CN110603333A - 用于改进的快速抗微生物剂敏感性测试的方法 - Google Patents

用于改进的快速抗微生物剂敏感性测试的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供改进的抗微生物剂敏感性测试，并且更具体地讲提供临床样品的改进的快速抗微生物剂敏感性测试，以进行有效和通用的分析和获得可靠的结果。

Description

用于改进的快速抗微生物剂敏感性测试的方法
相关申请的参考
本申请要求2016年12月23日提交的美国临时申请序列号62/438780和2017年4月21日提交的美国临时申请序列号62/488454以及2017年7月20日提交的美国临时申请序列号62/535106的优先权，其公开特此通过参考结合。
领域
本发明通常涉及抗微生物剂敏感性测试，并且更具体地讲涉及临床样品的快速抗微生物剂敏感性测试。
背景
抗微生物剂抗性的微生物感染与不良临床结果(包括受感染患者中的发病率、死亡率和健康护理成本增加)相关。在过去的30年中，美国的此类设施中这些生物体的流行度稳步增加。微生物的表型抗微生物剂敏感性测试(AST)对于告知医师适当的治疗方案至关重要。使用现有方法，AST测定一般地需要最少8小时，由于许多临床微生物学实验室中的轮班工作而使其成为过夜过程。在等待从目前AST方法测定的同时，患者经常被给予广谱抗微生物剂，这经常对患者健康具有显著的不利影响和/或有助于正在增加的抗微生物剂抗性流行。此外，获得准确的抗微生物治疗信息的这种时间延迟增加患者在医院中的停留，从而增加患者的成本和不便。
长时间来获得AST测定导致被传递给医生的信息不完整。所涉及的时间长度导致经常妨碍鉴定抗微生物剂效力的速率或杀灭动力学的终点测定。任何短期或间歇性数据产生的准确性和可靠性(如果有的话)都是有问题的，因为缺少足够的质量控制测定，无论是历史上可用的还是平行运行的。
政府和健康护理行业正在提出促进医院更好的抗微生物剂管理的规则，并且许多行业专家预计未来两年将实施财政激励措施。因此，需要一种快速确定微生物感染的抗微生物剂敏感性的方法。这里描述的方法是有利的，因为其以成本有效的方式解决了这种需要，并且可与现有的测定硬件组件兼容。
概述
本发明部分地基于发现本文所述的方法提供微生物感染的抗生素敏感性的改进的快速测定。本发明还部分地基于以下令人惊讶的发现：通过适应几种因素(包括微生物或抗微生物剂的性质和功能或其组合)的可变性，大大提高快速抗生素敏感性测试(AST)方法的有效性和可靠性，从而产生本发明的通用、模块化和稳定的平台测定系统。
应当理解，下述的任何方面和实施方案可以任何期望的方式组合，并且除非上下文另外说明，否则任何实施方案或实施方案的组合可应用于下述的每个方面。
在一个方面，本发明提供一种用于确定一种或多种微生物的抗微生物剂敏感性的方法，方法包括进行多种共具温育期的不同测定，其中每种测定包括在存在一种或多种抗微生物剂的情况下的微生物生长测定，并基于相对微生物生长确定一种或多种微生物的抗微生物剂敏感性。
本文提供通过提高微生物的生长效率以对测定的性能达到合适的阈值水平，而同时防止用于微生物生长的温育时间增加来改进用于确定一种或多种微生物的抗微生物剂敏感性的测定质量的方法。
本文还提供通过同时制备和运行另外的测定，而不增加从获得包含微生物的样品开始到确定微生物的抗微生物剂敏感性所需的时间来改进用于确定一种或多种微生物的抗微生物剂敏感性的测定质量、准确性和可靠性的方法。
在一些实施方案中，确定一种或多种微生物的抗微生物剂敏感性包括确定一种或多种抗微生物剂的最小抑制浓度(MIC)或定性敏感性结果(QSR)。
在一些方面，本发明提供一种用于确定一种或多种微生物的抗微生物剂敏感性的方法，方法包括：进行多个共具至少1.5小时的初始温育期的不同生长测定，其中在完成初始温育期之后添加一种或多种探针，每种测定包括在存在一种或多种抗微生物剂的情况下的微生物生长测定；和基于相对微生物生长确定一种或多种微生物对一种或多种抗微生物剂的抗微生物剂敏感性，并且可获得最小抑制浓度(MIC)和/或定性敏感性结果(QSR)。
在一些方面，本发明的方法包括以下步骤：- 将一种或多种微生物的悬浮液引入到包含多个室的盒中，其中多个室包含一种或多种抗微生物剂；- 在促进微生物生长的条件下将盒温育初始温育期；
- 在盒室的子集中进行一个或多个检查点测定以确定微生物生长是否已达到阈值；和
(a) 如果达到阈值，则在多个盒室中进行多个不同的生长测定以确定微生物对一种或多种抗微生物剂的敏感性，并获得最小抑制浓度(MIC)和/或定性敏感性结果(QSR)；或
(b) 如果未达到阈值，则在促进微生物生长的条件下进行一个或多个另外的温育期直至
(i) 达到阈值，并且之后进行步骤(a)；或者
(ii) 发生最多18小时而没有达到阈值并且不进行进一步的测定。
在一个方面，提供一种确定一种或多种微生物的抗微生物剂敏感性的方法，其中方法包括进行包括以下的生长测定：在存在一种或多种抗微生物剂而不存在代谢探针的情况下温育微生物的悬浮液；在温育一种或多种微生物之后，将代谢探针引入到水混溶性溶剂中；和基于相对微生物生长确定一种或多种微生物的抗微生物剂敏感性。
在一些实施方案中，用于确定一种或多种微生物的抗微生物剂敏感性的方法包括将微生物的悬浮液在包含抗微生物剂的盒中的多个室中温育初始时间段以促进微生物生长，在盒室的子集中进行一个或多个检查点测定以确定相对微生物生长是否达到阈值，其中达到阈值表明测定系统有足够的生长为微生物提供MIC或QSR数据，然后进行测定以获得MIC或QSR数据。
在一些实施方案中，在促进微生物生长的条件下，在存在或不存在一种或多种抗微生物剂的情况下温育一种或多种微生物用于测定微生物的抗微生物剂敏感性。
在一些方面，本发明提供一种用于促进微生物生长的方法，方法包括：在促进微生物生长的条件下，在存在一种或多种抗微生物剂的情况下，并且以不足以实现溶液混合的频率和/或轨道振荡半径搅动盒，在盒中温育一种或多种微生物的悬浮液。
在一些方面，本发明提供一种用于促进微生物生长的方法，方法包括：将包含微生物的悬浮液的盒预热至约30℃-约45℃的温度；和在促进微生物生长的条件下，在存在一种或多种抗微生物剂的情况下温育包含微生物的悬浮液的预热的盒。
在一些实施方案中，一种或多种抗微生物剂的最小抑制浓度(MIC)或定性敏感性结果(QSR)由多种测定来确定。
在一些实施方案中，用于确定一种或多种抗微生物剂的最小抑制浓度(MIC)或定性敏感性结果(QSR)的测定数目小于进行的测定数目。
在一些实施方案中，用于确定抗微生物剂的最小抑制浓度(MIC)或定性敏感性结果(QSR)的测定数目等于进行的测定数目。
在一些实施方案中，方法进一步包括确定测定是否适合于确定一种或多种微生物对一种或多种抗微生物剂的敏感性。
在一些实施方案中，方法进一步包括确定测定是否适合于确定一种或多种微生物对一种或多种抗微生物剂的敏感性。
在一些实施方案中，不同的测定用于不同的抗微生物剂-微生物组合。 在一些实施方案中，一种或多种不同的测定用于不同的微生物种类。
在一些实施方案中，至少一种测定选自：代谢探针测定法、表面结合探针测定、化学探针测定、生化探针测定、酶促生化探针测定、ATP测定、核酸探针测定、双链核酸探针测定、光密度测定、视觉测定和pH分子探针测定。
在一些实施方案中，多种生长测定包括代谢测定和表面结合测定。
在一些实施方案中，代谢生长测定包括：
(a) 向多个室中添加代谢探针；
(b) 在促进微生物生长的条件下的测定温育期；和
(c) 获得吸光度、荧光、发光、电化学信号测量中的一种或多种。
在一些实施方案中，初始温育期为约2-18小时。在一些实施方案中，初始温育期为约2-6小时。在一些实施方案中，初始温育期为约3小时。
在一些实施方案中，另外的时间段为1-18小时之间。在一些实施方案中，另外的温育期为约1-4小时。在一些实施方案中，另外的温育期为约1-2小时。
在一些实施方案中，测定温育期为约30分钟-2小时。在一些实施方案中，温育期为约3小时。
在一些实施方案中，盒室的<50%、<25%、<10%、<5%、<2%用于检查点测定。
在一些实施方案中，一个或多个检查点测定室不包含抗微生物剂。在一些实施方案中，一个或多个检查点测定室包含一种或多种抗微生物剂。
在一些实施方案中，在随后的生长测定之前进行代谢探针测定。在一些实施方案中，在表面结合探针测定之前进行代谢探针测定。
在一些实施方案中，代谢探针包含7-羟基-10-氧化吩噁嗪-10-鎓-3-酮(刃天青)。
代谢探针具有以下式(I)的结构：
其中
R1独立地为CN、任选取代的C6-C10芳基或任选取代的5-至10-元杂芳基；
R2独立地为任选取代的C6-C10芳基或任选取代的5-至10-元杂芳基；
R3独立地为任选取代的C6-C10芳基、任选取代的5-至10-元杂芳基或子结构A；
子结构A为
其中
L1独立地为任选取代的C6-C10芳基或任选取代的5-至10-元杂芳基；
L2独立地为共价键、任选取代的C6-C10芳基或任选取代的5-至10-元杂芳基；
R4独立地为CN、任选取代的C6-C10芳基或任选取代的5-至10-元杂芳基；
R5独立地为任选取代的C6-C10芳基或任选取代的5-至10-元杂芳基；
每个X独立地不存在或为单价阴离子。
在一些实施方案中，代谢探针包含2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓氯化物(INT)、(2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓钠盐(WST-1)、4-[3-(4-碘苯基)-2-(2,4-二硝基苯基)-2H-5-四唑鎓]-1,3-苯二磺酸盐(WST-3)或5-(2,4-二磺基苯基)-3-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-四唑鎓内盐单钠盐(WST-8)。
在一些实施方案中，代谢探针包含2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓氯化物(INT)。
在一些实施方案中，表面结合探针包含镧系元素与二亚乙基三胺四乙酸或穴状配体的配位络合物。
在一些实施方案中，表面结合探针包含
。
在一些实施方案中，指示剂包含铕、锶、铽、钐和镝或其组合。
在一些实施方案中，一种或多种生长指示剂包含能够结合微生物细胞膜、细胞壁、细胞被膜、质膜、细胞被囊；在细胞壁内、在细胞被膜内、纤毛、菌毛、鞭毛、细胞器、跨膜蛋白、细胞壁蛋白、细胞外蛋白、细胞内蛋白、细胞外相关多糖、细胞内相关多糖、脂质、细胞外脂质、细胞内脂质、膜脂质、细胞壁脂质、多糖、和/或与细胞被膜蛋白成为一体或相关的脂质、或细胞器、或核酸的化学或生化基团。
在一些实施方案中，其中用于确定微生物生长的测定包括使用选自酶、催化剂和纳米颗粒及其组合的放大器。
在一些实施方案中，用于确定微生物生长的测定包括用于量化双链DNA浓度的指示剂。在一些实施方案中，指示剂为溴化乙锭、碘化丙锭、SYTOX绿、菲啶类、吖啶类、吲哚类、咪唑类和花青，包括TOTO、TO-PRO和SYTO或其组合。在一些实施方案中，用于确定微生物生长的测定包括核酸扩增。在一些实施方案中，用于确定微生物生长的测定包括核酸测序。在一些实施方案中，用于确定微生物生长的测定包括使用腺苷三磷酸。
在一些实施方案中，用于确定微生物生长的测定包括光散射。
在一些实施方案中，用于微生物生长的测定基于微生物的吸光度测量或比浊法测量。
在一些实施方案中，多种不同的测定在不同的盒室中进行。
在一些实施方案中，多种不同的测定在相同的盒室中进行。
在一些实施方案中，多种不同的测定依序进行。
在一些实施方案中，多个室包含悬浮于培养基中的一种或多种抗微生物剂。
在一些实施方案中，在引入微生物的悬浮液之前，多个室包含抗微生物膜形式的一种或多种抗微生物剂。
在一些实施方案中，在引入微生物的悬浮液之前，多个室包含一种或多种固体形式的抗微生物剂。
在一些实施方案中，将一种或多种抗微生物剂冻干或干燥。
在一些实施方案中，方法进一步包括确定哪种抗微生物剂或抗微生物剂组合对一种或多种微生物最有效。最有效的抗微生物剂的测定为确定哪种抗微生物剂或组合在测定中产生微生物生长的最大抑制作用。
在一些实施方案中，方法进一步包括产生用于治疗由一种或多种微生物引起的感染的推荐。
在一些实施方案中，当进行测定时，盒处于约35℃的温度下。
在一些实施方案中，代谢探针为氧化还原活性探针。
在一些实施方案中，氧化还原活性探针包括7-羟基-10-氧化吩噁嗪-10-鎓-3-酮(刃天青)、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓(MTS)、3,3’-(3,3’-二甲氧基-4,4’-亚联苯基)双[2,5-双(对-硝基苯基)-2H-四唑鎓氯化物] (TNBT)、2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑鎓-5-甲酰苯胺(XTT)、水溶性四唑鎓盐类(WSTs)、(2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓钠盐(WST-1)、4-[3-(4-碘苯基)-2-(2,4-二硝基苯基)-2H-5-四唑]-1,3-苯二磺酸盐(WST-3)、2,2’-二苯并噻唑基-5,5’-双[4-二(2-磺基乙基)氨基甲酰基苯基]-3,3’-(3,3’-二甲氧基4,4’-亚联苯基)二四唑鎓二钠盐(WST-5)、5-(2,4-二磺基苯基)-3-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-四唑鎓内盐单钠盐(WST-8)、2,3,5-三苯基-四唑鎓氯化物(TTC)、5-氰基-2,3-二(对-甲苯基)四唑鎓氯化物(CTC)、3,3’(3,3’-二甲氧基-[1,1’-联苯]-4,4’-二基)双(2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑-3-鎓)(DBNPT)、3-(萘-1-基)-2,5-二苯基-2H-四唑-3-鎓(NDT)、噻唑蓝四唑鎓溴化物(TBTB)、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓氯化物(INT)、吩嗪甲基硫酸盐(PMS)、吩嗪乙基硫酸盐(PES)、甘氨酰苯基丙氨酰-氨基氟香豆素(GF-AFC)、2,2’-双(4-硝基苯基)-5,5’-二苯基-3,3’-(3,3’-二甲氧基-4,4’-亚联苯基)二四唑鎓氯化物(NBT)、2,5-二苯基-3-(1-萘基)四唑鎓氯化物(TV)、3,3’-(3,3’-二甲氧基[1,1’-联苯]-4,4’-二基)-双(2,5-二苯基-2H-四唑鎓)二氯化物(BTC)、5-氰基-2,3-双(4-甲基苯基)-2H-四唑鎓氯化物(CTC)、2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑鎓-5-甲酰苯胺内盐(XTT)、RealTime-Glo™、Caspase-Glo®、BATDA的乙酰氧基甲酯、二茂铁、十二烷基刃天青、二氢罗丹明123、二氢荧光素、6-羧基-2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯及其乙酰氧基甲酯、2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯、5-羧基-2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯及其乙酰氧基甲酯、氯甲基-2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯乙酰酯、二氢钙黄绿素AM、二氢乙锭、鲁米诺或2,3,4,5,6-五氟四甲基二氢rosamine。
在一些实施方案中，氧化还原活性探针包括7-羟基-10-氧化吩噁嗪-10-鎓-3-酮(刃天青)。
在一些实施方案中，氧化还原活性探针包括2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓氯化物(INT)。
在一些实施方案中，氧化还原活性探针包括(2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓钠盐(WST-1)、4-[3-(4-碘苯基)-2-(2,4-二硝基苯基)-2H-5-四唑]-1,3-苯二磺酸盐(WST-3)或5-(2,4-二磺基苯基)-3-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-四唑鎓内盐单钠盐(WST-8)。
另一方面，本发明提供一种用于确定一种或多种微生物的抗微生物剂敏感性的方法，方法包括将一种或多种微生物的悬浮液和一种或多种生长指示剂一起温育初始时间段以促进微生物生长并进行一个或多个检查点测定以确定相对微生物生长是否已达到阈值，并且如果达到阈值，则进行一种或多种测定以确定一种或多种微生物对一种或多种抗微生物剂的最小抑制浓度(MIC)或定性敏感性结果(QSR)；或者如果未达到阈值，如果一种或多种微生物的浓度尚未达到阈值，则将一种或多种微生物的悬浮液和一种或多种生长指示剂一起温育另外的时间段，并然后进行一次或多次测定以确定最小抑制浓度(MIC)或定性敏感性结果(QSR)。
在一些实施方案中，一个或多个检查点测定在一个或多个没有微生物的室中进行。
在一些实施方案中，一个或多个检查点测定在一个或多个含有针对一种或多种微生物的已知效力的一种或多种抗微生物剂的室中进行。
在一些实施方案中，阈值由阳性对照与背景对照的比率确定。
在一些实施方案中，阳性对照包含在没有抗微生物剂的情况下温育的微生物的悬浮液和一种或多种生长指示剂。
在一些实施方案中，背景对照包含在没有微生物的情况下温育的培养基和一种或多种生长指示剂。
在一些实施方案中，阳性对照与背景对照的比率为至少1.15。
在一些实施方案中，在进行一个或多个检查点测定之前，发生将微生物的悬浮液和一种或多种生长指示剂一起温育初始时间段。
在一些实施方案中，一种或多种生长指示剂在一个或多个检查点测定期间具有光学或电活性。
在一些实施方案中，一种或多种生长指示剂的光学信号包括荧光、时间分辨荧光、吸光度或发光。
在一些实施方案中，一种或多种生长指示剂的电信号为伏安信号或电位信号。
在一些实施方案中，一种或多种生长指示剂在检查点测定期间对pH有响应。
在一些实施方案中，一种或多种生长指示剂包括荧光素、羧基荧光素、曙红Y、8-羟基芘-1,3,6-三磺酸(pyranine)、半萘酚罗丹荧类、羧基SNARF、茜素黄、亮黄、溴甲酚、溴酚蓝、溴百里酚蓝、刚果红、邻甲酚酞、间甲酚紫、甲酚红、2,5-二硝基苯酚、乙基橙、间胺黄、甲基橙、甲基红、媒染橙、中性红、酚酞、酚红、喹哪啶红、玫红酸、百里酚蓝、百里酚酞、金莲橙或二甲酚蓝。
在一些实施方案中，一种或多种检查点测定包括显微术或质谱法。
在一些实施方案中，方法进一步包括将微生物的悬浮液引入到包含多个含有一种或多种抗微生物剂的室的盒中。
在一些实施方案中，盒包含至少24个室。
在一些实施方案中，盒包含96或384个室。
另一方面，本发明提供一种用于促进微生物生长的方法，方法包括在促进微生物生长的条件下，在存在一种或多种抗微生物剂的情况下和以不足以实现溶液混合的频率或半径搅动盒，在盒中温育一种或多种微生物的悬浮液。
在一些实施方案中，盒包含至少96个室。
在一些实施方案中，盒室每个具有小于12 mm的横向尺寸。
在一些实施方案中，盒通过机械搅动、声频搅动或磁力搅动来搅动。
在一些实施方案中，机械搅动为轨道振荡。
在一些实施方案中，轨道振荡以大于50转/分钟的频率发生。
在一些实施方案中，轨道振荡以大于350转/分钟的频率发生。
在一些实施方案中，轨道振荡以小于750转/分钟的频率发生。
在一些实施方案中，轨道振荡以约150转/分钟的频率发生。
在一些实施方案中，半径大于2 mm。
在一些实施方案中，半径为25 mm。
在一些实施方案中，以不足以实现溶液混合的频率或半径搅动盒导致搅动盒的微生物生长与没有搅动盒的微生物生长之间的生长比率更大。
在一些实施方案中，生长比率大于1且小于1.5。
另一方面，本发明提供一种用于促进微生物生长的方法，方法包括将包含微生物的悬浮液的盒预热至约30℃-约45℃的温度，和在促进微生物生长的条件下，在存在一种或多种抗微生物剂的情况下温育包含微生物的悬浮液的预热的盒。
在一些实施方案中，盒包含至少96个室。
在一些实施方案中，将盒预热至约30℃-约45℃之间的温度导致在至少96个室的基本上均匀加热。
在一些实施方案中，将盒预热少于15分钟。
在一些实施方案中，将盒预热1、2、5、10或15分钟。
在一些实施方案中，盒通过辐射加热、传导加热或对流加热来预热。
在一些实施方案中，辐射加热为红外辐射加热。
在一些实施方案中，盒通过传导和对流加热来预热。
在一些实施方案中，一个或多个加热表面进行传导和对流加热。
在一些实施方案中，盒通过辐射加热和传导和对流加热两者来预热。
在一些实施方案中，盒不会通过单独的对流加热来预热。
在一些实施方案中，盒通过在至少25℃的温度下向盒中添加一种或多种流体来预热。
在一些实施方案中，在预热盒之后30分钟内，在存在一种或多种抗微生物剂的情况下发生温育微生物。
在一些实施方案中，方法进一步包括在将盒装载到自动化平台之前预热盒以进行抗微生物剂敏感性测试。
在一些实施方案中，盒上的温度变化小于5%。
在一些实施方案中，最高温度室与最低温度室之间的温度差(℃)小于5%。
另一方面，本发明提供一种用于确定微生物的抗微生物剂敏感性的方法，方法包括将一种或多种微生物的悬浮液引入到包含多个含有一种或多种抗微生物剂的室的盒中，在促进微生物生长的条件下将盒温育初始时间段，进行一个或多个检查点测定以确定相对微生物浓度是否已达到阈值，并进行多种不同的生长测定以确定一种或多种微生物对一种或多种抗微生物剂的敏感性。
在一些实施方案中，方法进一步包括如果相对微生物生长尚未达到阈值，则将盒温育另外的时间段。
在一些实施方案中，阈值可为取决于微生物的特定值。在一些实施方案中，阈值可为取决于抗微生物剂的特定值。在一些实施方案中，阈值可为取决于微生物和抗微生物剂的特定值。
在一些实施方案中，培养基为液体、固体或半固体。
在一些实施方案中，盒包含至少2、4、6、8、12、24、48、96、192、384或1536个室。
在一些实施方案中，盒进一步包含至少一个对照室，对照室不包含抗微生物剂或包含一种或多种微生物不敏感的抗微生物剂。
在一些实施方案中，将盒在至少25℃且不高于45℃的温度下进行温育。
在一些实施方案中，一种或多种生长指示剂包含能够结合微生物细胞膜、细胞壁、细胞被膜、蛋白、糖、多糖、脂质、细胞器或核酸的化学或生化基团。
在一些实施方案中，一种或多种生长指示剂具有氧化还原活性。
在一些实施方案中，生长测定影响微生物生长或活力。
在一些实施方案中，多个生长测定在不同的室中平行或连续进行。
在一些实施方案中，一种或多种微生物源自临床样品。
在一些实施方案中，临床样品包括血液、脑脊液、尿液、粪便、阴道液、痰液、支气管肺泡灌洗液、咽喉、鼻拭子、伤口拭子或其组合。
在一些实施方案中，一种或多种微生物选自肠球菌属(Enterococcus spp.)，葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.)、不动杆菌属(Acinetobacter spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、肠杆菌属(Enterobacter spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、变形杆菌属(Proteus spp.)、气球菌属(Aerococcus spp.)、放线菌属(Actinomyces spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、巴尔通氏体属(Bartonella spp.)、博德特氏菌属(Bordetella spp.)、布鲁氏菌属(Brucella spp.)、弯曲杆菌属(Campylobacter spp.)、衣原体属(Chlamydia spp.)、嗜衣原体属(Chlamydophila spp.)、梭菌属(Clostridium spp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)、埃里希氏体属(Ehrlichia spp.)、弗朗西丝氏菌属(Francisella spp.)、加德纳氏菌属(Gardenerella spp.)、嗜血杆菌属(Haemophilius spp.)、螺杆菌属(Helicobacter spp.)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、军团菌属(Legionella spp.)、细螺旋体属(Leptospira spp.)、李斯特氏菌属(Listeria spp.)、分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)、支原体属(Mycoplasma spp.)、奈瑟氏球菌属(Neisseria spp.)、诺卡氏菌属(Nocardia spp.)、巴斯德氏菌属(Pasteurella spp.)、立克次氏体属(Rickettsia spp.)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas spp.)、密螺旋体属(Treponema spp.)、脲枝原体属(Ureaplasma spp.)、弧菌属(Vibrio spp.)、耶尔森氏菌属(Yersinia spp.)、假丝酵母属(Candida spp.)、伊萨酵母属(Issatchenkia spp.)、芽生菌属(Blastomyces spp.)、球孢子菌属(Coccidioides spp)、曲霉属(Aspergillus spp.)、隐球菌属(Cryptococcus spp.)、组织胞浆菌属(Histoplasma spp.)、肺囊虫属(Pneumocystis spp.)、葡萄穗霉属(Stachybotrys spp)、孢子丝菌属(Sporothrix)、突脐蠕孢属(Exserohilum)、枝孢属(Cladosporium)、环癣(ringworm)、毛霉菌属(mucormycetes)及其组合。
在一些实施方案中，促进微生物生长的条件包括环境空气、厌氧条件或高达10%的CO2。
在一些实施方案中，盒室的底部为平坦的、圆形的或V形的。
在一些实施方案中，盒为光学透明、白色或黑色中的一种或多种。
在一些实施方案中，微生物悬浮培养基包含至少一种营养物。
在一些实施方案中，一个或多个室包含不同的液体成分。
在一些实施方案中，阈值使用背景校正来确定。
在一些实施方案中，背景校正基于来自一个或多个室的测量。
在一些实施方案中，背景校正室不包含微生物或包含不能存活的微生物。
在一些实施方案中，确定微生物生长的多种测定包括指示剂的时间分辨荧光测量。
在一些实施方案中，促进微生物生长的条件包括在31℃-41℃下的温育期。
在一些实施方案中，检查点生长时间影响最小抑制浓度或定量敏感性结果的确定。
在一些实施方案中，不同的测定测量来自发射不同波长的光的探针的荧光发射。
在一些方面，本发明提供一种试剂盒，其包含用于进行本发明所述测定的所有组分。
根据附图和以下详述和权利要求，本发明的其他特征和优点将显而易见。
附图简述
当连同附图一起时，以上和进一步的特征将从以下详述更清楚地意识到。然而，附图仅用于说明目的；不是用于限制。
图1说明微生物温育后的生长发光比，其中在初始温育期之前将刃天青引入到一组微生物中，和在初始温育期之后将另一组引入到刃天青。图1显示尽管温育期间包含在孔中的刃天青可加速获得AST结果的时间，但由于刃天青对细菌生长的不利影响，其可对微生物生长具有抑制作用。
图2描绘在存在氨苄青霉素、庆大霉素和左氧氟沙星的情况下缓慢生长的临床金黄色葡萄球菌(S. aureus)菌株的使用临床实验室标准化研究所(Clinical andLaboratory Standards Institute) (CLSI)过夜参考方法进行肉汤微量稀释AST及其MIC测定的照片。最小抑制浓度(MIC)为没有可见细菌生长的特定抗生素的最低稀释度。
图3描绘其中对多种临床金黄色葡萄球菌(S. aureus)细菌菌株(包括缓慢生长的菌株)进行表面结合测定并测量阳性生长孔与抑制生长对照孔的吸光度比的图表。图3显示各种临床样品之间生长速率的差异，临床细菌菌株的生长速率可能大不相同。
图4A和4B显示使用刃天青生长指示剂(图4A)和表面结合探针测定(图4B)用于检查点测定的来自阳性生长孔的信号与未接种的对照或抑制生长对照孔的信号的荧光比率。图4A和4B显示生长指示剂提供来自检查点测试孔的可测量信号，其可用作通过终点测定测量的生长的指标。图4A和4B显示刃天青可用作检查点以确定是否已发生细菌生长。
图5显示在存在氨苄青霉素、庆大霉素和左氧氟沙星的情况下对快速生长和缓慢生长的临床金黄色葡萄球菌(S. aureus)菌株两者的AST测定产生的图表。图5显示生长速率对产生的AST测定结果的影响。将接种孔中的alamarBlue® (刃天青)信号与未接种孔的比率用作生长检查点以确定AST测定是否已准备好进行处理。
图6显示通过时间分辨荧光(TRF)和铕探针对3种不同铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)菌株的AST测定的MIC数据。每个图表的x轴表示抗微生物剂阿米卡星(AMK)的浓度(以mg/ml为单位)，和y轴表示与细菌表面结合的荧光。对于每种菌株，表示通过细菌培养物的光密度(600 nm处的吸光度)测量的生长检查数据。图表显示MIC结果的可靠性取决于细菌的最佳生长。
图7显示两种铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)菌株的生长检查比与(versus)细菌菌落形成测定数据的关系图。数据显示通过测量600 nm处的光密度获得的生长检查点数据(表示为盒上接种孔与未接种孔之间的吸光度的比率)与细菌菌落形成测定的相关性。x轴表示生长检查点数据和y轴表示以菌落形成单位(CFU)表示的菌落形成测定数据。
图8显示使用铕穴状化合物分子标记和量化微生物(左侧大肠杆菌 (E.coli)和右侧肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))的表面结合扩增测定结果和相对荧光单位(RFU)测量结果的图表。
图9A和9B显示温育期后在细菌样品测量的荧光比率的图表。在一个样品中(图9A)，于温育期开始时加入刃天青，和在另一个样品中(图9B)，于温育期之后加入刃天青。图9A和9B表明通过在细菌生长之后加入刃天青来改善刃天青荧光信号的细菌特异性诱导。
图10A和10B显示两个图表，其中随着时间的推移测量96孔微孔板的温度，同时通过辐射加热或对流预热。图10A显示图表，其中96孔板通过辐射加热预热并在不到2分钟内达到生长促进温度。图10B表明，在标准对流加热约20分钟之后单个96孔微孔板(带盖)达到生长促进温度，和堆叠的96孔微孔板需要约40分钟的加热时间才能达到这些温度。
图11显示96孔微孔板的4板堆叠的孔溶液温度数据。图11表明，对于4板堆叠的中心板，存在放大的明显的孔温度径向分布。
图12A和12B描绘预热板对通过在温育结束时测量光密度确定的细菌生长的影响。图12A显示基于大肠杆菌(E.coli)培养物的数据和图12B为基于铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)的数据，两者均在384孔板上培养。
图13描绘微生物生长的生长比率，其通过对两种细菌菌株在振荡与非振荡条件下的384孔微孔板于600 nm下的光密度测量来确定。在一种情况下，将384孔微孔板伴随以150rpm和25 mm半径振荡进行温育，在第二种情况下，在温育期间同样接种的微孔板保持静止。
图14描绘与伴随以150 rpm和25 mm半径振荡温育的同样接种的96孔微孔板相比较，通过在温育期间保持静止的96孔微孔板于600 nm处的光密度测量确定的微生物生长的生长比率。
图15A和15B显示温育期间的平板搅动(振荡)对微生物生长的影响。图15A显示基于在振荡和静止(非振荡)条件下的细菌生长的光密度数据。图15B显示在150 rpm、250 rpm和500 rpm的不同振荡速度下金黄色葡萄球菌(S. aureus)生长的细菌ATP含量的测量，如图表所示。
图16显示当在含有多种抗微生物剂的单个平板上用铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)测试代谢探针INT时的AST结果。
图17-20描绘当四唑鎓类似物(INT、NDT、DBNPT、TBTB、CTC和TTC)用作代谢探针用于确定各种抗生素(例如氨苄青霉素/舒巴坦(图17)、美罗培南(图18)、妥布霉素(图19)和阿米卡星(图20))对鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)的抗微生物剂敏感性时的AST结果。
图21-24描绘当四唑鎓类似物(INT、WST-1、WST-3和WST-8)用作代谢探针用于确定各种抗生素(例如亚胺培南(图21)、呋喃妥因(图22)、庆大霉素(图23)和四环素(图24))对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的抗微生物剂敏感性时的AST结果。
图25-28描绘与标准参考相比较，在存在各种电子载体的情况下细菌稀释曲线的吸光度结果。
图29A和B描绘确定每种抗生素的MIC的双重测定，显示正确%与基于算法上称为MIC的数值的比较。A. 肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae)的结果。B. 金黄色葡萄球菌(S. aureus)的结果。结果显示更准确的代谢测定或表面结合测定取决于抗生素。
图30A-F描绘基于示例性的细菌菌株肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的一组抗微生物剂的两种测定(左)代谢测定和(右)表面结合测定之间的比较。
定义
本文参考的专利和科学文献建立了本领域的技术人员可获得的知识。所公布的美国专利、允许的申请、所公开的美国和外国申请以及本文引用的参考文献特此通过参考结合至好像每个具体和单个地指明通过参考结合的相同程度。
本文使用的对变量的数值范围的描述旨在表达本发明可用等于该范围内的任何数值的变量来实践。因此，对于本身离散的变量，变量可等于数值范围内的任何整数值，包括范围的端点。类似地，对于本身连续的变量，变量可等于数值范围内的任何实数值，包括范围的端点。作为实例(并且非限制性地)，如果变量本身为离散的，则描述为具有0-2之间的数值的变量可取数值0、1或2，并且如果变量本身为连续的，则可取数值0.0、0.1、0.01、0.001或≥0且≤2的任何其他实数值。
除非另外具体说明，否则本文使用的单词“或”以“和/或”的包含性含义而不是“任一/或”的排他性含义使用。
本文使用的术语“约”意指其修饰的数值的±10%以内。例如，“约1”意指“0.9-1.1”，“约2%”意指“1.8%-2.2%”，“约2%-3%”意指“1.8%-3.3%”，和“约3%-约4%”意指”2.7%-4.4%”。除非上下文另外明确，否则本文提供的所有数值均由术语“约”修饰。
本文使用的单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指示对象，除非上下文另外明确说明。
术语“一个或多个”、“至少一个”、“多于一个”等理解为包括(但不限于)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多和之间的任何数字。
本文使用的术语“生长测定”是指用于测量微生物生长或活力的测定。生长测定的实例包括检查点测定和终点测定。
本文使用的术语“检查点测定”是指用于确定微生物生长而不干扰微生物生长的测定。一般地，检查点测定不会干扰微生物的生长或活力。可在终点测定之前或同时进行检查点测定。
本文使用的术语“终点测定”是指用于在存在抗微生物剂的情况下确定微生物的生长或活力或用于确定微生物对抗微生物剂的敏感性的测定。一般地，终点测定干扰微生物的生长或活力。终点测定可同时或在检查点测定之后进行。
本文使用的术语“生长指示剂”是指可用于测量微生物生长的物质。一般地，生长指示剂用于在不存在抗微生物剂的情况下测量微生物生长。
除非另外具体说明，否则本文使用的术语“与水混溶性溶剂”是指以基本上所有比例与水混溶的溶剂。
本文使用的术语“脂肪族”或“脂肪族基团”意指任选取代的直链或支链C1-12烃，其为完全饱和或含有一个或多个不饱和单元。例如，合适的脂肪族基团包括任选取代的直链或支链烷基、链烯基和炔基。除非另外指明，否则在各种实施方案中，脂肪族基团具有1-12、1-10、1-8、1-6、1-4、1-3或1-2个碳原子。对于本领域的技术人员显而易见的是，在一些实施方案中，本文所述的“脂肪族”基团可为二价的。单独使用或作为较大部分的一部分使用的术语“烷基”是指具有1-12、1-10、1-8、1-6、1-4、1-3或1-2个碳原子的饱和的、任选取代的直链或支链烃基。
术语“烷氧基”是指具有结构-OR的基团，其中R为本文所述的烷基。
术语“芳基”是指包含1-3个芳环的任选取代的C6-14芳烃部分。例如，芳基为C6-10芳基(即苯基和萘基)。芳基非限制性地包括任选取代的苯基、萘基或蒽基。本文使用的术语“芳基”和“芳-”还包括其中芳环与一个或多个脂环族环稠合以形成任选取代的环状结构比如四氢萘基、茚基或茚满基环的基团。术语“芳基”可与术语“芳基基团”、“芳基环”和“芳族环”互换使用。
术语“脂环族”是指具有3-约14个环碳原子的任选取代的饱和或部分不饱和环状脂肪族环系统。脂环族基团非限制性地包括任选取代的环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环庚烯基、环辛基、环辛烯基或环辛二烯基。
术语“卤素”或“卤代”意指F、Cl、Br或I。
术语“杂芳基”是指具有5-14个环原子(优选地5、6、9或10个环原子)、在环状阵列中共具6、10或14个π电子和除碳原子之外还具有1-5个杂原子的基团。杂芳基可为单-、双-、三-或多环，例如单-、双-或三环(例如单-或双环)。术语“杂原子”是指氮、氧或硫，并且包括任何氧化形式的氮或硫，以及任何季铵化形式的碱性氮。例如，杂芳基的氮原子可为碱性氮原子，并且还可任选地氧化成相应的N-氧化物。当杂芳基被羟基取代时，其还包括其相应的互变异构体。本文使用的术语“杂芳基”和“杂芳”还包括其中杂芳族环与一个或多个芳基、脂环族或杂环脂族环稠合的基团。杂芳基的非限制性实例包括噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吲嗪基、嘌呤基、萘啶基、蝶啶基、吲哚基、异吲哚基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、4H-喹嗪基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基和吡啶并[2,3-b]-1,4-噁嗪-3(4H)-酮。术语“杂芳基”可与术语“杂芳基环”、“杂芳基基团”或“杂芳族”互换使用，其中任何术语包括任选取代的环。
本文使用的术语“杂环”、“杂环基”、“杂环族基团”和“杂环族环”可互换使用，并且是指稳定的3-至8-元单环或7-10-元双环杂环部分，其为饱和或部分不饱和的，并且除碳原子之外还具有一个或多个，比如1-4个如上定义的杂原子。当用于指涉杂环的环原子时，术语“氮”包括取代的氮。作为实例，在具有0-3个选自氧、硫或氮的杂原子的饱和或部分不饱和的环中，氮可为N (如在3,4-二氢-2H-吡咯基中中)、NH (如在吡咯烷基中)或NR+ (如在N-取代的吡咯烷基中)。
将后缀“-ene”附着于基团上表示该基团为二价部分，例如，亚芳基为芳基的二价部分，和亚杂芳基为杂芳基的二价部分。
本文使用的短语“一个或多个取代基”是指等于基于可用键合位点的数目可能的一至最大取代基数目的取代基数目，条件是满足以上稳定性和化学可行性的条件。
芳基(包括芳烷基、芳烷氧基、芳氧基烷基等)、杂芳基(包括杂芳烷基和杂芳烷氧基等)基团可含有一个或多个取代基，并因此可为“任选取代的”。除以上和本文定义的取代基之外，芳基(例如苯基或萘基)或杂芳基(例如吡啶基)的不饱和碳原子上的合适取代基还包括并且通常选自卤素、-NO2、-CN、-R+、-C(R+)=C(R+)2、-C≡C-R+、-OR+、-SRº、-S(O)Rº、-SO2Rº、-SO3R+、-SO2N(R+)2、-N(R+)2、-NR+C(O)R+、-NR+C(S)R+、-NR+C(O)N(R+)2、-NR+C(S)N(R+)2、-N(R+)C(=NR+)-N(R+)2、-N(R+)C(=NR+)-Rº、-NR+CO2R+, -NR+SO2Rº、-NR+SO2N(R+)2, -O-C(O)R+,-O-CO2R+, -OC(O)N(R+)2, -C(O)R+, -C(S)Rº、-CO2R+, -C(O)-C(O)R+、-C(O)N(R+)2、-C(S)N(R+)2、-C(O)N(R+)-OR+、-C(O)N(R+)C(=NR+)-N(R+)2、-N(R+)C(=NR+)-N(R+)-C(O)R+、-C(=NR+)-N(R+)2、-C(=NR+)-OR+、-N(R+)-N(R+)2、-C(=NR+)-N(R+)-OR+、-C(Rº)=N-OR+、-P(O)(R+)2、-P(O)(OR+)2、-O-P(O)-OR+和-P(O)(NR+)-N(R+)2，其中R+独立地为氢或任选取代的脂肪族、芳基、杂芳基、脂环族或杂环基。每个Rº为任选取代的脂肪族、芳基、杂芳基、脂环族或杂环基。
烷基或烷氧基可含有一个或多个取代基，并因此可为“任选取代的”。除非以上和本文另外定义，否则烷基或烷氧基的饱和碳上的合适取代基选自以上对芳基或杂芳基的不饱和碳列出的那些取代基，并且另外包括以下：=O、=S、=C(R*)2、=N-N(R*)2、=N-OR*、=N-NHC(O)R*、=N-NHCO2Rº =N-NHSO2Rº或=N-R*，其中Rº如上定义，并且每个R*独立地选自氢或任选取代的C1-6脂肪族基团。
出于表面结合测定的目的，“表面结合探针”可与“信号传导剂”互换使用。
表面结合探针的结合可包括离子键、共价键、配价键、静电相互作用、氢键和范德华键中的一种或多种。
术语“生长测定”可与“活力测定”互换使用，特别是在代谢探针测定的情况下。
对于包含镧系元素螯合物的表面结合探针，术语“时间分辨荧光”本文定义为可与“时间门控发光”互换。因此，用于这些测量的单位可定义为以下任何一种：相对荧光单位、相对光单位、相对发光单位、相对发光强度(任意单位)、相对光强度(任意单位)。
出于搅动的目的，混合定义为湍流混合，其中由高雷诺数下的流体不稳定性产生的随机结构拉伸和折叠流体元素。
本文使用的吸光度测量表明微生物培养物的光密度的测量。光密度通过一定频率的入射光的吸光度来测量，使得吸光度与培养物中存在的微生物的数目在一定范围内成比例。本文使用的比浊法研究表明基于该浊度对光的透射和散射的影响的测量来确定溶液中的浑浊度或浊度的量。
本文使用的振荡和搅动在微生物培养盒或测定盒的情况下可互换使用。微生物培养物或测定板的振荡可在旋转式振荡器或平台、轨道式振荡器中进行。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域的普通技术人员通常理解且与本申请所属领域中通常使用的相同含义，这种技术通过参考以其全部结合。如果发生冲突，将以本说明书(包括定义)为准。
详述
本文所述的快速AST方法可提供与使用临床实验室标准化研究所(Clinical andLaboratory Standards Institute) (CLSI)参考方法在用多种抗微生物剂和基于多种微生物测试时获得的结果一致的准确结果，然而，这些方法可能比CLSI方法需要更少的时间来提供结果。相对于标准方法，本文所述的方法以大大减少的时间和费用可提供给患者适当的治疗方案，即特定的抗微生物剂和以特定的剂量。因此，本文所述的方法可改善患者结果，降低医院成本，并有助于减少抗微生物剂抗性的微生物的进一步发展，因此，本文所述的方法代表AST领域的重大突破。
在一个方面，本申请提供的方法旨在连同快速AST方法比如PCT/US17/14343所述的那些方法和装置比如PCT/US17/28906所述的那些装置一起实施，其通过参考以其全部结合至本文中。
例如，快速AST方法可提供将微生物的悬浮液引入到包含多个以预定的抗微生物剂浓度含有抗微生物剂的室的盒中。盒可为多孔板。盒包含一个或多个孔储存器。在一些实施方案中，盒为微孔板。盒可包含至少2、4、6、8、12、24、48、96、192、384或1536个室。进一步地，盒室可为微孔板上的孔或储存器。微生物的悬浮液可包含含有至少一种营养物的培养基。
进一步地，快速AST方法可包括在促进微生物生长的条件下将盒温育一段时间。温育时间段可发生约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。在一些实施方案中，初始温育发生约1-2小时、约1-3小时、约1-4小时、约1-5小时、约1-6小时、约2-3小时、约2-4小时、约2-5小时、约2-6小时、约3-4小时、约3-5小时、约3-6小时、约4-5小时、约4-6小时或约5-6小时的时间段。在一些实施方案中，初始温育期为约3小时。
最后，快速AST方法可提供进行生长测定以确定微生物对抗微生物剂的敏感性。生长测定可为活力测定。生长测定的非限制性实例可包括代谢探针测定、表面结合探针测定、化学探针测定、生化探针测定、ATP测定、核酸探针测定、双链核酸探针测定、光密度测定、视觉测定或pH分子探针测定。
本领域的技术人员已知的AST平台可为测试的每种抗微生物剂产生最小抑制浓度(MIC)结果和/或定性敏感性结果(QSR)。根据CLSI微生物学标准，对于给定种类和微生物菌株的给定抗生素的MIC可定义为抑制微生物生长的两倍稀释系列中抗生素的最低浓度，并可提供给医师给药信息。QSR也可提供给医师类似的给药信息，但不能提供数值MIC。
AST测定可主要配置成对每种获得的生物样品平行测试多种抗微生物剂。为了产生MIC或QSR结果，对于每种抗微生物剂都可能需要稀释系列。因此，对于CLSI称为“肉汤微量稀释”的基于液体的AST，通常在盒和/或微孔板中进行测定，这使得能够以不同浓度平行测试不同的抗微生物剂。这些MIC以及微生物种类和抗微生物剂一起用于确定临床实验室标准化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute) (CLSI)断点解释，以为微生物种类和抗微生物剂的每种组合提供临床AST结果。这种结果根据CLSI出版物M-100S采取敏感(S)、中度(I)、抗性(R)、不敏感(NS)和无解释(NI)的形式。
如(例如在实施例中)所公开的那样，已经显示本文所述的方法为广泛范围的微生物种类，包括所有6种(屎肠球菌(Enterococcus faecium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和肠杆菌属(Enterobacter species)(“ESKAPE”)病原体提供与金标准等同的结果。本文所述的方法可易于且廉价地适用于新的微生物种类菌株和诊断测试。
在一些实施方案中，方法提供通过将微生物的悬浮液引入到包含多个含有抗微生物剂的室的盒中，，在促进微生物生长的条件下将盒温育初始时间段，进行检查点测定以确定相对微生物浓度是否已达到阈值，和进行多种不同的生长测定以确定微生物对抗微生物剂的敏感性来确定微生物的抗微生物剂敏感性。
在一些实施方案中，本文所述的方法在用于抗微生物剂敏感性测试的自动化平台中进行。
多种不同的测定
AST方法可进行可用于确定某些细菌菌株的MIC或QSR的测定。发生其中在确定微生物对抗微生物剂的敏感性时，一种类型的测定对于特定的微生物菌株比其他类型更有效的情况。本文所述的方法提供一种确定多种不同测定中的哪一种(如果有的话)可适合于确定微生物对抗微生物剂的敏感性的方法。在一些实施方案中，方法对不同的抗微生物剂-抗生素组合使用不同的测定。
每种生长测定可选自终点测定，比如代谢探针测定、表面结合探针测定、化学探针测定、生化探针测定、ATP测定、核酸探针测定、双链核酸探针测定、光密度测定、微生物质量的测量、视觉测定或pH分子探针测定。
多种不同的测定可平行进行，其中生长测定(例如终点测定)提供抗微生物剂对给定微生物的敏感性的测定。AST方法可在如上所述的盒上运行。在一些实施方案中，多种不同的测定在不同的盒室中进行。在一些实施方案中，在盒上的特定行或列的室中进行相同的测定。
在一些实施方案中，平行运行的多种不同的测定意指测定共具微生物生长的温育期。在一些实施方案中，平行运行的测定为依序进行。在一些实施方案中，平行运行的测定在相同的盒室中进行。在一些实施方案中，测定以平行重叠的方式运行。
在一些实施方案中，本发明提供用于进行代谢探针测定和表面结合探针测定，以使得与临床实验室标准化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute)(CLSI)过夜参考方法相比较，能够以少于3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或8小时准确快速确定微生物对抗微生物剂的敏感性。在一些实施方案中，代谢探针测定在表面结合探针测定之前进行。累积地，来自这两种测定的数据可使得能够准确确定抗微生物剂的MIC，因此，在一些实施方案中，相对于标准方法，本发明以大大减少的时间提供给患者适当的治疗方案，例如特定的抗微生物剂和以特定的剂量。
代谢探针测定可利用存在于水混溶性溶剂中的代谢探针。因此，在一些实施方案中，代谢探针的引入不会产生乳液。在小室中以乳液引入探针可能是不方便的并且可能导致不一致的结果。在一些实施方案中，代谢探针为亲水性或基本上亲水性的。在一些实施方案中，代谢探针测定使用其为氧化还原活性探针的代谢探针。可在代谢探针测定期间引入的氧化还原活性探针的非限制性实例可包括7-羟基-10-氧化吩噁嗪-10-鎓-3-酮(刃天青)、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓(MTS)、3,3’-(3,3’-二甲氧基-4,4’-亚联苯基)双[2,5-双(对-硝基苯基)-2H-四唑鎓氯化物] (TNBT)、2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑鎓-5-甲酰苯胺(XTT)、水溶性四唑鎓盐类(WSTs)、(2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓钠盐(WST-1)、4-[3-(4-碘苯基)-2-(2,4-二硝基苯基)-2H-5-四唑]-1,3-苯二磺酸盐(WST-3)、2,2’-二苯并噻唑基-5,5’-双[4-二(2-磺基乙基)氨基甲酰基苯基]-3,3’-(3,3’-二甲氧基4,4’-亚联苯基)二四唑鎓二钠盐(WST-5)、5-(2,4-二磺基苯基)-3-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-四唑鎓内盐单钠盐(WST-8)、2,3,5-三苯基-四唑鎓氯化物(TTC)、5-氰基-2,3-二(对-甲苯基)四唑鎓氯化物(CTC)、3,3’(3,3’-二甲氧基-[1,1’-联苯]-4,4’-二基)双(2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑-3-鎓)(DBNPT)、3-(萘-1-基)-2,5-二苯基-2H-四唑-3-鎓(NDT)、 噻唑蓝四唑鎓溴化物(TBTB)、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓氯化物(INT)、吩嗪甲基硫酸盐(PMS)、吩嗪乙基硫酸盐(PES)、甘氨酰苯基丙氨酰-氨基氟香豆素(GF-AFC)、2,2’-双(4-硝基苯基)-5,5’-二苯基-3,3’-(3,3’-二甲氧基-4,4’-亚联苯基)二四唑鎓氯化物(NBT)、2,5-二苯基-3-(1-萘基)四唑鎓氯化物(TV)、3,3’-(3,3’-二甲氧基[1,1’-联苯]-4,4’-二基)-双(2,5-二苯基-2H-四唑鎓)二氯化物(BTC)、5-氰基-2,3-双(4-甲基苯基)-2H-四唑鎓氯化物(CTC)、2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑鎓-5-甲酰苯胺内盐(XTT)、RealTime-Glo™、Caspase-Glo®、BATDA的乙酰氧基甲酯、二茂铁、十二烷基刃天青、二氢罗丹明123、二氢荧光素、6-羧基-2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯及其乙酰氧基甲酯、2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯、5-羧基-2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯及其乙酰氧基甲酯、氯甲基-2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯乙酰酯、二氢钙黄绿素AM、二氢乙锭、鲁米诺或2,3,4,5,6-五氟四甲基二氢rosamine。
在一些实施方案中，合适的代谢探针为本领域的技术人员熟知的，并且描述于The Molecular Probes® Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 11th Ed. (2010) (参见例如Chapter 15, “Assays for Cell Viability,Proliferation and Function”)和Riss TL, Moravec RA, Niles AL, et al. CellViability Assays. 2013 May 1 [Updated 2016 Jul 1]. In: Sittampalam GS,Coussens NP, Nelson H, et al., editors. Assay Guidance Manual [Internet].Bethesda (MD): Eli Lilly & Company and the National Center for AdvancingTranslational Sciences; 2004-和US 7897331中，其通过参考以其全部结合至本文中。
在一些实施方案中，氧化还原活性探针具有以下式(I)的结构：
其中
R1独立地为CN、任选取代的C6-C10芳基或任选取代的5-至10-元杂芳基；
R2独立地为任选取代的C6-C10芳基或任选取代的5-至10-元杂芳基；
R3独立地为任选取代的C6-C10芳基、任选取代的5-至10-元杂芳基或子结构A；
子结构A为
其中
L1独立地为任选取代的C6-C10芳基或任选取代的5-至10-元杂芳基；
L2独立地为共价键、任选取代的C6-C10芳基或任选取代的5-至10-元杂芳基；
R4独立地为CN、任选取代的C6-C10芳基或任选取代的5-至10-元杂芳基；
R5独立地为任选取代的C6-C10芳基或任选取代的5-至10-元杂芳基；
每个X独立地不存在或为单价阴离子。
在一些实施方案中，R1独立地为CN或任选取代的C6-C10芳基(例如被0、1、2、3、4或5个取代基取代的苯基)。在一些实施方案中，R1独立地为CN。在一些实施方案中，R1独立地为未取代的苯基或未取代的萘基。在一些实施方案中，R1独立地为取代的C6-C10芳基(例如被1、2、3、4或5个取代基取代的苯基)。在一些实施方案中，R1独立地为具有1、2、3、4或5个独立地选自以下的取代基的C6-C10芳基(例如苯基)：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN、硝基和磺酸或其离子化形式(例如-SO3H或-SO3Na)。在一些实施方案中，R1独立地为具有1、2、3、4或5个独立地选自以下的取代基的C6-C10芳基(例如苯基)：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN和硝基。
在一些实施方案中，R2独立地为任选取代的C6-C10芳基(例如被0、1、2、3、4或5个取代基取代的苯基)。在一些实施方案中，R2独立地为未取代的苯基或未取代的萘基。在一些实施方案中，R2独立地为取代的C6-C10芳基(例如被1、2、3、4或5个取代基取代的苯基)。在一些实施方案中，R2独立地为具有1、2、3、4或5个独立地选自以下的取代基的C6-C10芳基(例如苯基)：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN和硝基。
在一些实施方案中，R3独立地为任选取代的C6-C10芳基(例如被0、1、2、3、4或5个取代基取代的苯基)。在一些实施方案中，R3独立地为未取代的苯基或未取代的萘基。在一些实施方案中，R3独立地为取代的C6-C10芳基(例如被1、2、3、4或5个取代基取代的苯基)。在一些实施方案中，R3独立地为具有1、2、3、4或5个独立地选自以下的取代基的C6-C10芳基(例如苯基)：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN和硝基。
在一些实施方案中，X为单价阴离子(例如Cl-或Br-)。在进一步的实施方案中，R1独立地为CN或任选取代的C6-C10芳基(例如被1、2、3、4或5个选自以下的取代基取代的苯基：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN和硝基)。
在一些实施方案中，X不存在。在进一步的实施方案中，R1独立地为取代的C6-C10芳基，其包含为离子化的磺酸基的取代基。
在一些实施方案中，R3为子结构A，并且化合物具有以下式(II)的结构：
。
在实施方案中，L1为任选取代的C6-C10亚芳基，和L2为共价键。
在实施方案中，L1和L2的每一个独立地为任选取代的C6-C10亚芳基。在实施方案中，L1和L2的每一个独立地为任选取代的亚苯基。在实施方案中，L1和L2的每一个为未取代的亚苯基。在实施方案中，L1和L2的每一个独立地为具有1、2、3或4个独立地选自以下的取代基的取代的亚苯基：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN和硝基。在实施方案中，L1和L2的每一个独立地为包含C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)的取代的亚苯基。
在一些实施方案中，R4独立地为CN或任选取代的C6-C10芳基(例如被0、1、2、3、4或5个取代基取代的苯基)。在一些实施方案中，R4独立地为CN。在一些实施方案中，R4独立地为未取代的苯基或未取代的萘基。在一些实施方案中，R4独立地为取代的C6-C10芳基(例如被1、2、3、4或5个取代基取代的苯基)。在一些实施方案中，R4独立地为具有1、2、3、4或5个独立地选自以下的取代基的C6-C10芳基(例如苯基)：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN、硝基和磺酸或其离子化形式(例如-SO3H或-SO3Na)。在一些实施方案中，R4独立地为具有1、2、3、4或5个独立地选自以下的取代基的C6-C10芳基(例如苯基)：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN和硝基。
在一些实施方案中，R1和R4为相同的基团。在一些实施方案中，R1和R4的每一个为具有0、1、2、3、4或5个独立地选自以下的取代基的C6-C10芳基(例如苯基)：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN、硝基和磺酸或其离子化形式(例如-SO3H或-SO3Na)。在一些实施方案中，R1和R4的每一个为具有0、1、2、3、4或5个独立地选自以下的取代基的C6-C10芳基(例如苯基)：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN和硝基。
在一些实施方案中，R5独立地为任选取代的C6-C10芳基(例如被0、1、2、3、4或5个取代基取代的苯基)。在一些实施方案中，R5独立地为未取代的苯基或未取代的萘基。在一些实施方案中，R5独立地为取代的C6-C10芳基(例如被1、2、3、4或5个取代基取代的苯基)。在一些实施方案中，R5独立地为具有1、2、3、4或5个独立地选自以下的取代基的C6-C10芳基(例如苯基)：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN和硝基。
在一些实施方案中，R2和R5为相同的基团。在一些实施方案中，R2和R5的每一个为具有0、1、2、3、4或5个独立地选自以下的取代基的C6-C10芳基(例如苯基)：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN、硝基和磺酸或其离子化形式(例如-SO3H或-SO3Na)。在一些实施方案中，R2和R5的每一个为具有0、1、2、3、4或5个独立地选自以下的取代基的C6-C10芳基(例如苯基)：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN和硝基。
在一些实施方案中，每个X为单价阴离子(例如每个X独立地为Cl-或Br-)。在进一步的实施方案中，R1和R4的每一个独立地为CN或任选取代的C6-C10芳基(例如被1、2、3、4或5个选自以下的取代基取代的苯基：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN和硝基)。在一些实施方案中，R1和R4为相同的基团。
示例性的式(I)化合物列于表1中。
表1. 示例性的式(I)化合物
在一些实施方案中，式(I)的化合物为INT。
在一些实施方案中，在代谢探针测定期间引入的代谢探针为水不溶性的。在进一步的实施方案中，代谢探针不需要添加中间电子载体以使分子被微生物有效还原。
在一些实施方案中，在代谢探针测定期间引入的代谢探针为7-羟基-10-氧化吩噁嗪-10-鎓-3-酮(刃天青)。在一些实施方案中，本文所述的方法使用市售可得到的alamarBlue®指示剂染料(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)作为包含刃天青的代谢探针。刃天青可在代谢活性细胞中经历还原反应，其中刃天青经代谢活性细胞的还原反应转化为荧光分子试卤灵。由试卤灵产生的荧光发射可通过读板器、荧光分光光度计和/或UV-Vis分光光度计测量。在其中使用刃天青的一些情况下，激发光滤光器可用于用约560nm波长的光激发样品，和发射光滤光器可用于检测从样品发射的约590 nm的光(例如在还原为试卤灵之后)。在一些实施方案中，不同的测定利用具有不同发射波长的荧光探针，以避免检测探针的荧光信号中的任何干扰。例如，代谢探针测定和表面结合探针测定可使用具有不同发射波长的荧光探针，这使得能够准确检测其信号。荧光探针的这种组合的一个实例为刃天青(其转化为试卤灵)和铕穴状化合物。
在一些实施方案中，代谢探针不能被微生物酶促水解。引入酶促可水解的探针对于代谢测定可能是有问题的，因为不同的微生物可具有不同的酶。可被微生物酶促水解的探针的实例包括4-甲基伞形酮磷酸酯和4-甲基伞形基脂肪酸酯(比如己酸酯、辛酸酯或壬酸酯)或其他脂肪酸酯(例如链长范围在C6-C16内)的混合物；4-甲基伞形基酯(例如磷酸酯)和7(N)-氨基酰基-4-甲基-7-氨基香豆素(例如7(N)-丙氨酰-4-甲基-7-氨基-香豆素)，相应的亮氨酸衍生物代替丙氨酸衍生物的混合物；4-甲基伞形基壬酸酯(MUN)；4-甲基伞形酮磷酸酯(MUP)；或4-甲基-7-氨基-香豆素-7-N-丙氨酰肽；或相应的其他香豆素的荧光衍生物。
可在酶促生化探针测定期间引入的酶促生化探针的非限制性实例可包括含有4-甲基伞形酮或7-氨基-4-甲基香豆素的香豆素衍生物的合成酶底物；含有邻-硝基苯酚、对-硝基苯酚、吲哚氧基、5-溴-4-氯-3-吲哚基或4-甲基伞形酮的酯的合成酶底物；对-硝基苯胺和7-氨基-4-甲基香豆素的芳基肽衍生物。例如，可使用以下酶的衍生物：β-D-葡糖醛酸糖苷酶(底物包括(但不限于)酚酞-单-β-D-葡糖苷酸、对-硝基苯酚-β-D-葡糖苷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖苷酸、4-甲基伞形基-β-D-葡糖苷酸)、β-D-半乳糖苷酶(底物包括(但不限于)邻-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷、对-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷、6-溴-2-萘基-β-D-吡喃半乳糖苷、4-甲基伞形基-β-D-吡喃半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)、6-磷酸-β-D-半乳糖苷6-磷酸半乳糖水解酶(底物包括(但不限于)邻-硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷-6-磷酸、邻-硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷)、α-D-半乳糖苷酶(底物包括(但不限于) 4-甲基伞形基-α-D-半乳糖苷)、β-D-葡萄糖苷酶(底物包括(但不限于)4-甲基伞形基-β-D-葡萄糖苷)、α-淀粉酶(底物包括(但不限于)5-、6-和7-麦芽糖的对-硝基苯酚衍生物)、神经氨酸酶(底物包括(但不限于) β-D-半乳糖胺、β-D-葡萄糖胺、2-D-N-乙酰神经氨酸、β-D-N’,N’-二乙酰基壳二糖的邻-硝基苯酚和4-甲基伞形基衍生物)、酯酶(底物包括(但不限于)4-甲基伞形基丁酸酯)、DNA酶(底物包括(但不限于)5-溴-4-氯-3-吲哚基-胸苷-3-磷酸、胸苷-5-单磷酸-对硝基苯酚酯、5-溴-4-氯-3-吲哚的磷酸酯)、磷酸酶(底物包括(但不限于)酚酞、苯酚、α-或β-萘酚、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基、对-硝基苯酚、4-甲基伞形基的衍生物)、焦谷氨酰氨肽酶(底物包括(但不限于)L-吡咯烷酮基-β-萘酰胺、L-焦谷氨酰-对硝基苯胺、L-焦谷氨酰-7-氨基-4-甲基香豆素)、L-丙氨酸氨肽酶(底物包括(但不限于) L-丙氨酸-对硝基苯胺)、内肽酶(底物包括(但不限于)硝基酰苯胺衍生物)、或凝固酶(底物包括(但不限于)色酶TH、D-Phe-Pro-Arg-β-萘酰胺HCl)。
在一些实施方案中，检测由特定酶活性引起的pH变化，比如由脲酶引起的pH变化。
可在生化探针测定期间引入的生化探针的非限制性实例可包括荧光葡萄糖类似物，包括(但不限于) 2-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-基)氨基)-2-脱氧葡萄糖；荧光抗生素，比如荧光多粘菌素B类似物(包括(但不限于)BODIPY®、OregonGreen®和丹磺酰衍生物)、荧光青霉素类似物(包括(但不限于)BOCILLINTM FL和BOCILLINTM 650/665)或荧光万古霉素类似物(包括(但不限于) BODIPY®)。
可在核酸探针测定期间引入的核酸探针的非限制性实例可包括吖啶橙、4,6-二氨基-2-苯基吲哚、Hoechst 33258、溴化乙锭、乙锭同型二聚体、单叠氮乙锭、碘化己锭、光辉霉素、碘化丙锭、SYTOX®染料系列、SYTO®染料系列、TOTO®染料系列(包括POPOTM、BOBOTM、YOYO®、JOJOTM、POPOTM、LOLOTM)、TO-PRO®染料系列(包括YO-PRO®)或7-氨基放线菌素D。
在一些实施方案中，这些探针可直接或在细胞溶解之后使用。
当在细胞溶解之前使用时，不能有效穿透完整细胞膜的核酸探针可为增加细胞生长提供信号减少。然后可将提供反向信号的测定与为增加生长提供信号增加的测定进行比较，比如代谢(氧化还原)探针、生化探针等。
可在RNA探针测定期间引入的RNA探针的非限制性实例可包括SYTO®RNASelectTM染料系列。
可在蛋白探针测定期间引入的蛋白探针的非限制性实例可包括8-苯胺基-1-萘磺酸或FUN®1细胞染色。
具有许多不同特征的任何光学装置(例如显微镜、微孔板读取器)可检测根据本文所述的方法发射的信号。例如：广谱灯(例如氙)、窄谱灯、激光、LED、多光子、共焦或全内反射照明可用于激发。照相机(单个或多个)、单个光电二极管或光电二极管阵列(1D或2D)、雪崩光电二极管、CMOS或CCD传感器、固态光电倍增管(例如硅光电倍增管)和/或具有基于滤光器或基于光栅的光谱分辨率(光谱分辨的发射波长)的光电倍增管(单个或多个)在检测侧是可能的。
在一些实施方案中，本文所述的方法使用光学系统，其包括光学激发源(例如氙灯、发光二极管(LED))、具有期望的特性的一组光学滤光器 (例如离散滤光器、单色仪)(例如带通、带阻、中心波长、半高全宽(FWHM))和光学检测器(例如光电倍增管)。光学系统还可包括用于收集和处理数据的数据采集和处理电子设备。在一些情况下，光学系统可包括一个或多个部件，比如嵌套在机械臂内或设置在其上的纤维光学和会聚光学器件、用于在整个系统中移动盒式磁带的机械臂。这种配置可帮助实现更快的样品处理和结果读取。这些光学系统可将信号从盒式磁带传送到检测器和数据处理电子设备。
在一些实施方案中，代谢探针测定本身用于确定抗微生物剂的MIC或QSR。
某些实施方案包括代谢探针测定和表面结合探针测定之间的分离步骤。潜在的分离技术可包括(但不限于)过滤(例如经具有小于或等于0.45微米或者小于或等于0.2微米的孔的过滤器)、离心(例如用g-力>500 × g）、电泳、介电泳和磁性捕获。这些技术可用于将探针从一种与粘附于过滤器中、沉淀于离心机中的微生物相关的测定分离出来，和/或与溶液中游离的那些电泳和/或磁性分离。游离探针通过过滤器(“滤液”)，离心或磁性分离之后保留在溶液(“上清液”)中，和/或电泳分开运行。离心可为标准、密度梯度或差速离心。磁性分离可能需要添加特异性地靶向与微生物缔合或结合的磁性颗粒。这些可在添加探针之前或同时添加。
为了使分离效率最大化，即使剩余的测定中的游离探针的数目最小化，可进行洗涤步骤。这些可为离散的(如在离心或磁性捕获的情况下)和/或连续的(如在过滤、磁性捕获或电泳的情况下)。
可在将来自表面结合探针测定的表面结合探针添加至微生物之前进行洗涤。例如，这些洗涤可去除其中微生物在温育期间悬浮的液体中存在的干扰种类。在一些实施方案中，不进行洗涤。
本文所述方法的某些实施方案包括添加包含乙二胺四乙酸和/或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的洗涤剂溶液。在一些实施方案中，洗涤剂溶液包含Tweens、Tritons、CTAB、Spans、Brijs、四铵化合物、阳离子聚合物、pluronics、硫酸盐、CPC、磺酸盐、BAC、磷酸盐、BZT、羧酸盐、DODAB、多库酯盐、脂肪/高级碳醇、CHAPS、磷脂和/或葡萄糖苷的一种或多种。
表面结合探针测定可引入包含镧系元素与二亚乙基三胺四乙酸或穴状配体的配位络合物的表面结合探针。在某些实施方案中，表面结合探针测定包括放大器，比如铕、锶、铽、钐和镝或其组合。在一些实施方案中，放大器为铕信号传导剂，其包括：
。
在本文所述的方法中，表面可为细胞壁、细胞被膜、质膜或细胞被囊的外表面；细胞壁、细胞被膜、质膜或细胞被囊的内表面；或在细胞壁、细胞被膜、质膜或细胞被囊内。表面可包括细胞外突出的细胞结构，包括(但不限于)纤毛、菌毛和鞭毛。表面可包括细胞器。表面可包括跨膜蛋白、细胞壁蛋白、细胞外蛋白、细胞内蛋白、细胞外相关多糖、细胞内相关多糖、细胞外脂质、细胞内脂质、膜脂质、细胞壁脂质、蛋白质、多糖和/或与细胞被膜成为一体或相关的脂质。表面可包括核酸。
表面可包括信号传导剂结合或缔合的生物分子。生物分子的非限制性实例可包括肽聚糖、胞壁质、甘露糖蛋白、孔蛋白、β-葡聚糖、几丁质、糖蛋白、多糖、脂多糖、脂寡糖、脂蛋白、内毒素、脂磷壁酸类、磷壁酸类、脂质A、碳水化合物结合结构域、外排泵、其他细胞壁和/或细胞膜相关蛋白、其他阴离子磷脂及其组合。
表面结合探针测定的信号显色可能需要添加“显色溶液”。对于包含催化剂的信号传导剂，显色溶液可包含信号前体，其可转化为光学和/或电活性信号传导分子。在添加显色溶液之后的指定时间，可测量比色和/或电化学信号。这种信号可包括(但不限于)吸光度、荧光、时间分辨荧光、化学发光、电化学发光、电流分析、伏安、阻抗和/或阻抗光谱。然后可类似于常规AST方案比较数据以确定AST和MIC。
在一些实施方案中，在其中使用基于镧系元素的放大器的情况下，使用时间分辨荧光(TRF)或时间门控发光(TGL)。在某些实施方案中，在其中使用铕(例如铕穴状化合物)的情况下，使用激发光滤光器以波长为约330 nm (例如具有80 nm的谱带)的光激发样品，和使用发射光滤光器检测从样品发射的约615 nm的光(例如带宽为10 nm)。激发和检测器一般地为同步的，因为由于镧系元素报告分子的寿命长，TGL使用短脉冲和延迟时间窗口进行测量。例如，对于铕，在激发光源的消光和开始测量样品发射的光之间可使用100-200微秒(μs)的延迟。例如，可使用200-600 μs的时段测量样品发射的光(即积分窗口)。
在一些实施方案中，确定信号水平包括测量与完整微生物相关的信号水平。或者或另外，确定信号水平包括测量与完整微生物无关的信号水平。
这些过程可直接从培养物、传代培养物、阳性血培养物、样品中进行。可在AST之前或在信号传导剂添加之前进行浓缩微生物和/或去除潜在干扰种类的处理。
用户可直接从通过本文所述的测定产生的数据解释MIC和/或QSR输出数据。或者，可通过算法处理这些数据以产生MIC和/或QSR。报告的MIC和/或QSR值可源自本文所述的测定。
在一些实施方案中，确定抗微生物剂的MIC或QSR的不同测定的数目可小于进行的测定数目。在一些实施方案中，确定抗微生物剂的MIC或QSR的不同测定的数目可等于进行的测定数目。
检查点测定
可进行检查点测定以确定微生物生长。例如，为了获得准确的AST测定，测定可说明缓慢生长的细菌菌株，并且因此，本文的方法可提供在初始温育期之后发生的检查点测定，以确定是否已发生足够的微生物生长。如同微生物的生长一样，生长可包括微生物的数目的增殖、长度的增加、体积的增加和/或核酸和/或蛋白质含量的增加。
尽管先前已证实各种终点测量(比如ATP、DNA、RNA和表面结合测量)适用于AST测定，但由于其无法说明缓慢生长的微生物菌株，因此这些测定迄今为止在商业上尚未成熟，比如万古霉素中介金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，其生长动力学明显慢于其他金黄色葡萄球菌(S. aureus)菌株，包括耐甲氧西林和甲氧西林敏感菌株。
常规AST方法可在于微孔板使用肉汤微量稀释程序的自动化仪器上进行，其中在接种和温育期间在肉汤中包含生长指示剂，以通过测量相对于时间的指示剂信号来确定AST结果。然而，发现这些生长指示剂(比如刃天青)，当在温育期间添加时，实际上可能对微生物有害。
尽管一些生长指示剂可抑制微生物生长，但其可通过在微生物温育期间纳入生长阈值检查点孔来用作不受抑制的生长的指标。为了解决缓慢生长的细菌局限性，可首先进行使用生长指示剂的检查点测定以判定足够的微生物生长已达到阈值，并然后可在单独的孔中进行相对微生物浓度的最终测量以确定 AST结果(例如MIC或QSR)。如果检查点测定显示微生物生长未能达到阈值，则可使得微孔板再温育一段时间并且不开始相对微生物浓度的最终测量，直到已达到生长阈值。在一些实施方案中，另外的温育时间段在1-20小时之间、2-20小时之间、3-20小时之间、4-20小时之间、5-20小时之间、6-20小时之间、8-20小时之间、9-20小时之间、10-20小时之间、11-20小时之间、12-20小时之间、13-20小时之间、14-20小时之间、15-20小时之间、16-20小时之间、17-20小时之间、18-20小时之间或19-20小时之间进行。在一些实施方案中，温育期为2-19小时之间或3-18小时之间、4-16小时之间、3-14小时之间、3-12小时或之间的每个可能的时间间隔。
在一些实施方案中，阈值为阳性对照与背景对照之间的比率。在一些实施方案中，阳性对照包含在没有抗微生物剂的情况下温育的微生物的悬浮液和生长指示剂。在一些实施方案中，背景对照包含在没有微生物的情况下温育的培养基和生长指示剂。在一些实施方案中，通过确定接种与未接种孔中的生长指示剂比如阿拉玛蓝信号的比率来测量信噪比。在某些实施方案中，阳性对照与背景对照的比率为1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5或更大。在一些实施方案中，通过测定来自接种与未接种孔中的表面结合剂的信号来测量信噪比。
在一些实施方案中，用于这些检查点测定的微孔板的孔不包含抗微生物剂，也不用于最终测量以确定抗微生物剂的功效。在某些实施方案中，检查点测定在没有抗微生物剂的室中进行。在一些实施方案中，检查点测定在没有一种或多种微生物的室中进行。在一些实施方案中，检查点测定在含有一种或多种针对微生物的已知效力的抗微生物剂的室中进行。
当阈值检查点测定表明生长足以启动AST生长测定时，可进行多种不同的测定。可使用如前所述的AST生长测定，比如ATP的测定，比如BacTiter-Glo®、RealTime-GloTM、Caspase-Glo®；DNA染色剂，比如溴化乙锭、碘化丙锭、SYTOX绿、菲啶、吖啶、吲哚、咪唑和花青，包括TOTO、TO-PRO、SYTO；和结合测定，比如酶联免疫吸附测定、抗体测定、基于凝集素的测定、基于多粘菌素B的测定和基于化学探针的测定。
在一些实施方案中，检查点测定包括核酸扩增或核酸测序。在一些实施方案中，检查点测定包括显微术或质谱法。在一些实施方案中，检查点测定包括测量微生物质量。
生长指示剂
如上所述，生长指示剂可用于检查点测定以确定在进行AST生长测定之前有足够的微生物生长。如下所示，可使用各种生长指示剂。
在一些实施方案中，生长指示剂在检查点测定期间具有光学或电活性。进一步地，在一些实施方案中，生长指示剂的光学信号包括荧光、时间分辨荧光、吸光度或发光。生长指示剂的电信号为伏安信号或电位信号。
在某些实施方案中，生长指示剂在检查点测定期间经历化学或生化反应。在一些实施方案中，生长指示剂为能够结合微生物细胞膜、细胞壁、细胞被膜、蛋白、糖、多糖、脂质、细胞器或核酸的化学或生化基团。仍然进一步地，生长指示剂可在检查点测定期间对pH有响应。
在一些实施方案中，本文所述的生长指示剂包括7-羟基-10-氧化吩噁嗪-10-鎓-3-酮(刃天青)、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓(MTS)、3,3’-(3,3’-二甲氧基-4,4’-亚联苯基)双[2,5-双(对-硝基苯基)-2H-四唑鎓氯化物] (TNBT)、2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑鎓-5-甲酰苯胺(XTT)、水溶性四唑鎓盐类(WSTs)、(2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓钠盐(WST-1)、4-[3-(4-碘苯基)-2-(2,4-二硝基苯基)-2H-5-四唑]-1,3-苯二磺酸盐(WST-3)、2,2’-二苯并噻唑基-5,5’-双[4-二(2-磺基乙基)氨基甲酰基苯基]-3,3’-(3,3’-二甲氧基4,4’-亚联苯基)二四唑鎓二钠盐(WST-5)、5-(2,4-二磺基苯基)-3-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-四唑鎓内盐单钠盐(WST-8)、2,3,5-三苯基-四唑鎓氯化物(TTC)、5-氰基-2,3-二(对-甲苯基)四唑鎓氯化物(CTC)、3,3’(3,3’-二甲氧基-[1,1’-联苯]-4,4’-二基)双(2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑-3-鎓)(DBNPT)、3-(萘-1-基)-2,5-二苯基-2H-四唑-3-鎓(NDT)、噻唑蓝四唑鎓溴化物(TBTB)、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓氯化物(INT)、吩嗪甲基硫酸盐(PMS)、吩嗪乙基硫酸盐(PES)、甘氨酰苯基丙氨酰-氨基氟香豆素(GF-AFC)、2,2’-双(4-硝基苯基)-5,5’-二苯基-3,3’-(3,3’-二甲氧基-4,4’-亚联苯基)二四唑鎓氯化物(NBT)、2,5-二苯基-3-(1-萘基)四唑鎓氯化物(TV)、3,3’-(3,3’-二甲氧基[1,1’-联苯]-4,4’-二基)-双(2,5-二苯基-2H-四唑鎓)二氯化物(BTC)、5-氰基-2,3-双(4-甲基苯基)-2H-四唑鎓氯化物(CTC)、2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑鎓-5-甲酰苯胺内盐(XTT)、RealTime-Glo™、Caspase-Glo®、BATDA的乙酰氧基甲酯、二茂铁、十二烷基刃天青、二氢罗丹明123、二氢荧光素、6-羧基-2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯及其乙酰氧基甲酯、2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯、5-羧基-2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯及其乙酰氧基甲酯、氯甲基-2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯乙酰酯、二氢钙黄绿素AM、二氢乙锭、鲁米诺或2,3,4,5,6-五氟四甲基二氢rosamine。
在一些实施方案中，生长指示剂具有以下式(I)的结构：
其中
R1独立地为CN、任选取代的C6-C10芳基或任选取代的5-至10-元杂芳基；
R2独立地为任选取代的C6-C10芳基或任选取代的5-至10-元杂芳基；
R3独立地为任选取代的C6-C10芳基、任选取代的5-至10-元杂芳基或子结构A；
子结构A为
其中
L1独立地为任选取代的C6-C10芳基或任选取代的5-至10-元杂芳基；
L2独立地为共价键、任选取代的C6-C10芳基或任选取代的5-至10-元杂芳基；
R4独立地为CN、任选取代的C6-C10芳基或任选取代的5-至10-元杂芳基；
R5独立地为任选取代的C6-C10芳基或任选取代的5-至10-元杂芳基；
每个X独立地不存在或为单价阴离子。
在一些实施方案中，R1独立地为CN或任选取代的C6-C10芳基(例如被0、1、2、3、4或5个取代基取代的苯基)。在一些实施方案中，R1独立地为CN。在一些实施方案中，R1独立地为未取代的苯基或未取代的萘基。在一些实施方案中，R1独立地为取代的C6-C10芳基(例如被1、2、3、4或5个取代基取代的苯基)。在一些实施方案中，R1独立地为具有1、2、3、4或5个独立地选自以下的取代基的C6-C10芳基(例如苯基)：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN、硝基和磺酸或其离子化形式(例如-SO3H或-SO3Na)。在一些实施方案中，R1独立地为具有1、2、3、4或5个独立地选自以下的取代基的C6-C10芳基(例如苯基)：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN和硝基。
在一些实施方案中，R2独立地为任选取代的C6-C10芳基(例如被0、1、2、3、4或5个取代基取代的苯基)。在一些实施方案中，R2独立地为未取代的苯基或未取代的萘基。在一些实施方案中，R2独立地为取代的C6-C10芳基(例如被1、2、3、4或5个取代基取代的苯基)。在一些实施方案中，R2独立地为具有1、2、3、4或5个独立地选自以下的取代基的C6-C10芳基(例如苯基)：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN和硝基。
在一些实施方案中，R3独立地为任选取代的C6-C10芳基(例如被0、1、2、3、4或5个取代基取代的苯基)。在一些实施方案中，R3独立地为未取代的苯基或未取代的萘基。在一些实施方案中，R3独立地为取代的C6-C10芳基(例如被1、2、3、4或5个取代基取代的苯基)。在一些实施方案中，R3独立地为具有1、2、3、4或5个独立地选自以下的取代基的C6-C10芳基(例如苯基)：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN和硝基。
在一些实施方案中，X为单价阴离子(例如Cl-或Br-)。在进一步的实施方案中，R1独立地为CN或任选取代的C6-C10芳基(例如被1、2、3、4或5个选自以下的取代基取代的苯基：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN和硝基)。
在一些实施方案中，X不存在。在进一步的实施方案中，R1独立地为取代的C6-C10芳基，其包含为离子化的磺酸基的取代基。
在一些实施方案中，R3为子结构A，并且化合物具有以下式(II)的结构：
。
在实施方案中，L1为任选取代的C6-C10亚芳基，和L2为共价键。
在实施方案中，L1和L2的每一个独立地为任选取代的C6-C10亚芳基。在实施方案中，L1和L2的每一个独立地为任选取代的亚苯基。在实施方案中，L1和L2的每一个为未取代的亚苯基。在实施方案中，L1和L2的每一个独立地为具有1、2、3或4个独立地选自以下的取代基的亚苯基：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN和硝基。在实施方案中，L1和L2的每一个独立地为包含C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)的取代的亚苯基。
在一些实施方案中，R4独立地为CN或任选取代的C6-C10芳基(例如被0、1、2、3、4或5个取代基取代的苯基)。在一些实施方案中，R4独立地为CN。在一些实施方案中，R4独立地为未取代的苯基或未取代的萘基。在一些实施方案中，R4独立地为取代的C6-C10芳基(例如被1、2、3、4或5个取代基取代的苯基)。在一些实施方案中，R4独立地为具有1、2、3、4或5个独立地选自以下的取代基的C6-C10芳基(例如苯基)：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN、硝基和磺酸或其离子化形式(例如-SO3H或-SO3Na)。在一些实施方案中，R4独立地为具有1、2、3、4或5个独立地选自以下的取代基的C6-C10芳基(例如苯基)：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN和硝基。
在一些实施方案中，R1和R4为相同的基团。在一些实施方案中，R1和R4的每一个为具有0、1、2、3、4或5个独立地选自以下的取代基的C6-C10芳基(例如苯基)：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN、硝基和磺酸或其离子化形式(例如-SO3H或-SO3Na)。在一些实施方案中，R1和R4的每一个为具有0、1、2、3、4或5个独立地选自以下的取代基的C6-C10芳基(例如苯基)：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN和硝基。
在一些实施方案中，R5独立地为任选取代的C6-C10芳基(例如被0、1、2、3、4或5个取代基取代的苯基)。在一些实施方案中，R5独立地为未取代的苯基或未取代的萘基。在一些实施方案中，R5独立地为取代的C6-C10芳基(例如被1、2、3、4或5个取代基取代的苯基)。在一些实施方案中，R5独立地为具有1、2、3、4或5个独立地选自以下的取代基的C6-C10芳基(例如苯基)：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN和硝基。
在一些实施方案中，R2和R5为相同的基团。在一些实施方案中，R2和R5的每一个为具有0、1、2、3、4或5个独立地选自以下的取代基的C6-C10芳基(例如苯基)：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN、硝基和磺酸或其离子化形式(例如-SO3H或-SO3Na)。在一些实施方案中，R2和R5的每一个为具有0、1、2、3、4或5个独立地选自以下的取代基的C6-C10芳基(例如苯基)：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN和硝基。
在一些实施方案中，每个X为单价阴离子(例如每个X独立地为Cl-或Br-)。在进一步的实施方案中，每个R1和R4独立地为CN或任选取代的C6-C10芳基(例如被1、2、3、4或5个选自以下的取代基取代的苯基：C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基或异丙基)、C1-6烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基)、卤素(例如F、Cl、Br或I)、-CN和硝基)。在一些实施方案中，R1和R4为相同的基团。
示例性的式(I)化合物列于表2中。
表2. 示例性的式(I)化合物
在一些实施方案中，式(I)的化合物为INT。
在一些实施方案中，合适的生长指示剂为本领域的技术人员熟知的代谢探针，并且描述于The Molecular Probes® Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 11th Ed. (2010) (参见例如Chapter 15, “Assays for CellViability, Proliferation and Function”)和Riss TL, Moravec RA, Niles AL, etal. Cell Viability Assays. 2013 May 1 [Updated 2016 Jul 1]. In: SittampalamGS, Coussens NP, Nelson H, et al., editors. Assay Guidance Manual [Internet].Bethesda (MD): Eli Lilly & Company and the National Center for AdvancingTranslational Sciences; 2004-和US 7897331中，其通过参考以其全部结合至本文中。
在一些实施方案中，生长指示剂为7-羟基-10-氧化吩噁嗪-10-鎓-3-酮(刃天青)。在一些实施方案中，本文所述的方法使用市售可得到的alamarBlue®作为包含刃天青的生长指示剂。在一些实施方案中，刃天青在代谢活性细胞中经历还原反应，其中刃天青转化为荧光分子试卤灵。在一些实施方案中，由试卤灵产生的荧光发射通过读板器、荧光分光光度计和/或UV-Vis分光光度计测量。在一些实施方案中，在将微生物的悬浮液引入盒室期间或在温育期开始时将生长指示剂引入到预定的检查点测定室中。
时间门控发光(例如时间分辨荧光)可用于测量来自生长指示剂的光学信号。在一些情况下，方法使得能够激发放大器分子并检测发射的光，其可在时间上(例如检测可被延迟并且发生在激发之后所有自发荧光消失时)和光谱上(例如激发波长可距离发射超过100nm，这使得能够使用不太贵的带通滤光器)两方面分开。在一些实施方案中，通过添加由结合的分子催化修饰的底物来实现扩增，并且可测量光输出。该光学信号可包括吸光度信号、荧光信号和/或化学发光信号。在一些实施方案中，信号包括电化学发光(ECL)。
盒
盒可为能够保持并允许微生物的液体悬浮液生长的容器。盒的非限制性实例可包括培养瓶、培养皿、皮氏培养皿、生物测定皿、培养管、试管、微量离心管、瓶、微室板、多室板、微量滴定板、微孔板。盒可包含一个室。盒可包含多个室，每个室为能够保持液体悬浮液与另一空间物理隔离的空间；室的一个实例为多壁板中的室。盒可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、48、96、192、384、1536或更多个室，以及之间的任何数目的室。盒室的底部为平坦的、圆形的或V形的。
存在于盒上的多个室内的抗微生物剂可悬浮于培养基中。在一些实施方案中，抗微生物剂以抗微生物膜的形式存在。在某些实施方案中，抗微生物剂以固体形式存在。在一些实施方案中，将固体抗微生物剂冻干和/或干燥。某些实施方案提供在引入微生物的悬浮液之前在一个或多个盒室中作为抗微生物膜、以固体形式(冻干或干燥)存在的一种或多种抗微生物剂。
在用微生物接种板之前，可将抗微生物剂稀释系列冷冻、冻干或新鲜制备。在一些情况下，可通过手动或使用自动化系统进行盒的接种。在一些实例中，比如在新鲜抗微生物板的情况下，可使用自动化液体处理系统来制备含有抗微生物剂稀释系列的盒。接种方法可包括可为本领域已知的各种方法中的任何方法。
本文所述的盒可用于含有各种流体组合，以进行多种测试序列，比如检查点测定和多种不同的生长测定。在一些实施方案中，盒具有一组用于便于一种或多种检查点测定的室和一组用于便于一种或多种生长测定的室。举例来说，盒可包含一系列以行和列排列的室。盒可包含一组对照室和一组抗微生物剂测试室。对照室组可包括两个室和测试室组可包括沿着板的其余的室。在一些实施方案中，对照室组包括至少两个室，其中一个室为生长室和另一个室为非生长室。在一些实施方案中，生长室包括或被接种以包括肉汤和微生物(其可在温育期间于肉汤内生长)的组合。在某些实施方案中，抗微生物剂不添加至检查点测定室中。而在一些实施方案中，非生长室可包括或被接种以包括没有微生物的肉汤。在一些实施方案中，抗微生物剂也未添加至无生长室中。因此，在温育期间，与微生物可在其中生长的生长室相比较，无生长室可用作基线。
在一些实施方案中，每个盒含有抗微生物剂和每种抗微生物剂的确定的两倍稀释系列的组合。另外，每个盒可含有对照室，比如生长对照室、无生长(污染)对照室和盐水对照室。盐水对照室可代表FIT对照，其大约等于接种物中微生物的初始浓度。盒可包含多个室(例如96室盒或384室盒)，其具有盖子(例如可移除的盖子)和唯一地定义抗生素配置的标识符(例如条形码)和独特的代码，其定义板并且可与符合HIPAA的独特患者样品相关联。
测试室可包含源自生物样品的微生物的各种组合中的任何一种以及可分析敏感性的各种类型和浓度的抗微生物剂。室的行可专用于特定的抗微生物剂，并且抗微生物剂的浓度可在同一行的列之间变化。例如，盒可具有一行含有青霉素的室，其中每个室从左到右含有增加浓度的青霉素。
当然，其他实例也是可能的。例如，不同的室和室组可位于沿着盒的各种位置中的任何一个。另外，不同的室组(例如对照室和测试室)可包括沿着盒的更多或更少的单个室。另外，在一些情况下，并非所有的室在测试期间都被使用/占用。
预热盒
在温育期之前将盒预热至30-45℃对于促进微生物生长可为有利的，这继而可产生更快和/或更准确的抗微生物剂敏感性测试(AST)测定。在一些情况下预热可能是有用的，因为标准空气对流温育箱一般地需要30-60分钟才能使测试面板达到期望的工作温度。预热对于与本文所述的方法一起用于进行快速AST特别有用，因为典型的期望的温育时间低于8小时，并且在大多数情况下少于7小时、少于6小时、少于5小时、少于4小时或少于3个小时。
通过使微生物在30℃-45℃、31-39℃或33-37℃之间的温度下温育的时间的量最大化，可实现足够的生长用于实现动态生长范围，从而实现更准确的AST确定。在其中使用肉汤微量稀释液的自动化AST测试中，增加每个盒孔中的溶液达到促进微生物生长的温度的速度可缩短AST测定的持续时间。
在一些实施方案中，在标准对流加热约20分钟之后，单个96孔微孔板(带盖)达到生长促进温度，并且可帮助提高测定通量的堆叠的96孔微孔板需要约40分钟的加热时间才达到这些温度。
使用标准温育箱，具体地讲对于堆叠的微孔板，孔间加热均匀性也是一个问题。孔温度可存在显著的径向分布，这对4板堆叠的中心板可放大。
本文所述的方法可通过在温育预热的盒之前将包含微生物的悬浮液的盒预热至约30℃-约45℃的温度来促进微生物生长。在一些实施方案中，在将盒预热之后10、15、20、25、30或60分钟内发生微生物的温育。通过本文所述的这些增强生长技术可产生更大的动态生长范围，这可产生更好的AST测定结果。
在一些实施方案中，将盒预热至约27℃-约48℃、约30℃-约45℃、约31℃-约39℃或约33℃-约37℃的温度。
预热的盒可包含至少96个室。盒的预热可导致至少96个室的基本上均匀加热。
在一些实施方案中，将盒预热少于约15分钟、少于约10分钟、少于约5分钟、少于约2分钟或少于约1分钟。在某些实施方案中，将盒预热1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15或30分钟。
盒的预热可通过辐射加热、传导加热或对流加热发生。在一些实施方案中，辐射加热为红外辐射加热。或者，盒可通过传导和对流加热来预热，并且至少一个加热表面可进行传导和对流加热。在一些实施方案中，盒通过辐射加热和传导和对流加热两者来预热。在一些实施方案中，盒不会通过单独的对流加热来预热。盒还可通过在至少25℃的温度、至少30℃的温度或至少35℃的温度下向盒中添加至少一种流体来预热。
在一些实施方案中，在将盒装载到自动化平台之前预热盒以进行抗微生物剂敏感性测试。
盒的预热可导致盒上的温度变化小于5%。某些实施方案提供室的基本上均匀加热，其中最高温度室与最低温度室之间的温度差百分比小于5%。
盒搅动
本领域的技术人员充分理解溶液混合，以通过增强溶液通气来促进大生长溶液体积(例如>10 mL)中的微生物生长速率。肉汤微量稀释AST测定通常在包含具有横向尺寸<12mm的孔的盒中进行。为了在横向尺寸<12 mm的孔中实现适当的溶液混合，轨道震荡频率必须为至少500转/分钟(rpm)。然而，由于对微生物的高应变和剪切，这些频率将抑制横向尺寸<12 mm的孔中的微生物生长。
在某些实施方案中，方法提供通过以不足以实现溶液混合的频率或半径搅动盒来促进微生物生长。在温育期间可使用盒和其中的微生物的搅动，比如轨道或轴向震荡，以促进微生物的更好氧合和均匀暴露于生长培养基中的营养物。令人惊讶的是，发现亚混合诱导震荡频率和半径可提高微生物生长速率。
在本方法的一些实施方案中，盒包含至少96个室，并且每个室具有小于12 mm的横向尺寸。盒可通过机械搅动、声频搅动或磁力搅动来搅动。机械搅动的非限制性实例可包括振荡或摇动和/或使用搅拌棒、搅拌桨、搅拌叶片和/或搅拌螺旋桨或叶轮。机械搅动可为轴线的、轨道或半轨道振荡。
轨道振荡(例如圆形、椭圆形等)可以大于50转/分钟、大于60转/分钟、大于70转/分钟、大于80转/分钟、大于90转/分钟、大于100转/分钟、大于125转/分钟、大于150转/分钟、大于175转/分钟、大于200转/分钟、大于225转/分钟、大于250转/分钟、大于275转/分钟、大于300转/分钟、大于325转/分钟、大于350转/分钟、大于375转/分钟、大于400转/分钟、大于500转/分钟、大于600转/分钟、大于700转/分钟、大于725转/分钟、大于750转/每分钟或大于775转/分钟的频率发生。
轨道振荡半径可大于1 mm、大于2 mm、大于3 mm、大于4 mm、大于5 mm、大于6 mm、大于7 mm、大于8 mm、大于9 mm、大于10 mm、大于11 mm、大于12 mm、大于13 mm、大于14 mm、大于15 mm、大于16 mm、大于17 mm、大于18 mm、大于19 mm、大于20 mm、大于21 mm、大于22mm、大于23 mm或大于24 mm。半径可为25 mm。
在一些实施方案中，轴向线性振荡包括1、2、3、4、5或6轴线性运动。
可调节搅动的速度和位移以获得另外的最佳性能。例如，与较大的孔(比如在96室的盒中)相比较，具有较小孔尺寸(例如直径)的盒(比如在384室的盒中)可得益于以较高频率和较小直径轨道(在轨道搅动的情况下)进行的搅动。随着板几何形状变化，这种搅动的变化可用于使盒孔中的液体保持在孔内平稳地旋动。在一些实施方案中，促进微生物生长的条件包括使微生物暴露于环境空气、厌氧条件或高达10% CO2。
在一些实施方案中，以不足以实现溶液混合的频率或半径搅动盒导致搅动盒的微生物生长与没有搅动盒的微生物生长之间的生长比率更大。
微生物
感染可包括任何微生物来源的感染因子，例如细菌、真菌细胞、古生菌和原生动物。在一些实例中，感染因子为细菌，例如革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和非典型细菌。抗微生物剂抗性微生物可为对抗微生物剂(即抗细菌药物、抗真菌药物、抗古生菌药物和抗原生动物药物)具有抗性的微生物。
微生物(例如微生物的液体悬浮液)可包括一种菌株的微生物。微生物可包括一个种类的微生物。微生物可包括多于一种菌株的微生物。微生物可包括一种目的微生物。微生物可包括一种纲的微生物。微生物可包括一种科的微生物。微生物可包括一种界的微生物。
微生物(例如微生物的液体悬浮液)可包括多于一种菌株的微生物。微生物可包括多于一个种类的微生物。微生物可包括多于一种属的微生物。微生物可包括多于一种目的微生物。微生物可包括多于一种纲的微生物。微生物可包括多于一种科的微生物。微生物可包括多于一种界的微生物。
微生物可为细菌。细菌的实例包括(但不限于)橙黄醋杆菌(Acetobacter aurantius)、沥青不动杆菌(Acinetobacter bitumen)、不动杆菌属(Acinetobacter spp.)、以色列放线菌(Actinomyces israelii)、放线菌属(Actinomyces spp.)、气球菌属(Aerococcus spp.)、放射形农杆菌(Agrobacterium radiobacter)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、无形体属(Anaplasma)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinelandii)、芽孢杆菌(Bacillus)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、梭状芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus Thuringiensis)、拟杆菌属(Bacteroides)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、牙龈拟杆菌(Bacteroides gingivalis)、产黑色素拟杆菌(Bacteroides melaninogenicus)(也称为产黑色素普雷沃菌(Prevotella melaninogenica))、巴尔通氏体(Bartonella)、汉氏巴尔通氏体(Bartonella henselae)、五日热巴尔通氏体(Bartonella quintana)、巴尔通氏体属(Bartonella spp.)、博德特氏菌(Bordetella)、支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、博德特氏菌属(Bordetella spp.)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、布鲁氏菌(Brucella)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)、布鲁氏菌属(Brucella spp.)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)、假鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、肉芽肿鞘杆菌(Calymmatobacterium granulomatis)、弯曲杆菌(Campylobacter)、结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、幽门弯曲杆菌(Campylobacter pylori)、弯曲杆菌属(Campylobacter spp.)、衣原体(Chlamydia)、衣原体属(Chlamydia spp.)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、嗜衣原体(Chlamydophila)、肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae)(先前称为肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae))、鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci)(先前称为鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydia psittaci))、嗜衣原体属(Chlamydophila spp.)、梭菌(Clostridium)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens) (先前称为魏氏梭菌(Clostridium welchii))、梭菌属(Clostridium spp.)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、棒状杆菌(Corynebacterium)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、梭形棒状杆菌(Corynebacterium fusiforme)、棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)、伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii)、恰菲埃里希氏体(Ehrlichia chaffeensis)、埃里希氏体属(Ehrlichia spp.)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、肠杆菌属(Enterobacter spp.)、肠球菌(Enterococcus)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、耐久肠球菌(Enterococcus durans)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus galllinarum)、病臭肠球菌(Enterococcus maloratus)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、大肠杆菌(Escherichia coli)、弗朗西丝氏菌属(Francisella spp.)、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、加德纳氏菌属(Gardenerella spp.)、阴道加德纳氏菌(Gardnerella vaginalis)、嗜血杆菌属(Haemophilius spp.)、嗜血杆菌(Haemophilus)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、百日咳嗜血杆菌(Haemophilus pertussis)、阴道嗜血杆菌(Haemophilus vaginalis)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、螺杆菌属(Helicobacter spp.)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.)、乳杆菌(Lactobacillus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、军团菌属(Legionella spp.)、细螺旋体属(Leptospira spp.)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、李斯特氏菌属(Listeria spp.)、extroquen甲烷杆菌(Methanobacterium extroquens)、多形微杆菌(Microbacterium multiforme)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、卡他莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、分枝杆菌(Mycobacterium)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、类白喉分枝杆菌(Mycobacterium diphtheriae)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、鼠麻风分枝杆菌(Mycobacterium lepraemurium)、草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、枝原体(Mycoplasma)、发酵枝原体(Mycoplasma fermentans)、生殖道枝原体(Mycoplasma genitalium)、人型枝原体(Mycoplasma hominis)、穿透枝原体(Mycoplasma penetrans)、肺炎枝原体(Mycoplasma pneumoniae)、枝原体属(Mycoplasma spp.)、奈瑟氏球菌(Neisseria)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、奈瑟氏球菌属(Neisseria spp.)、诺卡氏菌属(Nocardia spp.)、巴斯德氏菌(Pasteurella)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、巴斯德氏菌属(Pasteurella spp.)、土拉巴斯德氏菌(Pasteurella tularensis)、消化链球菌(Peptostreptococcus)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、产黑色素普雷沃菌(Prevotella melaninogenica) (先前称为产黑色素拟杆菌(Bacteroides melaninogenicus))、变形杆菌属(Proteus spp.)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、放射根瘤菌(Rhizobium radiobacter)、立克次氏体(Rickettsia)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、鹦鹉热立克次氏体(Rickettsia psittaci)、五日热立克次氏体(Rickettsia quintana)、立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)、立克次氏体属(Rickettsia spp.)、沙眼立克次氏体(Rickettsia trachomae)、罗卡利马氏体(Rochalimaea)、汉氏罗卡利马氏体(Rochalimaea henselae)、五日热罗卡利马氏体(Rochalimaea quintana)、龋齿罗氏菌(Rothia dentocariosa)、沙门氏菌(Salmonella)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、迂回螺菌(Spirillum volutans)、葡萄球菌(Staphylococcus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas spp.)、链球菌(Streptococcus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、鸟链球菌(Streptococcus avium)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、大鼠链球菌(Streptococcus cricetus)、屎链球菌(Streptococcus faceium)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、野生链球菌(Streptococcus ferus)、鸡链球菌(Streptococcus gallinarum)、乳酸链球菌(Streptococcus lactis)、温和链球菌(Streptococcus mitior)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、变异链球菌(Streptococcus mutans)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、鼠链球菌(Streptococcus rattus)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、血链球菌(Streptococcus sanguis)、表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)、链球菌属(Streptococcus spp.)、密螺旋体(Treponema)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、密螺旋体属(Treponema spp.)、脲枝原体属(Ureaplasma spp.)、弧菌(Vibrio)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、逗号弧菌(Vibrio comma)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、弧菌属(Vibrio spp.)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、草绿色链球菌(viridans streptococci)、沃尔巴克氏体(Wolbachia)、耶尔森氏菌(Yersinia)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)和耶尔森氏菌属(Yersinia spp.)。
微生物可为真菌。真菌的实例包括(但不限于)曲霉属(Aspergillus spp.)、芽生菌属(Blastomyces spp.)、假丝酵母属(Candida spp.)、枝孢属(Cladosporium)、球孢子菌属(Coccidioides spp)、隐球菌属(Cryptococcus spp.)、突脐蠕孢属(Exserohilum)、镰刀菌属(fusarium)、组织胞浆菌属(Histoplasma spp.)、伊萨酵母属(Issatchenkia spp.)、毛霉菌属(mucormycetes)、肺囊虫属(Pneumocystis spp.)、环癣(ringworm)、丝孢菌属(scedosporium)、孢子丝菌属(Sporothrix)和葡萄穗霉属(Stachybotrys spp)。微生物可为原生动物。原生动物的实例包括(但不限于)溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、疟原虫属(Plasmodium spp.)、兰氏贾第虫(Giardia lamblia)和布氏锥虫(Trypanosoma brucei)。
抗微生物剂
当微生物为细菌时，示例性的抗微生物剂包括(但不限于)阿米卡星、氨基糖苷、氨基糖苷阿莫西林、氨基糖苷类、阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸盐、氨苄青霉素、氨苄青霉素/舒巴坦、抗毒素、胂凡纳明、阿奇霉素、阿洛西林、氨曲南、β-内酰胺、杆菌肽、卷曲霉素、碳青霉烯类、羧苄青霉素、头孢克洛、头孢羟氨苄、头孢氨苄、头孢噻吩(Cefalothin)、头孢噻吩(Cefalotin)、头孢羟唑、头孢唑啉、头孢地尼、头孢托仑、头孢吡肟、头孢克肟、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢西丁、头孢泊肟、头孢丙烯、头孢洛林(Ceftaroline)、头孢洛林酯(Ceftaroline fosamil)、头孢他啶、头孢布坦、头孢唑肟、头孢吡普、头孢曲松、头孢呋辛、头孢菌素、氯霉素、氯霉素(Bs)、环丙沙星、克拉霉素、克林霉素、氯法齐明、氯唑西林、粘菌素、复方新诺明、环丝氨酸、达巴万星、氨苯砜、达托霉素、地美环素、双氯西林、地红霉素、多利培南、多西环素、依诺沙星、厄他培南、红霉素、乙胺丁醇、乙胺丁醇(Bs)、乙硫烟胺、氟氯西林、氟喹诺酮、氟喹诺酮类、磷霉素、呋喃唑酮、夫西地酸、加替沙星、格尔德霉素、吉米沙星、庆大霉素、格帕沙星、除莠霉素、亚胺培南/西司他丁、异烟肼、卡那霉素、左氧氟沙星、林可霉素、利奈唑胺、洛美沙星、氯碳头孢、大环内酯类、磺胺米隆、美罗培南、甲氧西林、甲硝哒唑、美洛西林、米诺环素、莫西沙星、莫匹罗星、萘夫西林、萘夫西林、萘啶酸、新霉素、奈替米星、呋喃妥因(Bs)、诺氟沙星、氧氟沙星、奥利万星、苯唑西林、土霉素、巴龙霉素、青霉素、青霉素G、青霉素V、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、平板霉素、多粘菌素B、泼斯唑来、吡嗪酰胺、奎奴普丁/达福普丁、雷得唑来、瑞西巴库、利福布丁、利福平(Rifampicin)、利福平(Rifampin)、利福喷丁、利福昔明、罗红霉素、磺胺嘧啶银、司帕沙星、壮观霉素、壮观霉素(Bs)、螺旋霉素、链阳菌素、链霉素、舒巴坦、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺地托辛、磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺二甲异噁唑(Sulfanilimide)、柳氮磺胺吡啶、磺胺异噁唑、磺酰胺基柯衣定、特地唑胺、替考拉宁、泰斯巴汀、特拉万星、泰利霉素、替马沙星、替莫西林、四环素、甲砜霉素、替卡西林、替卡西林/克拉维酸盐、替卡西林/克拉维酸、替加环素、替加环素(Bs)、替硝唑、TMP/SMX、妥布霉素、特地佐利、甲氧苄啶(Bs)、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、醋竹桃霉素、曲伐沙星、万古霉素及其泛型或其变体。
与微生物的相互作用影响微生物表面上的负电荷且受微生物表面上的负电荷影响的抗微生物剂包括：聚阳离子氨基糖苷类，其在结合细胞表面时置换Mg2+离子，其桥接脂质膜组分，从而破坏外膜并增强药物摄取；阳离子多粘菌素(粘菌素和多粘菌素B)，其与微生物细胞的结合也依赖于膜的负电荷，并且通过减少膜负电荷发生突变和质粒两者介导的对其的抗性；和达托霉素，一种脂肽，其类似于宿主先天免疫反应阳离子抗微生物肽并且需要Ca2+和磷脂酰甘油作为其破坏膜的作用机制，并且对其的抗性也可涉及细胞表面电荷的改变。
当微生物为真菌时，示例性的抗微生物剂包括5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine)、阿巴芬净、阿巴康唑、烯丙胺类、两性霉素B、氟胞嘧啶(Ancobon)、阿尼芬净、唑、秘鲁香脂、苯甲酸、联苯苄唑、布康唑、杀假丝菌素、卡泊芬净、环匹罗司、克霉唑、Cresemba、结晶紫、大扶康、棘白菌素类、益康唑、艾氟康唑、氟环唑、芬替康唑、菲律宾菌素、氟康唑、氟胞嘧啶(Flucytosine)、灰黄霉素(Grifulvin)V、灰黄霉素(Griseofulvin)、Gris-Peg、卤普罗近、哈霉素、咪唑类、艾沙康唑、艾沙康唑鎓、异康唑、伊曲康唑、酮康唑、疗霉舒、卢立康唑、米卡芬净、咪康唑、纳他霉素、诺科飞、制霉菌素、奥莫康唑、Onmel、Oravig、奥昔康唑、泊沙康唑、丙环唑、雷夫康唑、龟裂霉素、舍他康唑、斯皮仁诺(Sporanox)、硫康唑、特比萘芬、特康唑、噻唑类、硫代氨基甲酸酯抗真菌剂、噻康唑、托萘酯、三唑类、十一碳烯酸、威凡(Vfend)、伏立康唑及其泛型或其变体。
当微生物为原生动物时，示例性的抗微生物剂包括8-氨基喹啉、乙酰胂胺、针对变形虫界的药物、臭椿酮、阿莫地喹、两性霉素B、安普罗铵、抗毛滴虫剂、除疟霉素、胂噻醇、蒿醚林酸、蒿甲醚、蒿甲醚/苯芴醇、青蒿素、蒿乙醚、青蒿氧烷、青蒿琥酯、青蒿琥酯/阿莫地喹、阿托伐醌、阿托伐醌/氯胍、阿扎硝唑、阿奇霉素、苄硝唑、溴羟喹啉、布帕伐醌、卡巴胂、卡硝唑、喹碘方、氯喹、氯丙胍、氯丙胍/氨苯砜、氯丙胍/氨苯砜/青蒿琥酯、氯喹那多、囊泡藻界抗寄生虫药、金鸡纳、Cipargamin、克拉珠利、克立法胺、克清诺、球虫抑制药、Codinaeopsin、Cotrifazid、白叶藤碱、环氯胍、去氢依米丁、双苯他胂、二氢青蒿素、二氯尼特、重氮氨苯咪、双硫仑、多西环素、依洛尼塞、ELQ-300、依米丁、依托法胺、古虫界抗寄生虫药、夫马菌素、呋喃唑酮、甘铋胂、GNF6702、卤泛群、羟氯喹、咪多卡、异丙硝唑、金鸡纳[树]皮(Jesuit's bark)、KAF156、苯芴醇、马度米星、甲氟喹、Megazol、葡甲胺锑酸盐、美拉胂醇、麦帕克林、甲硝哒唑、米替福新、神经降压素(Neurolenin)B、尼卡巴嗪、硝呋莫司、尼莫拉唑、硝苯胂酸、两面针碱、硝呋醛、奥里发新(Olivacine)、奥硝唑、乳清群海绵定(Oroidin)、扑疟喹、巴龙霉素、戊烷脒、五价含锑药物、泛喹酮、氧二苯脒、哌喹、伯氨喹、氯胍、项目523、普罗硝唑、乙嘧啶、咯萘啶、喹法米特、奎宁、罗硝唑、Schedula Romana、SCYX-7158、塞克硝唑、塞马莫德、葡萄糖酸锑钠、螺环吲哚酮(Spiroindolone)、磺胺多辛、磺胺多辛-乙嘧啶、磺胺林、苏拉明、他非诺喹(Tafenoquine)、替克洛占、替诺尼唑、甲溴羟喹、替硝唑、三甲曲沙、杀锥虫剂、Warburg酊剂及其泛型或其变体。
抗微生物剂可为通过类似于本文所述的药物的机制起作用的药物。本领域已知的其他抗微生物药物可用于本文所述的方法中。
液体悬浮液
液体可包括生长培养基，比如阳离子调节的Mueller Hinton肉汤(MHB)。该培养基可含有本领域技术人员已知的促进微生物生长和稳定性的添加剂。除不同的抗微生物剂之外，不同的测试孔可含有已知的改进特定抗微生物剂的AST准确度的添加剂。例如，可将另外的氯化钠加入到包含苯唑西林的测试中，并且可将另外的钙加入到包含达托霉素的测试中。
生物样品
本文所述的微生物可源自生物样品。在一些实施方案中，生物样品为含有微生物(例如细菌和真菌细胞)的任何样品。生物样品可源自临床样品。
示例性生物样品可包括(但不限于)全血、血浆、血清、痰液、尿液、粪便、白血细胞、红血细胞、血沉棕黄层、泪液、粘液、唾液、精液、阴道液、淋巴液、羊水、脊髓或脑脊液、腹膜渗出物、胸腔渗出物、渗出液、点状物质、上皮涂片、活检样品、骨髓样品、来自囊肿或脓肿的液体、滑液、玻璃体或房水、洗眼液或吸出物、支气管肺泡灌洗液、支气管灌洗液或肺灌洗液、肺吸出物、以及器官和组织(包括(但不限于)肝、脾、肾、肺、肠、脑、心脏、肌肉、胰腺等)、拭子(非限制性地包括伤口拭子、口腔拭子、咽喉拭子、鼻拭子、阴道拭子、尿道拭子、宫颈拭子、直肠拭子、病灶拭子、脓肿拭子、鼻咽拭子等)及其任何组合。还包括细菌培养物或细菌分离物、真菌培养物或真菌分离物。普通技术人员还可意识到，从任何以上示例性的生物样品获得的分离物、提取物或材料也处于本发明的范围内。
得自生物样品的微生物可如本领域常规进行的那样进行培养或者处理。
AST方法中使用的对照
对照可包含微生物不敏感的抗微生物剂。例如，如果测定用于确定革兰氏阳性细菌的敏感性，则对照(和测试温育)可包含一种或多种靶向革兰氏阴性细菌的抗微生物剂，和如果测定用于确定真核微生物的敏感性，则对照(和测试温育)可包含一种或多种抗细菌的抗微生物剂。
在一些实施方案中，对照为在除了没有抗微生物剂或者含有一种或多种微生物不敏感的抗微生物剂之外其他条件相同的条件下从微生物测量的阳性对照。在一些实施方案中，在除了没有营养物之外其他条件相同的条件下从微生物测量对照。在一些实施方案中，在含有一种或多种已知抑制微生物生长的毒素并且其他条件相同的条件下从微生物测量对照。
在一些实施方案中，对照为阴性对照。阴性对照可为除了缺少至少一种组分之外与测定的其余部分设置相同的对照。在大多数情况下，阴性对照没有微生物，其他一切都与测定设置的其余部分相同。在一些测定中，存在背景对照。
对照可为历史对照。在一些实施方案中，在进行对照温育之后进行测试温育。在一些实施方案中，对照在与包含测试温育的盒不同的盒中进行。
自动化AST方法
本文所述的方法可使用市售可得到的设备、定制设备或其组合以自动化方式进行。使方法自动化使得能够进行更多的测定以及增加测定之间的一致性。自动化还可提高这些方法的速度和分辨率。
表面结合探针测定
表面结合测定(也称为表面结合探针测定)可利用信号传导剂。信号传导剂一般地包含能够与微生物结合的部分(例如与微生物表面结合的抗体和/或凝集素、与微生物表面非特异性结合的荷电部分和/或功能部分)和能够提供信号或有助于产生信号的化学部分(例如酶化学发光团和镧系元素螯合物)。示例性的酶包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶及其组合。
信号生成剂可包括一种或多种与一种或多种微生物受体缀合的化学部分。信号生成剂包括(但不限于)一种或多种催化剂(包括酶、金属氧化物纳米颗粒、有机金属催化剂、设计用于信号放大的纳米颗粒(比如本申请要求优先权且通过参考以其全部结合的美国临时申请所述的那些)、包含信号生成元件的噬菌体、荧光团(包括有机荧光团、含有铕或钌(II)、铼(I)、钯(II)、铂(II)的有机金属化合物)和/或比色染料(包括有机染色剂)。可使用以上的组合，比如纳米颗粒、树枝状分子和/或具有酶、荧光团和/或有机金属分子的其他纳米级结构。
可在使信号传导剂与微生物接触之前，信号传导剂最初与微生物接触的同时，或在信号传导剂已与微生物接触之后，使化学部分与信号传导剂缀合。
当将信号传导剂加入到含有微生物的AST稀释液中时，信号传导剂受体(例如可特异性或非特异性地与微生物结合的部分)可与微生物表面缔合。因此，微生物越完整，例如，在溶液中，与这些细菌缔合的信号传导剂的数目越大。因此，在完整细菌的数目和溶液中“游离”的信号传导剂的数目(如由未与完整细菌结合的那些所定义)之间存在反比关系。注意到，如果例如微生物响应于抗微生物剂处理而裂解，则游离的信号传导剂可与可溶性微生物组分结合。
与微生物表面缔合和/或插入微生物表面的信号传导剂的数目与微生物表面积成正比。微生物表面积与真正的抗性微生物密切相关。具体地讲，在响应于MIC和亚MIC浓度的抗微生物剂而膨胀或伸长的微生物(例如形成长丝的细菌)的情况下，已知代谢和/或体积鉴定给出对于“快速”AST时间点(定义为少于6小时的那些)的假敏感性概况。为了克服这种限制，本发明将微生物表面积(而不是体积)转化为可测量的信号，比如光学信号。本文所述的方法能够在少于6小时内准确地确定微生物抗性概况。
为了使与微生物缔合和/或插入微生物的信号传导剂与游离的信号传导剂分开，进行一个或多个分离和/或竞争性结合步骤可为必要的。这种步骤包括(但不限于)离心(例如以g-力>500 × g)、过滤(例如经具有小于或等于0.45微米或者小于或等于0.2微米的孔的过滤器)、电泳和/或磁性捕获；这种步骤为本领域的技术人员熟知的。
为了促进信号传导剂结合和/或减少背景，可进一步有利的是在添加信号传导剂之前使微生物与其在温育期间悬浮于其中的液体分离。这种分离可包括(但不限于)离心、过滤、电泳和/或磁性捕获。
信号传导剂可与微生物和/或抗微生物剂一起添加，使得它们在整个AST温育期均存在。该总时段可长达24小时，或在8小时内，或在5小时内。或者，可将信号传导剂在规定的温育期之后添加至微生物和抗微生物剂中。该时段可长达24小时，或在8小时内，或在4小时内。
信号传导剂被设计成与微生物表面(包括壁和/或膜)缔合和/或插入微生物表面(包括壁和/或膜)。设计用于缔合的信号传导剂包含结合部分，包括(但不限于)一种或多种抗体、凝集素、其他蛋白、具有一个或多个荷电化学基团的小分子、具有一个或多个功能性化学基团的小分子、噬菌体、糖蛋白、肽、适体、荷电小分子、具有固定电荷的小分子、荷电聚合物、具有固定电荷的荷电聚合物、疏水性小分子、荷电肽、具有固定电荷的荷电肽、具有交替的亲水性和疏水性区域的肽和/或小分子配体，其可能是或可能不是有机金属络合物。设计用于微生物缔合的分子为本领域的技术人员熟知的。信号传导剂可保持与微生物结合和/或可内化，因此包括所有缔合。设计用于插入的信号传导剂可包括(但不限于)小疏水性分子、疏水性肽和/或具有交替的疏水性和亲水性区域的肽。设计用于微生物插入的分子为本领域的技术人员熟知的。信号传导剂可进一步地为对于一种或多种类型的微生物特异性的。信号传导剂可具有多种受体。这些可增强结合和/或使得能够同时与两种或更多种微生物结合，这可进一步用于“凝集”细菌。在添加信号传导剂之前或同时，调节溶液pH可为有利的。这可能有益于增强微生物和信号传导剂之间的电荷-电荷相互作用。通过将溶液pH滴定至高于中性(更碱性)，可增加微生物的阴离子电荷。因此，使用具有一种或多种固定的阳离子电荷的部分可为有益的。
值得注意的是，信号传导剂可特异性地与微生物结合(例如特异性地与微生物种类或微生物菌株结合的抗体)或者可非特异性地与微生物结合(例如通过通用的共价或非共价键形成和本领域已知的另一种非特异性化学缔合)。
或者，可将能够与信号传导剂缔合的化学品和/或生物化学品添加至微生物在生长期间悬浮于其中的液体中，使得化学品和/或生物化学品在温育期间纳入到微生物中。这可用于增强信号传导剂与微生物的缔合。在备选实施方案中，信号传导剂本身可存在于微生物在温育期间悬浮于其中的液体中，并且可在生长期间纳入到微生物中。
信号传导剂可包含放大器信号生成剂(放大器基团)，使得来自每个完整微生物的信号可被放大超过与每个微生物缔合的信号传导剂的数目。例如，已知酶辣根过氧化物酶(HRP)能够使信号放大>1×104倍。因此，如果100个HRP分子与每个微生物表面结合，则可实现106的放大。这可通过使得能够区分无法以其他方式区分的微生物浓度来增加进行AST测定的速度。铕制剂的使用类似地提供信号放大。
或者，信号传导剂可包含本领域的技术人员已知为膜染料的光学染料前体，其被设计成在插入疏水性区域(比如细胞膜)时大大增加荧光发射。用这些信号传导剂设计的测定可能需要将微生物浓缩成较小的体积，接近平面，以产生足够的信号以易于进行光学测量。干扰物质可能需要使用近-IR荧光团。
示例性的放大器基团包括例如国际公开号WO 2016/015027和在国际申请号PCT/US 16/42589所述的那些，其各自通过参考以其全部结合。放大器基团可包含催化剂、荧光团、比色染料、酶、催化剂或纳米颗粒。示例性的荧光团包括国际申请号PCT/US 16/42589的表1所述的那些，其通过参考以其全部结合。放大器基团可包含镧系元素。镧系元素包括(但不限于)铕、锶、铽、钐或镝。
放大器基团可包含有机荧光团，例如配位络合物。配位络合物可为铕配位络合物、钌配位络合物、铼配位络合物、钯配位络合物、铂配位络合物。放大器可包含化学发光团、量子点、酶、铁配位催化剂、铕配位络合物、钌配位络合物、铼配位络合物、钯配位络合物、铂配位络合物、钐配位络合物、铽配位络合物或镝配位络合物。
在一些实施方案中，放大器基团包含其为以下的部分：
或
。
在一些实施方案中，放大器基团包含其为以下的部分：
或
。
放大器基团可包含荧光团或比色染料。合适的荧光团和比色染料为本领域的技术人员熟知的，并且描述于The Molecular Probes® Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 11th Ed. (2010)和Gomes, Fernandes, and LimaJ. Biochem. Biophys. Methods 65 (2005) pp 45-80和Manafi, Kneifel, and BascombMicrobiol. Rev. 55 (1991) pp 335-348中，其通过参考以其全部结合至本文中。示例性的荧光团还包括例如国际公开号WO 2016/015027和国际申请号PCT/US 16/42589所述的那些，其各自通过参考以其全部结合。
合适的荧光团或比色染料的实例包括(但不限于)溴化乙锭、碘化丙锭、SYTOX绿、菲啶类、吖啶类、吲哚类、咪唑类、花青、TOTO、TO-PRO、SYTO、5-羧基-2,7-二氯荧光素、5-羧基荧光素(5-FAM)、5-羧基萘基荧光素、5-羧基四甲基罗丹明(5-TAMRA)、5-FAM (5-羧基荧光素)、5-HAT (羟基色胺)、5-ROX (羧基-X-罗丹明)、6-羧基罗丹明6G、7-氨基-4-甲基香豆素、7-氨基放线菌素D (7-AAD)、7-羟基-4-甲基香豆素、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶、ACMA(9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶)、吖啶类、Alexa Fluors、茜素、别藻蓝蛋白(APC)、AMCA (氨基甲基香豆素)、Bodipy、羧基-X-罗丹明、儿茶酚胺、荧光素(FITC)、羟基香豆素、丽丝胺罗丹明、单溴二胺、俄勒冈绿、藻红蛋白、SYTO、硫杂二羰花青(DiSC3)、硫磺素、X-罗丹明、C或四甲基罗丹明异硫氰酸酯。
放大器基团可包含有机金属化合物、过渡金属络合物或配位络合物。这种放大器基团的实例包括(但不限于) EP 0180492、EP 0321353、EP 0539435、EP 0539477、EP0569496、EP 139675、EP 64484、US 4283382、US 4565790、US 4719182、US 4735907、US4808541、US 4927923、US 5162508、US 5220012、US 5324825、US 5346996、US 5373093、US5432101、US 5457185、US 5512493、US 5527684、US 5534622、US 5627074、US 5696240、US6100394、US 6340744、US 6524727、US 6717354、US 7067320、US 7364597、US 7393599、US7456023、US 7465747、US 7625930、US 7854919、US 7910088、US 7955859、US 7968904、US8007926、US 8012609、US 8017254、US 8018145、US 8048659、US 8067100、US 8129897、US8174001、US 8183586、US 8193174、US 8221719、US 8288763、US 8362691、US 8383249、US8492783、US 8632753、US 8663603、US 8722881、US 8754206、US 8890402、US 8969862、US9012034、US 9056138、US 9118028、US 9133205、US 9187690、US 9193746、US 9312496、US9337432、US 9343685、US 9391288和US 9537107中描述的那些，其通过参考以其全部结合。示例性的有机金属化合物、过渡金属络合物或配位络合物还包括例如国际公开号WO 2016/015027和国际申请号PCT/US 16/42589所述的那些，其各自通过参考以其全部结合。
在一些实施方案中，放大器基团为镧系元素配位络合物，比如镧系元素(例如Eu或Tb)和四齿配体之间的络合物或镧系元素(例如Eu或Tb)和穴状配体之间的络合物。在一些实施方案中，放大器基团为镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Pm)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、镥(Lu)、钌(Ru)、铑(Rh)、钯(Pd)、锇(Os)、铱(Ir)或铂(Pt)的配位络合物。在一些实施方案中，放大器基团为稀土金属的配位络合物，其共同指由从原子序数为57的镧到原子序数为71的镥的15种元素的组(镧系元素)和由原子序数为21的钪和原子序数为39的钇组成的两种另外元素组成的17种元素。稀土金属的具体实例包括铕、铽、镧、铈、镨、钕、钷、钐、钆、镝、钬、铒、铥、镱、镥、钪和钇。在一些实施方案中，放大器基团为镧系元素(例如铕或铽)与二亚乙基三胺四乙酸或穴状配体的配位络合物。
信号传导剂的具体实例包括(但不限于)包含以下的部分：
Eu-穴状化合物-马来酰亚胺
Eu-穴状化合物-NHS
Eu-穴状化合物-二胺
Eu-N1-ITC (Delfia)
Eu-N1-DTA
Eu-N1-氨基
Eu-N1-碘乙酰胺基
或
。
信号传导剂可包含发光团(供体)，其特征在于发光量子效率高和发光衰减时间长(> 100 ns)。示例性的发光团为钯、铑、铂、钌、锇、稀土(特别是铕和镧)的阳离子、金属有机络合物。这些金属有机络合物的有机部分可由例如来自卟啉类、联吡啶类、菲咯啉类或其他杂环化合物的组的配体组成。
在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含抗体(例如单克隆或多克隆)、修饰的抗体(例如生物素化的单克隆抗体、生物素化的多克隆抗体、铕螯合物-抗体、辣根过氧化物酶缀合的抗体)、抗体变体(例如Fab：片段，抗原结合(单臂)；F(ab')2：片段，抗原结合，包括铰链区(双臂)；Fab'：片段，抗原结合，包括铰链区(单臂)；scFv：单链可变片段；二-scFv：二聚单链可变片段；sdAb：单结构域抗体；双特异性单克隆抗体；三功能抗体；和BiTE：双特异性T细胞接合物)、WGA-生物素、多粘菌素B-生物素、凝集素、天然肽、合成肽、合成和/或天然配体、合成和/或天然聚合物、合成和/或天然糖聚合物、碳水化合物结合蛋白和/或聚合物、糖蛋白结合蛋白和/或聚合物、荷电的小分子、其他蛋白、噬菌体和/或适体。
在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含结构或由结构形成，所述结构包含抗体、凝集素、天然肽、合成肽、合成和/或天然配体、合成和/或天然聚合物、合成和/或天然糖聚合物、碳水化合物结合蛋白和/或聚合物、糖蛋白结合蛋白和/或聚合物、荷电的小分子、其他蛋白、噬菌体和/或适体。
在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含放大器基团，其包含镧系元素配位络合物和/或酶和链霉亲和素和/或抗体和/或适体。在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含结合部分，其包含多克隆和/或单克隆抗体。
在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含结合部分，其包含修饰的抗体。示例性的修饰的抗体包括生物素化的单克隆抗体、生物素化的多克隆抗体、铕螯合物-抗体和辣根过氧化物酶缀合的抗体。在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含结合部分，其包含抗体变体。示例性的抗体变体包括Fab：片段，抗原结合(单臂)；F(ab')2：片段，抗原结合，包括铰链区(双臂)；Fab'：片段，抗原结合，包括铰链区(单臂)；scFv：单链可变片段；二-scFv：二聚单链可变片段；sdAb：单结构域抗体；双特异性单克隆抗体；三功能抗体；和BiTE：双特异性T-细胞接合物)。
在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含WGA-生物素或多粘菌素B-生物素。在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含结合部分，其包含合成和/或天然配体和/或肽。在一些实施方案中，配体和/或肽选自双(锌-二甲基吡啶胺)、TAT肽、丝氨酸蛋白酶、导管素(cathelicidins)、阳离子糊精、阳离子环糊精、水杨酸、赖氨酸及其组合。在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含结合部分，其包含合成和/或天然聚合物和/或糖聚合物。在实施方案中，天然和/或合成聚合物为直链或支链的并且选自支链淀粉、聚(N-[3-(二甲基氨基)丙基]甲基丙烯酰胺)、聚(亚乙基亚胺)、聚-L-赖氨酸、聚[甲基丙烯酸2-(N,N-二甲基氨基)乙基酯]及其组合。在一些实施方案中，天然和/或合成聚合物和/或糖聚合物包含部分，其包括(但不限于)壳聚糖、明胶、葡聚糖、海藻糖、纤维素、甘露糖、阳离子葡聚糖和环糊精、季胺、吡啶鎓三溴化物、组氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、精氨酸、锍、鏻或其组合，包括(但不限于)共嵌段、接枝和交替聚合物。在一些实施方案中，能够结合微生物表面的信号传导剂包含结合部分，其包含选自甘露糖结合凝集素、其他凝集素、膜联蛋白及其组合的糖蛋白。
在一些实施方案中，能够与微生物表面结合的信号传导剂包含：抗体；和铕配位络合物。在一些实施方案中，能够与微生物表面结合的信号传导剂包含接头基团L，其包含NH2-PEG-生物素(2K)、NH2-PEG-生物素(4K)、磺基-NHS-生物素、WGA-生物素或多粘菌素B-生物素。在一些实施方案中，能够与微生物表面结合的信号传导剂包含铕络合物，其包含：
或
。
在一些实施方案中，能够与微生物表面结合的信号传导剂包含铕络合物，其包含：
或。
AST方法的示例性优点
本文所述的方法的方面可通过进行多种生长测定来提供准确、低成本的表型AST结果，以确定哪种抗微生物剂对给定的微生物最有效。本文的方法可提供适当浓度的给定的有效抗微生物剂用于处方目的。在一些实施方案中，方法提供产生用于治疗由给定微生物引起的患者感染的推荐。如本文所讨论的，患者可为可用作生物样品或样本的来源的宿主。在某些方面，供体为脊椎动物，其旨在表示任何动物种类(例如哺乳动物物种，比如人类)。在某些实施方案中，“患者”为任何动物宿主，包括(但不限于)人和非人灵长类、禽类、爬行动物、两栖动物、牛、犬、山羊、cavities、乌鸦(corvines)、epines、马、猫、山羊类(hircines)、兔(lapines)、野兔(leporines)、狼(lupines)、绵羊类(ovines)、猪类(porcines)、racines、狐狸(vulpines)等，非限制性地包括驯养牲畜、放牧或迁徙动物或鸟类、外来物种或动物样本，以及伴侣动物、宠物和在兽医师护理下的任何动物。
在一些实施方案中，本文的方法供在少于8小时、少于6小时、少于5小时或少于4小时内来自标准微生物菌落分离物或直接来自阳性血液样品的低成本表型AST。这允许标准临床微生物学实验室同移、表型AST结果。这可使目前的等待时间缩短超过20个小时，并可与目前接近FDA试验的直接来自阳性血液培养MALDI-TOF鉴定以及已经获得FDA批准的直接来自阳性血液培养多重PCR鉴定平台相匹配。在一些实施方案中，该设计使得本文所述的方法(“快速-AST”平台)能够打破传统的速度与成本的权衡。方法可与标准微孔板形式(例如具有6、12、24、48、96、384或1536个孔)和常规光学检测器两者兼容。
具有速度和准确性的入侵病原体的鉴定和抗微生物剂敏感性测试(AST)使得能够及时给予最有效的治疗剂。这种治疗可改善感染，减少住院患者的住院时间和缩短患者经受广谱抗微生物剂的时间，后者有助于抗微生物剂抗性的全球流行。相比之下，目前接受的对于微生物鉴定和敏感性结果的超过30小时的等待需要过度使用广谱抗微生物剂和比必要的患者停留时间更长。由于这个原因，抗击抗生素抗性细菌的总统咨询委员会最近使得开发和使用快速诊断用于检测抗生素抗性细菌是其主要目标之一。
感染患者的治疗
本文所述的方法可提供治疗患有由微生物引起的感染的患者。AST测定可使得健康护理专业人员或诊断科学家向患者推荐期望的作用过程或治疗方案。在一些实施方案中，如本发明所提供的，更快速和更准确地给出推荐。用于治疗感染的推荐可包括选择特定的抗微生物剂或抗微生物剂的组合或这种抗微生物剂的剂量。在一些实施方案中，基于MIC和/或QSR结果向医生提供或由医生生成这种推荐。
任何以上方面和实施方案可与如附图、概述和/或详述(包括以下实施例)所公开的任何其他方面或实施方案组合。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应解释为限制。使用不超过常规实验，本领域的技术人员将认识到或者能够确定本文所述的特定物质和程序的许多等同物。这种等同物旨在包含在以下实施例之后的权利要求的范围内。
实施例1：平行抗微生物剂敏感性测定
该实施例描述了平行进行的多种抗微生物剂敏感性测定(例如共具相同的温育期)。
将微孔板(每孔包含100 μL Mueller Hinton Broth (MH))用制备的抗微生物剂稀释液接种，并在35℃下温育3小时45分钟。3小时45分钟之后从振荡的温育箱中取出微孔板，并向每孔中加入10 μL AlamarBlue®。然后将微孔板放回温育箱中1小时。当从振荡的温育箱中取出微孔板时，在BioTek H1读板器上读取孔的荧光(激发560/发射590 nm)。然后，将100 μL包含乙二胺四乙酸和十六烷基三甲基溴化铵的洗涤剂溶液加入到两个微孔板的每孔中。然后将两个微孔板以300 rpm振荡10分钟，随后以2500×g离心2.5分钟以沉淀。然后吸出MH肉汤并向两个微孔板的每孔中加入100 μL的25 mM PBS。然后向每孔中加入10μL的化学部分(此处为0.005%戊二醛)，随后向每孔中加入10 μL的铕-穴状化合物制剂(作为信号传导剂) (20 ng /孔)。然后将两个微孔板以300 rpm振荡30分钟。之后，将两个板以30 2500×g离心2.5分钟以沉淀。吸出溶液，并向每孔中加入200 μL PBS-tween洗涤液，随后离心以沉淀。在吸出溶液之后，发生第二次相同的200 μL PBS-吐温洗涤，随后进行最后离心以沉淀。向每孔中加入200 μL PBS-吐温。然后在BioTek H1读板器上使用时间分辨荧光读取板。
表3显示关于确定20种不同的抗微生物剂对各种大肠杆菌(E. coli)菌株的最小抑制浓度(MIC)而言，与CLSI过夜方法相比较进行代谢探针测定和表面结合测定两者的结果。去除识别信息的分离的临床大肠杆菌(E. coli)菌株得自疾病控制中心(CDC)和BEIResources (根据美国典型培养物保藏中心(ATCC)的合同管理)以及其他来源。CLSI参考方法确定的MIC以粗体给出，并且2个快速测定中的每一个的结果以“ok”(完全匹配)、“抗性”(MIC大于参考值> 1稀释度)或“敏感”(MIC低于参考值<1稀释度)给出。数据显示，使用两种不同的测定有助于确保准确快速的AST结果。
表3
实施例2：检查点测定可用于确定足够的微生物生长
该实施例表明，检查点测定可确定微生物的生长。
生长指示剂可抑制温育期间的微生物生长。
在存在和不存在刃天青(alamarBlue®)的情况下，将细菌接种至包含阳离子调节的Mueller Hinton肉汤的96孔微孔板中，并在35℃下温育4小时。对于未与刃天青一起温育的孔，在温育4小时之后立即加入生长指示剂。将BacTiter-Glo®试剂(Promega, Madison,WI)加入到所有孔中并测量发光。如果细菌在存在刃天青的情况下温育，则在添加BacTiter-Glo®后观察到的发光信号少于未在存在刃天青的情况下温育细菌的孔，表明存在较少的活细菌。图1显示，尽管当在温育期间于孔中包含刃天青时可加速获得AST结果的时间，但其可对微生物生长具有抑制作用。因此，在温育期间从测试孔中去除生长指示剂可为有利的。
由于细菌菌株缓慢生长，AST结果的终点测量受到限制。
图2描绘在存在氨苄青霉素、庆大霉素和左氧氟沙星的情况下缓慢生长的临床金黄色葡萄球菌(S. aureus)菌株的CLSI过夜参考方法的肉汤微量稀释AST结果的照片，其中MIC称为没有可见细菌生长的特定抗生素的最低稀释度。如果使得测定能够运行过夜，这就是MIC的称谓方式。
图3描绘各种临床金黄色葡萄球菌(S. aureus)细菌菌株(包括缓慢生长的金黄色葡萄球菌(S. aureus)菌株)之间生长速率的差异。使用包含阳离子调节的Mueller Hinton肉汤的96孔微孔板，通过将菌落稀释到盐水中以达到McFarland值为0.5 (其使用分光光度计进行验证)来制备细菌。将其以1:20稀释到盐水中，并向每孔中加入10 μl接种物。伴随以150 rpm振荡，将接种的板在35℃下温育3小时45分钟。该温育之后，将阳离子磁珠和抗金黄色葡萄球菌(S. aureus)抗体(与辣根过氧化物酶缀合)加入到每孔中并温育20分钟。使用自动化洗板机，捕获磁珠，并用PBS-Tween 20 (0.1%)将每孔的内容物洗涤3次。加入TMB并使得温育15分钟，之后通过加入1 M硫酸终止反应。测量每孔在450 nm处的吸光度。图3中的数据显示测量来自阳性生长孔的吸光度信号与在抑制生长(无营养物)孔中测量的吸光度的比率。任何信号比> 1表示已发生细菌生长，并且数字越大表明已经发生越多的细菌生长。
这种缓慢的生长会产生错误或不完整的结果，因为微生物没有足够的时间生长，并且因此，它们对抗微生物剂的反应无法得到有效评价。对于破坏微生物的测定，该问题可能特别严重，因为不能进行进一步的测试。
检查点生长测定可确定足够的微生物生长
图4A和4B显示生长指示剂提供来自检查点测试孔的可测量信号，其可用作通过终点测定测量的生长的指标。使用包含阳离子调节的Mueller Hinton肉汤的96孔板，通过将菌落稀释到盐水中以达到McFarland值为0.5 (其使用分光光度计进行验证)来制备细菌。将其以1:20稀释到盐水中，并向每孔中加入10 μl接种物。将生长指示剂刃天青加入到预定的检查点测定孔中。伴随以150 rpm振荡，将接种的板在35℃下温育3小时45分钟。该温育之后，从包含刃天青的孔测量荧光(激发560/发射590 nm)。图4A (刃天青)中的数据表示为在阳性生长对照孔中测量的荧光与未接种的孔中测量的荧光的比率。任何信号比> 1表示已发生细菌生长。阳性生长阈值对照孔包含生长肉汤和微生物以及生长指示剂但不含抗微生物剂。图4B (表面结合)描绘通过表面结合的细菌定量，其中将阳离子磁珠和抗金黄色葡萄球菌(S. aureus)抗体(与辣根过氧化物酶缀合)加入到每孔中并温育20分钟。使用自动化洗板机，捕获磁珠，并用PBS-Tween 20 (0.1%)将每孔的内容物洗涤3次。加入TMB并使得温育15分钟，之后通过加入1 M硫酸终止反应，并测量每孔在450 nm处的吸光度。图4B中的数据表示为在阳性生长检查点孔中测量的吸光度与在抑制生长(无营养物)孔中测量的吸光度的比率。任何信号比> 1表示已发生细菌生长。
图5显示快速生长和缓慢生长的临床金黄色葡萄球菌(S. aureus)菌株两者的检查点测定结果和对生成的AST测定结果的影响。将接种孔中的alamarBlue® (刃天青)信号与未接种孔的比率用作生长检查点以确定AST测定是否已准备好进行处理。
如图5所示，缓慢生长的金黄色葡萄球菌(S. aureus)菌株从3小时45分钟的温育期后进行的AST测定中未产生可辨别的MIC测定。在接种之后3小时45分钟用两种金黄色葡萄球菌(S. aureus)菌株进行快速AST。在此期间，将每菌株的一个孔接种为“检查点孔”并包含alamarBlue® (起细胞生长量度作用的生长指示剂)。快速生长的菌株显示接种样品与未接种样品的alamarBlue®信号比为2.58。缓慢生长的菌株显示alamarBlue®信号比为1.15。快速生长的金黄色葡萄球菌(S. aureus)菌株在处理之前具有较高的生长检查点比率(alamarBlue®比率(细菌：对照) = 2.58)，在处理的AST测定中得到更明确的MIC数据，而缓慢生长的菌株具有较低的生长检查点比率(alamarBlue®比率(细菌：对照) = 1.15)，并且产生不太决定性的MIC数据。缓慢生长的金黄色葡萄球菌(S. aureus)菌株的不可分辨的MIC数据显示该样品在检查点阶段不会被核准继续进行AST处理，而是将其放回温育箱中进行进一步温育期。
图6显示使用3种铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)菌株作为示例性细菌的类似结果，当在细菌达到一定生长检查比值进行测试时，AST测试显示出改进的和决定性的MIC数据。通过探针的表面结合随后进行时间分辨荧光来进行AST。将铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)菌株在振荡条件下于35℃下温育4小时以获得生长，并通过在生长4小时之后测量培养物在600 nm处的吸光度来进行生长检查。在生长检查点值为1.13时，菌株2对于阿米卡星(AMK)未显示出可靠的MIC数据(其预计为8)。另一方面，在生长检查值较高为2.18时，菌株1呈现出可靠的MIC为8。类似地，菌株3在生长检查值1.25时显示出可靠性。
图7表明，对于两种铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)菌株，使用光密度测量获得的生长检查比值与CFU值一致，其中，具有较高生长检查比值的菌株具有较高的CFU值。将两种铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)菌株接种于100 μl MHB中，并使得在振荡条件下于35℃下生长4小时。测定接种孔中600 nm波长处的细菌培养物的光密度(OD)与未接种孔的比率。进行培养物的连续稀释，并将10 μl每种合适的稀释液涂于琼脂板上且温育过夜。第二天对形成的菌落计数，并且基于所涂的稀释液计算每孔细菌的菌落形成单位(CFU)。如图所示，观察到两种方法的一致性。
尽管生长指示剂可抑制微生物生长，但它们可通过其在微生物温育期间纳入生长阈值检查点孔来用作不受抑制的生长的指标。
在确定足够的生长后，可确定AST结果
表面结合扩增测定
使用铕穴状化合物分子标记和量化微生物的表面结合扩增测定可用于确定AST结果，如图8所示。将大肠杆菌(E. coli)和金黄色葡萄球菌(S. aureus) (左图)或肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) (右图)以MES缓冲液(pH 6)中的1e5至1e9范围内的浓度在96孔微孔板上接种。向包含细菌的每孔和相应的对照孔中，以66 ng/孔加入铕穴状化合物-二胺(Cisbio)，然后将5%戊二醛溶液加入到包含铕穴状化合物的孔中。使反应液温育30分钟，以便于用所选择的报告分子标记孔内细菌的外部。然后，使用Thermo Scientific HeraeusMultifuge X3以2500 rpm的速度将测试板离心2.5分钟，以使细菌沉淀在板的底部，同时任何未缔合的报告分子留在上清液中。然后使用BioTek Multiflo X洗板机抽吸板，以去除上清液和未反应的报告分子，之后加入洗涤缓冲液。重复该洗涤程序一次以彻底去除任何未反应的报告分子。将包含铕穴状化合物-二胺的孔以读取缓冲液重构，并在BioTek H1读板器上使用时间分辨荧光读取。
代谢探针测定
图9A和9B显示当仅在已达到确定足够的微生物生长的生长阈值之后将代谢探针添加到微孔板上的另外的孔中时，可利用代谢探针来确定AST结果。这使得生长指示剂具有优点没有缺点：信号主要来自活微生物，但是从初始温育期消除生长抑制和毒性作用。使用包含阳离子调节的Mueller Hinton肉汤的96孔板，通过将菌落稀释到盐水中以达到McFarland值为0.5 (其使用分光光度计进行验证)来制备细菌。将其以1:20稀释到盐水中，并向每孔中加入10 μl接种物。在接种时或3小时45分钟之后，将指示剂刃天青加入到特定的孔中。伴随以150 rpm振荡，将接种的板在35℃下温育4小时45分钟。该温育之后，从包含刃天青的孔测量荧光(激发560/发射590 nm)。图9A和图9B中的数据表示为在阳性生长对照孔中测量的荧光与未接种的孔中测量的荧光的比率。如果在初始细菌温育之后加入刃天青，则接种孔中的荧光信号与未接种孔的比率要大得多。
实施例3：温育之前预热盒
该实施例描绘利用红外辐射加热来预热盒。红外预热器的实验装置包括来自VJElectronix (VJ IR-1C)的现成加热装置和用于保持96孔微孔板的定制夹具。热数据采集通过National Instruments CompactDAQ Chassis, National Instruments ResistanceTemperature Device (RTD)模拟模块(NI 9216)和多达8个密封RTD (Omega, HSRTD-3-100-A-40-E)进行。
将RTD插入到期望的孔中，用于通过钻穿微孔板盖的1/8”孔进行测量，并用胶带粘贴以使RTD尖端浸没在每孔内存在的100 μL液体中。除了在盖中钻出插入RTD的通孔以外，板、盖和容积类似于用于标准肉汤微量稀释测试的那些。为了实时记录温度，这种实验适应性是必要的。
在IR-1C预热器上设定期望的预热温度，并打开4个加热器。为了使IR-1C准确地监测其自身温度，从而准确地保持其设定温度，在加热板正上方安装并固定K型热电偶。
一旦加热器处于温度下，将测试微孔板置于弹簧支架内。该夹具将板水平保持在加热罩上方~2 cm处。夹具被设计用于紧密固定微孔板，使其在预热步骤期间不会移动。
图10A中的数据显示加热的速率和均匀性。加热<2分钟之后，测量孔中存在的溶液达到35±1℃的温度。96孔板格式有8行标记为“A”到“H”，和12列标记为“1”到“12”。图10A中的3个点的热数据表示两个相对的边缘孔以及中心孔。
相比之下，标准对流温育箱可能需要20-30分钟才能将96孔板的所有孔从25℃加热到35℃。图10B中的数据为用相同的温度采集硬件和使用具有微孔板适配器的SouthwestScientific IncuShaker Mini获得。如图11中的数据所示，这种温育箱中的堆叠板可进一步导致加热不均匀。由于微生物生长速率随着温度在该范围内的增加而增加，因此2分钟的升温时间比30分钟的升温提供更长的生长期。这有利于缩短基于微生物生长的测定(比如AST)时间。另外，加热的均匀性对于准确性可能是重要的。因此，预热在温育时间内促进合适的细菌生长，以通过本文所述的方法进行AST测定。预热可进一步使得能够在对流温育箱中进行随后的堆叠。
图12A和12B分别显示伴随对两种示例性的细菌种类大肠杆菌(E. coli)和铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)将板预热的细菌生长的改善。将板预热30分钟，或在室温下放置。对于图12A，通过已知的细菌培养方法使大肠杆菌(E. coli)在384孔板上生长，并在600 nm处测定吸光度(光密度，OD)值，且减去未接种的对照孔的相同值，以获得描绘细菌生长的所得的OD值。在图12B的情况下，将两种铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)菌株接种于在预热的384孔板或在室温下放置的相同板中的40 μl阳离子调节的MHB中。在图表中描绘了伴有或不伴有预热的孔板中的细菌生长，显示在减去没有细菌接种物的孔的背景值之后，通过600nm处的吸光度确定的OD值。结果表明，当短期温育2-4小时时将板预热30分钟提供有利或最佳的细菌生长增加，这有利于本方法的目的之一，即减少抗微生物剂敏感性测定的总体实施时间。
实施例4：温育期间搅动盒
将两种代表性的微生物铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)和金黄色葡萄球菌(S. aureus)的稀释液引入到两个标准384孔微孔板中，并将一个微孔板置于温育箱中，温育箱以150 rpm的频率和25 mm半径进行轨道振荡(即搅动)。将另一个微孔板置于温育箱中并保持静止。3小时之后，通过600 nm处的光密度测量确定微生物生长。图13描绘在这些条件下温育的代表性微生物的提高的生长比率。生长比率为与伴随以150 rpm和以25 mm半径振荡温育的同样接种的384孔微孔板相比较，通过在温育期间保持静止的384孔微孔板于600 nm处的光密度测量确定的微生物生长。图14显示在96孔微孔板中实现了类似的生长增强。
通过以不足以提供溶液混合的振荡频率和半径搅动温育的具有横向尺寸<12 mm的孔的AST微孔板，实现了微生物的生长速率提高。
图15A通过在不存在轨道振荡的情况下测量金黄色葡萄球菌(S. aureus)培养物的OD值来提供细菌生长的直接并排比较。除了搅动以外，将细菌在相同条件下于384孔板中进行温育，并通过在生长4小时之后测量600 nm处的OD来确定培养物的吸光度。图15B显示通过测量培养物中的相对ATP水平指示的金黄色葡萄球菌(S. aureus)生长，同时相同的培养物分别经受150 rpm、250 rpm和500 rpm的振荡速度。在该研究中，将细菌接种到384孔板中的40 μl阳离子调节的MHB中。将细菌以指定速度在振荡下于35℃下温育2小时。在温育2小时后，将能够在存在ATP的情况下产生发光信号的试剂Bactiter Glo加入到孔中。信号的强度与培养液中的活细菌的量成比例，并因此表明生长。该数据表明，在给定条件下，轻度至中度的振荡速度最适合于这些细菌的生长，这将使得AST结果更好。
实施例5：四唑鎓类似物用于确定微生物活力的用途
该实施例表明，基于四唑鎓的分子可用作确定微生物活力的代谢探针和生长指示剂。在(1) 用伴随共具相同温育期的表面结合测定运行的代谢探针测定中和/或(2) 仅在已达到确定足够的微生物生长的生长阈值之后将代谢探针添加到微孔板上的另外的孔中时，这些分子可用于确定AST结果。
图16显示当在单个组合板上用铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)测试代谢探针INT时的AST结果。图17-20描绘当与鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)和各种抗生素(例如氨苄青霉素/舒巴坦(图17)、美罗培南(图18)、妥布霉素(图19)和阿米卡星(图20))组合时使用另外的四唑鎓类似物(INT、NDT、DBNPT、TBTB、CTC和TTC)作为代谢探针时的AST结果。用1:20稀释的0.5 MacFarland细菌标准品接种AST板并温育3.5小时。然后向每个板中加入10 μl指示剂(代谢探针)溶液-2 mg/mL的四唑鎓类似物NDT、DBNPT、TBTB、CTC和TTC溶液，0.8 mg/mL的INT溶液或alamarBlue®。使板再温育1小时以产生活细菌的可测量结果并在读板器上读取。读取四唑鎓在490 nm处的吸光度，并在Ex 560/Em 590处读取alamarBlue®的荧光。然后使含有INT的板经受铕测定，以确保没有看到由于不溶性甲臜产物造成的干扰。
图21-24描绘当与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和各种抗生素(例如亚胺培南(图21)、呋喃妥因(图22)、庆大霉素(图23)和四环素(图24))组合时使用另外的四唑鎓类似物(INT、WST-1、WST-3和WST-8)作为代谢探针时的AST结果。用1:20稀释的0.5MacFarland细菌标准品接种AST板并温育3.5小时。然后向每个板中加入10 μl指示剂(代谢探针)溶液-0.5 mM的WST-1、WST-3或WST-8溶液，WST-1细胞增殖溶液、0.8 mg/mL的INT溶液或alamarBlue®。使板再温育1小时以产生活细菌的可测量结果并在读板器上读取。读取四唑鎓在490 nm处的吸光度，并在Ex 560/Em 590处读取alamarBlue®的荧光。
另外，发现对于某些四唑鎓类似物，不需要中间电子载体以实现上述AST结果。为了确定电子载体分子是否对INT还原具有积极作用，测试了几种细菌和电子载体。将大肠杆菌(E. coli)、铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(S. aureus)和克雷伯氏菌(Klebsiella)的细菌溶液(100 μl)接种到4个单独的96孔微孔板(每细菌菌株一个微孔板)的顶行，每孔中含有100 μl MHB II，并沿着板连续稀释，最后一行留下纯MHB。然后将板温育1小时以使得细菌复制。将10 μL的0.8 mg/mL INT溶液或WST-1细胞增殖溶液置于每孔中，随后加入0.5 mM的甲萘醌、1-甲氧基-5-甲基-吩嗪鎓甲基硫酸盐、吩嗪乙基硫酸盐、麦尔多拉蓝或亚甲蓝溶液。然后将板温育1小时，之后测量四唑鎓在490 nm处(对INT)和450nm处(对WST-1)的吸光度。图25-28描绘与标准参考相比较，在存在各种电子载体的情况下细菌稀释曲线的吸光度结果。图25显示大肠杆菌(Escherichia coli)；图26显示铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；图27显示金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；图28显示肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)的稀释曲线。
实施例6：进行MIC确认的双重测定
该实施例显示，对于每个样品使用两种不同测定方法的基于AST的MIC测定可提供比使用任何单一测定更好的确认。基于每个种类的超过30种菌株的算法上所谓数据，准备用于代谢测定或表面结合测定的正确评分%。在该评分系统中，当两种测定的MIC通过一次双倍稀释而彼此不同时，认为已达到基本一致。图29显示两个种类的细菌A. 肺炎克雷伯氏菌(K. pneumonia)和B. 金黄色葡萄球菌(S. aureus)的代谢测定或表面结合测定的正确评分%。如图所示，尽管两种测定之间存在相当大的一致性，但基于所用抗生素的测定之间的正确评分%不同，例如，在图29A中，庆大霉素(GEN)的表面结合测定，显示对于算法上称为MIC的比肺炎克雷伯氏菌(K. pneumonia)的代谢测定具有更好的一致性(95%对83%)。在这种情况下，表面结合测定对于抗微生物剂庆大霉素对微生物肺炎克雷伯氏菌(K. pneumonia)的MIC产生更具决定性，明确和令人信服的结果。另一方面，抗微生物剂头孢曲松(CRO)在代谢测定和表面结合测定两者均显示出高度的准确性，代谢测定与算法上称为MIC的数据达到100%一致。
对于图30A-F所示的对肺炎克雷伯氏菌(K. pneumonia)和金黄色葡萄球菌(S. aureus)的抗生素的更多选择进行了双重测定的进一步详述。在该测定中，基于CLSI指南，用细菌接种AST板。将细菌(图30A-C，克雷伯氏菌属(Klebsiella sp.)和图30 D-F，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))在振荡条件下于35℃下温育3小时并使其生长。温育后，以1:10孔体积加入刃天青试剂并且再温育1小时。以560/590 nm的激发/发射波长获得光谱测量值，其给出代谢测定结果。向每孔中加入100 μl含有1% Tween的PBS中的洗涤剂溶液，并保持振荡状态10分钟。将培养物以2500 x g离心2.5分钟以获得细菌沉淀。吸出上清液，并将沉淀重悬于100 μl含有0.05% Tween的PBS /孔中。加入浓度为5 ng/孔(肺炎克雷伯氏菌(K. pneumonia))或20 ng/孔(金黄色葡萄球菌(S. aureus))的10 μl Eu-Cryptate以及10 μl/孔0.0005%戊二醛并振荡10分钟。将板以2500 x g离心2.5分钟。吸出上清液，并用含0.05% Tween的PBS (200 μl/孔)洗涤2-3次。将沉淀重悬于含有0.05% Tween的PBS(200 μl/孔)中，并通过时间分辨荧光进行荧光测量，以获得结合测定结果。数据显示为对应于相对光单位(RLU)的条形。
在图30A-F中，对于每种抗微生物剂，左图对应于代谢测定结果和右图对应于表面结合测定。每种抗微生物剂的两种测定之间的示例性的不一致在每个图中用箭头指出。如该图所示，每种抗微生物剂的代谢数据和表面结合数据可能取决于对所讨论的微生物的所讨论的抗微生物剂而不同。例如，如图30A所示，与代谢测定相比较，表面结合测定显示庆大霉素对肺炎克雷伯氏菌(K. pneumonia)的更具决定性的MIC，其中细菌的抑制作用随着剂量的增加不太明显。因此，这表明建议至少进行两种测定，以对给定微生物的特定抗微生物剂的MIC做出最佳判断。

Claims (129)

1.一种用于确定微生物的抗微生物剂敏感性的方法，所述方法包括：
- 将一种或多种微生物的悬浮液引入到包含多个室的盒中，其中多个室包含一种或多种抗微生物剂；
- 在促进微生物生长的条件下将所述盒温育初始温育期；
- 在所述盒室的子集中进行一个或多个检查点测定以确定微生物生长是否已达到阈值；和
(a) 如果达到所述阈值，则在多个所述盒室中进行多个不同的生长测定以确定所述微生物对所述一种或多种抗微生物剂的敏感性，并获得最小抑制浓度(MIC)和/或定性敏感性结果(QSR)；或
(b) 如果未达到所述阈值，则在促进微生物生长的条件下进行一个或多个另外的温育期，直至
(i) 达到所述阈值，并且之后进行步骤(a)；或者
(ii) 发生最多18小时而没有达到所述阈值并且不进行进一步的测定。
2.一种用于确定一种或多种微生物的抗微生物剂敏感性的方法，所述方法包括：
进行多个共具至少1.5小时的初始温育期的不同生长测定，其中在完成所述初始温育期之后添加一种或多种探针，每个测定包括在存在一种或多种抗微生物剂的情况下的微生物生长测定；和
基于相对微生物生长确定一种或多种微生物对一种或多种抗微生物剂的抗微生物剂敏感性，并且可获得最小抑制浓度(MIC)和/或定性敏感性结果(QSR)。
3.一种用于确定微生物的抗微生物剂敏感性的方法，所述方法包括：
(a) 将一种或多种微生物的悬浮液引入到包含多个室的盒中，所述多个室包含一种或多种抗微生物剂；
(b) 在促进微生物生长的条件下将所述盒温育初始时间段；
(c) 在室的至少一个子集中进行检查点测定以确定微生物生长是否已达到阈值；
和
(d) 当微生物生长达到所述阈值后，进行多个生长测定以确定微生物对多个盒室中的多种抗微生物剂的敏感性，使得可获得用于微生物的抗微生物剂的最小抑制浓度(MIC)和/或定性敏感性结果(QSR)。
4.权利要求3的方法，其中步骤(d)进一步包括：
当微生物生长达到低于所述阈值时，温育最多18小时的另外时间段，并重复步骤(c)以确定微生物生长是否已达到阈值；和
进行多个测定以确定微生物对多个盒室中的多种抗微生物剂的敏感性，使得可获得用于微生物的抗微生物剂的最小抑制浓度(MIC)和/或定性敏感性结果(QSR)。
5.一种用于通过进行生长测定确定一种或多种微生物的抗微生物剂敏感性的方法，所述方法包括：
在存在一种或多种抗微生物剂而不存在代谢探针的情况下温育微生物的悬浮液；
在温育所述一种或多种微生物之后，将代谢探针引入到水混溶性溶剂中；和
基于相对微生物生长确定所述一种或多种微生物的抗微生物剂敏感性。
6.一种用于确定一种或多种微生物的抗微生物剂敏感性的方法，所述方法包括：
(a) 将微生物的悬浮液在包含抗微生物剂的盒中的多个室中温育初始时间段以促进微生物生长；和
(b) 在所述盒室的子集中进行一个或多个检查点测定以确定相对微生物生长是否达到阈值，
其中达到所述阈值表明测定系统有足够的生长来提供对所述微生物的MIC或QSR数据；
(c) 如果所述阈值
(i) 被达到，进行一个或多个生长测定以确定所述一种或多种微生物对所述一种或多种抗微生物剂的最小抑制浓度(MIC)或定性敏感性结果(QSR)；或
(ii) 未达到，将微生物的所述悬浮液再温育一段时间；并重复步骤(a)和(b)直至
条件(b) (i)得到满足；或
流逝的总时间对于所述测定系统的生长不足以提供对所述微生物的MIC或QSR数据。
7.一种用于促进微生物生长的方法，所述方法包括：
在促进微生物生长的条件下，在存在一种或多种抗微生物剂的情况下，于盒中温育一种或多种微生物的悬浮液；和
以不足以实现溶液混合的频率和/或轨道振荡半径搅动所述盒。
8.一种用于促进微生物生长的方法，所述方法包括：
将包含微生物的悬浮液的盒预热至约30℃-约45℃的温度；和
在促进微生物生长的条件下，在存在一种或多种抗微生物剂的情况下温育包含微生物的所述悬浮液的所述预热的盒。
9.前述权利要求中任何一项的方法，其中用于确定所述一种或多种抗微生物剂的所述最小抑制浓度(MIC)或所述定性敏感性结果(QSR)的测定数目小于进行的测定数目。
10.前述权利要求中任何一项的方法，其中用于确定所述抗微生物剂的所述最小抑制浓度(MIC)或所述定性敏感性结果(QSR)的测定数目等于进行的测定数目。
11.前述权利要求中任何一项的方法，其进一步包括确定测定是否适合于确定所述一种或多种微生物对所述一种或多种抗微生物剂的敏感性。
12.前述权利要求中任何一项的方法，其中不同的测定用于不同的抗微生物剂-微生物组合。
13.前述权利要求中任何一项的方法，其中一种或多种不同的测定用于不同的微生物种类。
14.任何一项前述权利要求的方法，其中至少一种测定选自：代谢探针测定、表面结合探针测定、化学探针测定、生化探针测定、酶促生化探针测定、ATP测定、核酸探针测定、双链核酸探针测定、光密度测定、视觉测定和pH分子探针测定。
15.任何一项前述权利要求的方法，其中每种测定选自：代谢探针测定、表面结合探针测定、化学探针测定、生化探针测定、酶促生化探针测定、ATP测定、核酸探针测定、双链核酸探针测定、光密度测定、视觉测定和pH分子探针测定。
16.前述权利要求中任何一项的方法，其中所述多种生长测定包括表面结合测定。
17.前述权利要求中任何一项的方法，其中所述多种生长测定包括代谢测定。
18.前述权利要求中任何一项的方法，其中所述多种生长测定包括代谢测定和表面结合测定。
19.前述权利要求中任何一项的方法，其中所述代谢生长测定包括：
(a) 向多个室中添加代谢探针；
(b) 在促进微生物生长的条件下的测定温育期；和
(c) 获得吸光度、荧光、发光、电化学信号测量中的一种或多种。
20.权利要求19的方法，其中所述测定温育期为约30分钟-2小时。
21.权利要求19或20的方法，其中所述测定生长温育期为约1小时。
22.前述权利要求中任何一项的方法，其中代谢探针测定在随后的生长测定之前进行。
23.前述权利要求中任何一项的方法，其中代谢探针测定在表面结合探针测定之前进行。
24.前述权利要求中任何一项的方法，其中所述代谢探针包含7-羟基-10-氧化吩噁嗪-10-鎓-3-酮(刃天青)。
25.前述权利要求中任何一项的方法，其中所述代谢探针具有以下式(I)的结构：
(I)，
其中
R1独立地为CN、任选取代的C6-C10芳基或任选取代的5-至10-元杂芳基；
R2独立地为任选取代的C6-C10芳基或任选取代的5-至10-元杂芳基；
R3独立地为任选取代的C6-C10芳基、任选取代的5-至10-元杂芳基或子结构A；
子结构A为
,
其中
L1独立地为任选取代的C6-C10芳基或任选取代的5-至10-元杂芳基；
L2独立地为共价键、任选取代的C6-C10芳基或任选取代的5-至10-元杂芳基；
R4独立地为CN、任选取代的C6-C10芳基或任选取代的5-至10-元杂芳基；
R5独立地为任选取代的C6-C10芳基或任选取代的5-至10-元杂芳基；
每个X独立地不存在或为单价阴离子。
26.权利要求25的方法，其中R1独立地为CN或任选取代的C6-C10芳基。
27.权利要求25或26的方法，其中R2独立地为任选取代的C6-C10芳基。
28.权利要求25-27中任何一项的方法，其中R3独立地为任选取代的C6-C10芳基。
29.权利要求28的方法，其中X为单价阴离子。
30.权利要求25-27中任何一项的方法，其中R3为子结构A，并且所述化合物具有以下式(II)的结构：
。
31.权利要求30的方法，其中L1和L2的每一个独立地为任选取代的C6-C10亚芳基。
32.权利要求30或31的方法，其中R4独立地为CN或任选取代的C6-C10芳基。
33.权利要求30-32中任何一项的方法，其中R5独立地为任选取代的C6-C10芳基。
34.权利要求30-33中任何一项的方法，其中每个X独立地为单价阴离子。
35.权利要求25的方法，其中所述代谢探针具有选自以下的结构：
和。
36.权利要求35的方法，其中所述代谢探针包括2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓氯化物(INT)、(2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓钠盐(WST-1)、4-[3-(4-碘苯基)-2-(2,4-二硝基苯基)-2H-5-四唑鎓]-1,3-苯二磺酸盐(WST-3)或5-(2,4-二磺基苯基)-3-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-四唑鎓内盐单钠盐(WST-8)。
37.任何一项前述权利要求的方法，其中所述代谢探针包括3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓(MTS)、2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑鎓-5-甲酰苯胺(XTT)、2,3,5-三苯基-四唑鎓氯化物(TTC)、5-氰基-2,3-二(对-甲苯基)四唑鎓氯化物(CTC)、3,3’(3,3’-二甲氧基-[1,1’-联苯]-4,4’-二基)双(2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑-3-鎓)(DBNPT)、3-(萘-1-基)-2,5-二苯基-2H-四唑-3-鎓(NDT)、噻唑蓝四唑鎓溴化物(TBTB)、吩嗪甲基硫酸盐(PMS)、吩嗪乙基硫酸盐(PES)、甘氨酰苯基丙氨酰-氨基氟香豆素(GF-AFC)、RealTime-Glo™、Caspase-Glo®、BATDA的乙酰氧基甲酯或二茂铁。
38.前述权利要求中任何一项的方法，其中所述表面结合探针包含镧系元素与二亚乙基三胺四乙酸或穴状配体的配位络合物。
39.权利要求38的方法，其中所述表面结合探针包含
。
40.前述权利要求中任何一项的方法，其中一种或多种生长指示剂包含能够结合微生物细胞膜、细胞壁、细胞被膜、质膜、细胞被囊；在细胞壁内、在细胞被膜内、纤毛、菌毛、鞭毛、细胞器、跨膜蛋白、细胞壁蛋白、细胞外蛋白、细胞内蛋白、细胞外相关多糖、细胞内相关多糖、脂质、细胞外脂质、细胞内脂质、膜脂质、细胞壁脂质、多糖、和/或与细胞被膜蛋白成为一体或相关的脂质、或细胞器、或核酸的化学或生化基团。
41.前述权利要求中任何一项的方法，其中确定微生物生长的所述多种测定包括指示剂的时间分辨荧光测量。
42.前述权利要求的方法，其中所述指示剂包含铕、锶、铽、钐和镝或其组合。
43.前述权利要求中任何一项的方法，其中用于确定微生物生长的所述多种测定包括使用放大器。
44.前述权利要求的方法，其中所述放大器选自酶、催化剂和纳米颗粒及其组合。
45.前述权利要求中任何一项的方法，其中用于确定微生物生长的所述多种测定包括用于量化双链DNA浓度的指示剂。
46.前述权利要求的方法，其中所述指示剂为溴化乙锭、碘化丙锭、SYTOX绿、菲啶类、吖啶类、吲哚类、咪唑类和花青，包括TOTO、TO-PRO和SYTO，或其组合。
47.前述权利要求中任何一项的方法，其中用于确定微生物生长的所述多种测定包括核酸扩增。
48.前述权利要求中任何一项的方法，其中用于确定微生物生长的所述多种测定包括核酸测序。
49.前述权利要求中任何一项的方法，其中用于确定微生物生长的所述多种测定包括使用腺苷三磷酸。
50.前述权利要求中任何一项的方法，其中用于确定微生物生长的所述多种测定包括光散射。
51.前述权利要求中任何一项的方法，其中用于确定微生物生长的所述多种测定包括光学显微术。
52.前述权利要求中任何一项的方法，其中用于确定微生物生长的所述多种测定包括测量微生物质量。
53.任何一项前述权利要求的方法，其中用于微生物生长的测定基于微生物的吸光度测量或比浊法测量。
54.任何一项前述权利要求的方法，其中不同的生长测定在不同的盒室中进行。
55.任何一项前述权利要求的方法，其中不同的生长测定在相同的盒室中进行。
56.任何一项前述权利要求的方法，其中所述不同的生长测定依序进行。
57.任何一项前述权利要求的方法，其中所述不同的生长测定同时进行。
58.任何一项前述权利要求的方法，其中多个室包含溶解于培养基中的一种或多种抗微生物剂。
59.任何一项前述权利要求的方法，其中所述初始温育期为约2-18小时。
60.任何一项前述权利要求的方法，其中所述初始温育期为约2-6小时。
61.任何一项前述权利要求的方法，其中所述初始温育期为约3小时。
62.任何一项前述权利要求的方法，其中所述另外的温育期为约1-4小时。
63.任何一项前述权利要求的方法，其中所述另外的温育期为约1-2小时。
64.权利要求的方法，其中所述盒室的<50%、<25%、<10%、<5%、<2%用于检查点测定。
65.任何一项前述权利要求的方法，其中检查点测定室包含：
(a) 所述初始温育期和/或另外的温育期期间的生长指示剂；和/或
(b) 没有生长指示剂，其中所述检验点测定通过吸光度、浊度测定法、质量共振或声学进行。
66.任何一项前述权利要求的方法，其中一个或多个检查点测定室不包含抗微生物剂。
67.任何一项前述权利要求的方法，其中一个或多个检查点测定室包含一种或多种抗微生物剂。
68.任何一项前述权利要求的方法，其中所述阈值确定包括阳性对照。
69.任何一项前述权利要求的方法，其中所述阈值包括阳性对照和背景对照。
70.任何一项前述权利要求的方法，其中所述阈值确定包括阳性对照与背景对照的比率。
71.任何一项前述权利要求的方法，其中所述阳性对照包含在没有抗微生物剂的情况下温育的微生物的悬浮液和促进微生物生长的培养基。
72.任何一项前述权利要求的方法，其中所述背景对照包含微生物的悬浮液和不促进微生物生长的培养基。
73.任何一项前述权利要求的方法，其中所述阳性对照包含在没有抗微生物剂的情况下温育的微生物的悬浮液和促进微生物生长的培养基和一种或多种生长指示剂。
74.任何一项前述权利要求的方法，其中所述背景对照包含微生物的悬浮液和不促进微生物生长的培养基和一种或多种生长指示剂。
75.任何一项前述权利要求的方法，其中所述背景对照包括没有微生物的室。
76.任何一项前述权利要求的方法，其中阳性对照与背景对照的所述比率为约1.1-约2.5。
77.任何一项前述权利要求的方法，其中所述一种或多种生长指示剂在所述一种或多种检查点测定期间具有光学或电活性。
78.权利要求77的方法，其中所述一种或多种生长指示剂的光学信号包括荧光、时间分辨荧光、吸光度或发光。
79.权利要求77的方法，其中所述一种或多种生长指示剂的电信号为伏安信号或电位信号。
80.任何一项前述权利要求的方法，其中所述一种或多种生长指示剂经历化学或生化反应。
81.任何一项前述权利要求的方法，其中所述一种或多种生长指示剂包括7-羟基-10-氧化吩噁嗪-10-鎓-3-酮(刃天青)、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2H-四唑鎓(MTS)、2,3-双-(2-甲氧基-4-硝基-5-磺基苯基)-2H-四唑鎓-5-甲酰苯胺(XTT)、水溶性四唑鎓盐类(WSTs)、(2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺基苯基)-2H-四唑鎓钠盐(WST-1)、4-[3-(4-碘苯基)-2-(2,4-二硝基苯基)-2H-5-四唑]-1,3-苯二磺酸盐(WST-3)、或5-(2,4-二磺基苯基)-3-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-2-(4-硝基苯基)-2H-四唑鎓内盐单钠盐(WST-8)、2,3,5-三苯基-四唑鎓氯化物(TTC)、5-氰基-2,3-二(对-甲苯基)四唑鎓氯化物(CTC)、3,3’(3,3’-二甲氧基-[1,1’-联苯]-4,4’-二基)双(2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑-3-鎓)(DBNPT)、3-(萘-1-基)-2,5-二苯基-2H-四唑-3-鎓(NDT)、噻唑蓝四唑鎓溴化物(TBTB)、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓氯化物(INT)、吩嗪甲基硫酸盐(PMS)、吩嗪乙基硫酸盐(PES)、甘氨酰苯基丙氨酰-氨基氟香豆素(GF-AFC)、RealTime-Glo™、Caspase-Glo®、BATDA的乙酰氧基甲酯或二茂铁。
82.权利要求81的方法，其中所述生长指示剂包括刃天青。
83.权利要求81的方法，其中所述生长指示剂包括INT。
84.权利要求81的方法，其中所述生长指示剂包括WST-1、WST-3或WST-8。
85.任何一项前述权利要求的方法，其中所述一种或多种生长指示剂对pH有响应。
86.权利要求85的方法，其中所述一种或多种生长指示剂包括荧光素、羧基荧光素、曙红Y、8-羟基芘-1,3,6-三磺酸(pyranine)、半萘酚罗丹荧类、羧基SNARF、茜素黄、亮黄、溴甲酚、溴酚蓝、溴百里酚蓝、刚果红、邻甲酚酞、间甲酚紫、甲酚红、2,5-二硝基苯酚、乙基橙、间胺黄、甲基橙、甲基红、媒染橙、中性红、酚酞、酚红、喹哪啶红、玫红酸、百里酚蓝、百里酚酞、金莲橙或二甲酚蓝。
87.任何一项前述权利要求的方法，其中所述一种或多种检查点测定包括显微术或质谱法。
88.任何一项前述权利要求的方法，其中所述盒包含至少24个室。
89.任何一项前述权利要求的方法，其中所述盒包含96、384或1536个室。
90.任何一项前述权利要求的方法，其中所述盒室每个具有小于12 mm的横向尺寸。
91.任何一项前述权利要求的方法，其中所述盒通过机械搅动、声频搅动或磁力搅动来搅动。
92.权利要求91的方法，其中所述机械搅动为轨道振荡。
93.权利要求92的方法，其中所述轨道振荡以大于50转/分钟的频率发生。
94.权利要求91-93中任何一项的方法，其中所述轨道振荡以大于350转/分钟的频率发生。
95.权利要求91-94中一项的方法，其中所述轨道振荡以小于750转/分钟的频率发生。
96.任何一项前述权利要求的方法，其中对于96室盒，所述轨道振荡以约150转/分钟的频率发生。
97.任何一项前述权利要求的方法，其中对于384室盒，所述轨道振荡以约450转/分钟的频率发生。
98.任何一项前述权利要求的方法，其中所述轨道振荡半径大于2 mm。
99.任何一项前述权利要求的方法，其中所述轨道振荡半径为25 mm。
100.任何一项前述权利要求的方法，其中以不足以实现溶液混合的频率或半径搅动所述盒导致搅动所述盒的微生物生长与没有搅动所述盒的微生物生长之间的生长比率更大。
101.权利要求100的方法，其中所述生长比率大于1且小于1.5。
102.任何一项前述权利要求的方法，其中将所述盒预热至约30℃-约45℃之间的温度导致所述至少24个室的基本上均匀加热。
103.任何一项前述权利要求的方法，其中将所述盒预热少于15分钟。
104.任何一项前述权利要求的方法，其中将所述盒预热1、2、5、10或15分钟。
105.任何一项前述权利要求的方法，其中所述盒通过辐射加热、传导加热或对流加热来预热。
106.任何一项前述权利要求的方法，其中所述辐射加热为红外辐射加热。
107.任何一项前述权利要求的方法，其中所述盒通过传导和对流加热来预热。
108.权利要求105的方法，其中一个或多个加热表面进行所述传导和对流加热。
109.权利要求105的方法，其中所述盒通过辐射加热和传导和对流加热两者来预热。
110.权利要求105的方法，其中所述盒不通过单独的对流加热来预热。
111.任何一项前述权利要求的方法，其中所述盒通过向所述盒中添加至少25℃的温度的一种或多种流体来预热。
112.任何一项前述权利要求的方法，其中在预热所述盒之后约30分钟内，在存在一种或多种抗微生物剂的情况下发生所述温育微生物。
113.任何一项前述权利要求的方法，其进一步包括在将所述盒装载到自动化平台之前预热所述盒以进行抗微生物剂敏感性测试。
114.任何一项前述权利要求的方法，其中在所述预热步骤期间所述盒上的温度变化小于5%。
115.权利要求114的方法，其中最高温度室与最低温度室之间的℃温度差小于5%。
116.任何一项前述权利要求的方法，其中所述促进微生物生长的条件包括约33℃-约37℃的温度范围。
117.任何一项前述权利要求的方法，其中所述促进微生物生长的条件包括约35℃的温度。
118.任何一项前述权利要求的方法，其中所述一种或多种微生物源自临床样品。
119.前述权利要求的方法，其中所述临床样品包括血液、脑脊液、尿液、粪便、阴道液、痰液、支气管肺泡灌洗液、咽喉、鼻拭子、伤口拭子或其组合。
120.任何一项前述权利要求的方法，其中所述一种或多种微生物选自埃希氏杆菌属(Escherichia spp.)、肠球菌属(Enterococcus spp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)、克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.)、不动杆菌属(Acinetobacter spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、肠杆菌属(Enterobacter spp.)、链球菌属(Streptococcus spp.)、变形杆菌属(Proteus spp.)、气球菌属(Aerococcus spp.)、放线菌属(Actinomyces spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、巴尔通氏体属(Bartonella spp.)、博德特氏菌属(Bordetella spp.)、布鲁氏菌属(Brucella spp.)、弯曲杆菌属(Campylobacter spp.)、衣原体属(Chlamydia spp.)、嗜衣原体属(Chlamydophila spp.)、梭菌属(Clostridium spp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)、埃里希氏体属(Ehrlichia spp.)、弗朗西丝氏菌属(Francisella spp.)、加德纳氏菌属(Gardenerella spp.)、嗜血杆菌属(Haemophilius spp.)、螺杆菌属(Helicobacter spp.)、乳杆菌属(Lactobacillus spp.)、军团菌属(Legionella spp.)、细螺旋体属(Leptospira spp.)、李斯特氏菌属(Listeria spp.)、分枝杆菌属(Mycobacterium spp.)、支原体属(Mycoplasma spp.)、奈瑟氏球菌属(Neisseria spp.)、诺卡氏菌属(Nocardia spp.)、巴斯德氏菌属(Pasteurella spp.)、立克次氏体属(Rickettsia spp.)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas spp.)、密螺旋体属(Treponema spp.)、脲枝原体属(Ureaplasma spp.)、弧菌属(Vibrio spp.)、耶尔森氏菌属(Yersinia spp.)、假丝酵母属(Candida spp.)、伊萨酵母属(Issatchenkia spp.)、芽生菌属(Blastomyces spp.)、球孢子菌属(Coccidioides spp)、曲霉属(Aspergillus spp.)、隐球菌属(Cryptococcus spp.)、组织胞浆菌属(Histoplasma spp.)、肺囊虫属(Pneumocystis spp.)、葡萄穗霉属(Stachybotrys spp)、孢子丝菌属(Sporothrix)、突脐蠕孢属(Exserohilum)、枝孢属(Cladosporium)、环癣(ringworm)、毛霉菌属(mucormycetes)及其组合。
121.前述权利要求中任何一项的方法，其中所述促进微生物生长的条件包括环境空气、厌氧条件或高达10%的CO2。
122.前述权利要求中任何一项的方法，其中所述盒室的底部为平坦的、圆形的或V形的。
123.前述权利要求中任何一项的方法，其中所述盒为光学透明、白色或黑色中的一种或多种。
124.前述权利要求中任何一项的方法，其中所述微生物悬浮培养基包含至少一种营养物。
125.前述权利要求中任何一项的方法，其中所述一个或多个室包含不同的液体成分。
126.任何一项前述权利要求的方法，其进一步包括确定哪种抗微生物剂或抗微生物剂组合对所述一种或多种微生物最有效。
127.任何一项前述权利要求的方法，其进一步包括产生用于治疗由所述一种或多种微生物引起的感染的推荐。
128.任何一项前述权利要求的方法，其中所述步骤在用于抗微生物剂敏感性测试的自动化平台中进行。
129.一种试剂盒，其包含进行任何一项前述权利要求的方法的组分。
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