DE69026602T2

DE69026602T2 - Vorrichtung und verfahren zum testen der antimikrobiellen empfindlichkeit von mikroorganismen

Info

Publication number: DE69026602T2
Application number: DE69026602T
Authority: DE
Inventors: Rebecca D. Woodland Ca 95695 Fields; Michael V. Woodland Ca 95695 Lancaster
Original assignee: ALAMAR BIOSCIENCES LAB Inc
Current assignee: ALAMAR BIOSCIENCES LAB Inc
Priority date: 1989-01-17
Filing date: 1990-01-16
Publication date: 1997-01-09
Anticipated expiration: 2010-01-17
Also published as: EP0454784B2; EP0454784A1; EP0454784B1; ATE136939T1; EP0454784A4; ES2089009T5; WO1990008196A1; DE69026602D1; CA2044265C; ES2089009T3; CA2044265A1; DE69026602T3; JP2001112498A; JP3741598B2; AU5040990A; JPH04502707A

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft allgemein Vorrichtungen und Verfahren zur Prüfung der Empfindlichkeit eines Mikroorganismus gegenüber Wachstumshemmung durch ein antimikrobielles Produkt. Diese Erfindung betrifft sowohl Prüfung auf qualitative Empfindlichkeit als auch quantitative Empfindlichkeit von Mikroorganismen.

Stand der Technik im allgemeinen

Quelle von Organismen und Kultivierung für Testzwecke

Zu untersuchende Mikroorganismus-Proben können dem Labor von einer Anzahl von Quellen geliefert werden. Die Proben können von Ärzten in ihren Praxen gesammelt werden und zu einem zentralen Test-Labor geschickt werden oder die Proben können von Patienten in einem Krankenhaus gesammelt werden, an das das Labor angegliedert ist. Die Proben können von verschiedenen Teilen des Körpers, z.B. von zerebralem Spinalfluid, einem Abszeß, einer infizierten Wunde, einer Genitalinfektion usw. stammen. Die gesammelten Proben werden auf einer primären Agarplatte gemäß normaler Laborpraxis kultiviert. Von den Bakterienkolonien auf der primären Kulturplatte wird ein Impfstoff gemäß einem bekannten Verfahren hergestellt, welches eine bakterielle Suspension einer vorbestimmten Konzentration erzeugt. Weiteres Bearbeiten des Impfstoffs hängt von der für die Empfindlichkeitsprüfung zu verwendenden Vorrichtung und dem zu verwendenden Verfahren ab.

Vorrichtungen und Verfahren zur Empfindlichkeitsprüfung

Der Zweck der Empfindlichkeitsprüfung ist, dem betreffenden Arzt Informationen für den möglichen Erfolg der antibiotischen Wirkstoff-Therapie bereitzustellen, die bereits begonnen worden ist. Der Arzt wird im allgemeinen ein antimikrobielles Produkt, im allgemeinen antibiotischer Wirkstoff genannt, verschreiben, welches verabreicht werden soll, bevor die Testergebnisse bekannt sind, aber es ist oftmals wichtig für den Arzt zu erfahren, ob das antimikrobielle Produkt und die gegebene Konzentration erfolgreich den Mikroorganismus abtöten werden, der die Infektion verursacht. Nachdem die Testergebnisse erhalten worden sind, kann der Arzt die Wirkstoff-Therapie verändern, falls die Testergebnisse zeigen, daß es einen Grund gibt, das zu tun.
US-A-4,385,115 offenbart ein Identifizierungsverfahren für Mikroorganismen, in dem Mikroorganismen auf einem Substrat gewachsen werden, umfassend einen Wachstumsindikator, wie etwa Resazurin.

Qualitative gegen quantitative Empfindlichkeitsprüfung

Der Ausdruck "qualitatiave Empfindlichkeitsprüfung" bezieht sich auf Testvorrichtungen und Verfahren, die Testergebnisse erzeugen, die im allgemeinen anzeigen, ob ein Organismus gegenüber einem speziellen antimikrobiellen Produkt empfindlich oder resistent ist. Abhängig von dem involvierten Verfahren werden nur ein oder zwei Konzentrationen eines antimikrobiellen Produkts verwendet. Der Grad der Empfindlichkeit oder Resistenz wird in der qualitativen Empfindlichkeitsprüfung nicht berichtet.
Der Ausdruck "quantitative Empfindlichkeitsprüfung" betrifft Testvorrichtungen und Verfahren, die Testergebnisse erzeugen, die Daten für die Konzentration des antimikrobiellen Produkts bereitstellen, die ausreicht, um Wachstum des Mikroorganismus zu hemmen. Typischerweise werden 6 oder mehr unterschiedliche Verdünnungen des antimikrobiellen Produkts verwendet, welche den therapeutischen Konzentrationsbereich des antimikrobiellen Produkts abdecken. Der Ausdruck "minimale Hemmkonzentration (MIC, Minimum Inhibitory Concentration) wird oftmals verwendet, um auf das durch quantitative Empfindlichkeitsprüfung erhaltene Ergebnis hinzuweisen und wird als die minimale Konzentration des antimikrobiellen Produkts definiert, welche Hemmung des Wachstums des Mikroorganismus erzeugt.
Der Ausdruck "antimikrobielles Produkt" wird hierin verwendet, um ein Produkt zu bezeichnen, das eine Reihe von antimikrobiellen Mitteln (d.h. einzelne Antibiotika) in vorbestimmten Konzentrationen enthält und ist somit eine allgemeine Bezeichnung für einen einzelnen antibiotischen Wirkstoff oder eine Formulierung mit breitem Spektrum, die mehr als ein antibiotisches Mittel enthält.

Vorrichtungen und Verfahren zur qualitativen Empfindlichkeitsprüfung

Scheibendiffusion auf Kirby/Bauer-Platten (Figur 1A)

Scheibendiffusion ist ein Verfahren zur qualitativen Empfindlichkeitsprüfung, welches eine Platte 10 bedeckt mit einem Wachstumsmedium für die Mikroorganismen, typischerweise Kirby/Bauer-Platte genannt, eine Inoculum-Lösung und eine Vielzahl von Papierscheiben 11, auf denen ein antimikrobielles Produkt gelagert wurde, benutzt. Die Platte kann 150 mm im Durchmesser sein und die Scheiben 6 mm im Durchmesser. Die den Mikroorganismus enthaltende Inoculum-Lösung wird auf die Platte geschichtet und bildet einen gleichmäßigen Rasen des Organismus. Die Papierscheiben werden dann auf die Platte an getrennten Orten aufgebracht und die Platte wird dann in einen Inkubator gelegt, um Wachstum des Mikroorganismus zu ermöglichen. Figur 1A veranschaulicht ein Beispiel des Aussehens der Platte nach Inkubation. Der die Scheiben umgebende Bereich von Hemmung kann von 0 bis 25 oder 30 mm variieren.
Während der Inkubation diffundiert das antimikrobielle Produkt in der Scheibe in den Mikroorganismus-Rasen und bildet eine kontinuierliche Verteilung von unterschiedlichen Konzentrationen das antimikrobiellen Produktes. Wachstum des Mikroorganismus wird typischerweise in der zentralen Region des diffundierten Bereiches gehemmt, wo die Konzentration des antimikrobiellen Produkts am größten ist, falls der Mikroorganismus gegenüber dem antimikrobiellen Produkt nicht hochresistent ist. Bei einigen Radien von dem Mittelpunkt der Scheibe kann Wachstum der Mikroorganismen gesehen werden. Die Größe des Hemmbereiches um eine spezielle Scheibe ergibt eine Andeutung der Empfindlichkeit des Mikroorganismus gegenüber dem speziellen antimikrobiellen Produkt darauf.
Figur 1A und Tabelle I (am Ende dieser Beschreibung zu finden) veranschaulichen ein typisches Beispiel von einigen der verwendeten antimikrobiellen Produkte und die Ergebnisse der Auswertung eines Scheibendiffusions-Tests
Die Hauptvorteile des Scheibendiffusions-Verfahrens sind Flexibilität bei der Auswahl von antimikrobiellen Produkten zur Untersuchung und einfacher Aufbau des Tests. Scheibenlagerung und Abgabesysteme wurden zur gleichzeitigen Abgabe einer Vielzahl von Scheiben, die unterschiedliche antimikrobielle Produkte enthalten, auf die Platte an richtig getrennten Orten entwickelt. Das Abgabesystem kann mit verschiedenen Scheibenlagerungs-Modulen beladen werden, die dem Benutzer vollständige Flexibilität bei der Auswahl der in jeder Probe- Testsituation zu verwendenden antimikrobiellen Produkte gibt. Der Hauptnachteil ist, daß die "empfindlich" und "resistent" Beurteilung der Testergebnisse auf erreichbaren Serumgehalten eines Antibiotikums basieren, welche mit den erreichbaren antibiotischen Gehalten an Infektionsstellen außer Blut nicht gut korrelieren können. Dies trifft für alle qualitativen Empfindlichkeitsprüfungs-Verfahren zu. Andere Nachteile sind der schwierige und zeitaufwendige Vorgang von Ablesen und Auswerten des Tests unter Verwendung eines Lineals, um die Bereichsgröße zu messen und Hinzuziehen einer Tabelle zur Auswertung. Ein weiterer ist, daß Unterschiede bei der Beurteilung von "empfindlich" und "resistent" oft nur ein paar Millimeter beträgt, so daß Fehler aufgrund von Variationen bei der Testmethodik auftreten können, die von schwerem Inoculum oder anderen Variationen resultieren. Die Scheibendiffusions- Methodik begrenzt auch die Anzahl von antimikrobiellen Produkten, die auf einer Platte untersucht werden können.

Durchbruchpunkt - Testplatten (Figur 1B)

Ein anderer Ansatz zur qualitativen Prüfung der Empfindlichkeit umfaßt die Verwendung eines Testplattensytems mit vielen Vertiefungen, welche Durchbruchpunkt-Testplattensysteme oder Kirby/Bauer-Testplattensysteme genannt werden. Wie in Figur 1B gezeigt, nutzen Durchbruchpunkt-Testplattensysteme typischerweise eine Testplatte 20 mit vielen Vertiefungen mit einer negativen Wachstums-Kontrollvertiefung 21, einer positiven Wachstums-Kontrollvertiefung 22, einem ersten Plattenabschnitt 23, in dem zwei verschiedene Verdünnungen von vielen mikrobiellen Produkten verwendet werden, und einen zweiten Plattenabschnitt 24, in dem nur eine Verdünnung von jedem von mehreren antimikrobiellen Produkten vorliegt. Die Testvertiefungen der Platte werden mit einer Abkürzung des verbundenen antimikrobiellen Produkts markiert und die Konzentration in der Vertiefung wird in Mikrogramm pro Milliliter angegeben. Tabelle II am Ende der Beschreibung gibt die in diesem Beispiel einer Durchbruchpunkt-Platte des Standes der Technik verwendeten antimikrobiellen Produkte und Durchbruchpunkt -Konzentrationen an.
Die negative Wachstums-Kontrollvertiefung 21 enthält nur Wachstumsmedium und wird nicht mit dem Mikroorganismus geimpft. Sie wird hauptsächlich verwendet, um die Platte auf Verunreinigung zu beobachten. Wenn in der positiven Wachstums- Kontrollvertiefung Wachstum des Organismus nach der Inkubation detektiert wird, wird die Platte verworfen und der Test muß wiederholt werden. Die positive Wachstums-Kontrollvertiefung 22 enthält Wachstumsmedium, aber kein antimikrobielles Produkt und wird mit dem Mikroorganismus geimpft. Die positive Wachstums- Kontrollvertiefung dient dem Zweck zu zeigen, daß das Wachstumsmedium in der Platte fähig ist, den Mikroorganismus bei Nichtvorliegen eines antimikrobiellen Produktes wachsen zu lassen. Wenn kein Wachstum des Mikroorganismus in der postiven Wachstumskontroll-Vertiefung vorliegt, ist der Test ungültig und muß auf einer anderen Testplatte wiederholt werden.
Jede der mit den antimikrobiellen Produkten verbundenen Testvertiefungen enthält Wachstumsmedium und eine bekannte Konzentration des zugefügten antimikrobiellen Produkts. Diese Testchemikalien werden in die Vertiefungen abgeschieden und dann entweder eingefroren oder getrocknet. Gefrorene Platten werden gerade vor der Inokulation aufgetaut. Getrocknete Platten werden zur Zeit der Inokulation mit dem Mikroorganismus rehydratisiert unter Verwendung einer getrennten Rehydratation der negativen Wachstumskontroll-Vertiefung mit einer sterilen Rehydratisierungslösung.
Die zwei verschiedenen Konzentrationen von jedem antimikrobiellen Produkt im Plattenabschnitt 23 werden ausgewählt, um Information zu ergeben, ob ein spezieller Mikroorganismus gegenüber dem antimikrobiellen Produkt empfindlich oder resistent ist. Die Konzentrationen basieren auf Korrelation der Testergebnisse mit den Scheibendiffusions- Testverfahren und Ergebnissen, wie oben beschrieben.
Jede der positiven Wachstums-Kontrollvertiefungen und der mit jedem antimikrobiellen Produkt verknüpften Vertiefungen werden mit einer vorbestimmten gleichmäßigen Konzentration des Mikroorganismus geimpft. Die Platte wird dann inkubiert, typischerweise über Nacht, und dann visuell ausgewertet. Wenn die negative Wachstums-Kontrollvertiefung und die positive Wachstums-Kontrollvertiefung zeigen, daß die Platte zur Auswertung geeignet ist, wird jedes Paar von Testvertiefungen im Plattenbereich 23 oder die einzelne Testvertiefung im Plattenbereich 24 verknüpft mit den antimikrobiellen Produkten inspiziert, um zu bestimmen, welche Vertiefungen Wachstum des Mikroorganismus zeigen.
Bezugnehmend auf den Plattenabschnitt 23 mit zwei Verdünnungen ist das Testergebnis für dieses antimikrobielle Produkt "resistent", wenn der Mikroorganismus in jeder der beiden Vertiefungen wächst. Wenn der Mikroorganismus in keiner Vertiefung wächst, ist das Testergebnis "empfindlich". Wenn der Organismus in der Vertiefung mit geringerer Konzentration wächst und in der Vertiefung mit höherer Konzentration nicht wächst, ist das Testergebnis "unbestimmt". Wenn der Organismus in der Vertiefung mit höherer Konzentration und nicht in der Vertiefung mit geringerer Konzentration wachsen würde, würde dies einen fehlgeschlagenen Test anzeigen.
In dem Plattenabschnitt 24 mit einer einzelnen Verdünnung werden empfindlich und resistent als Testergebnisse, abhängig vom Wachstum oder Nichtwachstum in der einzelnen Vertiefung genannt. Wenn Wachstum vorliegt, ist der Mikroorganismus bei dem Gehalt an antimikrobiellem Produkt resistent; und wenn kein Wachstum vorliegt, ist der Mikroorganismus bei diesem Gehalt empfindlich.
Der Hauptvorteil von qualitativen Empfindlichkeit-Testplatten gegenüber Scheibendiffusions-Untersuchungen und quantitativen Empfindlichkeits-Testplatten, die unten diskutiert werden, ist, daß eine größere Zahl von antimikrobiellen Produkten in der Testplatte verwendet werden kann, da nur ein oder zwei Verdünnungen pro antimikrobiellem Produkt erforderlich sind.
Ein anderer Vorteil ist, daß die Platte im Verhältnis leichter und schneller als Scheibendiffusions-Testergebnisse auszuwerten ist.
Der Hauptnachteil von Durchbruchpunkt-Testplatten ist der gleiche wie der oben für Scheibendiffusions-Untersuchungen diskutierte. Zusätzlich stellen gegenwärtig erhältliche qualitative Empfindlichkeits-Testplatten keine Flexibilität bei der Untersuchung von Proben mit vom Anwender ausgewählten antimikrobiellen Produkten bereit, wenn der Anwender nicht ausreichende Mengen erwirbt, so daß der Hersteller bereit ist, eine Platte auf Bestellung zu machen. Im allgemeinen hat der Hersteller die auf die Platte auf zubringenden antimikrobiellen Produkte vorgewählt und der Anwender nimmt die Platte, wie sie geliefert wird. Der Hersteller kann einen Wirkstoff entfernen, für den der Anwender ein beträchtliches Untersuchungsinteresse hat. Es gibt üblicherweise eine Zeitverzögerung beim Aufbringen von neu erhältlichen Wirkstoffen auf kommerzielle Testplatten. In beiden Fällen muß der Anwender andere Testanordnungen machen, wenn Prüfen des Mikroorganismus gegen diese antimikrobiellen Produkte erforderlich ist.

Quantitative Empfindlichkeitsprüfung

Manuelle Auswertesysteme

Die meisten quantitativen Empfindlichkeitsprüfungen, die heutzutage in klinischen Laboratorien gemacht werden, verwenden Testplatten mit vielen Vertiefungen mit vielen Verdünnungen von 12 bis 23 unterschiedlichen antimikrobiellen Produkten zusammen mit einer negativen Wachstums-Kontrollvertiefung und einer positiven Wachstums-Kontrollvertiefung. Die meisten Auswertungen von solchen Platten werden manuell durch visuelles Auswerten der Platte gemacht. Visuelles Auswerten umfaßt Sehen nach Trübheit in der Testvertiefung als Indikator von Organismuswachstum. Alle Testvertiefungen für jedes antimikrobielle Produkt werden inspiziert und die Vertiefung mit der geringsten Konzentration des antimikrobiellen Produkts, in dem keine Trübheit vorliegt, ist die MIC.
Die Figuren 2A und 2B veranschaulichen ein Daten- Aufzeichnungssystem zur Testplatten-Auswertung, welches durch das U.S. Patent 4,453,220 von Lancaster et al. abgedeckt ist. Dieses allgemeine System ist typisch für die visuellen Auswerte- und Datenerfassungs-Systeme auf Computerbasis des Standes der Technik. Die in Figur 2A gezeigten antimikrobiellen Produkte und Verdünnungen sind typisch für die MIC- Testplattentechnologie zu der Zeit, als das '220-Patent eingereicht wurde. Andere antimikrobielle Produkte und Verdünnungen können in der gegenwärtigen MIC-Testplatten- Technologie verwendet werden.
Die Figuren 2A und 2B veranschaulichen, daß eine MIC-Testplatte 30 mit einer Identifikationsplatte 40 für den Mikroorganismus verknüpft sein kann. Eine in Figur 2A gezeigte Tastatur- Schablone entspricht dem Testvertiefungs-Muster in der MIC- Platte 30 und der ID-Platte 40 und paßt auf den Tastaturabschnitt 70 des Dateneingangssystems 60. Die Platten 30 und 40 passen in einen von hinten beleuchteten Ablese- Abschnitt 80, welcher die Testvertiefungen von hinten beleuchtet, um es einfacher zu machen, zu bestimmen, ob in den Testvertiefungen Trübheit vorliegt. Beim Auswerten der MIC- Platte 30 drückt der Techniker die Taste auf dem Tastaturabschnitt 70, die der Vertiefung mit der geringsten Konzentration des zugefügten antimikrobiellen Produkts entspricht, in der der Mikroorganismus nicht wächst. Dies ist der MIC-Wert für dieses antimikrobielle Produkt. Das Instrument 60 zeichnet diesen MIC-Wert für dieses antimikrobielle Produkt auf und druckt ihn später auf ein Testbericht-Formblatt. Weitere Einzelheiten dieses manuellen Auswerte- und Datenerfassungs- und -drucksystems können in dem oben bezeichneten Patent gefunden werden.
Der Hauptvorteil von quantitativen Empfindlichkeit-Testplatten ist die durch die Testergebnisse bereitgestellte quantitative Information. Die tatsächliche Konzentration eines antimikrobiellen Produkts, die Wachstum des Mikroorganimus hemmt, wird bestimmt und kann vom Arzt verwendet werden, um ein geeignetes antimikrobielles Produkt und eine geeignete Dosierung für die betreffende Infektion auszuwählen, oder eine bereits begonnene anfängliche Wirkstoff-Therapie zu bestätigen.
Die Hauptnachteile von MIC-Testplatten sind die begrenzte Anzahl von antimikrobiellen Produkten und Konzentrationen, die zur Untersuchung auf der Platte verfügbar sind und die festgelegte Auswahl der antimikrobiellen Produkte durch den Hersteller. Während ein großer Anwender Platten nach Maß mit ausgewählten antimikrobiellen Produkten bestellen kann, haben die meisten Anwender keine Kontrolle über die antimikrobiellen Produkte auf der Platte.
Ein zusätzlicher Nachteil ist die oftmals begegnete Schwierigkeit zu bestimmen, ob in einer speziellen Testvertiefung Wachstum vorliegt oder nicht. Manchmal ist die Trübheitsmenge gering und schwierig zu sehen, und in anderen Fällen kann es das Organismus-Wachstumsmuster schwierig machen, Wachstum nachzuweisen.

Automatisierte Auswertesysteme

Automatisierte Auswertesysteme zur Bestimmung von Wachstum oder Nichtwachstum des Mikroorganismus in quantitativen Empfindlichkeits-Testplatten sind erhältlich. Die Auswertung basiert entweder auf der Detektion von Trübheit in den Testvertiefungen der Platte oder auf Detektion der Herstellung von spezifischen Enzymen durch den Mikroorganismus unter Verwendung von spezifischen fluoreszierenden Substraten.
Es gibt zwei Grundarten von automatisierten Auswertesystemen: solche die Inkubation der Testplatte über Nacht vor der Auswertung umfassen und solche, die Auswertung nach 4 bis 6 Stunden Inkubation umfassen. Die letzteren werden üblicherweise als schnelle Systeme bezeichnet. Die automatisierten Auswertesysteme für Testplatten, die Inkubation über Nacht erfordern, verwenden Trübungsauswertung mit einer Art optischer Messung unter Verwendung von Lichttransmission. Deshalb erfordern alle eine klare Testplatte und klare Medien in den Testvertiefungen der Platte. Ein gleichmäßiger optischer Weg erfordert hochqualitativen Kunststoff und Kontrolle der Testvertiefungs-Flüssigkeit hinsichtlich Volumen und Konsistenz optischer Parameter. In dieser Art automatisierter Auswertung kann die Testplatte sowohl visuell als auch automatisch ausgewertet werden.
Die schnellen automatisierten Auswertesysteme verwenden entweder Trübungsauswertung oder Fluoreszenz-Auswertung. Die in diesen Systemen umfaßten Testplatten können nicht visuell zur Unterstützung der automatisierten Auswertung oder zur Bestatigung der Ergebnisse ausgewertet werden, wenn vermutet wird, daß das automatisierte System nicht richtig funktioniert.
Der einzige Vorteil der automatisierten Auswerter für Übernacht-Testplatten ist die Arbeitseinsparung beim Auswerten und Berichten der Daten von der Testplatte. Die Testergebnisse sind nicht genauer als die durch visuelles Auswerten durch einen Fachmann erzeugten. Der Hauptnachteil dieser Auswertesysteme sind die Kosten des Systems und die Möglichkeit von Maschinenfehlern beim Auswerten und Interpretieren von schwierigen Wachstumsmustern einiger Mikroorganismen.
Der Vorteil von schnellen automatisierten Auswertesystemen ist die Arbeitseinsparung beim Auswerten und Berichten der Daten und das frühere Berichten von Testergebnissen. Wie oben bemerkt, ist ein Nachteil dieser Systeme, daß die Testplatten nicht visuell zur Unterstützung der Maschinen-Auswertung ausgewertet werden können.

Aufgaben der Erfindung

Es ist die Hauptaufgabe dieser Erfindung, verbesserte Vorrichtungen und Verfahren zur Prüfung antimikrobieller Empfindlichkeit von Mikroorganismen bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, Vorrichtungen und Verfahren zur Prüfung antimikrobieller Empfindlichkeit von Mikroorganismen mit verbesserter Einfachheit der Auswertung der Testplatte bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, Vorrichtungen und Verfahren zur Prüfung antimikrobieller Empfindlichkeit von Mikroorganismen mit verbesserter colorimetrischer und Fluoreszenz -Auswertung der Testplatten bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, Vorrichtungen und Verfahren zur Prüfung der qualitativen Empfindlichkeit von Mikroorganismen mit verbesserter Flexibilität der Auswahl der antimikrobiellen Produkte bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, Vorrichtungen und Verfahren zur Prüfung der quantitativen Empfindlichkeit von Mikroorganismen mit verbesserter Flexibilität der Auswahl der antimikrobiellen Produkte bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, Vorrichtungen und Verfahren zur Prüfung der Empfindlichkeit von Mikroorganismen bereitzustellen, worin die Testplatten manuell oder automatisch ausgewertet werden können.

Merkmale und Vorteile der Erfindung

Ein Gegenstand dieser Erfindung kennzeichnet ein Verfahren zur Prüfung der Empfindlichkeit eines Mikroorganismus gegenüber Wachstumshemmung durch eine vorgewählte Konzentration eines antimikrobiellen Produktes, welches Vorbereiten einer negativen Wachtums-Kontrollvertiefung oder eines Aufnahmegefäßes zur negativen Wachstumskontrolle und einer positiven Wachstums- Kontrollvertiefung oder eines Aufnahmegefäßes zur positiven Wachstumskontrolle umfaßt, unter Verwendung der Schritte:
Einbringen einer vorbestimmten Konzentration eines Wachstumsmediums für Mikroorganismen und einer vorbestimmten Konzentration an Resazurin, das vorher in einem Konzentrationsbereich festgesetzt wurde, der durch geringe Toxizität gegenüber Mikroorganismen und beträchtliche Empfindlichkeit gegenüber Reduktion zu Resorufin durch Metaboliten des Mikroorganismus-Wachstums gekennzeichnet ist, in jeweils ein Aufnahmegefäß zur negativen Wachstumskontrolle und ein Aufnahmegefäß zur positiven Wachstumskontrolle; und Einbringen einer vorbestimmten Konzentration des Mikroorganismus in das Aufnahmegefäß zur positiven Wachstumskontrolle.
In diesem Verfahren wird ein Test-Aufnahmegefäß hergestellt durch die Schritte:
Einbringen der vorgewählten Konzentration des antimikrobiellen Produkts in ein Testaufnahmegefäß;
Einbringen der vorbestimmten Konzentration von Resazurin in das Testaufnahmegefäß;
Einbringen der vorbestimmten Konzentration des Wachstumsmediums in das Testaufnahmegefäß und
Einbringen der vorbestimmten Konzentration des Mikroorganismus in das Testaufnahmegefäß.
Danach werden alle Aufnahmegefäße zusammen für eine Inkubationszeitdauer inkubiert, die mit einem vorgewählten Meßprotokoll verbunden ist, umfassend ein Meßprotokoll mit sichtbarem Licht oder ein Meßprotokoll mit Fluoreszenzanregung. Nach der Inkubationszeitdauer werden die Aufnahmegefäße gemäß dem vorgewählten Meßprotokoll ausgewertet, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Wachstum des Mikroorganismus in dem Testaufnahmegefäß auf der Grundlage der relativen Konzentrationen von Resazurin und Resorufin darin zu bestimmen.
Das Meßprotokoll mit sichtbarem Licht umfaßt einen Entscheidungsalgorithmus, der auf mindestens einer vorbestimmten funktionellen Kombination der in jedem der Aufnahmegefäße detektierten Farbe der sichtbaren Lichtreflexion basiert. Das Meßprotokoll mit Fluoreszenzanregung umfaßt einen Entscheidungsalgorithmus, der auf mindestens einer vorbestimmten funktionellen Kombination der Werte des Fluoreszenzemissionssignals basiert, das durch das Reduktionsprodukt Resoruf in in jedem der Aufnahmegefäße erzeugt wird.
Einer der Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Verfügbarkeit der zwei unterschiedlichen Meßprotokolle von der gleichen Testmethodik. Sowohl das Meßprotokoll mit sichtbarem Licht als auch das Meßprotokoll mit Fluoreszenzanregung können automatisiert werden und das letztere kann in einem schnellen Testprotokoll verwendet werden, um Wachstum oder Nichtwachstum in einer Inkubationszeitdauer von 4 bis 6 Stunden zu bestimmen. Ein weiterer Vorteil ist, daß visuelles Auswerten gemäß dem Meßprotokoll mit sichtbarem Licht deutlich vereinfacht wird durch die Verwendung der Farbänderung von der ursprünglichen blauen Farbe von Resazurin zu der roten Farbe von Resorufin, wenn der Mikroorganismus in der Testvertiefung gewachsen ist. In Seite-an-Seite-Vergleichen mit visueller Auswertung der Trübheit wurde gezeigt, daß Auswerten von Wachstum mit Farbänderung schneller und einfacher ist.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen die Schritte zur Herstellung des Testaufnahmegefäßes zuerst Bilden eines Testmoduls in dem Testaufnahmegefäß, umfassend ein trockenes Feststoffvolumen einer vorbestimmten Menge des antimikrobiellen Produkts und ein trockenes Feststoffvolumen eines vorgewählten Teilsatzes der Bestandteile eines Testchemikaliensatzes, umfassend Resazurin und das Wachstumsmedium; und dann Zugeben eines Flüssigkeitsvolumens in die Testvertiefung, worin die vorbestimmte Konzentration des Mikroorganismus und alle nicht in dem Testmodul enthaltenen Bestandteile des Testchemikaliensatzes enthalten sind, um das Testmodul vor der Inkubation zu rehydratisieren. Bevorzugt umfaßt der Testchemikaliensatz einen vorgewählten Puffer zur Kontrolle des endgültigen pH-Wertes der rehydratisierten Testchemikalienlösung und ein vorgewähltes Redox- Stabilisierungsmittel, das durch wesentliche Verringerung der Reduktion von Resazurin durch das Wachstumsmedium während des Inkubationsschrittes gekennzeichnet ist.
Es ist auch bevorzugt, ein Trägermedium, wie etwa eine absorbierende Papierscheibe, in den Aufnahmegefäßen zu verwenden, wobei die Testchemikalien in jedem Aufnahmegefäß in das Trägermedium eingetrocknet sind. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt Flexibilität beim Unterbringen unterschiedlicher Komponenten des Testchemikaliensatzes in dem Trägermedium oder der rehydratisierenden Flüssigkeit bereit, aber es ist im allgemeinen bevorzugt, daß alle Testchemikalien- Bestandteile in dem Trägermedium untergebracht sind, so daß die rehydratisierende Flüssigkeit nur den in die positive Wachstums-Kontrollvertiefung und die Testvertiefung zu gebenden Mikroorganismus enthalten muß.
Das Verfahren dieser Erfindung erlaubt vorteilhaft die Verwendung von Standard-Wachstumsmedien in dem Testchemikaliensatz, und die Verwendung des Trägermediums stellt Flexibilität bei der Auswahl der zu verwendenden antimikrobiellen Produkte bereit, wenn das erfindungsgemäße Verfahren in Verbindung mit qualitativen Empfindlichkeits- Testplatten oder quantitativen Empfindlichkeits-Testplatten verwendet wird. Solche Platten können vollständig vorbeladene Platten sein und den Vorteil der Einfachheit der Auswertung dieser Erfindung liefern. Die Platten können vollständig beladbar sein durch Verwendung des getrockneten Trägermediums, bevorzugt in der Form von absorbierenden Papierscheiben mit dem antimikrobiellen Produkt und der Konzentration darauf aufgedruckt, um dem Anwender vollständige Flexibilität bei der Auswahl von antimikrobiellen Produkten und Konzentrationen zu geben. Zusätzlich können Testplatten mit einer Kombination von beladenen Testmodulen und leeren Testvertiefungen zur Beladung von anwenderausgewählten Testmodulen geliefert werden.
Testkits mit Scheibenabgabemitteln und anderen Testbestandteilen können gemäß dieser Erfindung bereitgestellt werden, um Einbringen von Scheiben in die Testvertiefungen zu einem einfachen Verfahren zu machen.
Andere Aufgaben, Merkmale und Vorteile dieser Erfindung werden durch Betrachtung der unten angegebenen genauen Beschreibung in Verbindung mit den begleitenden Figuren offensichtlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen:

Figur 1A veranschaulicht die Ergebnisse eines Scheiben- Diffusionstests auf einer Kirby/Bauer-Platte gemäß dem Stand der Technik.
Figur 1B veranschaulicht eine qualitative Empfindlichkeits-Testplatte gemäß dem Stand der Technik.
Figuren 2A und 2B veranschaulichen eine quantitative Empfindlichkeit-Testplatte und ein manuelles Auswerte- und Datenerfassungssystem gemäß dem Stand der Technik.
Figur 3 veranschaulicht das allgemeine Verfahren und die Vorrichtung zur Bestimmung der Empfindlichkeit eines Mikroorganismus gegenüber Wachstumshemmung durch ein antimikrobielles Produkt gemäß dieser Erfindung.
Figuren 4 bis 8 veranschaulichen ein Meßprotokoll mit sichtbarem Licht gemäß dieser Erfindung.
Die Figuren 9 bis 12 veranschaulichen verschiedene alternative Ausführungsformen des Verfahrens und der Vorrichtung zur Bestimmung der Empfindlichkeit eines Mikroorganismus gegenüber Wachstumshemmung durch ein antimikrobielles Produkt gemäß dieser Erfindung.
Figur 13 veranschaulicht das Verfahren und die Vorrichtung dieser Erfindung in einer qualitativen Empfindlichkeit- Testplatte.
Figuren 14 bis 16 veranschaulichen ein Meßprotokoll mit sichtbarem Licht für die qualitative Empfindlichkeits- Testplatte von Figur 13.
Figur 17 veranschaulicht das Verfahren und die Vorrichtung dieser Erfindung in einer quantitativen Empfindlichtkeits- Testplatte.
Figuren 18 und 19 sind veranschaulichende Beispiele eines Meßprotokolls mit sichtbarem Licht für die quantitative Empfindlichkeit-Testplatte von Figur 17.
Figuren 20A und 20B veranschaulichen Bestandteile von alternativen Ausführungsformen von qualitativen Empfindlichkeits-Testkits gemäß dieser Erfindung.
Figur 21 veranschaulicht eine qualitative Empfindlichkeits-Testplatte gemäß dieser Erfindung mit beladenen Testmodulen für viele antimikrobielle Produkte.
Figur 22 veranschaulicht eine qualitative Empfindlichkeits-Testplatte gemäß dieser Erfindung mit Testvertiefungen, die mit vom Anwender ausgewählten Testmodulen für viele antimikrobielle Produkte beladbar sind.
Figur 23 veranschaulicht eine qualitative Empfindlichkeits-Testplatte gemäß dieser Erfindung mit sowohl beladenen als auch leeren Testvertiefungen für viele antimikrobielle Produkte.
Die Figuren 24A und 24B veranschaulichen Bestandteile von alternativen Ausführungsformen von quantitativen Empfindlichkeits-Testkits gemäß dieser Erfindung.
Figur 25 veranschaulicht einen alternativen Satz von Testkit-Bestandteilen zum Einbringen von Testmodulen in Testvertiefungen einer leeren Testplatte für quantitative Prüfung der Empfindlichkeit.
Figur 26 veranschaulicht eine quantitative Empfindlichkeits-Testplatte gemäß dieser Erfindung mit beladenen Testmodulen für viele antimikrobielle Produkte.
Figur 27 veranschaulicht eine quantitative Empfindlichkeits-Testplatte gemäß dieser Erfindung mit leeren Testvertiefungen zum Beladen mit vom Anwender ausgewählten Testmodulen für viele antimikrobielle Produkte.
Figur 28 veranschaulicht Testkit-Bestandteile zum Einbringen von Testmodulen für viele antimikrobielle Produkte in leere Testvertiefungen einer Testplatte gemäß dieser Erfindung.
Figur 29 veranschaulicht eine quantitative Empfindlichkeits-Testplatte gemäß dieser Erfindung mit einem Abschnitt mit beladenen Testmodulen für viele vorgewählte antimikrobielle Produkte und einem Abschnitt von leeren Testvertiefungen zum Einbringen von Testmodulen für viele vom Anwender ausgewählte antimikrobielle Produkte.
Figur 30 ist eine schematische Veranschaulichung eines erfindungsgemäß geeigneten automatisierten Platten- Auswertesystems.
Figur 31 veranschaulicht ein Auswertesystem mit sichtbarem Licht, geeignet in Verbindung mit einem Meßprotokoll mit sichtbarem Licht für eine Testplatte gemäß dieser Erfindung.
Figur 32 veranschaulicht ein Fluoreszenzanregung- Auswertesystem, geeignet in Verbindung mit einem Meßprotokoll mit Fluoreszenzanregung für eine Testplatte gemäß dieser Erfindung.
Figur 33 ist ein Graph, der die Ergebnisse der Fluoreszenzauswertung von Mikroorganismus-Wachstum in einer Testvertiefung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren verglichen mit anderen Auswerteverfahren des Standes der Technik zeigt.
Figur 34 ist ein Graph, der die Fluoreszenzauswertung von Mikroorganismus-Wachstum in einer Testvertiefung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren mit verschiedenen Mikroorganismen veranschaulicht.

Genaue Beschreibung von Ausführungsformen der Erfindung

Die grundlegende Methodik (Figuren 3 bis 8)

Das grundlegende Verfahren dieser Erfindung umfaßt Prüfen der Empfindlichkeit eines Mikroorganismus gegenüber Wachstumshemmung durch eine vorgewählte Konzentration eines antimikrobiellen Produkts unter Verwendung einer Testplatte 100 mit einer negativen Wachstumskontroll-Vertiefung oder einem Aufnahmegefäß zur negativen Wachstumskontrolle 101, einer positiven Wachstumskontroll-Vertiefung oder einem Aufnahmegefäß zur positiven Wachstumskontrolle 102 und einer Testvertiefung oder einem Testaufnahmegefäß 103. Der Ausdruck "Vertiefung" oder "Aufnahmegefäß" wird in dieser Beschreibung austauschbar verwendet mit dem Verständnis, daß der Ausdruck "Aufnahmegefäß" allgemein für jede geeignete Struktur zum Aufnehmen der Testchemikalien gilt. Das Verfahren hängt nicht von der Verwendung einer Platte mit vielen Vertiefungen ab und getrennte einzelne Aufnahmegefäße könnten verwendet werden. Der Plattenansatz ist bevorzugt aufgrund der Einfachheit der Handhabung in und aus dem Inkubator und aus anderen Gründen, die den Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt sind. Die allgemeinen Schritte des Verfahrens werden nun beschrieben.
Eine vorbestimmte Konzentration eines Wachstumsmediums für Mikroorganismen wird in die zwei Wachstumskontroll- Aufnahmegefäße 101 und 102 eingebracht und eine vorbestimmte Konzentration von Resazurin wird ebenfalls in beide Wachstumskontroll-Aufnahmegefäße eingebracht. Das Wachstumsmedium kann z.B. eine Standard-Müller-Hinton- Nährlösung sein und die Konzentration dieses Wachstumsmediums kann im Standardbereich von gegenwärtig in der Empfindlichkeits-Prüfungsindustrie verwendeten Konzentrationen liegen. Die verwendete Konzentration von Resazurin liegt in einem vorbestimmten Bereich, gekennzeichnet durch geringe Toxizität gegenüber Mikroorganismen und wesentlicher Empfindlichkeit gegenüber Reduktion zu Resorufin durch die Stoffwechselprodukte von Mikroorganismus-Wachstum.
Eine vorbestimmte Konzentration des zu untersuchenden Mikroorganismus wird in die positive Wachstumskontroll- Vertiefung 102 eingebracht. Somit enthält, wie in Figur 3 gezeigt, die negative Wachstumskontroll-Vertiefung 102 Wachstumsmedium und Resazurin, während die positive Wachstumskontroll-Vertiefung Wachstumsmedium, Resazurin und den Mikroorganismus enthält.
In die Testvertiefung 103 werden die folgenden Testchemikalien eingebracht: das antimikrobielle Produkt in der vorgewählten Konzentration, die gleiche vorbestimmte Konzentration von Wachstumsmedium wie in den beiden Wachstumskontroll- Vertiefungen, die gleiche Konzentration von Resazurin und die gleiche Konzentration von Mikroorganismus wie in der positiven Wachstumskontroll-Vertiefung.
Nachdem alle Testchemikalien in die drei Aufnahmgefäße eingebracht sind, werden sie zusammen für eine Inkubationszeitdauer in Verbindung mit einem vorgewählten Meßprotokoll inkubiert. Im allgemeinen sind die zur Verwendung mit dieser Erfindung verfügbaren Meßprotokolle ein Meßprotokoll mit sichtbarem Licht und ein Meßprotokoll mit Fluoreszenzanregung. Genauere Angaben dieser unterschiedlichen Meßprotokolle sind unten angegeben.
Nach der Inkubationszeitdauer werden die drei Aufnahmegefäße gemäß dem vorgewählten Meßprotokoll ausgewertet, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Wachstum des Organismus in der Testvertiefung auf Grundlage der relativen Konzentrationen von Resazurin und Resorufin darin zu bestimmen. Das Meßprotokoll mit sichtbarem Licht umfaßt einen Entscheidungsalgorithmus, der auf mindestens einer vorbestimmten funktionellen Kombination der in jeder drei Testvertiefungen detektierten Farbe der sichbaren Lichtreflexion basiert. Das Meßprotokoll mit Fluoreszenzanregung umfaßt einen Entscheidungsalgorithmus, der auf mindestens einer funktionellen Kombination der Werte des Fluoreszenzemissionssignals basiert, die durch das Reduktionsprodukt Resorufin in jeder der Testvertiefungen erzeugt werden. Genaue Angaben der Meßprotokolle gemäß der Erfindung sind unten angegeben.

Die Reduktions/Oxidationsreaktion von Resazurin

In dem Verfahren und der Vorrichtung dieser Erfindung wird Resazurin als Reduktions/Oxidationsindikator verwendet. Wenn Mikroorganismen in einem Wachstumsmedium wachsen, wandeln sie Nährstoffe in Energie um, was in einer chemischen Reduktion ihrer Umgebung resultiert. Dies trifft für alle Mikroorganismen zu. Wenn ein Oxidations/Reduktionsindikator in der Umgebung des wachsenden Mikroorganismus vorliegt, wird er ebenfalls reduziert. Folglich stellt die Verwendung eines Oxidations/Reduktionsindikators einen universell anwendbaren Test für das Wachstum von allen Mikroorganismen bereit. Resazurin ist solch ein Oxidations/Reduktionsindikator und wird zu Resorufin reduziert. Resazurin ist tiefblau in der reflektierten Farbe und nicht fluoreszierend. Resorufin ist rot und hochfluoreszierend. Diese Reduktion von Resazurin zu Resorufin ist die Grundlage für das Meßprotokoll mit sichtbarem Licht und das Meßprotokoll mit Fluoreszenzanregung, wie sie in dem Verfahren dieser Erfindung verwendet werden.
Fluoreszenz-Auswertesyteme des Standes der Technik zur Prüfung der Empfindlichkeit enthalten keinen universellen Indikator auf Mikroorganismus-Wachstum. Statt dessen verwenden sie fluoreszierende Substrate, die die Produktion von spezifischen Enzymen messen und es gibt kein fluoreszierendes Substrat, das von allen Mikroorganismen genutzt wird. Resazurin-Reduktion ist nicht eine Reaktion auf Enzymbasis, sondern vielmehr eine chemische Reaktion abhängig von einer Veränderung des Oxidations/Reduktionszustandes der Umgebung. Sie ist unabhängig von einer enzymatischen Reaktion.
Resazurin ist auch ein pH-Indikator mit einer blauen Farbe über einem pH von ungefähr 6,5 bis 6,8 und ist rot unterhalb dieses Bereiches von pH-Werten. Aus diesem Grund ist es wichtig, daß der pH-Wert der Testchemikalien-Gruppe in den Wachstumskontroll- und Testaufnahmegefäßen kontrolliert wird, um die geeigneten Anfangsbedingungen bereitzustellen, insbesondere dort, wo das antimikrobielle Produkt einen relativ hohen pH (sauer) aufweist. Aus diesem Grund ist es bevorzugt, einen ausgewählten pH-Puffer, wie etwa ein Gemisch aus Natriumdihydrogenphosphat und Natriumhydrogenphosphat zu dem Testchemikaliensatz in den Vertiefungen zu geben. Die Menge dieses Puffers wird bevorzugt niedrig gehalten, um Verschlimmern der Autoreduktionsneigung des Wachstumsmediums zu vermeiden. Zusätzlich wurde entdeckt, daß während der Inkubation das Wachstumsmedium selbst dazu neigt, Resazurin zu reduzieren und aus diesem Grund ist es bevorzugt, einen Redox- Stabilisator, wie etwa Kaliumferrocyanid in den in die drei Vertiefungen eingebrachten Testchemikaliensatz einzuschließen. Der verwendete Redox-Stabilisator darf nicht toxisch gegenüber dem Mikroorganismus sein, um nicht beim Wachstumsvorgang zu stören.

Meßprotokoll mit sichtbarem Licht (Figuren 4 bis 8)

Das erfindungsgemäß verwendete Meßprotokoll mit sichtbarem Licht basiert auf der Farbverschiebung von blau zu rot, die während der Reduktion von Resazurin zu Resoruf in in der Testvertiefung als Ergebnis von Mikroorganismus-Wachstum erzeugt wird. Falls Wachstum des Mikroorganismus in der Testvertiefung 103 trotz der Anwesenheit der vorgewählten Konzentration eines darin eingebrachten antimikrobiellen Produkts vorliegt, wird die in der Testvertiefung vorliegende chemische Testlösung sich von blau zu rot verfärben, und eine einfache visuelle Inspektion der Testvertiefung liefert eine Grundlage zur Bestimmung eines positiven oder negativen Testergebnisses. Die Wachstumskontroll-Vertiefungen liefern eine Grundlage zum Vergleich von Wachstum- und Nichtwachstum- Bedingungen zur Unterstützung der Identifizierung des Zustandes in der Testvertiefung.
Figuren 4 bis 8 veranschaulichen genauer das Meßprotokoll mit sichtbarem Licht. Figur 4 veranschaulicht den anfänglichen Zustand der Testplatte 100A vor einer Inkubation. Alle drei Vertiefungen haben eine blaue Farbe, wie durch die Schraffur in dem die Vertiefungen darstellenden Bereich angezeigt ist.
Das Meßprotokoll mit sichtbarem Licht umfaßt Qualifikationsalgorithmen zur Plattenauswertung, welche verwendet werden, um zu bestimmen, ob die Platte selbst versagt hat, eine geeignete Grundlage für einen genauen Test bereitzustellen oder ob etwas schief gegangen ist, und das Erhalten einer genauen Bestimmung von Organismuswachstum oder Nichtwachstum in der Testvertiefung ausschließt. Figur 5 veranschaulicht einen fehlgeschlagenen Test aufgrund einer Farbveränderung der negativen Wachstumskontroll-Vertiefung von blau zu rot. Da in diese Vertiefung kein Mikroorganismus eingebracht wurde, sollte darin nichts wachsen, um die Farbverschiebung von blau zu rot von der Reduktion von Resazurin zu Resorufin zu ergeben. Die negative Wachstumskontroll-Vertiefung kann sich leicht in der Tiefe der blauen Farbe darin verändern aufgrund von etwas Autoreduktion von Resazurin durch das Wachstumsmedium während der Inkubation, aber Veränderung zu einer rosaroten oder roten Farbe zeigt an, daß der wahrscheinlich fehlgeschlagene Test wiederholt werden muß. Die Farbe der positiven Wachstumskontroll-Vertiefung und der Testvertiefung sind in Figur 5 nicht angezeigt, da die Farbe dieser Vertiefungen nicht in diesem Aspekt des Qualifikationsalgorithmus der Platte eingeschlossen ist.
Figur 6 veranschaulicht einen fehlgeschlagenen Test aufgrund des Scheiterns der positiven Wachstums-Kontrollvertiefung eine Farbveränderung von blau zu rot nach einer Inkubation zu zeigen. Das Fehlschlagen des Mikroorganismus in der positiven Wachstumskontroll-Vertiefung zu wachsen, wo keine wachstumshemmenden Testchemikalien vorliegen sollten, bedeutet, daß keine verläßliche Grundlage zur Beurteilung vorliegt, ob Wachstum des Mikroorganismus in der Testvertiefung durch die Konzentration des dort befindlichen antimikrobiellen Produkts gehemmt wurde oder nicht.
Figuren 7 und 8 veranschaulichen zwei Testplatten, die den Platten-Qualifikationstest bestanden haben und veranschaulichen auch den Algorithmus zur Bestimmung des Test-Endergebnisses. In Figur 7 zeigt eine Inspektion der negativen Wachstumskontroll- Vertiefung, daß sie in der Farbe blau geblieben ist wie sie sollte, da kein Mikroorganismus in dieser Vertiefung vorliegen sollte. Die positive Wachstumskontroll-Vertiefung hat die Farbe von blau zu rot geändert wie sie sollte, da der darin eingebrachte Mikroorganismus ohne Hemmung wachsen sollte. In der Testvertiefung 103 ist die Farbe der Testlösung auch noch blau, wodurch kein Organismus-Wachstum in der Testvertiefung angezeigt wird. Entsprechend ist das Testergebnis negativ, d.h. kein Organismus-Wachstum in der Testvertiefung oder dem Testaufnahmegefäß.
In Figur 8 haben die negative Wachstumskontroll-Vertiefung und positive Wachstumskontroll-Vertiefung die richtigen Farben und die in der Testvertiefung angezeigte rote Farbe erzeugt ein positives Testergebnis, d.h. es liegt Organismus-Wachstum in der Testvertiefung vor, das dort die Farbveränderung erzeugt hat gerade wie in der positiven Wachstumskontroll-Vertiefung.

Manuelles Auswerten

Es wird anerkannt werden, daß die Testplatte 100 leicht manuell ausgewertet werden kann, d.h. durch Anschauen der Vertiefungen mit dem bloßen Auge, um die Testergebnisse zu bestimmen unter der Annahme, daß die Person, die die Auswertung vornimmt, die normale Sehschärfe für Farberkennung besitzt.
In den meisten Fällen von visuellem Auswerten der Testplatte muß die Platte für eine ausreichende Zeitdauer inkubiert werden, so daß die Reduktion von Resazurin in der Testvertiefung zu Resorufin zu dem Punkt fortgeschritten ist, an dem die Farbveränderung von blau zu rot deutlich und einfach unterscheidbar ist. In einigen Fällen von gering wachsenden Organismen jedoch, oder unter Bedingungen, bei denen die Konzentration des antimikrobiellen Produkts in der Testvertiefung gerade an der Grenzlinie der MIC ist, kann das Organismus-Wachstum zu dem Punkt verlangsamt sein, daß das Ausmaß der Farbveränderung von blau zu rot nicht stark ist. Eine Farbskala kann bereitgestellt werden, um bei der Interpretation der Testergebnisse zu helfen und veranschaulicht das Ausmaß der Farbverschiebung, das vorliegen muß, um das Testergebnis positiv oder negativ zu nennen.
Der Vorteil dieser Erfindung über die visuelle Auswertung von Empfindlichkeits-Testplatten, die sich auf die Detektion von Trübheit stützen, ist, daß festgestellt wurde, daß die Farbveränderung von blau zu rot viel leichter detektiert werden kann als kleine Mengen von Trübheit. Es wurde im Seite an Seite-Vergleich gezeigt, daß Mikroorganismus-Wachstumsmengen, die schwierig zu detektierende Trübheit nach Inkubation der Platte über Nacht erzeugen, üblicherweise ein Ausmaß an Farbschiebung von blau zu rot erzeugen, das leicht als Indikator von Organismuswachstum zu detektieren ist. Als Ergebnis braucht man weniger Fachkenntnis und Konzentration, um eine Testplatte manuell auszuwerten, die das Verfahren dieser Erfindung nutzt. Dies resultiert in einer schnelleren und genaueren Auswertung der Testergebnisse und gibt dem Techniker mehr Vertrauen beim Berichten der Testergebnisse.

Automatisiertes Auswerten

Automatisiertes Auswerten einer Testplatte unter Verwendung des Meßprotokolls mit sichtbarem Licht kann ebenfalls leicht durch Vorrichtungen erzielt werden, die für colorimetrische Bestimmungen geeignet sind. Ein schematisches Diagramm eines automatisierten colorimetrischen Auswertesystems ist in den Figuren 30 und 31 gezeigt für den Fall, wo die Testplatte ein undurchsichtiges Material und die weiße Lichtquelle über der Platte ist. Ein alternatives System, in dem die Platte klar ist und die weiße Lichtquelle und ein Filter unter der Platte sind, könnten ebenfalls verwendet werden.
Wie veranschaulicht, wird die Testplatte 100 in jedem Fall relativ zu der Lichtquelle und dem Detektor gescannt, so daß jede der Vertiefungen nacheinander ausgewertet wird. Nachdem Daten für die Farbe der Testlösung in jeder der drei Vertiefungen erhalten wurden, werden die Algorithmen des Meßprotokolls mit sichtbarem Licht auf die Daten angewendet. Zuerst werden die Qualifikationsalgorithmen der Platte in der gleichen Weise wie in dem visuellen Auswerteansatz oben angewendet und dann werden die Testvertiefungs-Daten untersucht, um das Test-Endergebnis zu bestimmen, falls die Qualifikationstests bestanden wurden. Mit automatisierter Auswertung kann es möglich sein, die entsprechenden Ausmaße des Farbunterschieds zwischen der Testvertiefung und der negativen Wachstumskontroll-Vertiefung und zwischen der Testvertiefung und der positiven Wachstumskontroll-Vertiefung genau zu bestimmen und diese quantifizierten Daten als Grundlage zur Bestimmung des Testergebnisses zu verwenden. In diesem Fall kann der Algorithmus dem Meßprotokoll mit Fluoreszenzanregung, welches unten diskutiert wird, sehr ähnlich sein.

Meßprotokoll mit Fluoreszenzanregung

Einfaches Auswerten - statisches Testprotokoll

Da Resazurin nicht fluoreszierend ist, während Resorufin bei einer Wellenlänge von 580 nm stark fluoreszierend ist, kann die Testplatte 100 unter Verwendung eines Fluoreszenzmeß-Gerätes gemäß einem Meßprotokoll mit Fluoreszenzanregung unter Verwendung eines Auswertesystems, welches schematisch in Figur 31 veranschaulicht ist, ausgewertet werden. Eine Anregungsquelle mit einer Wellenlänge von 560 oder darunter wird verwendet, um Fluoreszenzemission von Resorufin in den Vertiefungen anzuregen. Angemessene Trennung von Anregungs- und Emissionswellenlängen sollte beibehalten werden. Die Platte 100 wird hinsichtlich der Anregungs-Lichtquelle und dem Detektor gescannt, so daß der Wert der Fluoreszenzanregung von Resorufin in jeder der drei Vertiefungen erhalten wird. Für Zwecke dieser Erklärung wird der von der negativen Wachstumskontroll- Vertiefung erhaltene Wert als N bezeichnet, der Wert von der positiven Wachstumskontroll-Vertiefung als P bezeichnet und der Wert von der Testvertiefung als T bezeichnet. Diese Auswertung der Platte wird durchgeführt, nachdem eine Inkubation der Testplatte für eine ausreichende Zeitdauer durchgeführt wurde, die eine beträchtliche Erzeugung von Resorufin in den Vertiefungen bewirkt, in denen Organismus-Wachstum auftritt. Die Werte von N und P werden dann untersucht, um zu bestimmen, ob die Daten einem gültigen Test entsprechen. Der Wert von N wird verglichen mit und muß für gültige Plattendaten unter einem Grenzwert Nf sein, der als für einen fehlgeschlagenen Test anzeigend bestimmt wurde aufgrund der Anwesenheit von zuviel Resorufin in der negativen Wachstumskontroll-Vertiefung aufgrund von Verunreinigung der Platte oder aufgrund einer anderen Ursache. Der Wert von P wird verglichen mit und muß für gültige Plattendaten überhalb einem Grenzwert Pf sein, der als für einen fehlgeschlagenen Test anzeigend bestimmt wurde aufgrund der Anwesenheit von zu wenig Resorufin in der positiven Wachstumskontroll-Vertiefung nach der Inkubationszeitdauer aufgrund eines Versagens des Wachstumsmediums das Organismus-Wachstum zu fördern oder aufgrund anderer Ursachen. Wenn die Plattendaten diese Gültigkeitstests bestehen, können die Testvertiefungs-Daten gemäß dem Rest des Meßprotokolls mit Fluoreszenzauswertung verarbeitet werden.
Ein Wachstumskontrollparameter Gc wird bevorzugt berechnet als die Differenz der Werte von P und N. Ähnlich wird ein korrigierter Testparameter Tc bevorzugt als Differenz der Werte T und N berechnet. Der von der negativen Wachstumskontroll- Vertiefung erhaltene Wert N wird so als Untergrundwert von Resorufin behandelt, das in den anderen beiden Vertiefungen aufgrund von etwas Autoreduktion von Resazurin während des Inkubations-Vorgangs vorhanden sein kann.
Der nächste Schritt in diesem Meßprotokoll ist die Berechnung des Wertes einer Testvariablen I unter Verwendung einer vorbestimmten funktionellen Kombination der Werte von Gc und Tc. Diese funktionelle Kombination könnte einfach die Differenz zwischen den beiden Werten sein, aber es ist bevorzugt, eine Funktion zu verwenden, die das Verhältnis von Tc und Gc umfaßt. Nachdem der Wert der Testvariablen I berechnet wurde, wird er einem Entscheidungsalgorithmus unterworfen und ein Testergebnis wird berichtet, basierend auf dem Ergebnis der Anwendung des Entscheidungsalgorithmus.
Der Entscheidungsalgorithmus basiert auf Daten, die von kontrollierten Untersuchungen auf Testplatten erhalten werden unter Verwendung von Organismen, die bekannte Testergebnisse erzeugen. Z.B. kann der Entscheidungsalgorithmus einen vorbestimmten positiven Entscheidungswert XP und einen vorbestimmten negativen Entscheidungswert XN umfassen. Diese Entscheidungswerte basieren auf Daten, die von Organismen gesammelt wurden, die sich in bekannter Weise verhalten, wobei der Wert XP ausgewählt ist, so daß alle solchen bekannten Organismen einen Wert der Testvariablen I erzeugen, der größer als oder gleich XP ist, wenn der Organismus in der Testvertiefung wächst oder der kleiner als oder gleich XN ist, wenn der Organismus in der Testvertiefung nicht wächst. Der Abstand zwischen den positiven und negativen Entscheidungswerten ist ein Unbestimmtheitsbereich und ein unbestimmtes Testergebnis wird berichtet, wenn der Wert von I zwischen diesen zwei Entscheidungswerten liegt.

Einfaches Auswerten - dynamisches Testprotokoll

Das oben beschriebene Meßprotokoll mit Fluoreszenzanregung ist im Grunde ein statisches einfaches Meßprotokoll, welches nach einer vorbestimmten Inkubationszeitdauer verbunden mit dem Protokoll durchgeführt wird. Ein komplexeres und möglicherweise genaueres Meßprotokoll mit Fluoreszenzanregung würde die Verwendung eines vorläufigen Qualifikationstests der Plattenauswertung umfassen, welcher eine minimale Wertdifferenz zwischen P und N erfordert, d.h. einen minimalen Wert von Gc, bevor der Testparameter I berechnet wird. Wenn die Platte die anderen Daten-Qualifikationstests der P- und N-Werte wie oben diskutiert besteht, aber der Wert von Gc unter dem vorbestimmten Grenzwert liegt, würde die Platte für eine zusätzliche Zeitdauer inkubiert, um zu ermöglichen, daß der Wert Gc mit der Zeit ansteigt (falls er kann) . Solch ein veränderter Ansatz ergibt Testergebnisse von größerer Genauigkeit und größerer Wahrscheinlichkeit der Vermeidung eines unbestimmten Testergebnisses für Organismen, die in der positiven Wachstumskontroll-Vertiefung langsam wachsen, selbst wenn kein antimikrobielles Produkt anwesend ist.

Schnelles Meßdrotokoll mit Fluoreszenzanregung

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur schnellen Bestimmung von Mikroorganismus-Wachstum in der Testvertiefung angepaßt werden unter Verwendung eines Meßprotokolls mit Fluoreszenzanregung, das auf Bestimmung der dynamischen Eigenschaften der Veränderungen des Resorufingehalts der Wachstumskontroll-Vertiefungen und der Testvertiefung basiert. Diese dynamischen Eigenschaften können die Rate der Änderung des Resorufingehalts in diesen Vertiefungen (d.h. die Geschwindigkeit der Resorufinerzeugung) und die Rate von Veränderungen dieser Veränderungsrate mit der Zeit (d.h. die Beschleunigung der Resorufinerzeugung) in den Vertiefungen umfassen.
In Testvertiefungen, in denen der Mikroorganismus wächst, steigt die Zahl solcher Mikroorganismen exponentiell mit der Zeit, wobei ein entsprechender exponentieller Anstieg der Menge von Resorufin in der Testvertiefung erzeugt wird. In Testvertiefungen, in denen der Mikroorganismus nicht wächst, kann etwas Autoreduktion von Resazurin zu Resorufin auftreten, aber dieses tritt bei einer linearen Rate auf und ist somit einfach von wachstumsbezogener Resorufinerzeugung unterscheidbar.
Der Inkubationsschritt in diesem Verfahren umfaßt Inkubieren der drei Testvertiefungen oder Aufnahmegefäße zusammen für eine Zeitdauer, die ausreicht, um einen Wert einer dynamischen Charakteristik der Resorufinerzeugung in der positiven Wachstumskontroll-Vertiefung zu erzeugen, welcher einen vorbestimmten Platten-Qualifikationswert übersteigt. Der Wert dieser dynamischen Charakteristik wird durch Auswerten des Wertes der Fluoreszenzanregung von Resorufin sowohl in der positiven Wachstumskontroll-Vertiefung als auch in der negativen Wachstumskontroll-Vertiefung zu mindestens zwei getrennten Zeitdauern (Geschwindigkeit) mit mindestens drei Messungen bei verschiedenen Zeitdauern, die sowohl für zu bestimmende Geschwindigkeits- als auch Beschleunigungscharakteristiken erforderlich sind, bestimmt.
Falls der Wert unterhalb des Qualifikationswertes liegt, wird die Platte für eine vorbestimmte weitere Inkubationszeitdauer zurückgelegt, nach der die Werte der Fluoreszenzanregung von Resorufin erneut erhalten werden und der Platten- Qualifikationstest wiederholt wird. Dies wird fortgesetzt, bis sich die Platte zur Auswertung qualifiziert oder aus den Daten bestimmt wird, daß die Platte defekt ist und niemals zur Auswertung geeignet sein wird.
Nachdem die Qualifikationstests zur Plattenauswertung bestanden sind, werden die bereits gemessenen Werte der dynamischen Charakteristiken von Resorufinerzeugung verwendet, um Werte für die dynamische Erzeugung von Resoruf in in der positiven Wachstumskontroll-Vertiefung und der Testvertiefung zu berechnen anhand der Durchführung zusätzlicher Messungen nach einer weiteren Zeitdauer oder unter Verwendung bereits erhaltener Datenwerte. Der Wert für die Testvertiefung wird als T' bezeichnet und der Wert für die Wachstumskontroll- Vertiefungen als G' bezeichnet. Die Verwendung dieser Bezeichnungen mit den "Strich"-Zeichen beabsichtigt nicht die dynamischen Charakteristiken auf Geschwindigkeitsbestimmungen zu begrenzen, was durch eine strenge mathematische Auslegung der Verwendung der "Strich"-Bezeichnung vorgeschlagen sein könnte. Es sollte verstanden werden, daß sowohl die Änderungsrate als auch die Beschleunigung der Änderungsrate in den Werten T' und G' verwendet werden kann.
Nachdem diese Werte bestimmt sind, wird der Wert einer Testvariablen I berechnet als vorbestimmte funktionelle Kombination von T' und G', bevorzugt eine Funktion, umfassend das Verhältnis dieser beiden Parameter. Dann wird ein Testergebnis übermittelt unter Verwendung des Wertes der Testvariablen in einen vorgewählten Entscheidungsalgorithmus. Der Entscheidungsalgorithmus kann vorbestimmte positive und negative Entscheidungswerte XP und XN, wie in dem Meßprotokoll mit sichtbarem Licht verwendet, nutzen. Diese Werte werden wiederum empirisch von in kontrollierten Tests unter Verwendung von Organismen, die bekannte Testergebnisse erzeugen, erhaltenen Daten bestimmt.

Testmodule und Testchemikalien-Teilsätze (Figuren 9 bis 12)

Figur 9 veranschaulicht, daß das allgemeine Verfahren dieser Erfindung bevorzugt durch Bilden eines Testmoduls in jeder der Wachstumskontroll-Vertiefungen 101 und 102 und der Testvertiefung 103 ausgeführt wird. Wie gezeigt werden Testmodule 107 und 108 in jeder der Wachstumskontroll- Vertiefungen gebildet, wobei das Testmodul in jedem Fall vom Typ TMA ist. Ein Testmodul 109 wird in der Testvertiefung 103 gebildet und ist vom Typ TMB, was anzeigt, daß es einen unterschiedlichen Testchemikaliensatz darin enthält. Jedes der Testmodule 107 und 108 hat einen Testchemikalien-Teilsatz TCB1 darin und das Testmodul 109 hat diesen gleichen Testchemikalien-Teilsatz plus das antimikrobielle Produkt. Die Testchemikalien-Teilsätze umfassen trockene Feststoffvolumen eines Teilsatzes der Bestandteile eines Testchemikaliensatzes, der bevorzugt alle oben beschriebenen Testchemikalien umfaßt, nämlich Resazurin, Wachstumsmedium, Puffer und einen Redoxstabilisator.
Nachdem die Testmodule in den Vertiefungen gebildet sind, werden sie durch Einbringen eines Flüssigkeitsvolumens in jede Vertiefung rehydratisiert. Die negative Wachstumskontroll- Vertiefung 101 wird mit einem Flüssigkeitsvolumen 110 rehydratisiert, das nur den Testchemikalien-Teilsatz TCB2 enthält. Sowohl die positive Wachstumskontroll-Vertiefung als auch die Testvertiefung werden mit Flüssigkeitsvolumen 112 und 113 im Inokulator 111 rehydratisiert, welche den Mikroorganismus sowie den Testchemikalien-Teilsatz TCB2 enthalten. Die Aufteilung der Testchemikalien zwischen den Testmodulen und der Rehydratations-Flüssigkeit veranschaulicht, daß bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eine beträchtliche Flexibilität beim Vorgang zum Erhalten der endgültigen Testchemikalienlösung in jeder der Vertiefungen vor dem Inkubationsschritt vorliegt. Der bevorzugte Testchemikaliensatz kann in verschiedene Teilsätze geteilt werden, wobei ein Teilsatz in dem Testmodul und der andere Teilsatz in der Rehydratationslösung vorliegt. Das bevorzugte Verfahren umfaßt platzieren aller Testchemikalien in die Testmodule in die Vertiefungen, so daß die Rehydratations-Flüssigkeit einfach ein steriles Flüssigkeitsvolumen für die negative Wachstumskontroll-Vertiefung und ein Volumen der gleichen Flüssigkeit mit einer Dispersion des Mikroorganismus darin als Inokulum für die anderen Vertiefungen ist. Es sollte verstanden werden, daß die Testmodule in getrennten Schritten rehydratisiert und inokuliert werden könnten.
In dem bevorzugten Verfahren ist der Testchemikalien-Teilsatz in jedem der Testmodule in den Wachstumskontroll-Vertiefungen der gleiche. Es sollte jedoch verstanden werden, daß das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung eines unterschiedlichen Testchemikalien-Teilsatzes in der negativen Wachstumskontroll-Vertiefung und in der positiven Wachstumskontroll-Vertiefung durchgeführt werden könnte. Es wäre auch möglich, verschiedene Testchemikalien-Teilsätze in der positiven Wachstumskontroll-Vertiefung und der Testvertiefung zu verwenden, aber dies würde die Vorbereitung der rehydratisierenden Inokulum-Flüssigkeit erschweren und ist somit nicht der bevorzugte Ansatz.

Abwechselnde Formen von Testmodulen

Wie in Figur 10 veranschaulicht, können die Testmodule in den Vertiefungen die Form eines trockenen Feststoffvolumens der Testchemikalien annehmen, welches direkt auf den Wänden der Vertiefungen der Platte 100-2 selbst gebildet werden. Dies kann durch Abgeben der Bestandteile des Testchemikalien-Teilsatzes TCB1 in jede der Wachstumskontroll-Vertiefungen und dieses Teilsatzes plus des antimikrobiellen Produktes in die Testvertiefung und dann Trocknen der Platte z.B. in einem Gefriertrockner, durchgeführt werden, um die Testchemikalien als trockenes Feststoff-Volumen an den Wänden der Vertiefungen festzuhalten.
Figur 11 veranschaulicht, daß die in den Vertiefungen gebildeten Testmodule die Form eines Trägermediums, wie etwa der Trägermedien 117, 118 und 119, annehmen können. Die bevorzugte Form des Trägemediums ist in jedem Fall eine absorbierende Papierscheibe der gleichen Art, wie sie in der oben beschriebenen Scheiben-Diffusionsuntersuchung verwendet wird. Andere Formen von Trägermedien können ebenfalls verwendet werden, wenn sie allgemein mit den absorbierenden Papierscheiben vergleichbare Charakteristiken aufweisen. Es muß möglich sein, die Trägermedien in einer bequemen Weise zur Herstellung der Testplatten abzugeben.
Ein Verfahren zur Herstellung von Testmodulen unter Verwendung von absorbierenden Papierscheiben wird unten beschrieben. In Figur 11 wird ein einzelnes Trägermedium in jeder Vertiefung verwendet, wogegen in Figur 12 a zwei Trägermedien in jeder Vertiefung verwendet werden, wobei jedes Trägermedium einen Teil des Teilsatzes der Testchemikalien, die in dem darin enthaltenen Testmodul gebildet sind, aufweist. Dies veranschaulicht, daß es möglich ist, z.B. das Verfahren dieser Erfindung unter Verwendung von zwei absorbierenden Papierscheiben durchzuführen, wobei eine das Resazurin und die andere das Wachstumsmedium enthält. Dieser Ansatz vermeidet Wechselwirkungen zwischen diesen beiden Testchemikalien- Bestandteilen beim Vorgang des Bildens der Testmodule in den Vertiefungen und insbesondere während des Trocknens der Scheiben.

Vorrichtung zur qualitativen Empfindlichkeitsprüfung (Figuren 13 bis 16)

Figuren 13 bis 16 veranschaulichen die Anwendung der Grundlagen dieser Erfindung auf eine Vorrichtung zur qualitativen Empfindlichkeitsprüfung, d.h. zur Prüfung der qualitativen Empfindlichkeit eines Mikroorganismus gegenüber Wachstumshemmung durch ein antimikrobielles Produkt unter Verwendung eines vorbestimmten qualitativen Empfindlichkeits- Testprotokolls, umfassend erste und zweite Mengen des antimikrobiellen Produkts. Eine Testplatte 200 legt eine negative Wachstumskontroll-Vertiefung 201, eine positive Wachstumskontroll-Vertiefung 202 und ein Paar Testvertiefungen 203 und 204 fest. Ein Testmodul 205 ist in jeder der Wachstumskontroll-Vertiefungen enthalten. Testmodule 206 und 207 sind in dem Paar von Testvertiefungen enthalten.
Figur 13 veranschaulicht die bevorzugte Form der Erfindung, in der die Testmodule alle chemischen Bestandteile des Testchemikaliensatzes darin aufweisen, aber es sollte verstanden werden, daß die Testchemikalien zwischen den Testmodulen und den Rehydratations-Flüssigkeitsvolumen, wie zuvor beschrieben, aufgeteilt sein kann. Figur 13 veranschaulicht auch die Verwendung einer einzelnen absorbierenden Papierscheibe als Trägermedium, welches die Basis jedes Testmoduls bildet, aber es sollte verstanden werden, daß jede der zuvor diskutierten Formen von Testmodulen ebenfalls in der Vorrichtung zur qualitativen Empfindlichkeitsprüfung gemäß dieser Erfindung verwendet werden könnte.
Jedes der Testmodule ist markiert mit R für Resazurin, B für Puffer, G für Wachstumsmedium und S für Redoxstabilisator, falls enthalten. Zusätzlich enthält das Testmodul 206 eine erste Menge des antimikrobiellen Produkts, bezeichnet A1, und das Testmodul 207 enthält eine zweite Menge des antimikrobiellen Produkts, bezeichnet A2. Für diese Beschreibung betrachten wir A2 als die größere der beiden Konzentrationen des antimikrobiellen Produkts in dem qualitativen Empfindlichkeits-Testprotokoll.
Testmodul 201 in der negative Wachstumskontroll-Vertiefung wird mit einem Teil eines rehydratisierenden Flüssigkeitsvolumens 208, welches einen Teil eines Gesamtinokulationssystems 210 bildet, rehydratisiert. Jedes der Testmodule 205, 206 und 207 ist angepaßt, um mit einem rehydratisierenden Flüssigkeitsvolumen zusammen mit einer Suspension der Mikroorganismen rehydratisiert zu werden, um das Inokulum für diese Vertiefungen zu bilden. Nach Rehydration wird die Testplatte 200 in einen Inkubator für eine vorbestimmte Inkubationszeitdauer verbunden mit einem vorgewählten mit der Platte zu verwendenden Meßprotokoll gelegt.

Auswerten der Testergebnisse

Figuren 14 bis 16 veranschaulichen ein Meßprotokoll mit sichtbarem Licht für eine Testplatte 200. Es sollte verstanden werden, daß alle oben beschriebenen manuellen und automatisierten Meßprotokolle zur Auswertung der Platte 200 verwendet werden können.
Wieder bezugnehmend auf Figuren 4 bis 6 sollte verstanden werden, daß die Farbe vor Inkubation in allen Vertiefungen der Testplatte blau ist. Es werden auch die gleichen Qualifikationstests zur Plattenauswertung angewendet unter Verwendung der negativen Wachstumskontroll-Vertiefung und der positiven Wachstumskontroll-Vertiefung. Diese werden hier nicht wiederholt, um Wiederholungen zu vermeiden und diese Beschreibung nimmt an, daß die Platte die Qualifikationstests für richtige Auswertung bestanden hat, wobei die negative Wachstumskontroll-Vertiefung eine blaue Farbe und die positive Wachstumskontroll-Vertiefung eine rote Farbe zeigt.
In Figur 14 zeigt die Platte 200A eine rote Farbe in beiden Testvertiefungen 203 und 204, was Organismus-Wachstum in beiden Vertiefungen anzeigt. Das entsprechende Testergebnis dieser qualitativen Empfindlichkeitsprüfung ist, daß der untersuchte Mikroorganismus resistent ist, d.h. er ist nicht empfindlich gegenüber Wachstumshemmung durch die höhere Konzentration A2 des antimikrobiellen Produkts in der Testvertiefung 207. In Figur 15 zeigt die Platte 200B eine rote Farbe in der Testvertiefung 203, was Organismus-Wachstum anzeigt, aber eine blaue Farbe in der Testvertiefung 204, was eine Wachstumshemmung anzeigt. In diesem Fall ist das Ergebnis unbestimmt, da der Mikroorganismus weder empfindlich noch resistent ist. Die Verwendung des Ausdrucks "unbestimmt" sollte nicht mißverstanden werden, daß er keine Information auf die qualitative Empfindlichkeit des Mikroorganismus gibt. Dieses Testergebnis bedeutet lediglich, daß der Organismus weder hochempfindlich noch hochresistent ist und dies gibt dem betreffenden Arzt ein Anzeichen, daß eine erfolgreiche Wirkstoff-Therapie mit diesem antimikrobiellen Produkt in relativ hohen Konzentrationen erzielt werden kann.
In Figur 16 zeigt die Platte 200C eine blaue Farbe in beiden Testvertiefungen 203 und 204, was Wachstumshemmung des Mikroorganismus in beiden Testvertiefungen anzeigt. Das entsprechende Testergebnis ist "empfindlich", was anzeigt, daß der Mikroorganismus im Wachstum durch relativ geringe Konzentrationen des antimikrobiellen Produkts gehemmt werden kann.

Vorrichtung zur quantitativen Empfindlichkeitsprüfung (Figuren 17 bis 19)

Figuren 17 bis 19 veranschaulichen die Anwendung der Grundlagen dieser Erfindung in einer Vorrichtung zur quantitativen Empfindlichkeitsprüfung, d.h. zur Prüfer der quantitativen Empfindlichkeit eines Mikroorganismus gegenüber Wachstumshemmung durch ein antimikrobielles Produkt unter Verwendung eines vorbestimmten quantitativen Empfindlichkeits- Testprotokolls, umfassend N unterschiedliche Mengen eines antimikrobiellen Produkts, worin N größer als 2 ist und typischerweise 6 oder mehr beträgt. Der gegenwärtige FDA- Standard für quantitative Empfindlichkeitsprüfung ist ein Minimum von 5 Verdünnungen des antimikrobiellen Produkts, welche einen Teil des Dosierungsbereiches zur Therapie am Menschen abdeckt.
Testplatte 230 legt eine negative Wachstumskontroll-Vertiefung 231, eine positive Wachstumskontroll-Vertiefung 232 und in diesem Fall vier Testvertiefungen 233 bis 236 fest. Vier Testvertiefungen werden hier zur Bequemlichkeit der Veranschaulichung verwendet. Die Verwendung einer größeren Anzahl von Testvertiefungen wird unten in Verbindung mit Testkits diskutiert, die die Grundlagen der quantitativen Empfindlichkeitsprüfung dieser Erfindung beinhalten. Ein Testmodul 237 ist in jeder der Wachstumskontroll-Vertiefungen enthalten. Vier verschiedene Testmodule 238 bis 241 sind in den vier Testvertiefungen enthalten. Wie bei der obigen Beschreibung der qualitativen Empfindlichkeitsprüfung veranschaulichen die Testmodule hier die bevorzugte Form der Erfindung unter Verwendung eines einzigen Trägermediums in Form einer absorbierenden Papierscheibe, wobei alle Bestandteile des Testchemikaliensatzes in jedem der Testmodule enthalten sind und wobei die Testmodule in den Testvertiefungen auch vier verschiedene Mengen des antimikrobiellen Produkts enthalten, nämlich A1 bis A4. Für Zwecke dieser Beschreibung werden die Mengen des antimikrobiellen Produkts als ansteigend von A1 bis A4 betrachtet. Es sollte verstanden werden, daß jede der alternativen Formen der Erfindung wie oben in Verbindung mit Figuren 9 bis 12 beschrieben auch hier verwendet werden könnte.
Testmodul 231 wird mit einem rehydratisierenden Flüssigkeitsvolumen 242 rehydratisiert, welches einen Teil eines Gesamtinokulations-Systems 245 bildet. Jedes der Testmodule in den anderen Vertiefungen wird mit einem rehydratisierenden Flüssigkeitsvolumen rehydratisiert, zu dem einer der Mikroorganismen mit individuellen Inokulations- Volumen 246 bis 250 für die Vertiefungen zugegeben wurde. Eine spezielle Form von Inokulations-System wird unten in Verbindung mit einer Ausführungsform als Testkit dieser Erfindung beschrieben werden. Nach Rehyratation und Inokulation wird die Platte 230 für eine vorbestimmte Inkubationszeitdauer verbunden mit einem mit der Platte zu verwendenden vorgewählten Meßprotokoll in einen Inkubator gelegt.

Auswerten der Testergebnisse als MIC-Wert

Figuren 18 und 19 veranschaulichen ein Meßprotokoll mit sichtbarem Licht für eine Testplatte 230. Es sollte verstanden werden, daß alle oben beschriebenen manuellen und automatisierten Meßprotokolle zur Auswertung von Platte 230 angewendet werden könnten.
Wieder bezugnehmend auf Figuren 4 bis 6 sollte verstanden werden, daß die Farbe vor der Inkubation in allen Vertiefungen der Testplatte blau ist. Es werden auch die gleichen Qualifikationstests zur Plattenauswertung angewendet unter Verwendung der negativen Wachstumskontroll-Vertiefung und der positiven Wachstumskontroll-Vertiefung. Diese werden hier nicht wiederholt, um Wiederholungen zu vermeiden und diese Beschreibung nimmt an, daß die Platte die Qualifikationstests zur richtigen Auswertung bestanden hat, wobei die negative Wachstumskontroll-Vertiefung eine blaue Farbe und die positive Wachstumskontroll-Vertiefung eine rote Farbe zeigt.
Wie in Figur 18 gezeigt, zeigt Platte 230A eine Farbverschiebung von blau nach rot in jeder der ersten drei Testvertiefungen 233 bis 235, was Wachstum des Mikroorganismus in jeder dieser Testvertiefungen anzeigt. Testvertiefung 236 zeigt die ursprüngliche blaue Farbe, was anzeigt, daß in dieser Testvertiefung kein Wachstum des Mikroorganismus stattfand. Das von dieser Auswertung erhaltene Testergebnis ist, daß die MIC des in der Testplatte verwendeten antimikrobiellen Produkts die Konzentration A4 ist. Es sollte verstanden werden, daß die Konzentration A4 sich sowohl auf die Menge des antimikrobiellen Produkts in dem Testmodul als auch die Konzentration des antimikrobiellen Produkts in der endgültigen Testlösung nach Inokulation und Rehydratation der Testchemikalien bezieht.
Wie in Figur 19 gezeigt, zeigt die Platte 230B eine Farbverschiebung von blau nach rot nur in der ersten Testvertiefung 233, und die ursprüngliche blaue Farbe ist in den anderen drei Testvertiefungen 234 bis 236 vorhanden. Dies zeigt Wachstum des Mikroorganismus nur in der ersten Testvertiefung und Wachstumshemmung in den anderen drei für einen resultierenden MIC-Wert von A2 an. A2 ist der MIC-Wert, da der Test A2 als die geringste Konzentration des antimikrobiellen Produkts zeigt, welche Wachstum des Mikroorganismus hemmt.

Kits zur qualitativen Empfindlichkeits-Prüfung (Figuren 20 bis 23)

Figuren 20 bis 23 veranschaulichen erfindungsgemäße Kits zur Prüfung der qualitativen Empfindlichkeit und zeigen auch wie Bestandteile der Testkits bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden. Zur Vollständigkeit zeigt Figur 20 eine primäre Kulturplatte 255, auf der Kolonien des zu prüfenden Mikroorganismus gewachsen werden, aber diese primäre Kulturplatte wird nicht als Teil des Testkits dieser Erfindung betrachtet. Die Bestandteile des in Figur 20A gezeigten Testkits 260 sind ein Behälter 261 mit rehydratisierender Flüssigkeit, ein Inokulum- Vorbereitungstablett 262, ein Inokulator-System 263 und eine Testplatte 264, in der die Testvertiefungen mit geeigneten Testmodulen wie zuvor beschrieben beladen sind.
Die rehydratisierende Flüssigkeit im Behälter 261 erhält den Teilsatz von Testchemikalien TCB2, die nicht in den Testmodulen in den Vertiefungen der Platte 264, wie zuvor beschrieben, enthalten sind. In der bevorzugten Ausführungsform sind alle Testchemikalien in dem Satz in den Testmodulen, und die rehydratisierende Flüssigkeit ist eine vorgewählte sterile Flüssigkeit, wie etwa destilliertes Wasser. Sie kann auch eine 0,9 %ige Natriumchloridlösung umfassen und kann eine Vielzahl von Benetzungsmitteln umfassen, um bei der Herstellung einer einheitlichen Suspension der Mikroorganismen mitzuhelfen.
Das Inokulum-Vorbereitungstablett 262 kann in einer geeigneten Form zum Mischen der rehydratisierenden Flüssigkeit mit Mikroorganismen von Kolonien, die auf der primären Kulturplatte wachsen, ausgebildet sein, um das Inokulum für die positive Wachstumskontroll-Vertiefung und die Testvertiefungen T1 und T2 zu bilden. Die Gestalt des Inokulum-Vorbereitungstabletts muß an die Struktur und Betriebsweise des Inokulator-Systems 263 angepaßt sein. Das Inokulatorsystem 263 kann ein Standard- Mehrfach-Pipettiersystem umfassen oder es kann speziell zum Abgeben von Inokulum in die Vertiefungen der Testplatte entworfen sein. Wie gezeigt, umfaßt das Inokulator-System Inokulator-Mittel zum Abgeben einer Rehydratisierungs- Flüssigkeit in die negative Wachstumskontroll-Vertiefung und Mittel zum Abgeben von Inokulum in die positive Wachstumskontroll-Vertiefung.
Testplatte 264 enthält beladene Testmodule, wie gezeigt, mit zwei Testvertiefungen zur qualitativen Empfindlichkeits-Prüfung unter Verwendung eines einzelnen antimikrobiellen Produktes in diesem Fall. Der Testkit wird als QLS-1-A bezeichnet, was qualitative Empfindlichkeits-Prüfung mit einem antimikrobiellen Produkt anzeigt. Figur 21 veranschaulicht eine beladene Testplatte 275, die zur qualitativen Empfindlichkeit eines Mikroorganismus unter Verwendung von M unterschiedlichen antimikrobiellen Produkten geeignet ist, wobei ein Paar von Testvertiefungen mit jedem antimikrobiellen Produkt verbunden ist und mit Testmodulen beladen ist, die geeignete Konzentrationen des antimikrobiellen Produkts aufweisen. Wie in Figur 21 gezeigt, ist jedes der Testmodule bevorzugt eine einzelne absorbierende Papierscheibe, die mit einer visuell ablesbaren Legende markiert ist, die den Namen des antimikrobiellen Produkts in dem Testmodul und die Konzentration dieses antimikrobiellen Produkts darin angibt. Die Angabe A1 repräsentiert den auf die Scheibe aufgedruckten Namen des ersten antimikrobiellen Produkts, und die Angabe K1 repräsentiert die auf die Scheibe aufgedruckte Konzentration.
Figur 20B veranschaulicht einen Testkit 270, bezeichnet QLS-1- B, in dem eine leere Testplatte 274 anstelle einer beladenen Testplatte, wie im Kit 260 verwendet wird. Zusätzliche Bestandteile des Kits 270 umfassen ein Abgabemittel 271 für Wachstumskontroll-Testmodule zum Abgeben von Testmodulen TMA 272 in die negative Wachstumskontroll-Vertiefung und die positive Wachstumskontroll-Vertiefung von Platte 274 und ein AP-Testmodul-Abgabemittel 273 zur Abgabe von Testmodulen TMB1 und TMB2 in die Testvertiefungen T1 und T2. Das Abgabemittel 273 enthält die zwei unterschiedlichen Testmodule in abwechselnd übereinander gelegter Art, so daß zwei aufeinanderfolgende Betätigungen des Scheibenabgabe-Mechanismus mit dem Beladen der zwei Testvertiefungen verbunden sind. Die Abgabemittel 271 und 273 können Standard-antibiotische Scheiben-Abgabemittel, beladen mit Testmodulen gemäß dieser Erfindung in der Form von absorbierenden Papierscheiben sein.
Als eine Alternative zu einem einzelnen Abgabemittel mit abwechselnd übereinandergelegten Scheiben, wie in Figur 20B gezeigt, sollte es offensichtlich sein, daß zwei getrennte Abgabemittel eingesetzt werden könnten, wobei jedes eines der AP-Testmodule lagert und in eine verbundene Test-Vertiefung abgibt. Es sollte auch verstanden werden, daß der Kit 270 eine Vielzahl von Testplatten 274 umfassen kann, die mit den Abgabemitteln funktionieren, die in der Lage sind, Testmodule in eine Anzahl von Testplatten abzugeben.
Testplatte 274 ist zur Prüfung mit einem antimikrobiellen Produkt ausgelegt. Wie in Figur 22 gezeigt, könnte auch eine Testplatte 276, die eine negative Wachstumskontroll-Vertiefung, eine positive Wachstumskontroll-Vertiefung und eine Vielzahl von Paaren von Testvertiefungen für eine Vielzahl von antimikrobiellen Produkten festlegt ebenfalls in den Testkits dieser Erfindung eingesetzt werden. Um eine Testplatte 276 zu beladen, wird ein Abgabemittel des Typs 271 für die Wachstumskontroll-Vertiefungen und ein Abgabemittel des Typs 273 für jedes der antimikrobiellen Produkte eingesetzt, um die Testvertiefungen für jedes antimikrobielle Produkt zu laden. Für die Testplatte 276 würde es bevorzugt sein, ein Testmodul- Abgabemittel bereitzustellen, das in der Lage ist, eine ganze Reihe von Vertiefungen gleichzeitig zu laden.
Figur 23 veranschaulicht, daß die Testkits dieser Erfindung zur Prüfung auf qualitative Empfindlichkeit eines Mikroorganismus gegenüber vielen antimikrobiellen Produkten eine Platte 277 nutzen können, die sowohl einen beladenen Plattenabschnitt und einen beladbaren Plattenabschnitt umfaßt. Ein Testkit mit dieser Art Testplatte vereint die Annehmlichkeit von beladenen Testvertiefungen für antimikrobielle Produkte, die üblicherweise in praktisch allen Prüfsituationen verwendet werden, mit der Flexibilität von Anwender ausgewählten antimikrobiellen Produkten zum Zwecke des Anpassens eines Teils der Testplatte an Anwenderbedürfnisse mit antimikrobiellen Produkten, die für die Bedürfnisse des Anwenders in Verbindung mit besonderen Prüfsituationen maßgeschneidert sind. Testkits mit beladbaren Testvertiefungen sind insbesondere vorteilhaft um zur Gestaltung von Testplatten zu sorgen, die neuere antimikrobielle Produkte umfassen, da sie entwickelt werden, ohne warten zu müssen, bis solch antimikrobielle Produkte auf beladenen Platten vom Hersteller eingeschlossen werden.

Kits zur Prüfung der quantitativen Empfindlichkeit (Figuren 24 bis 29)

Figuren 24 bis 29 veranschaulichen quantitative Empfindlichkeits-Testkits gemäß dieser Erfindung. Bezugnehmend auf Figur 24A umfaßt der darin veranschaulichte Testkit 280 einen Behälter 281 einer Rehydratisierungs-Flüssigkeit, ein Inokulum-Vorbereitungstablett 282, ein Inokulator-System 283 und eine beladene Testplatte 284. Die Form und Funktion dieser Testkit-Komponenten ist im allgemeinen die gleiche wie die der entsprechenden bereits in Verbindung mit dem Testkit in Figur 20A beschriebenen Komponenten und die Beschreibung muß hier nicht wiederholt werden.
Figur 24B veranschaulicht einen Testkit 290 ähnlich dem Testkit 280 in Figur 24A, wobei aber eine leere Testplatte 294 eingesetzt und Testmodul-Abgabemittel 291 und 293 umfaßt sind. Abgabemittel 291 gibt Wachstumskontroll-Module in die Wachstumskontroll-Testvertiefungen von Platte 294 ab. Abgabemittel 293 gibt AP-Testmodule in die Testvertiefungen von Platte 294 ab. Wie gezeigt, hat Abgabemittel 293 die Testmodule für die vier Tests in einer Reihenfolge gestapelt, so daß vier aufeinanderfolgende Betätigungen des Abgabemittels gebraucht werden, um vier unterschiedliche Testmodule in der Form von Scheiben in die vier Testvertiefungen abzugeben. Figur 25 veranschaulicht die Alternative von Verwendung von vier getrennten Abgabemitteln 295 bis 298, wobei jedes einen einzelnen Typ eines AP-Testmoduls mit einer einzigen Konzentration des antimikrobiellen Produktes darin enthält. Diese vier Abgabemittel können einzeln betrieben werden, oder sie können in einem Gesamt-Abgabesystem kombiniert sein, welches alle vier Abgabemittel in Position zum gleichzeitigen Abgeben von vier Scheiben hält und einen einzigen Betätigungs- Mechanismus aufweist, der den Abgabefinger in jedem Abgabemittel zur gleichen Zeit betätigt.
Figur 26 veranschaulicht eine beladene Testplatte 300, die ein negative Wachstumskontroll-Vertiefung, eine positive Wachstumskontroll-vertiefung und einen Bereich von M Spalten mal N Reihen von Testvertiefungen festlegt, wobei jede Spalte mit einem von einer Vielzahl von antimikrobiellen Produkten verbunden ist und mit Testmodulen beladen ist, die geeignete antimikrobielle Produkte und unterschiedliche Konzentrationen, wie angezeigt, aufweisen.
Figur 27 veranschaulicht eine entsprechende beladbare Testplatte 301, welche die gleichen allgemeinen Prüffähigkeiten aufweist. Wie in Figur 28 gezeigt, können M individuelle Abgabemittel 302 bis 306, wobei jedes ein aufeinanderfolgendes Stapeln von AP-Testmodulen, verbunden mit Anwender auswählbaren antimikrobiellen Produkten aufweist, eingesetzt werden, um die Testplatte 301 zu laden.
Figur 29 veranschaulicht eine Testplatte 310 mit einem Bereich von M1 x N von beladenen Testvertiefungen und einen Bereich von M2 x N von beladbaren Testvertiefungen. Die in Figur 28 gezeigten Testmodul-Abgabemittel können verwendet werden, um AP-Testmodule in den Abschnitt mit beladbaren Testvertiefungen der Platte 310 abzugeben. Testplatte 310 liefert die gleichen Vorteile im quantitativen Empfindlichkeits-Prüfbereich wie die Testplatte 277 für den qualitativen Empfindlichkeits- Prüfbereich, wie oben beschrieben.

Merkmale der Bestandteile und Herstellungsverfahren

Testplatten

Die in Verbindung mit dieser Erfindung verwendeten Testplatten mit vielen Vertiefungen sind bevorzugt aus einem weißen, undurchsichtigen Kunststoff-Material gebildet. Solche Platten erlauben die Verwendung von geringeren Konzentrationen von Resazurin sowohl für Auswertung mit sichtbarem Licht als auch für Auswertung mit Fluoreszenz. Geringere Konzentrationen von Resazurin sind gegenüber Mikroorganismen weniger toxisch und minimieren folglich den möglichen Einfluß von Resazurin auf Testergebnisse. Von den weißen Wänden der Platte reflektierte Lichtintensität erhöht sowohl das mit sichtbarem Licht- als auch mit Fluoreszenz-Auswertung erhältliche Signal. Die weiße Platte liefert einen einheitlichen Auswerteuntergrund, welcher jegliche Notwendigkeit für Hintergrundbeleuchtungs-Ausrüstung zur Auswertung der Platte eliminiert und in konsistenteren und genaueren visuellen Interpretationen resultiert. Kleinere Unterschiede in der Farbe können mit weißem Hintergrund unterschieden werden.
Weiße Platten können aus günstigeren Kunststoffen und mit günstigerer Kunststoffplattenbildungs-Technologie hergestellt werden, da optische Durchsichtigkeit kein Erfordernis ist.

Inokulator und Rehydratationssysteme

Wenn diese Erfindung in gefrorenen Platten verwendet wird, können die Testvertiefungen einfach mit einer Multiprong- Inokulum-Transfervorrichtung inokuliert werden, die ein kleines Volumen (5 bis 10 ml) von einem Inokulumsamen zu jeder Testvertiefung in der Platte überträgt.
Wenn diese Erfindung mit getrockneten Platten verwendet wird, gibt es zwei mögliche Ansätze zur Inokulation. Alle Vertiefungen der Platte können zuerst mit einem Volumen einer Rehydratisierungs-Flüssigkeit rehydratisiert werden, die keine Mikroorganismen enthält. Dann wird Inokulation der Testvertiefungen, wie oben in Verbindung mit der gefrorenen Platte beschrieben, durchgeführt.
Alternativ können Rehydratation und Inokulation gleichzeitig durchgeführt werden durch zunächst Einbringen einer vorbestimmten Konzentration des Mikroorganismus in die Rehydratisierungs-Flüssigkeit und dann Abgeben eines konsistenten Volumens dieser Inokulum-Flüssigkeit in jede Testvertiefung. Dies kann mit einer Pipettiervorrichtung mit einzelner Spitze, einer Pipettiervorrichtung mit vielen Spitzen oder mit einem speziellen Zufuhrsystem gemacht werden, welches für diesen Zweck entworfen wurde.

Testmodule

Die bevorzugte Form dieser Erfindung umfaßt Einbringen aller Bestandteile des Testchemikaliensatzes, d.h. Resazurin, Wachstumsmedium, Puffer (falls benötigt) und Redoxstabilisator in ein Testmodul in die Testvertiefungen der Platte. Um die allgemeine Beschreibung hier zu vereinfachen, wird die Diskussion von Herstellungsverfahren der Testmodule und Platten, die Testmodule enthalten, auf diesen Ansatz beschränkt.

Gefrorene Platten

Um das Verfahren und die Vorrichtung dieser Erfindung in gefrorene Testplatten zu inkorporieren, wird das Resazurin zusammen mit geeigneten stabilisierenden Bestandteilen der Testchemikaliengruppe in die Testvertiefungen entweder zusammen mit dem Wachstumsmedium und Verdünnungen des antimikrobiellen Produkts oder getrennt zugegeben.

Getrocknete Platten

Das Verfahren zur Bildung von Testmodulen in getrockneten Platten ist das gleiche wie für gefrorene Platten, ausgenommen daß die Testchemikalienbestandteile in den Vertiefungen getrocknet werden, um ein Testmodul in der Form eines trockenen Feststoffvolumens an den Wänden der Vertiefungen selbst zu bilden. Trocknen kann unter Luftstrom oder im Vakuum durchgeführt werden. Die Formulierung der Testchemikalien- Bestandteile ist kritischer, wenn das Testmodul in getrockneter Form vorliegt, da die Konzentrationen des Resazurins, des antimikrobiellen Produkts und des Wachstumsmediums sehr hoch werden, wenn sich das Trocknen der Vervollständigung nähert. Geeignetes Puffern des pH's der Lösung und Stabilisierung der reduzierenden Wirkung des Wachstumsmediums ist unter diesen Umständen wichtig. Die unten zur Verwendung in dem Herstellungsverfahren von Testmodulen in der Form von absorbierenden Papierscheiben beschriebenen chemischen Formulierungen werden bevorzugt in getrockneten Platten verwendet, um das Flüssigkeitsvolumen in den Testvertiefungen, das getrocknet werden muß, zu verringern.

Absorbierende Papierscheiben

Es gibt verschiedene Ansätze, die genommen werden können, um Papierscheiben herzustellen, wobei die Bestandteile des Testchemikaliensatzes in trockener Form in der Scheibe enthalten sind. Im allgemeinen werden zur Herstellung im großen Maßstab mit der Legende, die das antimikrobielle Produkt und die Konzentration angibt, vorgedruckte Blätter der Papierscheiben-Medien chargenweise mit der Testchemikalienlösung imprägniert, getrocknet und dann in Scheiben geschnitten und verpackt. Im Fall von Verpacken von gestapelten, Reihenverdünnungs-Scheiben werden Stapel von Papiermedien mit den unterschiedlichen Konzentrationen des antimikrobiellen Produkts bevorzugt in einem Arbeitsgang in Scheiben geschnitten und dann verpackt.
Um Scheiben im kleinen Maßstab herzustellen, können die folgenden Verfahren eingesetzt werden. Ein Volumen der Lösung zum Scheibenbeladen wird hergestellt. Da die Papierscheiben nur 25 µl der Lösung aufnehmen können und das Endvolumen der Rehydratisierungs-Flüssigkeit in den Testvertiefungen geeigneterweise 100 µl beträgt, wird eine vierfache Konzentration der Testchemikalien in der Scheiben-Beladungs- Lösung verwendet.
Im einzelnen wird die folgende Scheiben-Beladungs-Lösung hergestellt. Die grundsätzliche Trägerlösung ist ein Phosphatpuffer mit pH 7,4 in 0,1 molarer Konzentration. Das Wachstumsmedium, welches eine Standard-Müller-Hinton-Nährlösung in trockener pulverförmiger Form ist, wird mit 88,0 g/l zugegeben. Resazurin wird zugegeben, um eine Konzentration von 0,02 g/l zu erzielen. Als Redoxstabilisator dienendes Kaliumferrocyanid wird bis zu einer Konzentration von 0,004 M zugegeben. Diese Lösung wird dann als Verdünnungslösung für das in die Testmodul-Scheibe einzuschließende antimikrobielle Produkt verwendet. Die Anfangskonzentration des antimikrobiellen Produkts beträgt also das vierfache der Endkonzentration, die in der Testvertiefung nach Rehydratisierung erwünscht ist, aber wird eingestellt, um irreversible Bindung des antimikrobiellen Produkts an die Scheibe auszugleichen. In anderen Worten gelangt nicht die Gesamtmenge des antimikrobiellen Produkts in die Rehydratisierungs-Flüssigkeit, wenn die getrockneten Testchemikalien in der Scheibe rehydratisiert werden. Das gebundene antimikrobielle Produkt in der Scheibe ist gegen den Mikroorganismus nicht wirksam.
Die Konzentration von Resazurin wird ausgewählt, um eine hellblaue Anfangsfarbe für hohen visuellen Kontrast zwischen positivem und negativem Wachstum des Mikroorganismus zu erzeugen. Höhere Konzentrationen von Resazurin würden ansteigende Toxizität fur einige Mikroorganismen aufweisen und würden die unterscheidbare visuelle Farbveränderung in Antwort auf Wachstum des Mikroorganismus verringern oder verzögern. Geringere Konzentrationen von Resazurin würden in einem geringen Kontrast zwischen positiven und negativen Testvertiefungs-Reaktionen resultieren, d.h. die Farbe in den Vertiefungen, wo der Mikroorganismus geringfügig wächst, würde nicht so einfach als Farbveränderung unterscheidbar sein. Diese Aussagen beziehen sich alle auf visuelle Auswertung der Testplatten und die Konzentration von Resazurin ist weniger bedeutsam für Meßprotokolle mit Fluoreszenzanregung.
Die Konzentration von Wachstumsmedium ist die Standardkonzentration, die in diesen Typen von Testplatten verwendet wird, und es gibt keinen Grund, dies zu ändern. Eine Abnahme der Konzentration wird Wachstumsraten verringern und ein Anstieg erhöht nicht die Wachstumsrate, sondern verschlimmert die Autoreduktions-Neigung des Wachstumsmediums während Inkubation und Trocknung. Es sollte verstanden werden, daß andere Wachstumsmedium-Formulierungen als die Standard- Müller-Hinton ebenfalls verwendet werden können, aber sie müssen die Leistungseigenschaften der jetzigen Standard-Müller- Hinton-Nährlösung erfüllen.
Der Puffer wird in ausreichenden Konzentrationen verwendet, um pH-Verschiebungen und begleitende Farbuneinheitlichkeit zwischen Testvertiefungen oder Testmodulen aufgrund zu hoher Konzentrationen von sauren antimikrobiellen Produkten, insbesondere während des Trocknungsvorgangs zu verhindern. Der pH-Wert von 7,4 wird verwendet, da er den empfohlenen pH für eine in dieser Anwendung verwendete Müller-Hinton-Nährlösung darstellt. Die Pufferkonzentration wird an dem Minimum gehalten, das erforderlich ist, um eine pH-Stabilität insbesondere während des Trocknens zu ergeben. Eine zu hohe molare Konzentration sollte vermieden werden, da sie die Reduktion von Resazurin zu Resorufin verzögern und die Konsistenz der Testergebnisse nachteilig beeinflussen kann.
Der Redoxstabilisator wird in einer ausreichenden Konzentration verwendet, um Autoreduktion des Resazurins während der Trocknungs- und Inkubationsvorgänge auf annehmbare Werte zu drücken. Kaliumferrocyanid wurde aufgrund seiner relativ geringen Toxizität gegenüber Mikroorganismen und seiner Stabilisierungsfähigkeit in dem entsprechenden Oxidations/Reduktions-Potentialbereich ausgewählt. Eine Konzentration wird ausgewählt, um übermäßige Stabilisierung der Oxidations/Reduktionsreaktion aufgrund des Mikroorganismuswachstums zu vermeiden, da dies die Genauigkeit der Testergebnisse verzögern und/oder nachteilig beeinflussen würde.
Der Ladevorgang der Scheibenbeladungs-Lösung in die Scheiben umfaßt aseptisches Verarbeiten unter Verwendung von sterilen Rohmaterialien. Eine Gruppe von Scheiben wird in einer einzelnen Schicht, wobei sich die Kanten nicht berühren, in einen flachen sterilen Behälter gelegt, der bedeckt sein kann, wie etwa eine bedeckte Petrischale. Eine Mikropipettiervorrichtung wird verwendet, um 25 µl der Scheiben-Beladungs-Lösung auf jede Scheibe aufzutragen.
Der Behälter wird dann bedeckt und in einen Gefrierschrank bei -70ºC über Nacht gelegt. Der Behälter wird dann zu einer Gefriertrocknungskammer transferiert und die Scheiben im Vakuum getrocknet. Sie werden dann entfernt, in Ampullen mit Deckel, die eine Trockner-Kapsel enthalten, gelegt und in dunkler, gekühlter Umgebung gelagert.
Zum Laden der Scheiben in Testaufnahmegefäße werden die Scheiben einzeln in aseptischer Weise transferiert. Es sollte verstanden werden, daß dieses Verfahren für die Herstellung von Testplatten im kleinen Maßstab zur Verwendung in klinischen Untersuchungen und ähnlichem verwendet werden kann, aber daß automatisierte Herstellung von Scheiben und automatisierte Plattenbeladungstechnologie im großen Maßstab zur Herstellung von beladenen Testplatten im großen Maßstab eingesetzt werden würde.

Automatisierte Auswertung von Testplatten (Figuren 30 bis 34)

Figur 30 veranschaulicht die in einem automatisierten Auswertesystem zum Auswerten von Testplatten im allgemeinen eingesetzten Komponenten, die die Verfahren und Vorrichtungen dieser Erfindung inkorporieren unter Verwendung von entweder dem Meßprotokoll mit sichtbarem Licht oder dem Meßprotokoll mit Fluoreszenzanregung. Nach Inkubation wird die Testplatte auf einen Scann-Tisch platziert, der jede Testvertiefung an einen Ort bringt, um durch die Auswertequelle und den Detektor zusammen mit der Auswerteelektronik ausgewertet zu werden. Die Daten von der Auswerteelektronik werden bevorzugt einem Datenanalyse-Computer übermittelt, wo die Algorithmen des verbundenen Meßprotokolls auf die Daten von jeder Vertiefung in der Testplatte angewendet werden.
Figur 31 zeigt, daß im Fall von Auswertung der Reflektivität von sichtbarem Licht zum Durchführen eines Meßprotokolls mit sichtbarem Licht ein einzelner Filter zur Auswahl der Auswertewellenlänge verwendet werden kann, welche verwendet wird, um die reflektierten Farbeigenschaften der Flüssigkeit in der Testvertiefung zu bestimmen. Analyse mit vielen Wellenlängen könnte, falls gewünscht, ebenfalls verwendet werden. Figur 32 veranschaulicht, daß im Fall von Auswertung mit Fluoreszenzanregung zur Durchführung eines Meßprotokolls mit Fluoreszenzanregung getrennte Filter zur Auswahl der Anregungswellenlänge und der Emissionswellenlänge eingesetzt werden. Sowohl Auswertung mit sichtbarem Licht der reflektierten Farbe als auch Fluoreszenzauswertung können mit Vorrichtungen durchgeführt werden, die gegenwärtig kommerziell erhältlich sind und Personen, die mit dieser Technologie vertraut sind, bekannt sind.
Figur 33 veranschaulicht, daß die Auswertung mit Fluoreszenzanregung von Mikroorganismuswachstum unter Verwendung der Resazurin-Redoxreaktion gemäß dieser Erfindung Daten bereitstellt, die im allgemeinen vergleichbar sind mit in schnellen Mikroorganismuswachstums-Detektionssystemen des Standes der Technik verwendeten fluorogenen Auswertungen in Fällen, wo der spezielle Mikroorganismus gut an die Detektion durch das fluorogene Detektionssystem angepaßt ist. Der Ansatz zur Auswertung mit Fluoreszenzanregung dieser Erfindung ist der fluorogenen Auswertung des Standes der Technik für Mikroorganismen überlegen, die durch solche Verfahren des Standes der Technik nicht einfach detektiert werden.
Figur 34 zeigt, daß die von Fluoreszenzemissions-Auswertung von Wachstum einer Vielzahl von Mikroorganismen erhaltenen Daten und veranschaulicht die allgemeine Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens auf schnelle Wachstumsbestimmung unter Verwendung eines Meßprotokolls mit Fluoreszenzanregung. Die Graphen zeigen Detektion beträchtlicher Mengen von Resorufin aufgrund Mikroorganismuswachstum innerhalb einer Inkubationszeitdauer von 4 bis 6 Stunden. Der Entwurf eines speziellen Meßprotokolls mit Fluoreszenzanregung und des Tests und der damit verbundenen Entscheidungsalgorithmen umfaßt die Sammlung von Daten von einer Anzahl von Mikroorganismen, die eine bekannte Antwort erzeugen und dann Aufbauen des Tests und der Entscheidungsalgorithmen, so daß Wachstum oder Nichtwachstum von unbekannten Organismen mit einem hohen Grad an Zuverlässigkeit bestimmt werden kann. Fachleute sind vertraut mit den verschiedenen Verfahren zum Entwerfen und Entwickeln von solchen Meßprotokollen und deren Durchführung in Verbindung mit dieser Erfindung umfaßt eine geradlinige Anwendung von bekanntem Datenaufnehmen und Protokollerzeugungsprinzipien. Tabelle 1 Tabelle 2

Claims

1. Verfahren zur Prüfung der Empfindlichkeit eines Mikroorganismus gegenüber Wachstumshemmung durch eine vorgewählte Konzentration eines antimikrobiellen Produkts, umfassend die Schritte:

a. Einbringen einer vorbestimmten Konzentration eines Wachstumsmediums für Mikroorganismen und einer vorbestimmten Konzentration an Resazurin, das vorher in einem Konzentrationsbereich festgesetzt wurde, der durch geringe Toxizität gegenüber Mikroorganismen und beträchtliche Empfindlichkeit gegenüber Reduktion zu Resorufin durch Metaboliten des Mikroorganismus-Wachstums gekennzeichnet ist, in jeweils ein Aufnahmegefäß zur negativen Wachstumskontrolle und ein Aufnahmegefäß zur positiven Wachstumskontrolle;

b. Einbringen einer vorbestimmten Konzentration des Mikroorganismus in das Aufnahmegefäß zur positiven Wachstumskontrolle;

c. Einbringen der vorgewählten Konzentration des antimikrobiellen Produkts in ein Testaufnahmegefäß;

d. Einbringen der vorbestimmten Konzentration von Resazurin in das Testaufnahmegefäß;

e. Einbringen der vorbestimmten Konzentration des Wachstumsmediums in das Testaufnahmegefäß;

f. Einbringen der vorbestimmten Konzentration des Mikroorganismus in das Testaufnahmegefäß;

g. gemeinsames Inkubieren aller Aufnahmegefäße für eine Inkubationszeitdauer, verbunden mit einem vorgewählten Meßprotokoll, umfassend ein Meßprotokoll mit sichtbarem Licht oder ein Meßprotokoll mit Fluoreszenzanregung; und

h. nach der Inkubationszeitdauer das Auswerten der Aufnahmegefäße gemäß dem vorgewählten Meßprotokoll, wobei die Anwesenheit oder Abwesenheit von Wachstum des Mikroorganismus in dem Testaufnahmegefäß auf der Grundlage der relativen Konzentrationen an Resazurin und Resorufin darin bestimmt wird, wobei das Meßprotokoll mit sichtbarem Licht einen Entscheidungalgorithmus enthält, der auf mindestens einer vorbestimmten funktionellen Kombination der in jedem der Aufnahmegefäße detektierten Farbe der sichtbaren Lichtreflexion basiert, wobei das Meßprotokoll mit Fluoreszenzanregung einen Entscheidungsalgorithmus enthält, der auf mindestens einer vorbestimmten funktionellen Kombination der Werte des Fluoreszenzemissionssignals basiert, das durch das Reduktionsprodukt Resorufin in jedem der Aufnahmegefäße erzeugt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Schritte c. bis einschließlich f. ausgeführt werden durch

j1) Bilden eines Testmoduls in dem Testaufnahmegefäß, umfassend ein trockenes Feststoffvolumen einer vorbestimmten Menge des antimikrobiellen Produkts und ein trockenes Feststoffvolumen eines vorgewählten Teilsatzes der Bestandteile eines Testchemikaliensatzes, umfassend Resazurin und das Wachstumsmedium; und

j2) Zugeben eines Flüssigkeitsvolumens, worin die vorbestimmte Konzentration des Mikroorganismus und alle nicht in dem Testmodul enthaltenden Bestandteile des Testchemikaliensatzes enthalten sind, in die Testvertiefung, um das Testmodul vor Ausführung des Schrittes g zu rehydratisieren.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin der Testchemikaliensatz einen vorgewählten Puffer zur Kontrolle des endgültigen pH-Wertes der rehydratisierten Testchemikalienlösung und ein vorgewähltes Redox-Stabilisationsmittel enthält, das durch wesentliche Erniedrigung der Reduktion von Resazurin durch das Wachstumsmedium während dem Schritt g gekennzeichnet ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin der Schritt j1) ausgeführt wird durch

k1) Zugeben eines vorbestimmten Flüssigkeitsvolumens, worin die vorgewählte Konzentration des antimikrobiellen Produkts, die vorbestimmte Konzentration an Resazurin, der vorgewählte Puffer, und das vorgewählte Redoxstabilisationsmittel enthalten sind, zu einem Trägermedium,

k2) Trocknen des Trägermediums, um das antimikrobielle Produkt, das Resazurin, den Puffer und das Redoxstabilisationsmittel darin als trockene Feststoffkomponenten zu gewinnen; und

k3) Legen des Trägermediums in das Testaufnahmegefäß entweder bevor oder nachdem die Schritte k1) und k2) durchgeführt werden;

und Schritt j2) ausgeführt wird durch

l1) Zugeben eines Flüssigkeitsvolumens, worin die vorbestimmte Konzentration des Wachstumsmediums und die vorbestimmte Konzentration des Mikroorganismus enthalten sind, in das Testaufnahmegefäß um die trockenen Feststoffkomponenten in dem Trägermedium zu rehydratisieren.

Verfahren nach Anspruch 3, worin der Schritt j1) ausgeführt wird durch

k1) Zugeben eines vorbestimmten Flüssigkeitsvolumens, worin die vorgewählte Konzentration des antimikrobiellen Produkts, die vorbestimmte Konzentration des Resazurin, die vorbestimmte Konzentration des Wachstumsmediums, der vorgewählte Puffer und das vorgewählte Redoxstabilisationsmittel enthalten sind, zu einem Trägermedium

k2) Trocknen des Trägermediums, um das antimikrobielle Produkt, das Resazurin, das Wachstumsmedium, den Puffer und das Redoxstabilisationsmittel darin als trockene Feststoffkomponenten zu gewinnen; und

k3) Legen des Trägermediums in das Testaufnahmegefäß entweder bevor oder nachdem die Schritte k1) und k2) durchgeführt werden

und der Schritt j2) ausgeführt wird durch

l1) Zugeben eines Flüssigkeitsvolumens, das die vorbestimmte Konzentration des Mikroorganismus umfaßt, in das Testaufnahmegefäß, um die trockenen Feststoffkomponenten in dem Trägermedium zu rehydratisieren.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Schritt a ausgeführt wird durch

j1) Zugeben eines vorbestimmten Flüssigkeitsvolumens worin die vorbestimmte Konzentration des Resazurin, die vorbestimmte Konzentration des Wachstumsmediums, ein vorgewählter Puffer und ein vorgewähltes Redoxstabilisationsmittel enthalten sind, zu jeweils einem Paar an Trägermedien, wobei der vorgewählte Puffer eine vorbestimmte Konzentration zur Kontrolle des pH-Werts der Flüssigkeit enthält und das vorgewählte Redoxstabilisationsmittel durch eine beträchtliche Erniedrigung der Reduktion des Resazurin durch das Wachstumsmedium während Schritt g gekennzeichnet ist;

j2) Trocknen von jedem der Trägermedien, um das Resazurin, das Wachstumsmedium, den Puffer und das Redoxstabilisationsmittel darin als trockene Feststoffkomponenten zu gewinnen;

j3) Legen von jeweils einem der Trägermedien in das Aufnahmegefäß zur negativen Wachstumskontrolle und das Aufnahmegefäß zur positiven Wachstumskontrolle entweder bevor oder nachdem die Schritte j1) und j2) durchgeführt werden; und

j4) Zugeben eines Volumens von steriler Flüssigkeit in das Aufnahmegefäß zur negativen Wachstumskontrolle, um die trockenen Feststoffkomponenten zu rehydratisieren;

wobei die Schritte c., d., und e. ausgeführt werden durch

k1) Zugeben eines vorbestimmten Flüssigkeitsvolumens worin die vorgewählte Konzentration des antimikrobiellen Produkts, die vorbestimmte Konzentration des Resazurin, die vorbestimmte Konzentration an Wachstumsmedium, der vorgewählte Puffer und das vorgewählte Redoxstabilisationsmittel enthalten sind, zu einem Trägermedium;

k3) Legen des Trägermediums in das Testaufnahmegefäß entweder bevor oder nachdem die Schritte j1) und j2) durchgeführt werden

und die Schritte b. und f. ausgeführt werden durch

l1) Zugeben eines Flüssigkeitsvolumens, umfassend die vorbestimmte Konzentration des Mikroorganismus in das Aufnahmegefäß zur positiven Wachstumskontrolle und zum Testaufnahmegefäß, um die trockenen Feststoffkomponenten in dem Trägermedium zu rehydratisieren.

7. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Schritt g. das gemeinsame Inkubieren der Aufnahmegefäße für eine vorher festgesetzte Inkubationszeitdauer in Verbindung mit einem Meßprotokoll mit Fluoreszenzanregung umfaßt; und Schritt h. das Auswerten der Aufnahmegefäße gemäß des Meßprotokolls mit Fluoreszenzanregung umfaßt, beinhaltend die Schritte

h1) Ablesen des Wertes der Fluoreszenzanregung von Resorufin in jedem der Aufnahmegefäße, wobei der Wert für die Vertiefung zur negativen Wachstumskontrolle als N bezeichnet wird, der Wert für die Vertiefung zur positiven Wachstumskontrolle als P bezeichnet wird und der Wert für das Testaufnahmegefäß als T bezeichnet wird;

h2) Berechnen der Werte eines Wachstumskontrollparameters Gc und eines korrigierten Testparameters Tc als die Differenz der Werte P und N bzw. der Werte T und N;

h3) Berechnen des Wertes einer Testvariablen I, umfassend eine vorbestimmte funktionelle Kombination des Wachstumskontrollparameters Gc und des korrigierten Testparameters Tc; und

h4) Übermitteln eines Testergebnisses unter Verwendung der Testvariablen I in einen vorgewählten Entscheidungsalgorithmus.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin der Schritt h3) das Berechnen der Testvariablen 1 als eine vorbestimmte Funktion umfaßt, welche das Verhältnis von Tc und Gc beinhaltet; und der Schritt h4) das Übermitteln umfaßt von einem positiven Testergebnis (Organismuswachstum), wenn I größer als oder gleich wie ein vorbestimmter positiver Entscheidungswert XP ist, einem negativen Testergebnis (kein Organismuswachstum), wenn I weniger als oder gleich wie ein vorbestimmter negativer Entscheidungswert XL ist, oder einem unbestimmten Testergebnis, wenn I zwischen XP und XL ist, worin die Entscheidungswerte XL und XP empirisch aus Daten festgesetzt werden, die in Kontrolltests unter Verwendung von Organismen, die bekannte Testergebnisse erzeugen, erhalten werden.

9. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Schritt g. gemäß einem schnellen Meßprotokoll mit Fluoreszenzanregung ausgeführt wird und die gemeinsame Inkubation der Aufnahmegefäße für eine Zeitdauer beinhaltet, die ausreicht zur Erzeugung einer vorher festgesetzten Wachstumsrate der Mikroorganismen in dem Aufnahmegefäß zur positiven Wachstumskontrolle wie sie durch Ablesen des Wertes der Fluoreszenzanregung von Resorufin in dem Aufnahmegefzß zur negativen Wachstumskontrolle und dem Aufnahmegefäß zur positiven Wachstumskontrolle zu mindestens zwei verschiedenen Zeiten während der Zeitdauer bestimmt wird; und der Schritt h. das Auswerten der Aufnahmegefäße gemäß dem schnellen Meßprotokoll mit Fluoreszenzanregung umfaßt, welches die Schritte beinhaltet

h1) Bestimmen der Werte von vorbestimmten dynamischen Eigenschaften der Herstellung von Resorufin jeweils im Testaufnahmegefäß und im Aufnahmegefäß zur positiven Wachstumskontrolle durch Messung der Fluoreszenzanregungswerte von Resoruf in darin und im Aufnahmgefäß zur negativen Wachstumskontrolle bei mindestens zwei getrennten Zeitabschnitten unter Verwendung der gemessenen Werte des Aufnahmgefäßes zur negativen Wachstumskontrolle zur Korrektur, und Bezeichnen der Werte als T' bzw. G';

h2) Berechnen des Werts einer als I bezeichneten Testvariablen, die eine vorbestimmte funktionelle Kombination von T' und G' umfaßt; und

h3) übermitteln eines Testergebnisses unter Verwendung des Werts der Testvariablen I in einen vorgewählten Entscheidungsalgorithmus.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin der Schritt h2) das Berechnen der Testvariable I als eine vorbestimmte Funktion umfaßt, welche das Verhältnis von T' und G' beinhaltet; und Schritt h3) umfaßt das Übermitteln von

einem positiven Testergebnis (Organismuswachstum), wenn I größer als oder gleich wie ein vorher festgesetzter positiver Entscheidungswert XP ist,

einem negativen Testergebnis (kein Organismuswachstum), wenn I weniger als oder gleich wie ein vorher festgesetzter negativer Entscheidungswert XL ist, oder

einem unbestimmten Testergebnis, wenn I zwischen XP und XL ist,

worin die Entscheidungswerte XL und XP empirisch aus Daten festgesetzt werden, die in Kontrolltests unter Verwendung von Organismen, die bekannte Testergebnisse erzeugen, erhalten werden.

11. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Schritt g. die gemeiname Inkubation der Aufnahmegefäße für eine vorher festgesetzte Inkubationszeitdauer in Verbindung mit einem Meßprotokoll mit sichtbarem Licht umfaßt; und der Schritt h. die Schritte umfaßt

h1) Qualifizieren der Aufnahmegefäße zur Auswertung, basierend auf der Detektion einer Abwesenheit einer erkennbaren Verschiebung der anfänglichen blauen Farbe, die Resazurin in dem Aufnahmegefäß zur negativen Wachstumskontrolle zugeordnet werden kann, wodurch kein Wachstum der Mikroorganismen darin angezeigt wird und einer Anwesenheit einer beträchtlichen Farbverschiebung in der Vertiefung zur positiven Wachstumskontrolle von der anfänglichen blauen Farbe des Resazurin zu einer roten Farbe, welche der Erzeugung des Reduktionsprodukts Resorufin durch Mikroorganismuswachstum darin zugeordnet werden kann;

h2) Übermitteln eines mißlungenen Versuchs, wenn die Aufnahmegefäße sich nicht zur Auswertung gemäß Schritt h1) qualifizieren; und

h3) Übermitteln eines Testergebnisses, wenn sich die Aufnahmegefäße zur Auswertung gemäß Schritt i1) qualifizieren durch Detektion der Anwesenheit oder Abwesenheit einer beträchtlichen Farbverschiebung des Testaufnahmegefäßes von einer anfänglichen blauen Farbe des Resazurin zu der roten Farbe des Resorufin, wobei das Testergebnis positiv ist (Organismuswachstum), wenn die Farbverschiebung vorliegt und das Testergebnis negativ ist (kein Organismuswachstum) wenn die Farbverschiebung nicht vorliegt.

12. Verfahren nach Anspruch 3, worin der Schritt j1) ausgeführt wird durch

k1) Zugeben eines vorbestimmten Flüssigkeitsvolumens, worin die vorgewählte Konzentration des antimikrobiellen Produkts, die vorbestimmte Konzentration des Resazurin, die vorbestimmte Konzentration des Wachstumsmediums, der vorgewählte Puffer und das vorgewählte Redoxstabilisationsmittel enthalten sind, in das Testaufnahmegefäß; und

k2) Trocknen des Flüssigkeitsvolumens, um das antimikrobielle Produkt, das Resazurin, das Wachstumsmedium, den Puffer und das Redoxstabilisationsmittel als trockene Feststoffkomponenten zu gewinnen;

und der Schritt j2) ausgeführt wird durch

l1) Zugeben eines Flüssigkeitsvolumens, welches die vorbestimmte Konzentration des Mikroorganismus umfaßt, in das Testaufnahmegefäß, um die trockenen Feststoffkomponenten zu rehydratisieren.

13. Verfahren nach Anspruch 5, worin das Trägermedium eine absorbierende Papierscheibe umfaßt und die trockenen Feststoffkomponenten in der Scheibe gewonnen werden.

14. Verfahren nach Anspruch 5, worin das Trägermedium mindestens eine erste und eine zweite absorbierende Papierscheibe umfaßt, wobei die erste Scheibe darin Resazurin enthält, die zweite Scheibe das Wachstumsmedium darin enthält und der Puffer und das Redoxstabilisationsmittel zu einer der ersten oder zeiten Scheiben zugegeben werden.

15. Verfahren nach Anspruch 5, worin der Schritt g. die gemeinsame Inkubation der Aufnahmegefäße für eine vorher festgesetzte Inkubationszeitdauer in Verbindung mit einem Meßprotokoll mit sichtbarem Licht umfaßt; und der Schritt h. die Schritte umfaßt

h1) Qualifizieren der Aufnahmegefäße zur Auswertung, basierend auf der Detektion einer Abwesenheit einer erkennbaren Verschiebung der anfänglichen blauen Farbe, welche Resazurin in dem Aufnahmegefäß zur negativen Wachstumskontrolle zugeordnet werden kann, wodurch kein Wachstum des Mikroorganismus darin angezeigt wird und einer Anwesenheit einer beträchtlichen Farbverschiebung in der Vertiefung der positiven Wachstumskontrolle von einer anfänglichen blauen Farbe des Resazurin zu einer roten Farbe, welche der Erzeugung des Reduktionsprodukts Resorufin durch Mikroorganismuswachstum darin zugeordnet werden kann;

h2) übermitteln eines mißlungenen Versuches, wenn die Aufnahmegefäße sich nicht zur Auswertung gemäß Schritt h1) qualifizieren; und

h3) Übermitteln eines Testergebnisses, wenn sich die Aufnahmegefäße zur Auswertung gemäß Schritt i1) qualifizieren durch Detektion der Anwesenheit oder Abwesenheit einer beträchtlichen Farbverschiebung des Testaufnahmegefäßes von einer anfänglichen blauen Farbe des Resazurin zu der roten Farbe des Resorufin, wobei das Testergebnis positiv (Organismuswachstum) ist, wenn die Farbverschiebung vorliegt und das Testergebnis negativ (kein Organismuswachstum) ist, wenn die Farbverschiebung nicht vorliegt.

16. Vorrichtung zur Prüfung der qualitativen Empfindlichkeit eines Mikroorganismus gegenüber Wachstumshemmung durch ein antimikrobielles Produkt unter Verwendung eines vorbestimmten qualitativen Empfindlichkeitstestprotokolls, beinhaltend erste und zweite Mengen des antimikrobiellen Produkts, umfassend

eine Testplatte, bestimmend eine Vertiefung zur negativen Wachstumskontrolle, eine Vertiefung zur positiven Wachstumskontrolle und ein Paar Testvertiefungen;

ein Testmodul, jeweils in die Vertiefung zur negativen Wachstumskontrolle, in die Vertiefung zur positiven Wachstumskontrolle und in das Testvertiefungspaar eingebracht, wobei jedes der Testmodule ein trockenes Feststoffvolumen eines Teilsatzes der Bestandteile eines Testchemikaliensatzes umfaßt, umfassend eine Menge Resazurin und eine Menge Wachstumsmedium für Mikroorganismen, wobei jedes der Testmodule in dem Testvertiefungspaar weiterhin ein trockenes Feststoffvolumen der ersten oder zweiten Menge des antimikrobiellen Produkts umfaßt;

wobei das Testmodul in der Vertiefung zur negativen Wachstumskontrolle eingerichtet ist zur Rehydratisierung durch ein Volumen von steriler Flüssigkeit, enthaltend alle Bestandteile des Testchemikaliensatzes, die nicht in dem Teilsatz enthalten sind;

wobei die Testmodule jeweils in der Vertiefung zur positiven Wachstumskontrolle und dem Testvertiefungspaar eingerichtet sind zur Rehydratisierung durch ein Volumen von Inokulations-Flüssigkeit, enthaltend alle Bestandteile des Testchemikaliensatzes, die nicht in dem Teilsatz enthalten sind, zusammen mit einer vorbestimmten Konzentration des Mikroorganismus;

wobei das Volumen von steriler Flüssigkeit und das Volumen von Inokulations-Flüssigkeit die gleiche vorgewählte Volumenmenge aufweisen, wobei die Menge an Resazurin relativ zu der vorgewählten Volumenmenge vorgewählt wird, um eine vorgewählte Konzentration von Resazurin in jeder Vertiefung in einem Bereich zu erzeugen, der durch niedrige Toxizität gegenüber Mikroorganismuswachstum und beträchtliche Empfindlichkeit gegenüber Reduktion zu Resorufin durch Metaboliten des Mikroorganismuswachstums gekennzeichnet ist und die Menge an Wachstumsmedium vorgewählt ist, um eine vorgewählte Konzentration an Wachstumsmedium in jeder der Vertiefungen zu erzeugen;

wobei die Testplatte und die darin befindlichen rehydratisierten Testmodule eingerichtet sind, um für eine Inkubationszeitdauer inkubiert zu werden in Verbindung mit mit einem vorgewählten Meßprotokoll umfassend ein Meßprotokoll mit sichtbarem Licht oder ein Meßprotokoll mit Fluoreszenzanregung und danach zur Auswertung gemäß dem vorgewählten Meßprotokoll, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Wachstum der Mikroorganismen in den Testvertiefungen zu bestimmen.

17. Vorrichtung zur Prüfung der quantitativen Empfindlichkeit eines Mikroorganismus gegenüber Wachstumshemmung durch ein antimikrobielles Produkt unter Verwendung eines vorbestimmten quantitativen Empfindlichkeitstestprotokolls, beinhaltend N unterschiedliche Mengen des antimikrobiellen Produkts, worin N> 2, umfassend

eine Testplatte, welche eine Vertiefung zur negativen Wachstumskontrolle, eine Vertiefung zur positiven Wachstumskontrolle und N Testvertiefungen bestimmt,

ein Testmodul, eingebracht jeweils in die Vertiefung zur negativen Wachstumskontrolle, in die Vertiefung zur positiven Wachstumskontrolle und in die N Testvertiefungen, wobei jedes Testmodul ein trockenes Feststoffvolumen eines Teilsatzes der Bestandteile eines Testchemikaliensatzes enthält, umfassend eine Menge Resazurin und eine Menge von Wachstumsmedium für Mikroorganismen, wobei jedes der Testmodule in den N Testvertiefungen weiterhin ein trockenes Feststoffvolumen einer unterschiedlichen Menge des antimikrobiellen Produkts, ausgewählt gemäß dem quantitativen Empfindlichkeitstestprotokoll, enthält;

wobei das Testmodul in der Vertiefung zur negativen Wachstumskontrolle eingerichtet ist zur Rehydratisierung mit einem Volumen von steriler Flüssigkeit, enthaltend alle Bestandteile des Testchemikaliensatzes, die nicht in dem Teilsatz enthalten sind;

wobei die Testmodule in jeweils der Vertiefung zur positiven Wachstumskontrolle und in den N Testvertiefungen eingerichtet sind zur Rehydratisierung Volumen von Inokulations-Flüssigkeit, enthaltend alle Bestandteile des Testchemikaliensatzes, die nicht in dem Teilsatz enthalten sind, zusammen mit einer vorbestimmten Konzentration des Mikroorganismus;

wobei das Volumen von steriler Flüssigkeit und das Volumen von Inokulations-Flüssigkeit die gleiche vorgewählte Volumenmenge aufweisen, wobei die Menge von Resazurin relativ zu der vorgewählten Volumenmenge ausgewählt wird, um eine vorgewählte Konzentration von Resazurin in jeder der Vertiefungen zu erzeugen in einem Bereich, der durch niedrige Toxizität gegenüber Mikroorganismuswachstum und beträchtliche Empfindlichkeit gegenüber Reduktion zu Resorufin durch Metaboliten des Mikroorganismuswachstums gekennzeichnet ist und die Menge an Wachstumsmedium ausgewählt ist, um eine vorgewählte Konzentration an Wachstumsmedium in jeder der Vertiefungen zu erzeugen; wobei die Testplatte und die darin enthaltenden rehydratisierten Testmodule eingerichtet sind zur Inkubation für eine Inkubationszeitdauer in Verbindung mit einem vorgewählten Meßprotokoll, umfassend ein Meßprotokoll mit sichtbarem Licht oder ein Meßprotokoll mit Fluoreszenzanregung und danach zur Auswertung gemäß dem vorgewählten Meßprotokoll, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Wachstum des Mikroorganismus in den Testvertiefungen zu bestimmen.

18. Vorrichtung nach Anspruch 16 oder Anspruch 17, worin jedes der Testmodule ein Trägermedium, enthalten in einer entsprechenden Vertiefung umfaßt und jedes der Testmodule den Teilsatz der Bestandteile des Testchemikaliensatzes enthält.

19. Vorrichtung nach Anspruch 18, worin das Trägermedium eine absorbierende Papierscheibe umfaßt und jede der absorbierenden Papierscheiben in den Testvertiefungen mit einer sichtbar lesbaren Anzeige sowohl des Namens als auch der Konzentration des darin aufbewahrten antimikrobiellen Produkts bedruckt ist.

20. Vorrichtung nach Anspruch 18, worin das Trägermedium mindestens eine erste und eine zweite absorbierende Papierscheibe umfaßt, wobei die erste Papierscheibe das Resazurin enthält und die zweite Papierscheibe das Wachstumsmedium enthält, wobei jeweils eine der beiden Papierscheiben in den Testvertiefungen die entsprechende Menge des antimikrobiellen Produkts trägt und mit einer sichtbar lesbaren Anzeige des Namens und der Konzentration des darin aufbewahrten antimikrobiellen Produkts bedruckt ist.

21. Kit zur Prüfung der qualitativen Empfindlichkeit eines Mikroorganismus gegenüber Wachstumshemmung durch ein antimikrobielles Produkt unter Verwendung eines vorbestimmten qualitativen Empfindlichkeitstestprotokolls, beinhaltend eine erste und zweite Menge des antimikrobiellen Produkts, umfassend

eine Testplatte, bestimmend eine Vertiefung zur negativen Wachstumskontrolle, eine Vertiefung zur positiven Wachstumskontrolle und ein Paar von Testvertiefungen;

ein Testmodul, enthalten jeweils in der Vertiefung zur negativen Wachstumskontrolle, in der Vertiefung zur positiven Wachstumskontrolle und in dem Paar von Testvertiefungen, wobei die Testmodule jeweils ein trockenes Feststoffvolumen eines Teilsatzes der Bestandteile eines Testchemikaliensatzes enthalten, umfassend eine Menge Resazurin und eine Menge Wachstumsmedium für Mikroorganismen, wobei die Testmodule in dem Paar von Testvertiefungen jeweils weiterhin ein trockenes Feststoffvolumen von einer ersten oder zweiten Menge des antimikrobiellen Produkts enthalten;

einen Behälter mit Rehydratisierungs-Flüssigkeit, enthaltend alle Bestandteile des Testchemikaliensatzes, die nicht in dem Teilsatz enthalten sind;

Inokulum- Aufbewahrungsmittel zur Aufbewahrung eines Volumens von Rehydratisierungs-Flüssigkeit, zu dem der Mikroorganismus zugegeben wurde, um eine Inokulations- Flüssigkeit zu bilden mit einer vorbestimmten Konzentration an Mikroorganismen darin;

Inokulationsmittel, beinhaltend Mittel zur Abgabe einer vorbestimmten Menge der Rehydratisierungs-Flüssigkeit in die Vertiefung zur negativen Wachstumskontrolle, Mittel zur Abgabe einer vorbestimmten Menge der Inokulations- Flüssigkeit in die Vertiefung zur positiven Wachstumskontrolle und das Paar von Testvertiefungen, um die Testchemikalien in den Testmodulen darin zu rehydratisieren; wobei die Menge von Resazurin relativ zu der vorbestimmten Menge vorgewählt ist, um eine vorgewählte Konzentration an Resazurin in jeder der Vertiefungen in einem Bereich zu erzeugen, der durch niedrige Toxizität gegenüber Mikroorganismuswachstum und beträchtliche Empfindlichkeit gegenüber Reduktion zu Resorufin durch Metaboliten des Mikroorganismuswachstums gekennzeichnet ist und die Menge des Wachstumsmediums vorgewählt ist, um eine vorgewählte Konzentration von Standardwachstumsmedium in jeder der Vertiefungen zu erzeugen;

wobei die Testplatte und die darin enthaltenen rehydratisierten Testmodule eingerichtet sind zur Inkubation für eine Inkubationszeitdauer in Verbindun mit einem vorgewählten Meßprotokoll, umfassend ein Meßprotokoll mit sichbarem Licht oder ein Meßprotokoll mit Fluoreszenzanregung und danach zur Auswertung gemäß dem vorgewählten Meßprotokoll, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Wachstum der Mikroorganismen in den Testvertiefungen zu bestimmen.

22. Kit zur Prüfung der quantitativen Empfindlichkeit eines Mikroorganismus gegenüber Wachstumshemmung durch ein antimikrobielles Produkt unter Verwendung eines vorbestimmten quantitativen Empfindlichkeitstestprotokolls, beinhaltend N unterschiedliche Mengen des antimikrobiellen Produkts, worin N> 2, umfassend eine Testplatte, bestimmend eine Vertiefung zur negativen Wachstumskontrolle, eine Vertiefung zur positiven Wachstumskontrolle und N Testvertiefungen;

ein Testmodul, enthalten jeweils in der Vertiefung zur negativen Wachstumskontrolle, in der Vertiefung zur positiven Wachstumskontrolle und in den N Testvertiefungen, wobei die Testmodule jeweils ein trockenes Feststoffvolumen eines Teilsatzes der Bestandteile eines Testchemikaliensatzes enthalten, umfassend eine Menge an Resazurin und eine Menge an Wachstumsmedium für Mikroorganismen, wobei die Testmodule in den N Testvertiefungen jeweils weiterhin ein trockenes Feststoffvolumen von einer von N unterschiedlichen Mengen des antimikrobiellen Produkts umfassen;

Inokulum-Aufbewahrungsmittel zur Aufbewahrung eines Volumens von Rehydratisierungs-Flüssigkeit mit dazu zugegebenen Mikroorganismen, um eine Inokulations- Flüssigkeit zu bilden, die eine vorbestimmte Konzentration an Mikroorganismus darin enthält;

Inokulations-Mittel, beinhaltend Mittel zur Abgabe einer vorbestimmten Menge der Rehydratisierungs-Flüssigkeit in die Vertiefung zur negativen Wachstumskontrolle, Mittel zur Abgabe einer vorbestimmten Menge der Inokulations- Flüssigkeit in die Vertiefung zur positiven Wachstumskontrolle und jeweils in die N Testvertiefungen, um die Testchemikalien in den Testmodulen darin zu rehydratisieren; wobei die Menge an Resazurin vorgewählt ist, relativ zu der vorbestimmten Menge, um eine vorgewählte Konzentration an Resazurin in jeder der Vertiefungen zu erzeugen, in einem Bereich, der durch niedrige Toxizität gegenüber Mikroorganismuswachstum und beträchtliche Empfindlichkeit gegenüber Reduktion zu Resorufin durch Metaboliten des Mikroorganismuswachstums gekennzeichnet ist, und die Menge des Wachstumsmediums vorgewählt ist, um eine vorgewählte Konzentration von Standardwachstumsmedium in jeder der Vertiefungen zu erzeugen;

wobei die Testplatte und die darin enthaltenen rehydratisierten Testmodule eingerichtet sind zur Inkubation für eine Inkubationszeitdauer in Verbindung mit einem vorgewählten Meßprotokoll, umfassend ein Meßprotokoll mit sichtbarem Licht oder ein Meßprotokoll mit Fluoreszenzanregung und danach zur Auswertung gemäß dem vorgewählten Meßprotokoll, um die Anwesenheit oder die Abwesenheit von Wachstum des Mikroorganismus in den Testvertiefungen zu bestimmen.

23. Kit nach Anspruch 21 oder Anspruch 22, worin die Testmodule jeweils eine absorbierende Papierscheibe umfassen und jede der absorbierenden Papierscheiben in den Testvertiefungen mit einer sichtbar lesbaren Anzeige des Namens und der Konzentration des darin aufbewahrten mikrobiellen Produkts bedruckt ist.

24. Kit nach Anspruch 21 oder Anspruch 22, worin jedes der Testmodule mindestens eine erste und eine zweite absorbierende Papierscheibe umfaßt, wobei die erste Scheibe das Resazurin enthält und die zweite Scheibe das Wachstumsmedium enthält, wobei eine der ersten und zweiten Papierscheiben in jeder der Testvertiefungen, die entsprechende Menge des antimikrobiellen Produkts enthält und jeweils mit einer sichtbar lesbaren Anzeige des Namens und der Konzentration des darin aufbewahrten antimikrobiellen Produkts bedruckt ist.

25. Kit nach Anspruch 21, umfassend ein erstes Testmodul, enthaltend ein Trägermedium zum Tragen der ersten Menge des antimikrobiellen Produkts in trockener Feststofform und eine Gruppe Testchemikalien, umfassend einen Teilsatz der Bestandteile eines Testchemikaliensatzes, umfassend eine Menge Resazurin und eine Menge eines Wachstumsmediums für Mikroorganismen;

ein zweites Testmodul, umfassend ein Trägermedium zum Tragen einer zweiten Menge des antimikrobiellen Produkts in trockener Feststofform und die Testchemikaliengruppe; und

Abgabemittel zur Abgabe des ersten und zweiten Testmoduls in das Paar von Testvertiefungen.

26. Kit nach Anspruch 25, zusätzlich umfassend

ein Paar Wachstumstestmodule, jeweils umfassend ein Trägermedium zum Tragen der Testchemikaliengruppe in trockener Feststofform; und

einen Behälter der Rehydratisierungs-Flüssigkeit;

wobei das Abgabemittel Mittel zur Abgabe von einem der Paare von Wachstumstestmodulen, jeweils in die Vertiefung zur negativen Wachstumskontrolle und die Vertiefung zur positiven Wachstumskontrolle, enthält; und

das Inokulations-Mittel Mittel zur Abgabe einer vorbestimmten Menge der Rehydratisierungs-Flüssigkeit in die Vertiefung zur negativen Wachstumskontrolle und einer vorbestimmten Menge der Inokulations-Flüssigkeit in die Vertiefung zur positiven Wachstumskontrolle enthält.

27. Kit nach Anspruch 25, umfassend eine Vielzahl an Testplatten zur Prüfung von einer Vielzahl von Mikroorganismen und eine Vielzahl von jeweils ersten Testmodulen und zweiten Testmodulen; und

wobei die Abgabemittel erste und zweite Aufbewahrungsmittel zur Aufbewahrung der Vielzahl der ersten bzw. zweiten Testmodule und ein Abgabegerät umfassen, operativ verbunden mit den Aufbewahrungsmitteln zur gleichzeitigen Abgabe von einem der ersten Testmodule aus den ersten Aufbewahrungsmitteln in eine der Testvertiefungen und eines der zweiten Testmodule aus den zweiten Aufbewahrungsmitteln in die andere der Testvertiefungen in einer Testplatte aus der Vielzahl an Testplatten.

28. Kit nach Anspruch 25, umfassend eine Vielzahl an Testplatten zur Prüfung einer Vielzahl von Mikroorganismen und eine Vielzahl von jeweils ersten Testmodulen und zweiten Testmodulen;

wobei die Abgabemittel Aufbewahrungsmittel zur Aufbewahrung der Vielzahl der ersten und zweiten Testmodule in einer abwechselnden Art und ein Abgabegerät umfassen, operativ verbunden mit den Aufbewahrungsmitteln zur alternierenden Abgabe eines ersten Testmoduls in eine der Testvertiefungen in einer der Testplatten und eines zweiten Testmoduls in die andere der Testvertiefungen derselben Testplatte.

29. Kit nach Anspruch 23, worin der Testchemikaliensatz weiterhin einen vorgewählten Puffer zur pH-Kontrolle und ein vorgewähltes Redoxstabilisationsmittel zur Erniedrigung der Reduktion von Resazurin durch das Wachstumsmedium und den Puffer während der Inkubation der Testplatte umfaßt, und worin alle Bestandteile des Testchemikaliensatzes in der absorbierenden Papierscheibe enthalten sind, wobei die Inokulations-Flüssigkeit nur den Mikroorganismus enthält.

30. Kit nach Anspruch 25, eingerichtet zur Prüfung der qualitativen Empfindlichkeit des Mikroorganismus gegenüber Wachstumshemmung durch M unterschiedliche antimikrobielle Produkte, worin

die Testplatte M Paare an Testvertiefungen festlegt, wobei jedes Paar mit einem der M antimikrobiellen Produkte assoziiert ist;

M erste Testmodule und M zweite Testmodule bereitgestellt werden, die jeweils mit einem der antimikrobiellen Produkte assoziiert sind;

wobei die Abgabemittel Mittel zur Abgabe von jeweils M ersten Testmodulen und jeweils M zweiten Testmodulen in die entsprechenden der M Paare vontestvertiefungen umfassen; und

die Inokulationsmittel eine vorbestimmte Menge der Inokulations-Flüssigkeit in jede Vertiefung der M Paare von Testvertiefungen abgeben.

31. Kit nach Anspruch 30, worin jedes der M ersten und zweiten Testmodule eine absorbierende Papierscheibe umfaßt, welche mit einer sichtbar lesbaren Bezeichnung sowohl des Namens als auch der Konzentration des assoziierten darin enthaltenen antimikrobiellen Produkts bedruckt ist.

32. Kit nach Anspruch 31, worin der Testchemikaliensatz weiterhin einen vorgewählten Puffer zur pH-Kontrolle und ein vorgewähltes Redoxstabilisationsmittel zur Erniedrigung der Reduktion von Resazurin durch das Wachstumsmedium und den Puffer während der Inkubation der Testplatte, umfaßt und worin alle Bestandteile des Testchemikaliensatzes in jeder der absorbierenden Papierscheiben enthalten sind und die Inokulations- Flüssigkeit nur den Mikroorganismus enthält.

33. Kit nach Anspruch 22, umfassend mindestens N Testmodule, jeweils enthaltend ein Trägermedium zum Tragen einer von N unterschiedlichen Mengen des antimikrobiellen Produkts in trockener Feststofform und eine Testchemikaliengruppe, umfassend einen Teilsatz der Bestandteile des Testchemikaliensatzes, umfassend eine Menge an Resazurin und eine Menge an Wachstumsmedium für Mikroorganismen; und

Abgabemittel zur Abgabe der N Testmodule in die N Testvertiefungen gemäß der Reihenfolge der Menge des darin befindlichen antimikrobiellen Produkts.

34. Kit nach Anspruch 33, umfassend eine Vielzahl an Testplatten zur Prüfung einer Vielzahl von Mikroorganismen und eine Vielzahl an Sätzen der N Testmodule;

wobei die Abgabemittel Aufbewahrungsmittel zur Aufbewahrung der Vielzahl der Sätze an N Testmodulen und Mittel zur einzelnen Abgabe der Testmodule von den Aufbewahrungsmitteln umfassen, wobei die N Testmodule in jeder der Vielzahl der Sätze in den Aufbewahrungsmitteln in einer vorbestimmten Reihenfolge gemäß der Menge des darin enthaltenen antimikrobiellen Produkts vorbestimmt sind, so daß die Abgabemittel N Testmodule in der Reihenfolge in die N Testvertiefungen in jede der Testplatte betriebsmäßig abgeben können.

35. Kit nach Anspruch 23, worin der Testchemikaliensatz weiterhin einen vorgewählten Puffer zur pH-Kontrolle und ein vorgewähltes Redoxstabilisationsmittel zur Erniedrigung der Reduktion von Resazurin durch das Wachstumsmedium und den Puffer während der Inkubation der Testplatte umfaßt und worin alle Bestandteile des Testchemikaliensatzes in der absorbierenden Papierscheibe enthalten sind, wobei die Inokulations-Flüssigkeit nur den Mikroorganismus enthält.

36. Kit nach Anspruch 34, eingerichtet zur Prüfung der quantitativen Empfindlichkeit des Mikroorganismus gegenüber Wachstumshemmung durch M unterschiedliche antimikrobielle Produkte, worin

die Testplatte M Sätze an N Testvertiefungen festlegt, wobei jeder Satz mit einem der antimikrobiellen Produkte assoziiert ist;

die Abgabemittel M separate Aufbewahrungsmittel umfassen, wobei jedes mit einem der M antimikrobiellen Produkte assoziiert ist und begleitende Mittel zur Abgabe von N darin aufbewahrten Testmodulen in den assoziierten der M Stze von N Testvertiefungen umfaßt;

die Inokulations-Mittel die vorbestimmte Menge der Inokulations-Flüssigkeit in jede der N Testvertiefungen in jeden der M Sätze von Testvertiefungen in einen folgenden Satz zeitlich abgeben.