DE69301725T2

DE69301725T2 - Verfahren und gerät zur analyse von biologischem material

Info

Publication number: DE69301725T2
Application number: DE69301725T
Authority: DE
Inventors: Christopher Thomas Evans; Nicholas Peter Martin Foote; Peter Leonard Grant; Michael Noble
Original assignee: Celsis International PLC
Current assignee: Celsis International PLC
Priority date: 1992-03-20
Filing date: 1993-03-22
Publication date: 1996-07-25
Anticipated expiration: 2013-03-23
Also published as: US5624815A; ES2083853T3; NZ249934A; WO1993019199A1; DK0631634T3; FI944340A; EP0631634A1; NO943477L; AU670072B2; NO943477D0; DE69301725D1; JPH07509120A; EP0631634B1; BR9306104A; CA2131090A1; AU3761993A; FI944340A0; GR3019409T3; ATE135050T1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse, z.B. zur Zählung und/oder Identifizierung von Mikroorganismen oder anderem biologischen Material in einer flüssigen Probe, und eine Vorrichtung zur Verwendung in einem solchen Verfahren.

Hintergrund der Erfindung

In vielen Industriezweigen, einschließlich der pharmazeutischen Industrie, ist der Nachweis von geringen Niveaus an Materialien in großen Flüssigkeitsvolumina erforderlich. Beispielsweise stützen sie sich weitgehend auf klassische mikrobiologische Techniken, um mikrobielle Kontamination nachzuweisen. Bereiche, die oft unter der Aufsicht von Personal zur Qualitätskontrolle stehen, umfassen die Kontrolle biologischer Belastung bei eingehenden Ausgangsmaterialien, insbesondere Flüssigkeiten; die Überwachung der mikrobiellen Population in der Produktionsumgebung; Kontrollen während des Verfahrens, insbesondere nach einer Lagerung; und Überprüfung des Endprodukts. Oft wird ein Produkt hergestellt und gelagert, während die Analyse hinsichtlich eines Gehalts an Mikkroorganismen stattfindet. Wird Kontamination nachgewiesen, kann es erforderlich sein, das Produkt zu vernichten und die Fertigungsstraße zu schließen, bis die Quelle der Kontamination gefunden ist. Oft ist die für die Analyse auf Mikroorganismen aufgewendete Zeit der geschwindigkeitsbestimmende Faktor für den Betrieb der Anlage. Dies kann zu erheblichen Kosten für Ausschußproduktion oder Ausgangsmaterialien führen.
Die Bestimmung der Anzahl von Mikroorganismen, welche in den verschiedenen Wasserarten vorhanden sind, die in einer pharmazeutischen Umgebung verwendet werden, wird als kritischer Faktor bei der Herstellung vieler Produkte betrachtet. Gewöhnlich reicht die mikrobiologische Klassifizierung von 0,01 bis 100 cfu/ml Wasser, abhängig von der Quelle der Probe.
Klassische Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen, obwohl als verläßlich betrachtet und in der Industrie anerkannt, sind langsam und erfordern wertvollen Lagerungs- und Laborraum.
Ein Test auf coliforme Bakterien ist im "Handbook of Practical Bacteriology" 9 (1956), von T.J. Mackie und JE. McCartney, Hrsg. E. und S. Livingstone, beschrieben. Das Verfahren verwendet ein spezielles Medium, welches von coliformen Bakterien unter Freisetzung von Säure verwertet wird und so mit einem pH-Indikator eine Farbänderung ergibt. Es werden mehrere Reagenzgläser mit verschiedenen Verdünnungen eingesetzt und eine McCrady-Tabelle wird zur Bestimmung der wahrscheinlichsten Bakterienzahl aus der Anzahl der nachgewiesenen positiven Ergebnisse verwendet. Dieses Verfahren erlaubt den Nachweis kleiner Zahlen von Mikroorganismen in einem großen Flüssigkeitsvolumen, aber es beinhaltet eine Reihenverdünnung und ein Inkubationsstadium von 48 Stunden.
Cherwell Laboratories Ltd., Bicester, UK, und Wilkinson und Simpson Ltd., Gateshead, UK, produzieren jeweils Testsätze unter den Warenzeichen "Colitrace" bzw. "Colilert", bestimmt zur Untersuchung von Wasser hinsichtlich der Niveaus ausgewählter Organismen, bis herunter zu 1 pro 100 ml Probe. Die Probe wird auf unabhängige Reagenzgläser mit Kulturflüssigkeiten verteilt, die dann inkubiert werden; die Anwesenheit coliformer Bakterien wird durch eine Farbänderung angezeigt und E. coli kann durch Fluoreszenz nachgewiesen werden. Der Test der wahrscheinlichsten Zahl (MPN) wird dann verwendet, um die Anzahl der Organismen abzuschätzen.
WO-A-8202561 und auch Williams et al., Annals of the New York Acad. Sci. 501:350-353 (1987), offenbaren Verfahren zum Nachweis von Mikroorganismen in Gel-Mikrotröpfchen durch Zählung mit Hilfe eines Durchfluß-Mikrofluorimeters. Die Technik ist bei einem großen Probenvolumen, das eine geringe Anzahl an Mikroorganismen enthält, schwierig anzuwenden.
FR-A-2649411 offenbart ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Bakterien, indem sie auf einem semi-selektiven Medium auf einem Membran-Träger gezüchtet werden. Das Verfahren ist zur Unterscheidung zwischen Arten von Mikroorganismen ungeeignet.
GB-A-2035372 offenbart ein Verfahren zur mengenmäßigen Bestimmung von coliformen Bakterien. In einem Beispiel wird eine 5 ml-Probe bei einer Maximalgeschwindigkeit von 0,2 ml/Min. gemessen. Dies ist für große Probenvolumina zu langsam.
Pat. Abs. Japan 9(299) (P-408) (2022) (27. November 1985), entsprechend JP-A-60135862, offenbart ein Verfahren, bei dem eine Serumprobe auf 128 Vertiefungen verteilt wird und anschließend Wachstumsmedium zugegeben wird. Der Serum-Titer wird festgestellt, indem man dann die Anzahl von Vertiefungen zählt, die durch Zellkolonien geschlossen sind. Diese Technik ist zur Untersuchung großer Probenvolumina nicht geeignet.
US-A-3929583 und nachfolgende Literatur, die A.N. Sharpe als Autor nennt, beschreibt Membran-Filter zur Zählung von Mikro- Organismen. Die damals neuartige Membran weist ein aufgedrucktes Gittermuster auf, was bis zu 1600 "Zellen" ergibt, worin Mikroorganismen durch Filtration zurückgehalten und unter Koloniebildung gezüchtet werden können. Jede Zelle weist eine Fläche auf, die kleiner ist als die normale Koloniegröße, so daß nach der Inkubation jede vorhandene Kolonie eine gleichmäßige Größe und Gestalt aufweist und gut zu sehen ist. Sie kann dann sichtbar gemacht und mit der MPN-Technik gezählt werden. Diese Vorrichtung wird gegenüber herkömmlichen Membran-Filtern insofern als günstiger nachgewiesen, als die letzteren kein höheres Zählungsergebnis als 400 cfu erlaubten.
Es ist wünschenswert, nicht nur Gesamteinheiten an Material in einer Probe zu zählen, sondern auch spezielle Arten von Material zu identifizieren. Beispielsweise sind bestimmte Stämme, welche die Spezies Escherichia coli bilden, imstande eine Krankheit zu induzieren. E. coli wird deshalb als potentieller pathogener Organismus betrachtet. Es sind mehrere verschiedene Gruppen von Diarrhöe-induzierenden Stämmen bekannt. Die enterotoxigenen E. coli (ETEC)-Stämme erzeugen ein oder mehrere Toxin(e) aus den wärmelabilen und den wärmestabilen (ST) Enterotoxin-Familien. Herkömmlicherweise wurde das ST-Enterotoxin mit Hilfe des Jungmaus-Assays nachgewiesen; ein weniger kostspieliger und zeitaufwendiger Assay ist wünschenswert, der keine Einrichtungen für Tiere erfordert.
Platten mit mehreren Vertiefungen werden in analytischen Laboratorien in großem Umfang verwendet. Einige solcher Platten weisen an der Grundfläche jeder Vertiefung ein Filtermaterial auf. Dieses kann verwendet werden, um Flüssigkeit unter Ansaugen durch die Vertiefungen zu ziehen, nachdem (verschiedene) Proben in jede Vertiefung eingebracht wurden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, daß eine schnellere Zählung von Mikroorganismen oder anderem biologischem Material in Proben, die ein sehr geringes Niveau des Materials enthalten, erforderlich ist. Insbesondere erlaubt die vorliegende Erfindung eine Zählung ohne den zeitraubenden Schritt der Züchtung von Mikroorganismen zu sichtbaren Kolonien. Ferner stellt sie im Gegensatz zur US-A-3929583 ein Mittel zur Identifizierung des Materials bereit.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird in einem Verfahren zur Analyse von Mikroorganismen oder anderem Material, die oder das in einer Probe anwesend sind (ist), die Probe in flüssiger Form, erforderlichenfalls verdünnt, auf eine Anzahl von diskreten Vertiefungen, die adaptiert sind, um das Material zurückzuhalten, verteilt und durch diese passiert, und die Vertiefungen werden auf die Anwesenheit des Materials untersucht. Zur Zählung kann dann die Anzahl der Vertiefungen, in denen das Material anwesend ist, als Funktion der Gesamtzahl an Vertiefungen bestimmt werden. Alternativ oder zusätzlich werden die Vertiefungen auf die Anwesenheit eines spezifischen Materials hin untersucht.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung umfaßt eine neuartige Vorrichtung die Kombination von:
einer Einheit, die eine Anzahl von diskreten Vertiefungen umfaßt, welche adaptiert sind, um das Material zurückzuhalten und den Durchtritt von Flüssigkeit unter Anwendung von vermindertem Druck zu erlauben;
einem Behälter für die Probe, umfassend eine Vielzahl von Kammern, die jeweils mit einer Vertiefung korrespondieren; einem Aufnahmegefäß für Flüssigkeit;
Mitteln, um unter vermindertem Druck Flüssigkeit aus dem Behälter und durch die Vertiefungen zu ziehen; und Mitteln, um den Behälter relativ zu der Einheit entweder in einer ersten fixierten Position, wo eine flüssige Probe zwischen den Kammern über der Einheit passieren kann, oder in einer zweiten fixierten Position, wo jede korrespondierende Kammer und Vertiefung ein diskretes Volumen definieren, zu halten, während eine periphere Flüssigkeitsabdichtung aufrechterhalten wird.

Beschreibung der Erfindung

Die neue Vorrichtung und ihre Verwendung hängt von dem Vorhandensein einer Vielzahl von Abteilungen ab, die einzeln klein an Volumen sein können, aber einen großen Durchsatz an Flüssigkeit aufnehmen können. Die Vertiefungen sind nichtsdestoweniger durch Wände abgetrennt, was eine individuelle Analyse von Material in den Vertiefungen erlaubt. Es ist die Möglichkeit, große Flüssigkeitsvolumina (in denen sehr geringe Mengen des Materials anwesend sein können, z.B. eine geringe Anzahl an Mikroorganismen) handzuhaben, die einen Hauptunterschied der vorliegenden Erfindung gegenüber dem Stand der Technik ausmacht. Ein weiterer ist die Tatsache, daß die Verteilung dazu verwendet werden kann, um in mindestens im wesentlichen jede Abteilung 0 oder 1 Einheit an Material zu geben, wodurch nicht nur die Analyse der Anzahl an Materialeinheiten in der ursprünglichen Probe erleichtert wird, sondern auch homogenes Material in einzelnen Abteilungen bereitgestellt wird, das identifiziert werden kann.
Es werden Mittel bereitgestellt, um das Material in der Abteilung zurückzuhalten, während der Durchtritt von Flüssigkeit erlaubt wird. Beispielsweise kann ein immobilisierter Ligand für das Material eingeführt werden, z.B. durch chemische Umsetzung auf den Wänden der Abteilung, und dieser kann für das zu untersuchende Material spezifisch sein. Verfahren und Materialien für diesen Zweck sind auf diesem Gebiet wohlbekannt. Alternativ kann ein Filterelement in der Grundfläche einer jeden Abteilung vorgesehen sein.
Die Abteilungen, auf welche die flüssige Probe verteilt wird, können die Vertiefungen einer Multivertiefungs-Mikrotiterplatte sein. Eine solche Platte kann ein im Handel erhältlicher Typ sein, einschließlich der Produkte, die mit einem Filtermaterial, welches die Grundfläche der Vertiefung bildet, erhältlich sind, und diese sind insbesondere geeignet wenn die Probe, wie bevorzugt, unter Ansaugen in die Vertiefungen gezogen wird.
Die Gesamtzahl an Vertiefungen sollte ausreichen, um jede Probe mit der größten erforderlichen Genauigkeit zu analysieren. In einer Platte können beispielsweise 24, 48 oder 96 vorliegen, wie bei einer herkömmlichen Mikrotiterplatte. Diese kann für eine Probe verwendet werden, oder es können eine Anzahl verschiedener Proben auf einer Platte getestet werden. Nur 8 Vertiefungen können für eine Probe eingesetzt werden, um eine geeignete Basis zur Zählung oder Identifizierung gemäß der vorliegenden Erfindung zu ergeben.
Die Probenkonzentration sollte so sein, daß nach der Verteilung mindestens eine Vertiefung keine Einheiten des nachweisbaren Materials enthalten sollte; wenn das Material in jeder Abteilung vorhanden ist, wird kein aufschlußreiches Ergebnis erhalten. Das Verfahren wird somit auf Fälle angewandt, in denen die Beobachtung der Vertiefungen anzeigt, daß das Material in einigen und nicht in anderen (Vertiefungen) anwesend ist.
Das zu untersuchende Material kann eine Flüssigkeit sein, in welchem Fall es mit minimaler Vorbehandlung (z.B. Verdünnung) verteilt werden kann. Alternativ kann es ein Feststoff sein, in dem Mikroorganismen anwesend sein können, oder Mikroorganismen, die auf einem Bausch oder Filter gesammelt wurden, in welchem Fall die Organismen in einem geeigneten flüssigen Medium dispergiert werden sollten.
Mikroorganismen wurden oben, und werden im folgenden, nur beispielhaft erörtert. Die Erfindung ist auf jedes Material anwendbar, das in einem beliebigen Niveau in einer Probe anwesend ist, vorausgesetzt, daß eine Einheit des Materials nachgewiesen werden kann. Wenn die anfängliche Konzentration des Materials in der Probe niedrig ist, kann es direkt auf die Abteilungen verteilt werden; falls sie hoch ist, kann es zuerst geeignet verdünnt werden. Für viele Umwelt-Proben, z.B. beim Testen auf coliforme Bakterien, wird eine Verdünnung nicht oft erforderlich sein. Es kann jedoch jede Verdünnung ziemlich schnell durchgeführt werden, und der Nachweis von zurückgehaltenem Material kann dann direkt, ohne weitere Verzögerung, erfolgen.
Alternativ kann das Material (oder Nachweismittel seiner Anwesenheit) amplifiziert werden. So können Niveaus unterhalb der Empfindlichkeit eines vorgegebenen Instruments nach der Amplifizierung mit demselben Instrument bestimmt werden. Beispiele solcher Materialien sind DNA (welche durch PCR amplifiziert werden kann) und Substanzen, die nach Umsetzung mit einer anderen Substanz ein vervielfältigbares Produkt ergeben.
Wenn das in den Abteilungen zurückgehaltene Material amplifiziert werden soll, um die Analyse zu erleichtern, kann das Amplifizierungsmittel nach der Verteilung der Probe eingeführt werden. Umfaßt das Material Mikroorganismen, kann ein geeignetes Wachstumsmedium mit der Probe eingeführt werden. Ein solches Medium wird flüssig sein, die Tatsache, daß diskrete Vertiefungen verwendet werden, bedeutet jedoch, daß keine Konfluenz auftritt.
Nach der Verteilung enthält jede Abteilung entweder Material, z.B. 1 Mikroorganismus, oder nicht. Die Amplifizierung kann dann eine reine homogene Kultur ergeben, was an sich einen Wert darstellt. Die Wahrscheinlichkeit, daß eine Abteilung eine homogene Kultur enthält, kann ohne weiteres berechnet werden. Darüber hinaus können die jeweiligen Abteilungen verschiedene Mikroorganismen umfassen, welche einzeln analysiert werden können, wesentlich genauer und empfindlicher als es durch Analyse nach der Amplifizierung des gesamten Materials in der ursprünglichen Probe möglich ist. Die Abteilungen können mit spezifischen Sonden getestet werden und nicht-spezifische Reaktionen minimiert werden.
DNA- oder RNA-Sonden und monoklonale Antikörper sind Beispiele geeigneter Sonden. Deren Bindung an Material in den Abteilungen kann auf übliche Weise bestimmt werden, z.B. mit Hilfe eines Enzym-verknüpften Immunoassays und/oder Biolumineszenz, unter Verwendung bekannter Reagenzien.
Ein alternatives Verfahren beinhaltet die Beobachtung einer Farbänderung. Für diesen Zweck konnen kolorimetrische Reagenzien in jedem geeigneten Stadium in die Abteilungen eingeführt werden, gegebenenfalls zusammen mit einem Wachstumsverstärker.
Durch geeignete Wahl der Materialien kann eine Farbreaktion beobachtet werden, z.B. rosa oder hellblau, entsprechend den Materialien. In diesem Fall ist keine maschinelle Anzeige erforderlich.
Die Anwesenheit von Mikroorganismen kann durch die Einführung von Biolumineszenz-Reagenzien nachgewiesen werden. Eine solche Technik, die viel empfindlicher ist als der visuelle Nachweis von Kolonien, erlaubt es, Vertiefungen, die zurückgehal tenes Material enthalten, mit einem geeigneten Gerät viel schneller zu registrieren als bei Verwendung von z.B. einer Membran mit einem aufgedruckten Gittermuster. Die Verwendung diskreter Vertiefungen erlaubt es auch, von Kolonien das Wachstumsmedium zu entfernen, und gegebenenfalls auch eine Waschflüssigkeit, geeigneterweise unter Ansaugen, bevor eine Substanz, z.B. Luziferin-Luziferase, eingeführt wird, die in Gegenwart des zu untersuchenden Materials ein Signal ergibt.
Welches Verfahren auch gewählt wird, eine digitale (binäre) Anzeige kann in einem sehr kurzen Zeitraum, z.B. innerhalb von 24 Stunden und oft weniger, erhalten werden. Dies ist von Vorteil im Vergleich zu den längeren Zeiträumen, die bei gegenwärtigen Techniken erforderlich sind.
Eine statistische Analyse erlaubt die Berechnung von Wahrscheinlichkeiten für die Zählung von Mikroorganismen in beispielsweise einer Multivertiefungs-Mikroplatte. Der verwendete mathematische Ansatz hängt davon ab, ob das erforderliche Ergebnis eine Schätzung der Gesamtzahl der in die Vertiefungen eingeführten Mikroorganismen ist oder ein Wert für die wahrscheinlichste Anzahl von Mikroorganismen pro Einheitsvolumen in einer umfangreichen Probe, aus der eine Teilprobe entnommen wurde.
Der erstere Ansatz wird ein ganzzahliges Resultat ergeben, das die wahrscheinlichste Ursache für ein spezielles Ergebnis darstellt. Wenn beispielsweise Y Abteilungen aus einer Gesamtzahl von W positive Ergebnisse aufweisen, ist die wahrscheinlichste Ursache, daß N Mikroorganismen ursprünglich eingeführt wurden.
Für niedrige Werte von Y wird N gleich Y sein. Für höhere Werte wird N größer als Y sein.
Soll das Ergebnis eines Tests in Beziehung zur wahrscheinlichsten Anzahl von Mikroorganismen pro Einheitsvolumen einer umfangreichen Probe gesetzt werden, müssen auch die Wahrscheinlichkeiten, die beim Probenahmeschritt beteiligt sind, berücksichtigt werden. Es sind Gleichungen entwickelt worden, die den Anteil von Abteilungen mit einem negativen Ergebnis (Abwesenheit von Analyt) zur wahrscheinlichsten Zahl von Analyt-Einheiten in der Probe in Beziehung setzen, und die zur Berechnung der Wahrscheinlichkeit eines jeden Ergebnisses verwendet werden können. Diese wurden von Cochran (1950; Biometrics 5, 105-116) in einer Übersicht dargestellt. Die Gleichungen können in ein Computerprogramm inkorporiert werden, um Ergebnistabellen für die Interpretation von Tests aufzustellen. Daraus können die wahrscheinlichste Zahl und die relevanten Zuverlässigkeitsgrenzen abgelesen werden.
In einer modifizierten Multivertiefungs-Platte zur Verwendung in der Erfindung ist eine Wand in jeder Vertiefung vorgesehen. Beispielsweise kann in einer kreisförmigen Vertiefung die teilende Wand linear sein, um zwei halbkreisförmige Abteilungen zu bilden, oder kreisförmig, um eine innere und äußere ringförmige Abteilung zu bilden. Alternativ kann die Wand zwischen zwei sonst diskreten Vertiefungen einen darin gebildeten Kanal aufweisen. Falls dies gewünscht wird, kann die Vertiefung in mehr als zwei Abteilungen unterteilt werden.
Eine solche erfindungsgemäße Vorrichtung kann verwendet werden, indem eine Probe bis zu einem Niveau oberhalb der teilenden Wand in die Vertiefung eingeführt wird, so daß die Probe in der gesamten Vertiefung gleich ist. Dann, vielleicht nach der Züchtung von Mikroorganismen oder einer anderen Manipulation des Vertiefungsinhalts, wird ein Teil des Inhalts entfernt, so daß das Niveau unterhalb jenes der Wand fällt. Nun befinden sich zwei unabhängige Proben mit derselben Zusammensetzung in jeder Abteilung, die unabhängig behandelt werden können, z.B. indem eine als Grundlage eines Experiments und die andere als Kontrolle verwendet wird.
Eine Vorrichtung der Erfindung und geeignet, um das Verfahren der Erfindung auszuführen, wird nun beispielhaft unter Bezug auf die Begleitzeichnungen beschrieben, in denen:
Fig. 1 eine Explosionsansicht einer Ausführungsform der Erfindung ist;
Fig. 2 und 3 Querschnittsansichten eines Teils der in Fig. 1 gezeigten Ausführungsform in verschiedenen Positionen sind; und
Fig. 4 eine perspektivische Ansicht eines Teils einer modifizierten Multivertiefungsplatte zur Verwendung in der vorhegenden Erfindung ist.
Fig. 1 zeigt eine Deckplatte 21 für einen oberen Verteiler 22, die zur Verhinderung des Eindringens von Staubpartikeln während der Filtration adaptiert ist. Der obere Verteiler 22 weist eine Anordnung von Trichtern 23 auf, die es erlauben, bis zu 12 einzelne Proben in die Vorrichtung einzuführen. Jede Anordnung oder Reihe von Kammern kann separat auf einem Anzeigefeld 24 auf der Oberfläche des Verteilers 22 identifiziert werden.
Der obere Verteiler 22 paßt auf den Hauptteil 25 des Verteilers. Dieser umfaßt eine Anordnung von 8 x 12 vertikal verlängerten Kammern 26 (die als Träger der Identifizierungsziffern 1-12 gezeigt sind), in welche die Probe nach der Einführung durch die Trichter des oberen Verteilers fließt.
Der Hauptverteiler 25 dient als Behälter für (eine) flüssige Probe (n). Er sitzt auf einer Multivertiefungs-Filtrierplatte 27, wobei die Vertiefungen 28 wiederum in einer 8 x 12 Anordnung vorliegen. Die Filtrierplatte 27, von herkömmlicher Art, weist Filtermaterial an der Grundfläche jeder Vertiefung auf. Sie kann zur Inkubation entfernt werden.
Die Platte 27 sitzt auf einem Grundelement 29, das durch eine Rohrleitung mit einer Vakuumpumpe (nicht gezeigt) verbunden ist. Die Basis 29 stellt eine Vakuumkammer und eine Plattform für die Filtrierplatte bereit, mit Innenstiften 30, welche die Platte 27 unterstützen und deren Einsturz verhindern, wenn angesaugt wird. Die Platte 27 ist mit der Basis 29 mittels entgegengesetzt einstellbaren Klammerelementen 31 verklammert, welche drei Positionen ermöglichen, d.h. offen (zur Konstruktion oder zur Zerlegung der Vorrichtung, z.B. zur Entfernung der Platte 27 für Inkubation), dazwischenliegend und geschlossen, jeweils durch durchgezogene, gepunktete und gepunktete Linien angezeigt.
Fig. 2 und 3 zeigen die Berührungspunkte der jeweiligen Ränder des Hauptverteilers 25 und der Filtrierplatte 27 und zeigen auch die Filtermembran 32, welche die Grundfläche der Vertiefungen in der Platte 27 bildet. Eine Dichtung 33 ist um den Rand der Filtrierplatte herum angeordnet und geeignet mit deren oberer Oberfläche verbunden.
Fig. 2 zeigt die anfängliche Verklammerung in der Zwischenposition eines Klammerelements 31, so daß eine Lücke zwischen dem Verteiler 25 und der Platte 27 vorhanden ist, was den Transfer von Flüssigkeit zwischen den Kammern zur Äquilibrierung erlaubt, wie durch Pfeile dargestellt. Fig. 3 zeigt die Verklammerung in der geschlossenen Position eines Klammerelements 31, worin jede korrespondierende Kammer 26 und Vertiefung 28 ein diskretes Volumen darstellt. Die in Fig. 3 gezeigte Konfiguration ist adaptiert zur Anwendung von vermindertem Druck in der Basis 29, um Flüssigkeit durch die Vertiefungen 28 zu ziehen.
Fig. 4 zeigt eine einzelne Vertiefung einer Multivertiefungs platte 41, die gemäß einem Aspekt dieser Erfindung modifiziert ist. Eine Vertiefung 42 mit größerem Durchmesser schließt eine kreisförmige Wand 43 ein, die eine innere Vertiefung 44 mit niedrigerer Höhe definiert.
Das folgende Verfahren veranschaulicht die Grundlage zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, um z.B. 1-50 Mikroorganismen in 100 ml (0,01 - 0,05 cfu/ml) nachzuweisen. Es kann 1 Liter oder jedes größere Volumen verwendet werden.
Um die Probe auf verschiedene Vertiefungen zu verteilen, wird eine wie in Fig. 1 der Zeichnung dargestellte Vorrichtung verwendet. Das vollständige Verfahren kann umfassen das Sammeln einer 100 ml-Probe in dem Verteiler/Behälter, das Plazieren des Behälters und der Filtriermikroplatte auf eine Saugpumpe und das Abziehen von Flüssigkeit, und das Zugeben eines ausgewählten flüssigen Mediums, welches ein Mikrobiologe normalerweise zur Durchführung von herkömmlichen Agarplatten- oder Flüssigkultur-Assays verwenden würde, zu jeder Vertiefung. Man läßt die Mikrotiterplatte inkubieren. Dann kann der Filter mit PBS oder ähnlichem gewaschen werden, um das Medium und irgendwelche anderen unerwünschten chemischen Bestandteile zu entfernen.
Jede Vertiefung, die ursprünglich mit einem Mikroorganismus inokuliert wurde, enthält nun viele Organismen. Die Anzahl der vorhandenen Organismen hängt von mehreren Faktoren ab, den Haupteinfluß werden jedoch die Wartezeit und die Verdopplungsrate der anwesenden Organismen darstellen.
Die Mikrotiterplatte wird dann einem Assay unterzogen, z.B. unter Verwendung eines Versuchsprotokolls bei dem zelluläres ATP freigesetzt und mittels Biolumineszenz nachgewiesen wird.
Unter der Annahme, daß der Hintergrund des Wachstumsmediums niedrig ist (wozu eine Behandlung erforderlich sein kann), würden die Resultate bei jeder Anzeige, die merklich höher als der Hintergrund des Mediums/Reagenzes ist, als positiv bewertet. Die Gesamtzahl an Positiven gibt die Minimalanzahl an Organismen in der ursprünglichen Probe.
Bei diesem Verfahren kann eine modifizierte Multivertiefungsplatte der Erfindung, z.B. wie in Fig. 4 dargestellt, eingesetzt werden, indem ausreichend Medium zu jeder Abteilung, die zwei Vertiefungen (42, 44) umfaßt, zugegeben wird, so daß das Medium in jeder Abteilung konfluent ist. Nach der Inkubation wird die Platte auf eine Absaugvorrichtung plaziert und das Medium abgezogen. Bei der Resuspendierung der Zellen als Bereitstellung für den Assay wird das Suspensionsmedium zu der Abteilung so zugegeben, daß keine Überlappung von Medium zwischen Vertiefungen stattfindet, z.B. durch Abziehen einiger Flüssigkeit. Auf diese Weise werden zwei Vertiefungen hergestellt, welche Zellen enthalten, die von mindestens einem Organismus stammen. Der Inhalt einer Vertiefung kann in dem Biolumineszenzverfahren (welches gegebenenfalls das Abtöten der Mikroorganismen beinhaltet, und welches die nachfolgenden Tests stören könnte) eingesetzt werden, während der Inhalt der anderen für andere Tests, z.B. der Identifizierung von Organismen, eingesetzt werden kann. In diesem Fall können die Identifizierungstests auf diejenigen Vertiefungen beschränkt werden, die durch Biolumineszenz mikrobielles Wachstum anzeigten.
Das folgende Beispiel erläutert wie die Erfindung zur Bestimmung der wahrscheinlichsten Zahlen (MPN) lebensfähiger Bakterien und ST-produzierenden E. coli, die in einer einzelnen Probe vorhanden sind, eingesetzt werden kann. Nicht-spezifische MPN wird durch "digitale" Zählung mittels ATP-Biolumineszenz erhalten. Der spezifische Nachweis und die Zählung von ST-Enterotoxin basiert auf dem Konkurrenz-Enzym-Immunoassay (EIA) -Format, unter Verwendung eines synthetischen Peptid Analogons und eines monoklonalen Antikörpers, um die Spezifität sicherzustellen.

BEISPIEL

Bakterien wurden in 50 ml-Kolben mit steriler CA-YE-Brühe inokuliert und bei 37ºC 18 Stunden lang in einem Orbital-Inkubator gezüchtet. Die Kulturen wurden mit PBS (pH 7,2) auf eine Endkonzentration von etwa 50 cfu/ml verdünnt, bevor 50 µl pro Vertiefung der Filter-Mikroplatte zugegeben wurden. Drei Kolonnen der Mikroplatte (24 Vertiefungen) repräsentierten Leerwerte (nur PBS); drei Kolonnen repräsentierten verdünnte ST- erzeugende E. coli (NCTC 11603); drei Kolonnen repräsentierten verdünnte Salmonella typhimurium (NCTC 64), als negative Kontrolle eingesetzt; und drei Kolonnen repräsentierten eine 1:1 v/v verdünnte E. coli/S. typhimurium-Probe. Nach dem Durchziehen der 50 µl-Proben unter Vakuum wurden 200 µl CA-YE-Brühe zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Platte wurde 18 Stunden lang bei 37ºC inkubiert.
1 µl-Proben wurden aus den Vertiefungen der inkubierten Filter-Mikroplatte entnommen, welche die gemischte Probe repräsentierten, und auf MacConkey's Agar ausgestrichen. Dieses Medium erlaubte die Unterscheidung zwischen gemischten und Monokulturen von E. coli und 5. typhimurium. Lactose-fermentierende E. coli bilden rote Kolonien auf MacConkey's-Agar, während Nicht-Lactose-fermentierende 5. thyphimurium farblose Kolonien bilden.
Das verbleibende Kulturmedium wurde unter Vakuum entfernt und in einer zweiten Mikrotiterplatte für den Enterotoxin-Assay gesammelt. Die filtrierte Mikrotiterplatte wurde vor der Entfernung mit 250 µl PBS unter Vakuum gespült. Ein ATP-Biolumineszenz-Assay wurde auf der Filterplatte unter Verwendung eines Mikroplatten-Luminometers durchgeführt.
Test- und Kontroll-Proben wurden zu synthetisch beschichteten Vertiefungen mit 200 µl pro Vertiefung zugegeben. Meerrettichperoxidase-konjugierter Anti-Toxin-Antikörper wurde mit 10 µl pro Vertiefung zugegeben, bevor gemischt und bei Raumtemperatur 90 Minuten lang inkubiert wurde. Nach der Inkubation wurden die Inhalte abgesaugt und verworfen. Die Platten wurden fünfmal gewaschen, bevor 100 µl an frisch hergestelltem Phenylendiamin-Wasserstoffperoxid-Substrat zugegeben wurden. Nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Reaktion durch Zugabe von 100 µl 1,5 N Schwefelsäure gestoppt. Die Extinktionen (A) wurden bei 490 nm abgelesen.
Tabelle 1 gibt die ATP-Biolumineszenz-Ergebnisse der verdünnten Bakterienproben an, welche in CA-YE-Brühe 18 Stunden lang gezüchtet wurden, und somit die MPN. Positive Ergebnisse repräsentieren Anzeigen, die mehr als zwanzig Standardabweichungen über dem Mittel liegen. Die MPN (Höchstwahrscheinlichkeitszahl) -Zahlenangaben weisen einen Zuverlässigkeitsbereich von 95% auf. TABELLE 1 Probe Positive E. coli S. typhimunum gemischt (E. coli/S. typhimunum)
Tabelle 2 faßt die Ausstrichplatten-Ergebnisse zusammen, welche die Züchtung von 1 µl-Proben aus den gemischten Probe- Vertiefungen der Mikrotiterplatte auf MacConkey's Agar repräsentieren. Es gelten die folgenden Abkürzungen: E = E. coli;
S = S. typhimurium; M = gemischt (E. coli und S. typhimurium);
B = Leerwert (kein Wachstum). TABELLE 2 Kolonne Reihe
Die vierundzwanzig Vertiefungen, welche die gemischte Probe repräsentieren, wurden auf Enterotoxin untersucht. Die Ergebnisse des Assays sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Positive Anzeigen für Enterotoxin (+) repräsentieren A 490 nm Anzeigen, die um mindestens 0,5 niedriger waren als der negative Kontrollwert (- = negativ für Enterotoxin). TABELLE 3 Kolonne Reihe
Das Beispiel bietet ein Mittel, um sowohl die Gesamtzahlen der lebensfähigen Organismen in einer Probe zu zählen als auch spezifisch ST-Enterotoxin-erzeugende E. coli nachzuweisen und zu zählen. Der Enterotoxin-Assay war imstande, die Anwesenheit von Enterotoxin in allen Vertiefungen nachzuweisen, welche die Toxin-erzeugenden E. coli enthielten, wie in den Tabellen 2 und 3 gezeigt. Dies schloß den Nachweis von Toxin sowohl in Monokulturen als auch in gemischten Bakterienkulturen ein. Diejenigen Mikrotiter-Vertiefungen, die entweder Monokulturen von S. typhimurium oder kein Wachstum enthielten, waren hinsichtlich der Anwesenheit von ST-Enterotoxin alle negativ. Eine MPN von 44,8 cfu/ml (95% Zuverlässigkeitsbereich 24,6-76,2) wurde für die gemischte Probe bestimmt, während 15 der 24 Vertiefungen, die diese Probe repräsentieren, ST-enterotoxigene E. coli (entsprechend einer MPN von 24,5 cfu/ml) enthielten.
Zusammenfassend stellt dieser Assay eine schnelle, empfindliche und verläßliche Technik für den Nachweis von ST-Enterotoxin in den Kulturfiltraten einer Filter-Mikrotiterplatte zur Verfügung.

Claims

1. Verfahren zur Analyse von Material in einer flüssigen Probe, welches die Schritte umfaßt:

Verteilen der Probe mittels Passage durch eine Anzahl diskreter Vertiefungen, die zum Zurückhalten des Materials adaptiert sind, wobei die Konzentration des Materials so ist, daß es mindestens in einer Vertiefung abwesend ist; und

Analyse der Vertiefungen auf die Anwesenheit von zurückgehaltenem Material.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Material DNA oder RNA ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Material Mikroorganismen umfaßt.

4. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, welches vor dem Analyse-Schritt den zusätzlichen Schritt umfaßt, daß in die Vertiefungen eine Substanz eingeführt wird, welche in Gegenwart von zurückgehaltenem Material ein Signal aussendet.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin die Substanz Biolumineszenz-Reagenzien umfaßt.

6. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, welches den zusätzlichen Schritt der Amplifizierung des zurückgehaltenen Materials oder der Nachweismittel seiner Anwesenheit umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin der Amplifizierungs Schritt die Einführung eines flüssigen Wachstumsmediums für das Material in die Vertiefungen umfaßt.

8. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Analyse-Schritt die Zugabe einer oder mehrerer Sonde (n) für das Material und die Analyse der Vertiefungen auf Nachweismittel einer Reaktion zwischen einer Sonde und dem Material umfaßt.

9. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche zur Zählung des Materials, welches umfaßt, daß die Anzahl von Vertiefungen, in denen Material zurückgehalten wird, als Funktion der Gesamtzahl der Vertiefungen berechnet wird.

10. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Analyse-Schritt die Identifizierung des Materials, das in einer oder mehrerer der Vertiefungen zurückgehalten wird, umfaßt.

11. Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Vertiefungen in einem integrierten Element vorliegen und deren Grundflächen durch Filtermaterial definiert sind.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin die Probe die Vertiefungen unter Anwendung von vermindertem Druck passiert.

13. Vorrichtung, die zur Verwendung in einem Verfahren zur Analyse von Material in einer flüssigen Probe adaptiert ist, welche umfaßt die Kombination von:

einer Einheit (27), die eine Anzahl von diskreten Vertiefungen (28) umfaßt, welche adaptiert sind, um das Material zurückzuhalten und den Durchtritt von Flüssigkeit unter Anwendung von vermindertem Druck erlauben;

einem Behälter (25) für die Probe, umfassend eine Vielzahl von Kammern (26), die jeweils mit einer Vertiefung korrespondieren;

Mitteln, um unter vermindertem Druck Flüssigkeit aus dem Behälter und durch die Vertiefungen zu ziehen;

und

Mitteln (31), um den Behälter relativ zur Einheit entweder in einer ersten fixierten Position (Fig. 2) , wo eine flüssige Probe zwischen den Kammern über der Einheit passieren kann, oder einer zweiten fixierten Position (Fig. 3), wo jede korrespondierende Kammer und Vertiefung ein diskretes Volumen definieren, zu halten, während eine periphere Flüssigkeitsabdichtung (33) aufrechterhalten wird.

14. Vorrichtung nach Anspruch 13, worin jede Vertiefung (42) in zwei oder mehr Abteilungen (42, 44) durch eine oder mehrere Wände (43) aufgeteilt ist, deren Höhe geringer als jene der Vertiefung (42) ist.

15. Vorrichtung nach Anspruch 13 oder Anspruch 14, worin die Grundflächen der Vertiefungen durch Filtermaterial definiert sind.