiku kostnego, specyficzne przeciwciała bądź fragmenty przeciwciał albo dodaje się bezpośrednio do próbek, albo po odwirowaniu z bądź bez płukań przed lub po odwirowaniu komórek w próbkach i przywróceniu ich do zawiesiny, albo też przed płukaniem, ponownym zawieszeniem i dodaniem odpowiednich przeciwciał albo fragmentów przeciwciał, można przygotować frakcję komórek jednojądrzastych poprzez wirowanie w gradiencie na np. Lymphoprepie.

Warunki procedur dla a) i b) ustala się, jak to przykładowo pokazano w wynikach uzyskanych w udanych doświadczeniach takich, jak te opisane poniżej.

Dla c), wyniki okazały się być pod wpływem dużej liczby czynników, które zbadano szczegółowo. Wśród nich są stężenie przeciwciała, stosunek liczby cząstek paramagenetyka do liczby komórek, czas i objętość inkubacji, typ pożywki inkubacyjnej oraz poziom pH. Stosunek komórek jednojądrzastych we wszystkich doświadczeniach powinien być w zakresie 0,5/1 - 2/1, zależnie od powinowactwa wiązania pierwszorzędowych specyficznych przeciwciał albo fragmentów.

Poważnym problemem było niespecyficzne wiązanie do komórek normalnej krwi albo szpiku kostnego cząstek pokrytych przeciwciałami owczymi albo szczurzymi antymysimi samymi albo z dodatkiem przeciwciał swoistych. Doświadczenia wykazały, iż nieswoiste wiązanie jest równie wysokie bez obecności przeciwciał swoistych, co wskazuje, iż problem nie jest spowodowany przez krzyżową reakcję przeciwciał celowanych z komórkami zdrowymi. Możliwość, iż swoistość mniejsza od optymalnej była spowodowana przez wiązanie jonowe wykluczono. Inną możliwością było, iż subpopulacje komórek z linii B mogły przylegać do kompleksów pokrytych cząstkami. Jednakże immunomagnetyczne usunięcie komórek B z zawiesiny komórkowej przed dodaniem kompleksów swoistych przeciwciał z cząstkami pokrytymi przeciwciałami nie polepszyło jego swoistości.

Problem w procedurze stosowanej na izolowanych frakcjach jednojądrzastych szpiku kostnego i krwi obwodowej, polegający na tym, ze pewne komórki niedocelowe mogły również związać cząstki paramagnetyczne, został pokonany lub ominięty. I tak dla cząstek pokrytych owczymi przeciwciałami anty-mysimi samych albo ze swoistymi przeciwciałami, liczba cząstek nieswoiście związanych z niską frakcją jednojądrzastą komórek krwi albo szpiku kostnego zmniejszyła się od średnio 10 do około 1, a równolegle frakcja komórek normalnych z cząstkami zmniejszyła się z 1-2% do 0,5-1% albo mniej.

177 483

Otrzymano dowody, iż problem może być spowodowany przez siły hydrofobowe związane z przeciwciałami związanymi z cząstkami paramagnetycznymi. Sposoby zmniejszenia tej hydrefoboweści zostaną zatem zastrzeżone. Jednym z takich sposobów jest wstępna inkubacja cząstek pokrytych przeciwciałami i zawiesiny komórek z łagodnymi detergentami w odpowiednich stężeniach, na przykład Tween 20™ w stężeniach mniejszych niż 0,1% przez 30 minut w 4°C. Gdy zagwarantuje się możliwy dobór komórek docelowych, zawiesina komórek powinna zawierać niskie stężenie detergentu, np. 0,01% Tween 20™. W kilku doświadczeniach procedura ta niemal wyeliminowała albo dramatycznie zmnieszyła problem nieswoistego wiązania, widzimy we frakcjach komórek jednojądrzastych z krwi bądź szpiku kostnego.

Inne ulepszenie które, jeśli będzie uzasadnione, można zastosować wraz z detergentem przebiega jak następuje: Po inkubacji zawiesiny komórkowej z pierwotnymi przeciwciałami albo fragmentami przeciwciał oraz pokrytymi przeciwciałami cząstkami paramagnetycznymi, jak opisano uprzednio, zawiesinę komórek inkubuje się z drugim zestawem przeciwciał albo fragmentów przeciwciał, skierowanych przeciwko innym zewnątrzkomórkowym albo przeciwko wewnątrzkomórkowym determinantom komórek docelowych, z bądź bez wstępnej obróbki utrwalaczami komórek, takimi jak formaldehyd albo alkohole. Przeciwciała te albo ich fragmenty powinny być wstępnie wyznakowane środkami fluorescencyjnymi, metalokoloidami, radioizotopami, kompleksami biotyny albo enzymami takimi jak peroksydaza i fosfataza zasadowa, co umożliwi wizualizację per se znanymi sposobami za pomocą mikroskopu i/lub odpowiedniego urządzenia liczącego.

Komórki docelowe będą uwidocznione i dzięki tej drugiej metodzie i dzięki posiadaniu związanych na swej powierzchni cząstek, i w ten sposób będzie można je policzyć.

Dla uproszczenia odróżnienia pomiędzy komórkami docelowymi i niedocelowymi, zawiesinę komórkową, albo jej część, można przed drugim etapem uwidaczniania albo poddać wirowaniu cytospinowemu albo części mieszaniny nałożyć na pokryte szkiełka podstawowe, na których komórki ze związanymi cząstkami rozłożoną się w postaci cienkiej warstwy, ułatwiając rozpoznanie podwójnie „zabarwionych” komórek.

Alternatywny sposób według niniejszego wynalazku dla dalszego uproszczenia odróżniania komórek docelowych i niedecelowych wykorzystuje urządzenie filtrujące, komórki, w którym cała zawiesina komórek po etapach selekcji komórek docelowych, może być dodana bezpośrednio do urządzenia filtrującego komórki. Wolne, nie związane perełki, nieswoiście związane komórki niedocelowe oraz wszelkie niezwiązane komórki niedocelowe przejdą przez filtr, pozostawiając związane komórki docelowe dla uwidocznienia na filtrze. Filtr z izolowanymi komórkami docelowymi może być usunięty z urządzenia, a komórki mogą zostać utrwalone i zabarwione przy zastosowaniu znanych metod immunocytochemicznych i uwidocznione w mikroskopie. Po usunięciu filtra z urządzenia może być on poddany obróbce tak jak tradycyjny preparat mikroskopowy typu, który jest znany i zwykle używany w immunocytochemii.

Dla celów specjalnych filtr może być albo usunięty z urządzenia albo pozostać połączony z urządzeniem, a pożywka hodowlana, tak jak znana pożywka hodowlana z bądź bez agarozy, dodana dla celów rozmnożenia izolowanych komórek docelowych umiejscowionych na filtrze.

Zestawy do zastosowania w nowej procedurze będą zawierać na przykład wstępnie pokryte cząstki paramagnetyczne przygotowane dla każdego przeciwciała mdndkldnalnego. W innym przykładowym wykonaniu, zestawy zawierają cząstki paramagnetyczne wstępnie pokryte specyficznym przeciwciałem anty-mysim albo anty-ludzkim o izotopie IgG jako ich część, a różne, skojarzone z komórkami docelowymi, na przykład komórkami nowotworowymi, przeciwciała jako inną część. W trzecim przykładowym wykonaniu, zestaw zawiera cząstki paramagnetyczne wstępnie pokryte specyficznymi przeciwciałami anty-Fc, takimi jak poliklonalne anty-mysie albo mdnoklonalne szczurze anty-mysie, albo anty-mysie, albo anty-ludzkie przeciwciała, zdolne do związania fragmentu Fc przeciwciał wiążących komórki docelowe, związane ze swoistymi przeciwciałami przeciw komórkom docelowym.

177 483

W czwartym przykładowym hykaocolu zestawy zawierają oddzielne cząstki paramagnetyczne albo o naturze niemagnetycznej, które mogą być pokryte albo nie pokryte antygenem komórek docelowych albo grupą antygenów komórek docelowych, tak że w czasie obróbki według tego sposobu, cząstki te zostają uwięzione w urządzeniu filtrującym komórki, tym samym działając jako kontrola h wykazywaniu na przykład,, iż wszystkie aspekty lnteraajl przeaiwalcło-antzgen działają w sposobie poprawnie. Cząstki te mogą być dołączone do zawiesiny komórkowej na etapie przed albo w czasie sposobu, albo też cząstki mogą być zastosowane jako oddzielne „zawiesiny komórkowe” do obróbki przy zastosowaniu tego samego sposobu, co zawiesina komórkowa, zawierająca oddzielane komórki docelowe. W dalszym przykładowym wykonaniu zestaw zawiera Iooó specyficzne przeciwciała albo fragmenty przeciwciał skierowane przeciwko antygenom/receptorom wewnątrz albo na pożądanych komórkach docelowych, przy czym wspomniane przeciwciała albo fragmenty przeciwciał są skoniugowanó z pórokszdczą_> fosfatazą zasadową albo innymi enzymami, wraz z odpowiednimi substratami dla takich enzymów i wspomniane przeciwciało albo fragment przeciwciała wiąże się z niópcramagnótzaznzmi cząstkami o specyficznych kolorach albo ze związanymi enzymami takimi jak peroósydcza i fosfataza zasadowa.

Urządzenie

Nowa cecha wynalazku dotyczy urządzenia do filtracji komórek, które można określać jako wielostudzienkowy rozdzielacz komórkowy i które może być albo nie być częścią opisanego zestawu. Urządzenie zawiera układ mikrostudzióoóowógo rozdzielacza komórkohóga, który wykorzystywany jest do oddzielenia mieszanych populacji komórek o różnych wymiarach, takich jak te znajdowane we krwi albo szpiku kostnym. Uzyskane komórki można oglądać bezpośrednio na błonie pod mikroskopem albo zautomatyzowanym urządzeniem skanującym. Wynalazek może być zastosowany w połączeniu z konwencjonalymi technikami izolacji komórek przy pomocy cząstek magnetycznych dla zapewnienia szybkiego, czułego i prostego sposobu przyglądania dużych ilości próbek o dużej bądź małej objętości w poszukiwaniu obecności komórek nowotworowych w ciągu 1 do 4 godzin.

Według niniejszego wynalazku zapewnia się układ miórosaudzieoóowógo rozdzielacza komórek, obejmujący otwarte pudełko zbiorcze filtratu z przykrywką, które może mieć albo nie mieć podłączenia do rury próżniowej i ma usuwalny i wyjmowany układ wielu studzienek z filtrem błony rozdzielającej komórki, tkóy sanoowi tych wśelu studzśenek ,

Pokrywa bądź przykrywka dla tego układu może również być zapewniona. Pudełko zbiorcze filtratu i układ przykrywki mogą być wykonane z materiału dogodnego do sterzzlizaji \cysoóotómpóraturwcej albo mogą być hykoncoó z tworzywa sztucznego przezroczystego albo nieprzezroczystego takiego jaó znane ze stanu techniki thorzysa do hodowli tkaokowzah.

Filtr błonowy rozdzielający komórki może zawierać regularne i jednorodne pod względem kształtu i rozmiarów pory, takie jak znajdowane w błonach jednowłóklenóohzch z nylonu, które stanowią podstawę pojedynczych studzienek. Filtr błonowy rozdzielający komórki może być przymocowany do mlórostudziónek taó, że może być on usunięty po sposobie rozdzielenia komórek w celu ułatwienia badania. Błona rozdzielająca komórki może również zacierać kartonową albo plastykową ramę otaczającą dla ułatwienia badania po usunięciu z miórostudzienek.

Pudełko zbiorcze filtru może zawierać ramę, do której mogą być włożone usuwalne paski z więcej niż jedną studzienką.

Pudełko zbiorcze filtratu może mieć postać podobną do tradycyjnej płyty 96studzienkohej, przystosowanej do przyjęcia błony rozdzielającej komórki, pudełka zbiorczego oraz dołączenia próżni nlskoalśolóniaheS.

Wynalazek może również zacierać górną pokrywkę albo przykrywę.

W urządzeniu zapewnia się usuhalne naczynie hodowlane z przykrywką. które umożliwia wsunięcie pasków z mlkrastuazióokcml i αsóptyazoa hodowlę. Częścią naczynia hodowlanego są nacięcia albo wręby, które ułatwiają umieszczenie paska mikaastudzlenóó

177 483 podobnego do tego z pudełka zbiorczego filtratu oraz zapobiegają ruchowi paska z mikrostudzienkami w czasie hodowli. Wycięcia albo wręby jak opisano mogą zapewniać lub nie położenie błony rozdzielającej komórki po usunięciu z paska mikrostudzienek.

Wynalazek zostanie wyjaśniony w następującym opisie w odniesieniu do rysunków towarzyszących, które przedstawiają jedynie w charakterze przykładu, jedną z postaci układu mikrostudzienkowego rozdzielacza komórek, stanowiącego przykładowe jego wykonanie.

Odnosząc się do fig. 1 do 5, widać na nich, iż układ Mikrostudzienkowego Rozdzielacza Komórek 20 składa się z pokrywy albo przykrywki 21 i pudełka zbiorczego filtratu 22, które mogą mieć lub nie mieć złącza dla dołączenia próżni niskociśnieniowej 23, z usuwalnymi paskami wielostudzienkowymi 24, które mają odłączalną podstawę błonową 25 z podparciem 25a.

Figury 1.1. i 1.2 przedstawiają dwa alternatywne przykładowe wykonania wynalazku częściowo zestawionego.

Pudełko zbiorcze filtratu 22 może być podobne pod pewnymi względami do konwencjonalnych formatów płyty 96-studzienkowej z usuwalnymi paskami studzienek i może być ustawione tak, by pasowało do jednego bądź wielu pasków studzienek.

Studzienek 24 mogąbyć umieszczone na podwójnych paskach, jak przedstawiono albo w pojedynczych bądź wielu paskach.

Umiejscowienie studzienek 24 w pudełku zbiorczym filtratu 22 jest takie, iż możliwa jest tylko jedna orientacją co można zapewnić dzięki umieszczeniu bolców 28 albo wrębów 29.

Filtr błonowy rozdzielający komórki 25 przymocowany jest do dna studzienek 24 i stanowi podstawę tych studzienek. Umocowane filtra błonowego 25 do studzienek 24 jest takie, iż mogą one być oddzielone bez odkształcenia filtra błonowego 25 albo podparcia filtra błonowego 25 a.

Filtr błonowy 25 można oglądać pod mikroskopem albo można skanować go metodą densytometryczną albo podobną.

Filtr błonowy 25 może zawierać pory regularne i jednorodne pod względem kształtu i rozmiaru, takie jak znajdowane w błonach jednowłókienkowych z nylonu, co może być także dogodne dla oglądu w tradycyjnych maszynach skanujących bądź odczytujących płyty 96studzienkowe.

Naczynie hodowlane 26 oraz przykrywka naczynia hodowlanego 27 mogą być również wykonane z materiału nadającego się do celów hodowli tkankowych. W ten sposób możliwe jest podanie pożywki hodowlanej tak od góry wielu studzienek, jak i od dołu naczynia hodowlanego 26.

Wszystkie wymiary przedstawione na rysunkach są przykładowe, a urządzenie filtrujące komórki 20 nie powinno być ograniczone tymi wymiarami. Co więcej, należy zauważyć iż w zamierzeniu wynalazek nie jest ograniczony tylko do powyższego przykładu, gdyż możliwe są różne odmiany bez opuszczenia jego zakresu. Niniejszy sposób będzie następnie przedstawiony w doświadczeniach modelowanych, przykładach użyteczności nowego sposobu oraz przykładach praktycznych zastosowań. Przykłady te nie będą rozpatrywane jako ograniczające w jakikolwiek sposób wynalazek.

Doświadczenia modelowe

1. Wiązanie kompleksów kuleczka-przeciwcialo z liniami komórek nowotworowych. W celu określenia stężeń przeciwciał i optymalnych warunków wiązania kompleksów przeciwciało-cząstka paramagnetyczna z komórkami nowotworowymi, zastosowano szeroko zakres linii komórek raka. Perełki paramagnetyczne związano z komórkami, czy to poprzez pokrycie specyficznymi przeciwciałami cząstek paramagnetyka pokrytych owczymi przeciwciałami anty-mysimi (Sheep-Anti-Mouse, SAMZ), czy to przez wstępną inkubację komórek ze specyficznymi przeciwciałami, płukanie, po którym następowała druga inkubacja z cząstkami pokrytymi SAM. Wyniki tych doświadczeń podano w tabelach 2a i 2b (patrz Dodatek), w których + oznacza związanie kilku perełek ze wszystkimi komórkami, (+) oznacza albo niewielką liczbę perełek związanych z każdą komórką albo że nie wszystkie komórki nowotworowe miały perełki związane ze swoją powierzchnią co odzwierciedla brak wiązania, zaś (-) oznacza bardzo słabe wiązanie.

177 483

2. Wykrywanie komórek nowotworowych we frakcji jednojądrzastej szpiku kostnego albo krwi obwodowej. Przeprowadzono modelowe doświadczenia, w których swoiste przeciwciała oraz cząstki paramagnetyczne pokryte przeciwciałami SAM dodano albo do takich komórek jednojądrzastych albo do zawiesiny komórek, do której do wspomnianych komórek jednojądrzastych dodano różne liczby komórek raka z hodowanych in vitro linii komórkowych. W niektórych doświadczeniach albo komórki jednojądrzaste albo komórki nowotworowe wstępnie zabarwiono barwnikiem fluorescencyjnym tak, by móc odróżnić te dwa typy komórek. We wszystkich doświadczenaich, nie wiążące przeciwciała pierwotne i/lub perełki pokryte przeciwciałami owczymi anty-mysimi zastosowano oddzielne jako kontrolę. Przeprowadzono dodatkowe doświadczenia bez przygotowania frakcji komórek jednojądrzastych. Stwierdzono, iż oddzielenie komórek w ten sposób zmniejszyło ilość nieswoistego wiązania w porównaniu z frakcjami krwi rozdzielonymi metodą Lymphoprep.

3. oddzielenie i uwidocznienie kompleksów perełka-przeciwciało na liniach komórek nowotworowych przy zastosowaniu urządzenia filtrującego komórki. Zawiesiny komórek nowotworowych oraz komórki nowotworowe wyznakowane fluorescencyjnie zmieszane z zawiesinami krwi bądź szpiku kostnego przygotowano i poddano obróbce takiej jak opisana w doświadczeniach modelowych 1 i 2, po czym poddano działaniu urządzenia filtrującego komórki. Po wypłukaniu, utrwaleniu i zabarwieniu komórek na filtrze w urządzeniu, filtr obejrzano pod mikroskopem. Wyniki z zawiesiny samych komórek nowotworowych wykazały kompleksy przeciwciało-perełka-komórka nowotworowa wyraźnie wyizolowane na filtrze, wyniki z zawiesiny komórek nowotworowych znakowanych fluorescencyjnie wraz z krwią bądź szpikiem kostnym również wykazały kompleksy przeciwciało-perełka-komórka nowotworowa wyraźnie wyizolowane na filtrze (fig. 6). Dodatkowe doświadczenia w celu sprawdzenia czułości metody wykazały iż 100 komórek nowotworowych, gdy zmiesza się je z zawiesiną 10⁷ komórek krwi bądź szpiku kostnego, dawało się wykryć przy zastosowaniu tego sposobu.

4. Wzrost oddzielonych komórek wyizolowanych przy zastosowaniu urządzenia filtrującego komórki. Zawiesiny komórek nowotworowych poddane obróbce i wyizolowane jak opisano w doświadczeniach modelowych 1 i 2, poddano działaniu urządzenia filtrującego, a filtr następnie inkubowano w półpłynnej pożywce, zawierającej 0,3% agarozy w pożywce hodowlanej zawierającej 20% surowicy cielęcej. Komórki inkubowano w atmosferze 5% CO₂ w 37°C. Komórki nowotworowe wykazały zdolność do podziału i wzrostu.

W kilku doświadczeniach obserwowano pewne nieswoiste wiązanie z komórkami jednojądrzastymi, co, jak stwierdzono, związane było z naturą swoistego przeciwciała, i co było równie silnie zaznaczone dla samych cząstek pokrytych SAM. Wielkość niespecyficznego wiązania wahała się od prawie 0% do poziomu pomiędzy 0,5-2%. To nieswoiste wiązanie zostało niemal całkowicie wyeliminowane poprzez łagodną obróbkę detergentem, (Tween20™), przeprowadzoną. dla zmniejszenia problemu hydrofobowych oddziaływań komórkowych.

Przykłady użyteczności precedury

1. Wykrywanie choroby nowotworowej z mikroprzerzutami we krwi i szpiku kostnym. Wczesna i wiarygodna diagnoza rozprzestrzenienia się komórek raka do krwi i/lub szpiku kostnego nabrała znaczenia dla wyboru optymalnej terapii, być może dającej wyleczenie w wielu typach nowotworu, w tym w rakach, jak opisano w przykładzie zastosowania 1. Podobne procedury dla czerniaka złośliwego, mięsaka, neuroblastoma i kilku innych nowotworów opracowano lub pracuje się nad nimi.

2. Wykrywanie komórek nowotworowych w wysiękach opłucnowych, z wodobrzusza i w moczu., Natura wysięków może przedstawiać poważny problem diagnostyczny, zwłaszcza gdy niewielka liczba komórek nowotworowych obecna jest razem z normalnymi komórkami reaktywnymi bądź nabłonkowymi. W kilku przypadkach definitywną diagnozę wykonano bardzo szybko dzięki nowemu sposobowi, w przypadkach, gdy konwencjonalne badanie cytologiczne okazało się być negatywne bądź nie dało rezultatu. Podobną korzyść można odnieść w nowotworach nerek albo przewodu moczowego i pęcherza.

177 483

3. Wykrywanie komórek nowotworowych w płynie mózgowo-rdzeniowych.. Jako iż układowe leczenie wielu typów nowotworów uległo poprawie, częstość przypadków z objawowymi przerzutami do mózgu znacznie wzrosła, a równolegle konieczność wczesnego wykrywania takiego rozprzestrzeniania się. Przy zastosowaniu nowej procedury nawet niewielka liczba komórek nowotworowych może być łatwo zidentyfikowana, umożliwiając interwencję z terapeutycznymi alternatywami na wczesnym etapie wewnątrzczaszkowej manifestacji nowotworu.

4. Diagnoza nowotworu w bioptacie tkankowym.. Gdy podejrzewa się nowotwór i uzyska się biopsje tkankowe poprzez procedurę chirurgiczną albo np. biopsję igłową, dzięki nowemu sposobowi,, gdy zastosuje się go na przygotowanych zawiesinach komórek, można poczynić o wiele prostszą i szybszą, diagnozę w porównaniu z konwencjonalnymi procedurami morfologicznymi albo immunohistochemicznymi albo cytochemicznymi. Odróżnienie pomiędzy kilkoma alternatywnymi nowotworami można przeprowadzić przy zastosowaniu odpowiednich przeciwciał.

5. Identyfikacja wskaźników rokowniczych. Jako iż ekspresja kilku cząsteczek błonowych, jak wykazano, koreluje z postępem choroby nowotworowej w kilku nowotworach złośliwych, niniejszy sposób można zastosować do identyfikacji wskaźników rokowniczych, na przykład opisanych w przykładzie zastosowania 2.

6. Identyfikacja komórek wskazujących na specyficzne choroby bądź na postęp albo stan choroby. W różnych typach chorób reumatoidalnych (takich jak reumatoidalne zapalenia stawów), jak również w chorobach alergicznych, autoimmunologicznych oraz sercowonaczyniowych, identyfikacja układowej bądź lokalnej obecności specyficznych subpopulacji komórek jest ważna dla diagnozy i dla określenia stopnia zaawansowania choroby. Szybkie wykrywanie takich populacji komórkowych w nowym sposobie ma dlatego znaczną wagę diagnostyczną i terapeutyczną.

7. Wykrywanie subpopulacji normalnych komórek.. Dla kilku celów ważne będzie wykrycie frakcji szczególnej subpopulacji komórek normalnych w subpopulacji. Stosuje się to np. w biopsjach wątroby, gdzie identyfikacja komórek posiadających antygen nabłonka żółciowego, może mieć znaczenie. Podobnie można zagwarantować identyfikację i możliwą izolację specyficznych komórek nabłonkowych z zawiesiny komórek przygotowanej z różnych normalnych tkanek.

8. Izolacja i wzrost wybranych komórek.. Dla wielu powyższych celów może być wymagane posiadanie większej populacji komórek do badań. Niniejszy sposób przy zastosowaniu urządzenia filtrującego komórek może zapewnić warunki, umożliwiające rozmnażanie i pozytywny wybór komórek docelowych, bez obecności wolnych niezwiązanych cząstek albo innych nieswoiście związanych komórek.

Kilka z cząsteczek błon komórkowych wspomnianych powyżej w punktach 1-6 może być również zastosowanych jako cele dla immunoterapii kilkoma typami aktywowanych komórek typu killer albo na przykład immunotoksynami. Identyfikacja nowym sposobem ekspresji takich cząsteczek ma dlatego również wartość dla określania, w których przypadkach takie typy terapii należy zastosować.

Przykłady praktycznego zastosowania sposobu.

Przykład 1. Dla zdiagnozowania rozprzestrzenienia się komórek nowotworu we krwi /lub szpiku kostnym we wczesnym stadium, zastosowaliśmy w nowej procedurze przeciwciała antyrakowe MOC-31, NrLulO, BM2, BM7, 12H12 oraz MLuC1 dla określenia czy można z dużą czułością zidentyfikować w płynach ustrojowych chorobę z mikroprzerzutami w raku sutka, płuc, okrężnicy/odbytnicy i gruczołu krokowego. Zadowalające wyniki z tymi przeciwciałami mają znaczne implikacje kliniczne.

Przykład 2. Ekspresja wielu cząstek błonowych, jak wykazano, koreluje z postępem choroby nowotworowej w kilku typach nowotworów złośliwych. Wykrycie wiązania takich cząsteczek do odpowiednich przeciwciał można zatem zastosować dla uzyskania informacji o dużej wartości rokowniczej. Wśród takich antygenów jest duża liczba cząstek adhezyjnych, antygenów węglowodanowych, glikolipidów, receptorów czynników wzrostu oraz markerów nowotworowych wymienionych powyżej. Zidentyfikowaliśmy, przy zastosowaniu nowej

177 483 procedury, wiązanie kompleksów cząstka-przeciwciało do wariantów CD44, kadheryny E, Le^y, CEA, EGF-r, receptora transferyny, epitopu MUC-1, epitopu LUB-CRU-G7, antygenu raka gruczołu krokowego, epitopu UJ13A, 2-mikroglkbuliny, antygenów HLA oraz receptora apoptozy.

Przykład?. Uzyskano dwa litery wysięku opłucnowego od pacjenta z podejrzeniem czerniaka złośliwego. Po odwirowaniu, komórki sawisszkno w objętości 2 ml RPMI z 10% surowicą płodową cielęcą, iokubowank z przeciwciałem prssciw-cssrniakowym 9.2.27 (!0g/ml) w 4°C przez 30 min., przepłukano i ponownie inkubowano z przeciwciałami SAM Dynabeads™ M450/IgG2A w 4°C przez 30 min. Zawiesinę komórek następnie zbadano pod mikroskopem dla określenia frakcji komórek z komórkami paramagnetycznymi przymocowanymi do ich powierzchni. Rozpoznanie czerniaka złośliwego potwierdzono, ponieważ około 10% komórek miało znaczną liczbę związanych rozetek cząstek.

Przykład 4. Otrzymano bioptat tkankowy z podskórnego guza w przypadku z klinicznymi oznakami albo drobnokomórkowego raka płuc albo czerniaka złośliwego. Z bioptatu przygotowano zawiesinę pojedynczych komórek, podzielono ją na dwie frakcje, jedną iokubowaok z przeciwciałem przsciwcz,srniakowym 9,2,27, a drugą z przeciwciałem przeciwrakowym MOC-31 (obydwa w stężeniu 10 g/ml). Inkubacja była podobna do zastosowanej w przykładzie powyżej. Żadna z komórek inkubowanych z przeciwciałem czerniaka nie związała perełek, natomiast wszystkie komórki nowotworowe inkubowane z MOC-31 były pozytywne.

Przykład 5. Bioptat tkankowy od pacjenta z podejrzeniem czerniaka złośliwego zbadano po przygotowaniu zawiesiny pojedynczych komórek, inkubacji z przeciwciałem prssciwcssrniakowym 9.2.27, a stępnie według procedury jak wyżej. Większość komórek była pozytywna z dużą liczbą rozetek z cząstek przymocowanych do ich błon.

Przykład 6. Wysięk opłucny- od pacjentki z rakiem sutka zbadano dla sprawdzenia czy komórki nowotworowe można było wykryć w tym płynie. Jeden litr płynu odwirowano, komórki ponownie zawieszono i w oddzielnych probówkach iokubowank z każdym z 3 różnych przeciwciał przeciwrakowych (MOC-31, 2E11, 12H12). Po zakończeniu procedury jak w powyższym prsykładsis stwierdzono, iż większość komórek związała cząstki pokryte przeciwciałami we wszystkich 3 przypadkach.

Przykład 7. Zawiesinę szpiku kostnego uzyskaną od pacjentki z rakiem sutka zbadano dla stwierdzenia, czy były obecne komórki mikroprzerzutów nowotworu. Po przygotowaniu komórek jednojądrzastych ^^owa^ je z tymi samymi 3 przeciwciałami antyrakowymi, co w przykładzie powyżej , ale w tym przypadku prs.ccSwciała najpierw z cząstkami paramagnetycznymi z przeciwciałami SAM Dzoabeaas™ IgG. Po 1 inkubacji z tymi bezpośrednio pokrytymi cząstkami, zawiesinę komórek zbadano pod mikroskopem i soalezeono dużą liczbę komórek pozytywnych z wieloma rozetkami cząstek dołączonymi do ich błony. Podobne doświadczenia przeprowadzono dla wielu wysięków opłucnowych bądź z wodobrzusza oraz ze szpiku kostnego u pacjentek z rakiem sutka.

Przykład 8. Komórki T47D lkazkόsgk raka sutka iodubkwaok przez różne okresy czasu z barwnikiem fluorescencyjnym Hoechsta, po czym sprawdzano żywtność wyznakowanych komórek. Różne liczby znakowanych komórek raka sutka dodano następnie do 1 x 10⁶ komórek szpiku kostnego, uzyskanych od zdrowych ochotników. W różnych doświadczeniach dodano różne stężenia paramagnetycznych, monkdyspsrszjnych cząstek (Dzoabsaak™ P450), pokrytych poszczególnymi przeciwciałami prseciwrakowzmi (NrLuIO, MOC31, lub 12H12). Po inkubacji przez 30 min. na lodzie, próbki z różnych probówek zbadano w komorze liczącej pod mikroskopem świetlnym i fluorescencyjnym. Gdy stosunek komórek nowotworowych do całkowitej liczby komórek jądrzastych był niski, zawiesinę komórkową poddawano polu magnetycznemu, a komórki z dołączonymi cząstkami izolowano przed badaniem w mikroskopie. Stwierdzono, iż przy optymalnym stosunku 1-10 perełek paramagoetyka na komórkę nowotworową w misszαnenie komórek, wszystkie komórki nowotworowe miały 2-15 perełek dołączonych do swojej powierzchni. Czułość metody wykrywania była bliska jednej komórce nowotworowej na 10⁴ komórek jądrzastych. W doświadczeniach kontrolnych z wyznakowanymi komórkami nowotworowymi, przy

177 483 zastosowaniu przeciwciał, o których wiadomo, iż dają pewną reaktywność krzyżową z komórkami zdrowymi, tę reaktywność krzyżową potwierdzono z cząstkami parambgoeteka pokrytymi przeciwciałami. W doświadczeniach z kuleczkami bez pokrycia przeciwciałami skojarzonymi z nowotworem, żadna z komórek docelowych nie związała perełek.

Podobne doświadczenia przeprowadzono i z inoemi liniami raka sutka i z linią komórkową drobnokomórkowago raka płuc. Podobną czułość i swoistość uzyskano w innych doświadczeniach.

Przykład 9. Płyn z opłucnej i z wodobrzusza od pacjentki z rakiem sutka oraz rakiem jajnika odwirowany, z dodatkiem tych samych pokrytych cząstek paramagnetycznych co w przykładzie 1, inkubowane i zatężony w polu magnetycznym przed zawieszeniem zbadano pod mikroskopem świetlnym. Zwykle, komórki, które miały wyraźne cechy morfologiczne komórek nowotworowych miały dołączone perełki, natomiast żadna z nieliczoech zdrowych komórek nie związała perełek pokrytych przeciwciałami. W dwóch przypadkach z wysiękiem opłucnowym, niezależne badanie morfologiczne nie ujawniło komórek nowotworowych, natomiast znaczna liczba komórek nowotworowych została wykryta przy zastosowaniu perełek pokrytych przeciwciałem. W pewnych przypadkach komórki nowotworowe oddzielono w polu magnetycznym i przeniesiono do butelek do hodowli tkankowych, zawierających pożywkę wzrostową specjalnie przygotowaną do hodowli komórek raka sutka, w celu próby uzyskania trwałych lmii komórkowych z tych hodowli. Równolegle, komórki z wysięków nowotworowych hodowano bezpośrednio bez selekcji pozytywnej z kuleczkami magnetycznymi. W tych ostatnich przypadkach nie udało się wprowadzić linii komórkowych, podczas gdy w ponad 50% przypadków, w których zastosowano pozytywnie wyselekcjonowane komórki nowotworowe, udało się uzyskać linie komórkowe.

Przykład 10. W niektórych przypadkach, szpik kostny oraz krew obwodową uzyskane od pacjentów z rakiem sutka zbadano według niniejszej procedury poprzez dodanie pokrytych przeciwciałami perełek pbcbmbgoeteczneah, inkubację przez 30 min. w 4°C oraz zalężenie w polu magnetycznym i badanie zαwiasine pod mikroskopem świetloem. W obydwu przypadkach wykryto wiązanie perełek paramagoete'kα z komórkami nowotworowymi, stanowiącymi 0,1-1% komórek jądrzastych w szpiku kostnym i krwi, których to komórek nie dało się zidentyfikować żadną inną metodą.

Przykład 11. Przeciwciała przeciwko pewnym receptorom czynników wzrostowych albo innym produktom genów ekspresjonowboych na powierzchni specyficznych populacji komórek można zastosować do identyfikacji i pozytywnej selekcji tych komórek. Perełki pokryte przeciwciałami przeciwko receptorowi transfer^y, zastosowane w nowym sposobie według niniejszego wynalazku stanowią, jak wykazano, szybką, prosta i czułą metodę identyfikacji komórek posiadających receptor transferymy.

Przykład 12. Dla różnych celów uzasadniona jest izolacja swoistych populacji normalnych komórek. Komórki nabłonkowe wyściełające naczynia włosowate albo małe naczynka w tkance zdrowej i nowotworowej można pozytywnie wyselekcjonować z zawiesin komórkowych przygotowanych z odpowiednich tkanek. Procedura ta wykorzystywała zastosowanie perełek pokrytych przeciwciałem skierowanym przeciwko strukturom ekspresjonowboem na komórkach nabłonkowych, ale nie na innych normalnych komórkach w mieszaninie komórkowej.

Przykład 13. Ludzkie komórki wstrzyknięte gryzoniom z defektem odporności obecne są w zawiesinach komórkowych przygotowanych z nowotworów ksenogeniczoie wszczepionych i z różnych nαcządów/tkboek biorcy, jak wykazano przy zastosowaniu cząstek magnetycznych pokrytych przeciwciałami typu boti-pbc-humbc.

Przykład 14. Linie komórek nowotworowych od pacjentów z rakiem sutka i czerniakiem oddzielono od mieszanej populacji komórek krwi i szpiku kostnego i przefiltrowano przy zastosowaniu opisanego urządzenia filtrującego komórki. Po dodaniu pożywki hodowlanej i następnej inkubacji, wybranym komórkom nowotworowym na filtrze pozwolono rosnąć przy braku wolnych oiezwiązbnech cząstek albo innych nieswoiście związanych komórek.

177 483

Tabela 1

Lista odpowiednich antygenów i przykłady skojarzonych przeciwciał wiążących antygeny

ANTYGENY	PRZECIWCIAŁA MONOKLO- NALNE
Cząsteczki adhezyj-
ne
Receptor fibronek-	Pierce 36114, BTC21/22
tyny (integryna	CalBiochem 341649
α 5β1)
Integryna α3β1	M-Kiol2
Receptor witronek-	TP36.1, BTC 41/42
tyny (integryna
ανβ3)
Integryna α2	Calbiochem 407277
Integryna α3	Calbiochem 407278
Integryna α4	Calbiochem 407279
Integryna α5	Calbiochem 407280
Integryna αν	Calbiochem 407281
Integryna β2	Calbiochem 407283
Integryna β4	Calbiochem 407284
ΘρΙΙβΙΙΙα	8221
ICAM-! (CD 54)	C57-60, CL203.4, RR 1/11
VCAM-1	Genzyme 2137-01
ELAM-1	Genzyme 2138-01
Selektyna E	BBA 8
Selektyna P/GMP-140	BTC 71/72
LFA-3 (CD58)	TS 2/9
CD4 4	BM 1441 272,25:32
warianty CD 44	11.24, 11.31, 11.10
N-CAM (C]^^6)	MOC-1

177 483

H-CAM	BCA9
L-CAM	BM 1441 892
N-CAM	TURA-27
MACAM-1	NKI-M9
kadheryna E	BTC 111, HECD-1, gF9
kadheryna P	NCC-CAD-299
Tenascyna	BM 1452 193,
Receptor trombo-	Calbiochem 580664 BM 1441 264
spondyny (CD 36) VLA-2	A1.43
Receptor lamininy Epitop HNK-1	HNK-1
Antygeny węglowodanowe Antygen T	HH8, HT-8
Antygen Tn	TKH6, BaGs2
Sialylo Tn	TKH-2
Antygen skojarzony	CA 19-9
z rakiem przewodu pokarmowego (Mw200kD) Antygen skojarzony	C-50
z rakiem Ley	MLuC1, BR96, BR64
di-Lex, tri-Lex	B3
Dimeryczny epitop	NCC-ST-421
Lea H-typ 2	B1
epitop CA15-3	CA15-3

177 483

CEA	I-9, I-14, I-27, II-10,
Galb1-4GlcNac (nL	I 46, Calbiochem 250729 1B2
4,6,8)
H-II	BE2
A typ 3	HH8
Lakto-N-	PM-81
fukopentanoza III
(CD 15)
Glikolipidy
GD3	ME36.1, R24
gd2	ME36.1, 3F8, 14.18
Gb3	38-13
GM3	M2590
gm2	MKI-8, MKI-16
FUCGM1	1D7, F12
Receptory czynników
wzrostu
Receptor EGF	425.3.2.E9, 225
c-erbB-2 (HER2)	BM 1378 998, 800 E6
Receptor PDGFa	Genzyme 1264-00
Receptor PDGF3	Sigma P 7679
Receptor transfery-	OKT 9, D65.30
ny
Receptor NGF	BM 1198 637
Receptor IL-2	BM 1295 802, BM 1361
(CD25)	937

177 483 c-kit

Receptor TNF Receptor NGF

Antygeny czerniaka

Antygen wielkocząsteczkowy (HMW 250.000)

Glikoproteina skojarzona z czerniakiem Mw 105 Antygen 100kDa (czerniak/rak) gp 113 p95-100

Sp75 gr 100-107 MAA

M_r125kD (gp125)

Antygeny mięsaka

Epitop TP-1 i TP-3

Mw200kD

Mw160kD

Markery raków

Epitop MOC-31 (antygen nabłonkowy cluster 2)

BM 428 616, 14 A3, ID9,3D6

Genzyme 1995-01,PAL-M1

9.2.27, NrML5, 225.28

ME20

376.96

MUC 18

PAL-M2

15.75

NKI-bereb

K9.2

Mab 436

TP-1, TP-3 29-13, 29.2 35-16, 30-40

MOC-31, NrLu10

177 483

Antygeny MUC-1 (takie jak epitop DF3 )	MUC-1, DF3.BCP-7 do -10
MUC-2 i MUC-3	PMH1
Epitop LUBCRU-G7 (gp 230kD)	LUBCRU-G7
Antygen swoisty gruczołu krokowego	BM1276 972
Antygen swoisty raka gruczołu krokowego	E4-SF
Antygen wysokoczą- steczkowy gruczołu krokowego Mw>400kD	PD41
Polimorficzne mucy-	BM-2, BM-7, 12-H-
ny nabłonkowe	12
Swoisty antygen błonowy gruczołu krokowego (Cyt-356)	7E11-C5
Globulina tłuszczu	Immunotech HM'FG-1,
ludzkiego mleka	27.1
Epitop 42 kD raka sutka	B/9189
Mucyna Mw>10skD	TAG-72, CC-49, CC- 83
Epitop OC125 raka jajnika ((V750kD)	OC125
Glikoproteina trzustkowa HMW	DU-PAN-2

177 483

Antygen okrężnicy Co17-1A(M_W37000) Epitop G9 (rak okrężnicy)

Ludzka sulfomucyna okrężnicy

Antygen trzustkowy M_r300kD

GA 733.2

TAG 72

Niezdefiniowany

Skojarzony z rakiem trzustki

Ogólnorakowy

Antygen gruczolakoraka gruczołu krokowego

Gruczolakorak płuc Mw150-130kD Antygen raka płuc gp160 (Cancer Res. 48, 2768, 1988) Antygen raka pęcherza moczowego Mw92 kD

Antygen raka pęcherza moczowego Mw600 kD

Antygen raka pęcherza moczowego (Cancer Res. 49, 6720, 1989)

17-1A

G9

91.9H

MUSE11

GA733, KS1.4

B72.3, CC49, CC83

Oa11, SM1

MUSE 11

CC49

PD41

AF-10 anty go 160

3G2-C6

C3

AN43, BB369

177 483

Epitop CAR-3 M_w>400kD Epitop MAM-6 (C15.3)

Wysokocząsteczkowy antygen raka jajnika

Epitop mucynowy Ia3

Antygen raka wątrobowokomórkowego Mw900kD Epitop hepema (gp43) antygen raka wątrobowokomórkoweg o

Mucyna O-związana, zawierająca kwas Nglikoliloneuraminowy

Antygen raka okrężnicy/odbytnicy Mw4 8kD

Antygen raka sutka Mw71kD

Epitop 16.88 (antygen raka okrężnicy/odbytnicy) CAK1 (raki jajników)

Antygen p specyficzny dla okrężnicy

Antygen raka płuc

AR-3

115D8

OVX1, OVX2

Ia3

KM-2

Hepema-1

3E1.2

D612

BCA 227

16.88

K1

Mu-1, Mu-2

DF-L1, DF-L2

177 483

Mw350-420kD Antygen raka pęcherza moczowego gp54 Antygen raka pęcherza moczowego gp85 Antygen raka pęcherza moczowego gp25

Antygeny neuroblastoma

Skojarzone z neuroblastoma, takie jak epitop UJ13A

Antygeny glejaka Epitop Mel-14

Antygeny raka głowy i szyi

Antygen Mw18-22kD

Antygeny HLA

HLA Klasy I HLA-A

HLA-B

HLA-A2

HLA-ABC HLA-DR, dq, dp 32-mikroglobulina

Receptor apoptozy

Epitop Apo-1

T16

T43

T138

UJ13A

Mel-14

E48

TP25.99

VF19LL67

H2-149.1

KS1

W6.32

Q 5/13, B 8.11.2 NAMB-1

Apo 1

177 483

Różne Antygeny i recepto-	Poliklonalne królicze
ry aktywatora plazminogenu Glikoproteina p	C219, MPRG16.JSB-1,
Katepsyna D	265/F4 CIS-Diagnostici, Italy
Antygen nabłonka	HEA 125
żółciowego Antygen nerwowo-	ME491, NKI-C3, LS62
gruczołowy (CD63) CD9	TAPA-1, R2, SM23
Antygen komórek	pan-H
ludzkich pan-human

Tabela 2a

Wyniki wiązania przeciwciał z różnymi liniami komórkowymi

Przeciwciała	Lmća óomóróowa MCF-7	Lima komórkowa SKBR3	Lima komórkowa T47D	L^cćs komórkowa MDA 231	Lima óomóróowa MDA 435	Linda komórkowa DU 145	Luna komórkowa FEMX-1	Linćs komórkowa LOX
1	2	3	4	5	6	7	8	9
NrLu10 IgG2b		+	+	(+)	(+)	+
Moc31 IgG1	+	+	+	(+)	(+)	+
Moc1 IgG1			(+)	(+)	+
12H12 IgG1		+	+		+	+
2E11 IgG3	+	+	+		+	+
5A6 IgG1		(+)	+
5F2 IgM			(+)
CC3 IgG2a	-	-	-
CC1 IgM
CU18 IgG1	-	-	-					(+)

177 483 cd. tabeli 2a

1	2	3	4	5	6	7	8	9
CU46 IgG1	(+)	-	-
7F11 IgG1	-	-	+
ID7 IgG3			(+)			-	-	-
E4SF IgG1		+	+
425-3			+			(-)	-	50%+
9.2.27							+	+
MUC18		-					+	+
2g12 IgG1						-	-	-
4b7							+
IgG1	+		+				+
BCRU-G7 IgM							+

Tabela 2b

Wyniki wiązania przeciwciał z różnymi liniami komórkowymi

Przeciwciała	Linia komórkowa PM1	Linia komórkowa MA-11	Lima komórkowa ' CRL-1435	Lima komórkowa CRL-1740	Lima komórkowa H-146	Lima komórkowa Colo-205	Lima komórkowa 786-0	Lima komórkowa WIDr
1	2	3	4	5	6	7	8	9
NrLu10 IgG2b	+	+	+	+	+	+	-
Moc31 IgG1	+	+	+	+	+	+	+	+
Moc1 IgG1					+	-
12H12 IgG1	+	+	(+)		-	-	-
2E11 IgG3	(+)	+	-	+	-	-	-
5A6 IgG1	+	+
CC3 IgG2a					-		-
CC1 IgM					(+)		-
CU18 IgG1					-		-
CU46 IgG1					-		-
7F11 IgG1	(+)	+	-		-	-		-
ID7 IgG3					-			-
E4SF IgG1	+	+	+	+	-	-		-
MUC18	-						-
2g12 IgG1					-		-
4b7					-		-

177 483 cd. tabeli 2b

1	2	3	4	5	6	7	8	9
BM2(=2F11)	+	+
BM7 (=7F11)	+				+			-
GENTES IgG					+			-
3C9 IgM					-			-
HH8 IgM					-			-
5F4 IgM					-			-
3F1 IgG1					-			-

177 483

Fig. 3

177 483

177 483

CELLS ΚσΜορ€«

Fig. 6

1000 CELLS KOMONIC

177 483

Fig. 1.1

26mm

177 483

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Claims (16)

1.6.2 przenoszenia sawissioy izolowanych komórek docelowych do urządzenia filtrującego komórki albo rozdzielacza komórek i przeprowadzania sposobu według 1.5.2 powyżej.

1.6.1 zastosowania mikroskopu i/lub odpowiedniego urządssnOa liczącego komórki/cząstki albo,

1.6 jeżeli stosunek uomórid docelowc/komórki cółkowiłe w zawiesinie komórek wynosi >1% obejmuje etap badania i licsenia komórek docelowych w inkubowanej mieszanioie cząstek paramagnetycznych, przeciwciał oraz mieszaniny komórek (1.3), albo, w przypadku gdy przeciwciała bądź fragmenty przeciwciał skoniugowane są z cząstkami nisparamagnstycznymi, które można uwidocznić bezpośrednio z uwagi na kolor albo poprzez aktywację enzymatyczną.

1.5.2 przenoszenia zawiesiny izolowanych komórek docelowych do urządzenia filtrującego komórki albo rozdzielacza komórek (20), w którym zawiesinę komórek wprowadza się do mikrostudzienki, przy zastosowaniu filtra błonowego dogodnego dla zatrzymania kompleksów cząstka/komórka docelowa, przy użyciu bądź bez ssania, usunięcia filtrów z wyizolowanymi komórkami docelowymi z urządzenia filtrującego komórki dla utrwalenia i wybarwienia znanymi metodami immunohistochemiczymi oraz oglądania pod mikroskopem albo dodawania pożywki hodowlanej dla celów rozmnożenia wyizolowanych kompleksów komórek docelowych umiejscowionych na filtrze w celu scharakteryzowania swoistych cech biochemicznych i biologicznych, albo;

1.5.1 badania i zliczania zabarwionych i niezabarwionych kompleksów cząstkakomórka docelowa w zawiesinie komórkowej, przy zastosowaniu mkroskopu i/lub odpowiedniego urządzenia liczącego komórki/cząstki, albo

1.5. poddawania śnkubowauejmieszaniny ez^sk paramagnetdcgoyty-pozeciwaiałkomórek (1.3) działaniu pola magnetycznego, jeśli gęstość komórek docelowych jest niska, albo jeśli stosunek komórek docelowych/komórek całkowitych w mieszaninie komórkowej jest niski (<1%), a następnie

177 483

1.4.3 fragmenty przeciwciał mogą być biotynowane, a wiązanie uwidacznia się, po inkubacji z awidyną skompleksowaną z peroksydazą, fosfatazą zasadową albo innymi, enzymami, z dodatkiem i inkubacją z odpowiednimi substratami, albo;

1.4.2 jeżeli jest pożądane zabarwienie lub uwidocznienie kompleksu komórka-cząstka zawiesiny komórkowe, nie poddane lub poddane wstępnej obróbce formaliną, alkoholem bądź innym utrwalaczem można inkubować, z innymi przeciwciałami albo fragmentami przeciwciał wiążącymi zeowątrzkomórkowe albo wewnątrzkomórkowe cząsteczki obecne na komórkach docelowych, przy czym stosowane przeciwciała są wcześniej wyznakowane peroksydazą, fosfatazą zasadową albo innymi enzymami umożliwiającymi dodatkowe uwidocznienie wiązania przez dodanie i inkubację z odpowiednimi substratami, albo;

1.4.1 jeżeli populacja komórek docelowych zawarta jest we krwi albo aspiratach szpiku kostnego, siły hydrofobowe związane z cząstkami pokrytymi przeciwciałami można zmniejszyć poprzez wstępną inkubację cząstek pokrytych przeciwciałami oraz zawiesiny komórek z łagodnymi detergentami w odpowiednich stężeniach, przez 30 min w 4°C lub;

1.3 inkubowania obu mieszanin z 1.2.1 i 1.2.2 przez 5-10 min. do 2 godz., korzystnie przez 30 min., w temperaturze pomiędzy 0°C a 25°C, korzystnie 4°C przy delikatnym wirowaniu, i;

1.2.2 mieszania zawiesiny komórek zawierającej komórki docelowe z wolnymi przeciwciałami wiążącymi komórki docelowe i inkubowania tej mieszaniny przez 5-10 min. do 2 godz., korzystnie przez 30 min., w temperaturze pomiędzy 0°C a 20°C, korzystnie 4°C przy delikatnym wirowaniu i płukania i dodawania cząstek paramagnetycznych lub perełek wstępnie pokrytych przeciwciałami przeciwko Fc;

1.2.1 mieszania przeciwciał wiążących komórki docelowe (mysich albo ludzkich), które są przyłączone do cząstek albo perełek, z zawiesiną komórek, zawierającą komórki docelowe, albo

1.1 pokrywania, według procedury znanej per se, cząstek paramagnetycznych albo inaczej perełek albo a) przeciwciałami albo fragmentami przeciwciał skierowanych przeciwko strukturom błonowym specyficznie ekspresjonowsozm na komórkach docelowych a nie na komórkach niedocelowych w mieszaninie komórek, bądź też b) przeciwciałami, korzystnie poliklonalnymi anty-mysimi albo monoklonalnymi anty-mysimi przeciwciałami szczurzymi albo przeciwciałami anty-ludzkimi, zdolnymi do wiązania fragmentów Fc przeciwciał, skierowanych przeciwko strukturom błonowym; i

1. Sposób wykrywania swoistych komórek docelowych w zawiesinach knmórkowych mieszanych populacji komórek oraz w płynnych układach zawierających mieszane populacje komórek, a także w zawiesinach pojedynczych komórek przygotowanych z tkanek stałych, za wyjątkiem zdrowych i nowotworowych komórek hemopoetzczozch we krwi i szpiku kostnym, przy użyciu cząstek paramagnetycznych pokrytych przeciwciałami skierowanymi przeciwko swoistym epitopom na komórkach docelowych, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

2. sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciała albo ich fragmenty kieruje się przeciwko antygenom w normalnych, żywych komórkach, takich jak hepatocyty, komórki Kupffera oraz komórki nabłonkowe typu 1 i 2 oraz komórki płuc Clary, komórki nabłonkowe specyficznych narządów, komórki egzokrynne i endokrynos trzustki, komórki kanalików nerkowych, komórki nabłonka pęcherza moczowego, mózgowe komórki glejowe i epsndymaloe, komórki nabłonkowe pęcherza moczowego oraz gruczołu krokowego, urzęsione komórki dróg oddechowych, różne populacje komórek śluzowych w przewodzie pokarmowym, komórki przysadki oraz inne komórki endokrynne w różnych narządach wytwarzających hormony.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako przeciwciało dla komórek docelowych wykorzystuje się przeciwciało, które reaguje z antygenami obecnymi na subpopulacjach normalnych komórek oraz produktami onkogenów ekspresjonowanymi na błonie komórek normalnej tkanki.

4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako przeciwciało do selekcji pozytywnej wykorzystuje się przeciwciało, które skierowane jest przeciwko receptorom czynników wzrostowych na błonie normalnych komórek, takim jak receptor EGF, receptor PDGF (AiB), receptory insuliny, receptory czynników insulino-podobnych, receptor dla transferyny, receptor NGF i FGF.

5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że wykorzystuje przeciwciało skierowane przeciwko grupie integryn oraz innym błonowym cząsteczkom adhezyjnym oraz białkom MDR w normalnych komórkach.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nakierowuje się przeciwciała albo ich fragmenty przeciwko antygenowi albo receptorom w komórkach o nienormalnych wzorcach rozwojowych, korzystnie takich jak pierwotne i przerzutowe komórki nowotworowe.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako przeciwciała wiążące komórki docelowe wykorzystuje się przeciwciała o isotypie IgG, albo fragmenty F(ab’)2 albo F(ab), albo IgM, albo fragmenty IgM.

8. Sposób według zastrz. 2 albo 6, znamienny tym, że przygotowuje się zawiesinę komórkową z mieszanych populacji komórkowych, obejmujących tkanki ssaków, takie jak

177 483 ludzki szpik kostny i krew obwodowa, z wysięków opłucnowych i otrzewnowych, innych płynów ustrojowych, takich jak mocz, płyn mózgowordzeniowy, nasienie, chłonka albo z litych guzów w normalnych tkankach i narządach, takich jak wątroba, węzły chłonne, śledziona, płuca, trzustka, tkanka kostna, ośrodkowy układ nerwowy, gruczoł krokowy, skóra oraz błony śluzowe.

9. Sposóbweóług zastrz. 1, znamienny tym, żeprzec iwciało albo frabmenty przeciwciała kieruje się przeciwko grupom determinant antygenowych, takich jak te wymienione w tabeli 1.

10 Sposób według zastrz. 6, znamienne tym, że wykorzystuje jako przeciwciało dla komórek docelowych, przeciwciało albo fragment przeciwciała, które skierowane jest przeciwko receptorom czynnika wzrostowego oraz produktom onkogenów ekspresjonowanych na błonie komórek nowotworowych, takich jak receptory insulinowe, receptory czynników insulino-podobnych oraz receptory FGF, oprócz wymienionych w tabeli 1.

11. sposób według zastrz. 6, znamienne tym, ee wykorzystuje przeciwciało albo fragment przeciwciała skierowanego przeciwko grupie integryn, innych błonowych cząsteczek adhezyjnych oraz białek MDR w nienormalnych komórkach, wymienionych w tabeli 1.

12. Sposób według zastrz. 1, znamienne tym, że zastosowane przeciwciała, fragmenty przeciwciał albo ich kombinacje skierowane są przeciwko determinantom antygenowym wymienionym w tabeli 1.

13. Sposób według zastrz. 6, znamienne tym, ee jako przeciwciało wykorzystuje się przeciwciało, które reaguje z antygenami obecnymi na nieprawidłowych komórkach, takich jak komórki raka sutka, jajnika i płuc, czerniaka, mięsaka, glejaka wielopostaciowago oraz komórek raka przewodu pokarmowego i moczowopłciowego, a także układu siateczkowośródbłonkowego i/lub komórkom docelowym związanym z chorobami nienowotworowymi, takimi jak zaburzenia sercowo-naczyniowe, neurologiczne, płucne, autoimmunologiczne, żołądkowo-jelitowe, moczowo-płciowe, siateczkowo-śródbłonkowe.

14. Urządzenie do filtrowania komórek albo rozdzielacz komórkowy (20) do oddzielania kompleksów cząstka-komórka docelowa od perełek niezwiązanych i niezwiązanych komórek niedocelowych w zawiesinie komórkowej mieszanych populacji komórkowych, obejmujące studzienki z otworami po obu stronach, przy czym nad jednym z otworów umiejscowiony jest zespół filtrujący, do którego przytwierdzony jest materiał filtrujący, tworząc obszar filtrowania, znamienne tem, że zawiera pudełko zbiorcze filtratu (22) z bolcem/bolcami wiodącymi (28), z pokrywką (21), z częścią dla dołączenia podciśnienia (23), zawierające wiele jednostek wielostudzienkowych (24) z wrębem wiodącym (29), z filtrem błonowym rozdzielacza komórek (25) oraz podparcie błony (25a) odłączalnie umocowanymi na dnie jednostki wielostudzienkowej (24).

15. Urządzenie filtrujące komórek (20) według zastrz. 14, znamienna tem, że pory w filtrze błonowym są regularne i jednorodne pod względem kształtu i rozmiaru, jak w błonach jednowłókienkowych z nylonu o rozmiarach porów w zakresie od 10 pm do 75 pm, korzystnie 20 pm.

16. Zestaw do wykrywania swoistych komórek docelowych w zawiesinach komórkowych mieszanych populacji komórek oraz w płynnych układach zawierających mieszane populacje komórek, a także w zawiesinach pojedynczych komórek przygotowanych z tkanek stałych, za wyjątkiem zdrowych i nowotworowych komórek hemopoetycznych we krwi i szpiku kostnym przy użyciu cząstek paramagnetycznych pokrytych przeciwciałami skierowanymi przeciwko swoistym epitopom na komórkach docelowych, znamienne tem, że zawiera;

16.1 swoiste; przeziwcieca ciao ft^^i^mer^tg erzeziwciac nakłzrowane na receptoec antygenowe na pożądanych komórkach docelowych, przy czym przeciwciało albo fragment

177 483 przeciwciała jest związany z dołączonymi cząstkami paramagnetycznymi, bezpośrednio lub przez przeciwciała przeciw Fc, lub

16.2 cząstki paramagnetyczne wstępnie pokryte swoistymi przeciwciałami anty-Fc, korzystnie poliklonalnymi anty-mysimi, albo monoklonalnymi szczurzymi anty-mysimi, albo anty-ludzkimi przeciwciałami, zdolnymi do związania fragmentów Fc przeciwciał wiążących komórki docelowe, oraz swoiste wolne przeciwciała dla komórek docelowych, i/lub

16.3 inne swoiste przeciwciała albo fragmenty przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom/receptorom wewnątrz albo na pożądanych komórkach docelowych, przy czym przeciwciała albo fragmenty przeciwciał skoniugowane są z biotyną, peroksydazą, fosfatazą zasadową albo innymi enzymami, albo przeciwciała albo fragmenty przeciwciał związane są z nieparamagnetycznymi cząstkami o specyficznych kolorach albo ze związanymi enzymami takimi jak peroksydaza i fosfataza zasadowa, i/lub

16.4 urządzenie filtrujące zawierające pudełko zbiorcze filtratu (22) z bolcem/bolcami wiodącymi (28), z pokrywą (21), z częścią dla dołączenia podciśnienia (23), zawierające wiele jednostek wielostudzienkowych (24) z wrębem wiodącym (29), z filtrem błonowym rozdzielacza komórek (25) oraz podparcie błony (25a) odłączalnie umocowanymi na dnie jednostki wielostudzienkowej (24), przy czym pory w filtrze błonowym korzystnie są regularne i jednorodne pod względem kształtu i rozmiaru, jak w błonach jednowłókienkowych z nylonu, o rozmiarach porów w zakresie od 10 μm do 75 pm, korzystnie 20 pm,

16.5 cząstki paramagnetyczne albo nieparamagnetyczne wstępnie opłaszczone swoistym antygenem komórek docelowych albo grupą antygenów stanowiące wzorzec.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wykrywania swoistych komórek docelowych w zawiesinach komórkowych, urządzenie do filtrowania komórek służące do przeprowadzania tego sposobu, oraz zestaw, zawierający m.in. urządzenie, do przeprowadzenia sposobu wykrywania swoistych komórek docelowych w zawiesinach komórkowych.