CN112424370A - 快速测试抗菌剂敏感性的方法和系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于快速测试抗菌剂敏感性的方法和系统，其中作为读数数据的线性趋势的一个或多个斜率α的函数，来确定接种的微生物对抗菌剂或抗菌剂组合的定性和定量的敏感性。
Description
技术领域
本发明涉及用于快速测试抗菌剂敏感性的方法和系统，其中作为读数值的线性趋势的一个或多个斜率α的函数，来确定接种的微生物对抗菌剂或抗菌剂组合的定性和定量的敏感性。
背景技术
在临床微生物学中，通过液体培养进行的表型研究是评估特定细菌或真菌微生物样品对一种或多种抗菌剂的耐药性的金标准。一种方法涉及表型抗菌剂敏感性试验(AST)，其例如包括在存在一种抗菌剂或两种或多种抗菌剂的组合的情况下，分别在液体培养基中培养微生物的一个或多个分离株，并评估是否出现各自分离株群体的生长。
抗菌剂敏感性试验允许定性确定微生物分离株对所用的抗菌剂是敏感(S)、中介(I)还是耐药(R)。
因此，“敏感”类别表示抗菌剂/抗菌剂组合可能是治疗由受试微生物引起的感染的合适选择，并且细菌/真菌耐药性不存在或处于临床上不显著的水平。
“中介”类别表示受试的微生物分离群体对受试抗菌剂“中度敏感”，因此该类别可作为“敏感”和“耐药”之间的缓冲区。如果属于这一类的抗菌剂可以集中在感染焦点(如尿中的喹诺酮类和β-内酰胺类)，或者由于其毒性较低，可使用高于正常剂量的抗菌剂(如β-内酰胺类)，则仍可使用此类抗菌剂。这种抗菌剂可能仍然对受试分离株有效，但应答率可能低于敏感分离株。
“耐药”类别表示受试分离株对各自的抗菌剂具有抗性，这意味着该细菌或真菌微生物似乎不受正常剂量方案下通常可达到的受试抗菌剂浓度的抑制。因此，这类抗菌剂不是治疗由受试细菌或真菌分离株引起的感染的合适选择。
或者，可以使用野生型(WT)或非野生型(NWT)来对微生物的敏感性进行分类。因此，如果针对所讨论的抗菌剂，不存在表型上可检测的获得性和突变性抗性机制，则可以将微生物分离株定义为一个物种的WT。这反过来意味着，如果针对所讨论的抗菌剂，存在表型上可检测的获得性或突变性抗性机制，则可以将微生物分离株定义为一个物种的NWT。
此外，抗菌剂敏感性试验方法允许通过确定抗菌剂对特定分离株的最低抑菌浓度(MIC)进行定量评估，从而在琼脂、在培养管或在微量滴定板中进行抗菌剂稀释试验。当在培养管或微量滴定板内确定MIC时，将单一抗菌剂或两种或多种抗菌剂的组合的系列稀释与样品微生物的标准接种物一起接种到孔或管中。使用浊度来测量在各自的抗菌剂浓度存在下的生长。最低抑菌浓度是指完全抑制分离株生长的抗菌剂的最高稀释度或最低浓度。当在琼脂上使用MIC法时，例如，将含有抗菌剂浓度梯度的接种扩散条施加到琼脂上，使得梯度从该条转移到琼脂中。过夜培养或更长时间后，形成以该条为中心的椭圆形抑制区。可以在椭圆边缘与MIC条相交的点读取MIC值。所得的MIC值可以使用欧洲抗菌剂敏感性试验委员会(EUCAST)或临床和实验室标准协会(CLSI)提供的标准进行解释。
鉴于由耐抗菌剂微生物引起的可能的致命的感染所带来的威胁以及细菌对抗生素的耐药性在全球范围内的扩散，因此越来越需要对此类耐药物种的快速检测，以及确定最低抑菌浓度。
尽管抗菌剂耐药性的表型试验非常可靠，但它们中的许多也非常耗时，因为当微生物的分离株被接种到新的培养基中时，微生物的增殖速率特别慢，这可以被视为分批培养中所谓的细菌生长的滞后期。在这个阶段，用于计数微生物的标准测量方法产生不可接受的低信噪比。然而，现有技术的抗菌剂敏感性试验仅在生长后期(例如指数或对数期)确定微生物分离株是否在特定环境中增殖。因此，表型抗菌剂敏感性试验的最短时间取决于微生物的指数或对数生长期。根据FDA，对于快速生长的细菌，培养时间低于16小时的测试被称为采用“短期培养”，然而，通常需要16至20小时的培养时间(有一些例外)，因此抗菌剂敏感性试验的整体结果需要数天和数周的时间。鉴于AST的定性和定量评估有时对威胁生命的感染至关重要，需要将获得定性和定量AST结果的时间缩短。
加快提供AST定性和/或定量结果的时间的一种方法是通过使用微量滴定板培养，例如在标准的96-或384-孔微量滴定板中，这使得能够同时将多种不同条件应用于同一微生物样品，例如存在或不存在特定抗菌剂或其不同浓度。潜在的生长，即微生物的繁殖，发生在微量滴定板的孔中，其可以通过肉眼进行光学评估，也可以通过机器测量直接取决于微生物生长的物理或化学性质来评估。
另一个加快抗菌剂耐药性检测和量化的尝试是培养的自动化。自动化抗菌剂敏感性试验系统的实例有VITEK和Phoenix(分别由bioMerieux和Becton Dickinson提供)，它们利用了专用的微流控芯片，或MicroScan和Sensititre，两者都可以处理96孔微量滴定板。
此外，现有技术教导适当地监控微生物培养物，以缩短检测其生长所需的时间。这些方法通常需要在特殊条件下对培养物的特定物理或化学性质进行测量。例如，培养基的颜色(US 6,265,182 B1)、使用特定化合物的荧光猝灭(US 6,165,741 B1)、小样品子体积的电阻抗(US 6,649,402 B2)或氧分压(EP 0 128 527 A2)是提供微生物生长的监测信息的性质。这些解决方案的主要缺点是需要针对测量的特定实验设置。此外，上述方法不能进行非常快速的试验(例如，使用US 6,265,182 B1，抗生素敏感性试验仍需要4至6小时)。
另一方面，微流体技术的重大进展为快速进行AST试验提供了一种方法。在文章Antibiotic susceptibility testing in less than 30min using direct single-cellimaging(O.Baltekin等人,PNAS August 22,2017,114(34),9170-9175)中，描述了这样的方法，其中可以将单个细菌捕获在微流体通道中，用不同的介质(即使用抗生素或不使用抗生素)进行处理，然后通过相差显微镜观察。还可以根据Rapid pathogen-specificphenotypic antibiotic susceptibility testing using digital LAMPquantification in clinical samples(Schoepp等人,Sci.Transl.Med.9,eaal3693(2017))中公开的方法快速检测抗生素对样品的影响。在那里，根据基于核酸等温扩增的定量分析结果，将暴露于抗生素和参比物的样品进行比较。两种微流体技术方法均给出了令人印象深刻的试验参数，但它们也需要非常复杂的设备。
总之，现有技术的解决方案存在以下问题：
·鉴于进行分离的微生物样品生长的培养步骤，标准的抗菌剂敏感性试验是非常耗时的。
·基于阻抗/颜色/荧光猝灭的测量需要特定的实验设置。
·Baltekin等人描述的新微流技术可观察单个细菌，因此可缩小观察系统的规模，并且也需要特定的设置和实验室程序。
·Schoepp等人描述的新微流技术也需要使用特定的实验室程序(LAMP扩增)。
发明内容
独立权利要求的主题解决了本发明的一个或多个问题。在下文的详细描述和/或附图以及从属权利要求中阐述了优点(优选实施方案)。
因此，本发明的第一方面涉及一种使用液体培养基稀释在表型抗菌剂敏感性试验(AST)中确定微生物接种物的定性或定量敏感性的计算机实施的方法，其特征在于，所述AST方法包括以下步骤或由以下步骤组成：
a)提供微生物接种物，并在适于液体培养基稀释法AST的培养基中稀释所述接种物，
b)提供载体，其包含一个或多个适于液体培养基稀释法AST的隔室，其中所述隔室或所述隔室的至少一部分分别包含单一抗菌剂或抗菌剂的组合，
c)将步骤a)的包含稀释接种物的培养基样品分配到步骤b)的载体的隔室或隔室的至少一部分中，以使载体的一个或多个接种隔室包含各自的测试试验，
d)培养步骤c)的载体，所述载体包含各自的一个或多个测试试验，
e)在培养步骤d)期间，对于所述一个或多个测试试验中的每一个，以恒定或不恒定的频率f，对源自接种微生物的化学或物理性质的信号进行至少n次测量，其中所述信号表示在测量的测试试验中微生物数目的基本上单调的函数，并且在相应的记录时间{ti}读取相应的值{xi}，其中i表示测量的索引号，由整数1至n表示，并且其中n表示13个或更多个测量的全整数，
f)作为分布的函数，估计数据中线性趋势的一个或多个斜率α，所述分布为一对读数值{xi}和{xj}(其中j>i)的成分相减的差值除以获取索引为i和j的读数之间的时间间隔δtij的分布，由此将在相应记录时间{ti}的n个读数值{xi}的部分或全部，但是至少13个或更多个读数值{xi}，用于所述分布，以及
g)作为线性趋势的一个或多个斜率α的函数，确定接种微生物对单一抗菌剂或抗菌剂组合的定性或定量敏感性。
本发明的第二方面涉及一种使用液体培养基稀释法进行表型抗菌剂敏感性试验的快速抗菌剂敏感性试验系统，所述系统包括：
a)适于容纳至少一个载体的培养组件，所述载体具有一个或多个隔室用于接收在生长培养基中稀释的微生物接种物样品，其中所述隔室或所述隔室的至少一部分分别包含单一抗菌剂或抗菌剂的组合，使得每个接种的隔室都容纳各自的测试试验，其中所述培养组件被配置为在所述一个或多个隔室中提供所述一个或多个测试试验的培养和/或测量环境，
b)询问读取组件，其包括被配置为在一个或多个载体的培养期间询问和读取所述一个或多个测试试验的询问装置和测量装置，其中所述询问读取组件便于i)对于所述一个或多个测试试验中的每一个，以恒定或不恒定的频率f，对源自接种微生物的化学或物理性质的信号进行至少n次测量，其中所述信号表示在测量的测试试验中微生物数目的基本上单调的函数，以及ii)在相应的记录时间{ti}读取相应的值{xi}，其中i表示测量的索引号，由整数1至n表示，其中n表示13个或更多个测量的全整数，以及
c)计算组件，其包括一个或多个处理器和一个或多个存储指令的计算机可读介质，所述指令在被所述一个或多个处理器执行时使得所述一个或多个处理器执行操作，所述操作包括i)从询问读取组件接收读数的数目n、值{xi}以及相应的记录时间{ti}，以及ii)作为分布的函数，估计数据中线性趋势的一个或多个斜率α，所述分布为一对读数值{xi}和{xj}(其中j>i)的成分相减的差值除以获取索引为i和j的读数之间的时间间隔δtij的分布，由此将在相应记录时间{ti}的n个读数值{xi}的部分或全部，但是至少13个或更多个读数值{xi}，用于所述分布，以及iii)作为线性趋势的一个或多个斜率α的函数，确定所述接种微生物对单一抗菌剂或抗菌剂组合的定性或定量敏感性。
本发明的第三方面涉及使用液体培养基稀释法进行抗菌剂敏感性试验(AST)的本发明的快速抗菌剂敏感性试验系统在确定接种微生物的定性和定量敏感性中的用途。
上文公开的本发明的发明方面可以包括——如果对本领域技术人员来说是合理的话——从属权利要求中阐述的或以下详细描述中公开的优选发明实施方案的任何可能的组合。
附图说明
图1示出了在抗菌剂敏感性试验中接种微生物样品的示例性生长曲线，其中虚线表示一种生长阶段的结束，在该生长阶段中由于微生物群体生长引起的测量信号值的变化小于由于测量装置的高频噪声引起的信号值的变化。
图2示出了由于微生物生长导致的信号值(读数值)的增加，以测量装置的高频噪声的倍数显示，其中相对于测量装置的高频噪声信号的1倍、2倍和3倍增加的点用虚线1σ、2σ和3σ表示。
图3示出了使用本发明的方法使用所有测量值为示例性生长曲线计算的线性趋势α的值，其中虚线表示一种生长阶段的结束，在该生长阶段中由于微生物群体生长而引起的测量信号值的变化小于由于测量装置的高频噪声引起的信号值的变化。
图4示出了使用本发明的方法用所有测量值计算的趋势α的相对不确定度(估计的标准偏差)，其中虚线表示一种生长阶段的结束，在该生长阶段中由于微生物群体生长而引起的测量信号值的变化小于由于测量装置的高频噪声引起的信号值的变化。
图5示出了使用本发明的方法和最后进行的2000次测量为示例性生长曲线计算的线性趋势α的值，其中虚线表示一种生长阶段的结束，在该生长阶段中由于微生物群体生长而引起的测量信号值的变化小于由于测量装置的高频噪声引起的信号值的变化。
图6示出了使用本发明的方法和最后进行的2000次测量计算的趋势α的相对不确定度(估计的标准偏差)，其中虚线表示一种生长阶段的结束，在该生长阶段中由于微生物群体增长而引起的测量信号值的变化小于由于测量装置的高频噪声引起的信号值的变化。
图7示出了趋势的估计斜率α的标准偏差对读数数目的相关性。
图8示出了趋势的估计斜率α的标准偏差对测量设备的高频噪声的相关性。
图9示出了使用不同抗菌剂浓度的抗菌剂敏感性试验的独立测试试验的十条生长曲线，以确定最低抑菌浓度。
图10示出了使用不同抗菌剂浓度的抗菌剂敏感性试验的十个独立测试试验的十条生长曲线，以确定最低抑菌浓度。
图11示出了使用不同抗菌剂浓度的抗菌剂敏感性试验的三个独立测试试验的三条生长曲线，以确定最低抑菌浓度。
图12示出了使用现有技术的方法通过实验确定的MIC的演变。
图13示出了使用本发明通过实验确定的MIC的演变。
具体实施方式
如下文详细描述的，本发明人意外地发现，当使用本发明的方法、系统或用途时，有可能使用液体培养基稀释法来减少标准抗菌剂敏感性试验(AST)的培养时间和/或增加抗菌剂敏感性的定性或定量测定的精确度。这种改进无需使用如现有技术的测量所要求的特定的实验装置和实验室程序(例如Baltekin等人或Schoepp等人描述的基于阻抗、颜色、荧光猝灭或微流体技术的测量，其中观察单个细菌并且观察系统规模缩小，或者使用LAMP扩增)就可以实现。
本发明是基于：对于一项测试试验的13次或更多次测量，评估一对读数值的成分相减的差值除以取得这些读数值之间的时间间隔的分布，并确定接种微生物的定性或定量的抗菌剂敏感性。
本发明的方法是计算机实施的，这意味着本发明的方法是通过使用合适的处理装置和任选的合适的存储装置来实现的，例如通过使用计算机、笔记本电脑、智能设备等，并且在组件连接到互联网的情况下，所述合适的处理装置和任选的存储装置可以由可访问互联网的服务器提供，特别是云服务器网络。
根据本发明，使用在相应的n个记录时间{ti}的部分或全部n个读数值{xi}，但至少13个或更多，优选100个或更多，更优选500个或更多，甚至更优选1000个或更多的读数值{xi}，作为分布的函数，来估计数据中的线性趋势的一个或多个斜率α，所述分布为一对读数值{xi}和{xj}(其中j>i)的成分相减的差值除以获取索引为i和j的读数之间的时间间隔δtij的分布。换句话说，对于至少13个或更多，优选100个或更多，更优选500个或更多，甚至更优选1000个或更多的读数值{xi}，可以如下计算一对读数值的成分相减除以读数之间的时间间隔(频率f)的分布：
从n个读数值{xi}(同义地也称为读数或读数{xi})的集合，可以构建一对读数值的
个归一化差值{ηij}的集合，
其中j>i，并且δtij是获取索引为i和j的读数值之间的时间差。如果读数以恒定的频率进行，那么δtij＝δt(j-i)，其中δt是连续读数之间的平均时间。
可以计算所有归一化差值的平均差值
平均差值
等于一系列读数的斜率α的估计值
α的估计的不准确度σα等于
其中σ是仪器高频噪声的标准偏差。
根据本发明的所有方面，作为线性趋势的一个或多个斜率α的函数，确定接种的微生物对单一抗菌剂或抗菌剂组合的定性或定量敏感性。
接种微生物的定性或定量敏感性的确定是基于以下发现，即接种的微生物的生长是否被抑制。因此，测试试验y中的接种微生物的生长速率μ可以使用校正函数
来计算。
生长速率μ估计的不准确度σμ等于
其中σ是仪器高频噪声的标准偏差。
这意味着，定性或定量的敏感性确定的精确度(即线性趋势α估计的标准偏差σα)仅取决于用于减法的分布的读数数目和来自测量装置的高频噪声的标准偏差σ。此外，它与
成比例，这意味着，与现有技术的通常AST方法(例如最小二乘法，其中比例因子为
)相比，接种微生物样品的定性或定量敏感性的确定的精确度随着读数数目的增加而增加得更快。
因此，根据本发明的第一方面，使用液体培养基稀释法在表型抗菌剂敏感性试验(AST)中确定微生物接种物的定性或定量敏感性的计算机实施方法包括或由以下步骤组成：
a)提供微生物接种物，并在适于液体培养基稀释法AST的培养基中稀释所述接种物，
b)提供载体，其包含一个或多个适于液体培养基稀释法AST的隔室，其中所述隔室或所述隔室的至少一部分分别包含单一的抗菌剂或抗菌剂的组合，
c)将步骤a)的包含稀释的接种物的培养基样品分配到步骤b)的载体的隔室或隔室的至少一部分中，以使载体的一个或多个被接种的隔室包含各自的测试试验，
d)培养步骤c)的载体，所述载体包含各自的一个或多个测试试验，
e)在培养步骤d)期间，对于所述一个或多个测试试验中的每一个，以恒定或不恒定的频率f，对源自接种微生物的化学或物理性质的信号进行至少n次测量，其中所述信号表示在测量的测试试验中微生物数目的基本上单调的函数，并且在相应的记录时间{ti}读取相应的值{xi}，其中i表示测量的索引号，由整数1至n表示，并且其中n表示13个或更多个测量的全整数，
f)作为分布的函数，估计数据中线性趋势的一个或多个斜率α，所述分布为一对读数值{xi}和{xj}(其中j>i)的成分相减的差值除以获取索引为i和j的读数之间的时间间隔δtij的分布，由此将在相应记录时间{ti}的n个读数值{xi}的部分或全部，但是至少13个或更多个的读数值{xi}，用于所述分布，以及
g)作为线性趋势的一个或多个斜率α的函数，确定接种微生物对单一抗菌剂或抗菌剂组合的定性或定量敏感性。
根据本发明，可以测试任何合适微生物的抗菌剂敏感性，优选地，所述微生物选自细菌，例如好氧或厌氧细菌，包括分枝杆菌，和真菌。根据本发明的一个实施方案，所述微生物选自细菌，其包括好氧细菌或厌氧细菌。
关于第一方面，相应微生物的微生物接种物和合适的液体培养基稀释液根据本领域的标准方法制备，特别是如EUCAST(欧洲抗菌剂敏感性试验委员会http://www.eucast.org)和CLSI(抗菌剂敏感性试验性能标准，第22版；CLSI文档M100-S22 Wayne，PA：临床和实验室标准协会；2012年)所述。通过引用将各自描述的用于细菌、分枝杆菌和真菌的抗菌剂敏感性试验的标准方法并入本文。根据本发明，将微生物接种物(通常是被测微生物的过夜培养物或过夜培养物的一部分)在合适的生长培养基中稀释，例如液体液体培养基稀释(也同义地也称为“适合液体培养基稀释法AST的培养基”)。然后将该稀释的接种物的样品(同义地也称为“含有稀释的接种物的培养基样品”、“微生物接种物的液体培养基稀释样品”或“在生长培养基中稀释的微生物接种物样品”)用于本发明方法的步骤c)。根据实施例1，将该悬浮液通过与各自的抗生素液体培养基溶液混合进一步稀释两次。对于样品，稀释液中微生物细胞的计数是可确定的。优选地，含有稀释接种物的样品培养基的密度为5*105CFU/ml(菌落形成单位/ml)。尤其是在测试细菌作为微生物时，所述液体培养基选自未经补充的阳离子调节的Mueller-Hinton液体培养基(MH液体培养基)，其根据ISO标准20776-1，2006被用于测试非营养苛求性的生物体，或补充有5％裂解的马血和20mg/Lβ-NAD的阳离子调节的MH液体培养基(MH-F液体培养基)，其被用于测试链球菌属(Streptococcusspp.)(包括肺炎链球菌(S.pneumoniae))、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)和大肠弯曲杆菌(Campylobactercoli)、多杀性巴斯德菌(Pasteurella multocida)、棒状杆菌属(Corynebacterium spp.)、栖血气球菌(Aerococcus sanguinicola)和尿道气球菌(Aerococcus urinae)、金格杆菌(Kingella kingae)以及其他几种营养苛求性的生物。未经补充的MH液体培养基也可以从商业来源购买。
根据本发明的第一方面，可以使用任何合适的载体，其包含一个或多个适于液体培养基稀释法AST的隔室，其中所述隔室或所述隔室的至少一部分分别包含单一抗菌剂或抗菌剂的组合。载体通常还促进第一发明方面的步骤e)中的性质的测量以及避免测试试验之间的交叉污染。这样的载体可以选自由以下组成的组：微量滴定板、试管(例如Eppendorf管)、培养皿或微流控芯片。载体优选地为微量滴定板或微流体芯片，因为可以同时进行多个测试试验。根据所有发明方面，微流体芯片仍可优选作为载体，因为其可容纳等于或大于100个培养隔室，优选等于或大于128个培养隔室，更优选等于或大于320个培养隔室，甚至更优选等于或大于640个培养隔室，以及更优选等于或大于1280个培养隔室。微流体芯片的(培养)隔室也可以同义地称为培养段或培养孔。用于本发明的载体还可以包括促进培养的装置，例如温度调节装置和/或气体交换装置。适合于本发明的非常优选的微流体芯片特别在波兰专利申请PL 425106和PL 425107(均以Bacteromic sp.z.o.o.的名义，也是本申请人)中描述，并且两个申请PL 425106和PL 425107的有关微流体芯片的内容通过引用并入本文。
本发明使用的载体的一个或多个隔室分别包含单一的抗菌剂或两种、三种、四种或更多种抗菌剂的组合，并根据需要任选地进一步包含赋形剂。抗菌剂(antimicrobialagent)(同义地也称为“抗菌剂(antimicrobial)”)或抗菌剂的组合可以选自以下组：抑制细菌(特别是分枝杆菌)和/或真菌生长的剂。特别地，抗菌剂或抗菌剂的组合可以包括抑细菌剂、杀细菌剂、抑真菌剂或杀真菌剂。通过合适的方式将单一抗菌剂或抗菌剂的组合以及任选的其它赋形剂分配到载体的各个隔室中，其中各个隔室中抗菌剂的最终浓度必须是已知的或可确定的。特别地，在使用微量滴定板或微流体芯片的情况下，将单一抗菌剂或两种或多种抗菌剂的组合以及任选的其它赋形剂例如点入各自的隔室(微量滴定板的孔或微流控芯片的培养隔室/段/孔)中。如果抗菌剂与接种的微生物以1:1的稀释比例混合，那么各个隔室中抗菌剂的浓度必须是目标浓度的两倍。例如，将等份(即100μl或50μl)的接种的液体培养基稀释液和抗菌剂稀释液在允许测量样品的光学性质的多层板(
96Well
Microplate，https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls3340，CorningTMCostarTMFlat Bottom Cell Culture Plates，https://www.fishersci.com/shop/products/costar-cell-culture-plates-17/0720090)的孔中混合。优选地，为每个测试试验准备3次重复。当使用其他混合比例时，则需要使用相应的抗菌剂浓度。在定量确定抗菌剂敏感性的情况下，特别是通过本发明确定最低抑菌浓度的情况下，载体的两个或更多个隔室包含不同浓度的单一抗菌剂或抗菌剂的组合。优选地，根据EUCAST(欧洲抗菌剂敏感性试验委员会；http://www.eucast.org)和CLSI(抗菌剂敏感性试验性能标准，第22版；CLSI文档M100-S22 Wayne，PA：临床和实验室标准协会；2012年)提供的标准使用一系列不同的浓度。
根据本发明的第一方面，将步骤a)的包含稀释接种物的培养基样品分配到步骤b)的载体的隔室或隔室的至少一部分中，使得所述载体的一个或多个接种隔室包括各自的测试试验。分配步骤可以根据现有技术的任何合适的方法进行，特别是包括用于手动或自动分配的分配装置。微流体芯片也可以促进分配，其中所述微流体芯片包括容纳接种液体培养基样品的容器，其中所述容器与所述一个或多个隔室连接。所述一个或多个隔室(培养隔室/段/孔)可以用接种的液体培养基稀释液填充，通过将具有已填充的容器的微流体芯片放入填充室并增加其中的压力从而将接种的液体培养基稀释液压入所述一个或多个隔室中。合适的微流体芯片在波兰专利申请PL 425106和PL 425107中公开。
根据本发明的第一方面，包含各自的一个或多个测试试验的载体通常通过使用合适的培养组件来培养。培养组件(其也在有关本发明的第二方面公开)被配置为为其中包含的一个或多个载体的测试试验提供合适的培养和/或测量环境。在本发明的上下文中，表述“合适的培养环境”是指提供了微生物生长的最佳条件，例如，温度在30-40℃的范围，优选为在35-37℃，气体交换，特别是为好氧微生物提供氧气等。合适的培养环境可以由培养组件和/或载体提供，例如微流体芯片，优选如PL425107中所述的微流体芯片。在本发明的上下文中，表述“合适的测量环境”是指培养组件和载体允许询问包含在载体的隔室中的一个或多个测试试验，并测量基本上单调相关的性质/信号。在测量光(散射光、荧光)的强度的情况下，优选将培养组件与不是由测试试验发射的光分开，换言之，将测试试验保持黑暗。
在本发明的第一方面的方法的步骤d)中的接种的载体的培养过程中，对于每个测试试验，以恒定或不恒定的频率f，对源自接种微生物的化学或物理性质的信号进行至少n次测量，其中所述信号表示在测量的测试试验中微生物数目的基本上单调的函数，并且在相应的记录时间{ti}读取并记录相应的n个值{xi}，其中i表示测量的索引号，由整数1至n表示，并且其中n表示13个或更多个测量的全整数。在本申请的上下文中，表述“信号表示在测量的测试试验中微生物数目的基本上单调的函数”是指显示出信号的基础测量化学或物理性质遵循与所测测试试验中微生物数目相关的基本上单调的函数，由此测量仪器的高频噪声可能使信号偏离单调函数。测量步骤可以通过使用询问读取组件来进行，所述询问读取组件包括询问装置和测量装置，所述询问装置和测量装置被配置为在一个或多个载体的培养期间询问和读取一个或多个测试试验。源自接种微生物的化学或物理性质的信号可以优选地选自光(例如荧光或散射光)的强度；光密度、吸光度、浊度、光反射或其他光学性质；电导率、电容或其他电性质；微生物代谢涉及的气体分压、粘度或营养吸收，更优选地，通过培养隔室时散射的光强度或从适当激发的微生物样品发出的荧光强度，特别是在微生物样品包含刃天青(resazurin)的情况下，因为活性代谢微生物产生间苯二酚，其是刃天青的还原产物，其在适当激发后发出荧光。
频率f以及两次连续测量之间的时间间隔优选为1mHz或更大，更优选地f在10mHz至10Hz的范围中，甚至更优选地在100mHz至1Hz的范围中。为了减轻基础计算，频率f优选地在所有n个记录时间{ti}之间是恒定的。
根据本发明的第一方面，使用在相应的记录时间{ti}的部分或全部n个读数值{xi}，但至少13个或更多个读数值{xi}，作为分布的函数，来估计数据中的线性趋势的一个或多个斜率α，所述分布为一对读数值{xi}和{xj}(其中j>i)的成分相减的差值除以获取索引为i和j的读数之间的时间间隔δtij的分布。换句话说，对于至少13个或更多个读数值{xi}，可以如下准备一对读数值的成分相减的差值除以读数之间的时间间隔(与频率f有关)的分布：
如上所述，从n个读数值{xi}的集合，可以构建读数值对的
个归一化差值{ηij}的集合，
其中j>i，并且δtij是获取索引为i和j的读数值之间的时间差。如果读数以恒定的频率进行，那么δtij＝δt(j-i)，其中δt是连续读数之间的平均时间。可以计算所有归一化差值的平均差值
平均差值
等于一系列读数的斜率α的估计值
α的估计的不准确度σα等于
其中σ是仪器高频噪声的标准偏差。
如果读数是以恒定频率记录的，那么记录第i次读数xi的时间由ti＝T0+δt·i给出，其中δt是记录两次连续读数之间的平均时间，上述公式可以数学推导如下：
如果记录量的增加很小，那么可以由线性函数来对其进行近似。因此，每个读数可以被近似为实验设置的高斯高频噪声(即噪声的频率f噪音高于获取读数的频率
)、线性趋势和描述培养基背景的函数f背景之和。
数学上，如果来自培养基的背景变化可以忽略不计，即f背景(t)≈C＝常数，那么每个读数可以用下述加和描述：xi＝N(0,σ)+α·(T0+δt·i)+C，其中α是数据线性趋势的斜率，并因此是培养中的微生物生长的量度，σ是高频噪声的标准偏差，δt是连续读数之间的时间间隔，T0是实验的开始时间，i是读数的编号，并且C是描述培养基背景的常数。符号N(μ,σ)被用于表示正态(或高斯或高斯或拉普拉斯-高斯)分布，其中μ是分布的平均值，σ是分布的标准偏差，并且σ2是分布的方差。因此，每个读数都可以被视为一个具有平均值α·(T0+i·δt)+C和标准偏差σ的随机变量：xi～N(α·(T0+δt·i)+C,σ)。
从一个读数减去另一个读数的结果也是一个随机变量。每个读数都可以看作是信号的真实(“平均值”)值和例如来自实验装置的高频噪声的偏差的总和。因此，对于这种减法的结果，其平均值等于读数平均值之差，并且标准偏差等于
(Bennett Eisenberg和Rosemary Sullivan,Why is the Sum of Independent Normal Random VariablesNormal,Math.Magazine,2008,Vol.81,p 362-366)。因此减法的结果由以下等式给出：
然后两个索引为i和j＝i+k的读数相减的结果由记录所述读数之间的时间差tj-ti＝δt(j-i)＝δtk归一化，由
给出并且是随机变量：
对于固定值k，n个读数的集合的所有减法的结果ηk的总和由以下等式给出：
并且也是随机变量
对于所有k值，n个读数的整个集合的所有减法的结果ηk的总和由以下等式给出：
并且是随机变量
因此，n个读数的集合中的任意两个的平均归一化减法(进行
次减法)具有以下分布：
级数
可以改写为两个级数之和：
并且根据黎曼假设(巴塞尔问题)，对于大的n它的上限可以近似为
(对于n＝13，近似的结果为
对于n>15，差值小于10％，并且对于n>33，差值小于5％)。此外，对于大的n，项
的上限可以近似为
最后，平均归一化减法的分布等于
因此，计算平均归一化减法提供了标准偏差为
的线性趋势α的估计。
根据本发明的第一方面，作为线性趋势的一个或多个斜率α的函数，确定接种的微生物对单一抗菌剂或抗菌剂组合的定性或定量敏感性。
接种微生物的定性或定量敏感性是基于以下发现，即接种的微生物的生长是否受到抑制。因此，测试试验y中的接种微生物的生长速率μ可以使用校正函数f(y):μ＝(f′(y))-1·α来计算。
优选地，最低抑菌浓度的值可以确定为：
i.生长速率与抗生素浓度相关性在最高斜率点的切线的交叉(Chorianopoulos,N.G.,Lambert,R.J.W.,Skandamis,P.N.,Evergetis,E.T.,Haroutounian,S.A.和Nychas,G.-J.E.(2006),A newly developed assay to study the minimum inhibitoryconcentration of Satureja spinosa essential oil.Journal of AppliedMicrobiology,100:778–786.doi:10.1111/j.1365-2672.2006.02827.x；Lambert,R.J.W.和Pearson,J.(2000),Susceptibility testing:accurate and reproducible minimuminhibitory concentration(MIC)and non-inhibitory concentration(NIC)values.Journal of Applied Microbiology,88:784–790.doi:10.1046/j.1365-2672.2000.01017.x；Lambert,R.J.W.和Lambert,R.(2003),A model for the efficacyof combined inhibitors.Journal of Applied Microbiology,95:734–743.doi:10.1046/j.1365-2672.2003.02039.x)。
ii.增长率(数据中的线性趋势)低于给定阈值的最低可检测到的抗生素浓度。
生长速率μ估计的不准确度σμ等于
其中σ是仪器高频噪声的标准偏差。
这意味着，定性或定量的敏感性确定的精确度(即，线性趋势α估计的标准偏差σα)仅取决于用于从减法得到的差值的分布的读数数目和来自测量装置的高频噪声的标准偏差σ。此外，它与
成比例，这意味着，与现有技术的通常AST方法(例如最小二乘法，其中比例因子为
)相比，接种微生物样品的定性或定量敏感性确定的精确度随着读数数目的增加而增加得更快。
本发明的方面也适用于不以恒定频率记录读数的情况。以非恒定频率获取读数的一个实例是读数分布在数目M个集合之间的情况。所述集合被定义为全部连续读数的子集，获取属于同一集合的连续读数之间的时间间隔值具有相同的分布。每个集合包括数目Mi个读数，其中
它是所有集合中读数的总数。获取属于第i个集合的连续读数之间的平均时间间隔为δti。获取第i个集合的第一个读数的时间为Ti。因此，获取第i个集合的第j个读数的时间tij为tij＝T0+Ti+δti·j。
在这种情况下，系列读数的斜率α的估值
的公式：
以及不准确度σα可以在数学上推导如下：
如果记录量的增加很小，那么可以由线性函数来对其进行近似。因此，每个读数可以被近似为实验设置的高斯高频噪声(即噪声的频率f噪声高于获取属于任意所述集合读数的频率
其中i∈<1；M>)、线性趋势和描述培养基背景的函数f背景之和。
数学上，如果来自培养基的背景变化可以忽略不计，即f背景(t)≈C＝常数，那么每个读数可以用下述加和描述：xij＝N(0,σ)+α·(T0+Ti+δti·j)+C，其中α是数据中线性趋势的斜率，并因此是培养中的微生物生长的量度，σ是高频噪声的标准偏差，i是读数所属的集合的索引，j是读数在该集合中的编号(因此xij代表第i个集合的第j个读数)，δti是属于第i个集合的连续读数之间的时间间隔，T0是实验的开始时间，T0是获取属于第i个集合的读数的开始时间，并且C是描述培养基背景的常数。符号N(μ,σ)被用于表示正态(或高斯或高斯或拉普拉斯-高斯)分布，其中μ是分布的平均值，σ是分布的标准偏差，并且σ2是分布的方差。因此，每个读数都可以被视为一个具有平均值α·(T0+Ti+δti·j)+C和标准偏差σ的随机变量：xij～N(α·(T0+Ti+δti·j)+C,σ)。
从一个读数减去另一个读数的结果也是一个随机变量。每个读数都可以看作是信号的真实(“平均值”)值和例如来自实验装置的高频噪声的偏差的总和。因此，对于这种减法的结果，其平均值等于读数平均值之差，并且标准偏差等于
(Bennett Eisenberg和Rosemary Sullivan,Why is the Sum of Independent Normal Random VariablesNormal,Math.Magazine,2008,Vol.81,p 362-366)。因此减法的结果由以下等式给出：
如果两个读数属于同一集合(其索引为i，即i′＝i)，那么然后两个索引为j和j′＝j+k的读数相减的结果由记录所述读数之间的时间差tij′-tij＝δti(j′-j)＝δtik归一化，由
给出，并且是随机变量：
对于固定值k，属于第i个集合的mi个读数的所有减法的结果ηik的总和由以下等式给出：
并且也是随机变量
对于所有k值，属于第i个集合的mi个读数的所有减法的结果ηik的总和由以下等式给出：
并且是随机变量
因此，对于属于同一库的所有读数对，所有减法ηik的总和等于
并且是随机变量
如果属于第i个库的读数的数目mi对于任意的i是恒定的，即
并且获取属于第i个库的连续读数之间的时间间隔δti对于任意的i是恒定的，即
则此分布可以被简化为：
如果两个读数属于不同集合(其索引为i和i′)，那么然后两个索引为j(即第i个集合中的第j个读数)和j′(即第i′个集合中的第j′个读数)的读数相减的结果由记录所述读数之间的时间差ti′j′-tij＝Ti′-Ti+δti′·j′-δti·j＝ΔTii′+δti′·j′-δti·j归一化，由
给出，并且是随机变量：
所有属于第i个集合的mi个读数与属于第i′个集合的第j′个读数的所有相减的ηi′j′ij的结果的总和
也是随机变量
所有属于第i个集合的mi个读数与所有属于第i′个集合的mi′个读数的所有相减的ηi′j′ij的结果的总和
也是随机变量
在一些实际应用中，如果从连续集合开始收集读数之间的时间间隔ΔTii′＝Ti′-Ti大于获取属于单个集合的所有读数的时间δti·mi，即ΔTii′＞＞δti·mi，是特别有利的。
在这种情况下，求和ΔTii′+δti′·j′-δti·j可以近似为ΔTii′，因此所有属于第i个集合的mi个读数与所有属于第i′个集合的mi′个读数的所有相减的ηi′j′ij的结果的总和
可以被描述为：
如果连续集合之间的时间间隔ΔT是恒定的，即或任意的ΔTi(i+1)＝ΔT，则求和等于：
上面的求和涵盖了属于索引为i的一个集合的读数与属于索引为i′的集合的读数的所有归一化的相减，其中i≠i′。因此，对于不同集合的所有对，来自一个集合的读数与来自另一个集合的读数的所有相减的总和由以下给出：
这里假设集合的索引i越高，它包含的读数越晚(即
)。
对于不同集合的所有对，来自一个集合的读数与来自另一个集合的读数的所有相减的总和是随机变量，其有以下分布给出：
如果属于第i个库的读数的数目mi对于任意的i是恒定的，即
并且索引i’和i的差被l＝i′-i替代，则此分布可以被简化为
如前所示，这可以进一步被简化为
已经计算了属于不同库的所有读数对的所有相减的和，以及属于同一库的所有读数对的所有相减的和，就可以从全部n个读数中计算出所有
个读数对的归一化相减的和。
所有读数对的所有相减之和等于：
它也是随机变量的和，因此它也是随机变量：
因此，n个读数中的任意两个的平均归一化减法(进行
次减法)具有以下分布：
因此，计算平均归一化减法提供了标准偏差为
的线性趋势α的估计。
生长速率μ估计的不准确度σμ等于
其中σ是仪器高频噪声的标准偏差。
这意味着，定性或定量敏感性确定的精确度(即，线性趋势α估计的标准偏差σα)仅取决于用于计算减法的分布的读数的数目和分布和来自测量装置的高频噪声的标准偏差σ。
另一个以非恒定频率获取读数的实例是，获取每个读数的时间由读数数目的任意(arbitral)单射函数决定。因此，获取第i个读数的时间为ti＝T0+f(i)。
在这种情况下，系列读数的斜率α的估值
的公式：
以及不准确度σα可以在数学上推导如下：
如果记录量的增加很小，那么可以由线性函数来对其进行近似。因此，每个读数可以被近似为实验设置的高斯高频噪声(即噪声的频率f噪声高于获取读数的最高频率
其中i∈<1；n>)、线性趋势和描述培养基背景的函数f背景之和。
数学上，如果来自培养基的背景变化可以忽略不计，即f背景(t)≈C＝常数，那么每个读数可以用下述加和描述：xi＝N(0,σ)+α·(T0+f(i))+C，其中α是数据线性趋势的斜率，并因此是培养中的微生物生长的量度，σ是高频噪声的标准偏差，i是读数的索引，T0是实验的开始时间，f(i)是获取读数的开始时间，并且C是描述培养基背景的常数。符号N(μ,σ)被用于表示正态(或高斯或高斯或拉普拉斯-高斯)分布，其中μ是分布的平均值，σ是分布的标准偏差，并且σ2是分布的方差。因此，每个读数都可以被视为一个具有平均值α·(T0+f(i))+C和标准偏差σ的随机变量：xi～N(α·(T0+f(i))+C,σ)。
从一个读数减去另一个读数的结果也是一个随机变量。每个读数都可以看作是信号的真实(“平均值”)值和例如来自实验装置的高频噪声的偏差的总和。因此，对于这种减法的结果，其平均值等于读数平均值之差，并且标准偏差等于
(Bennett Eisenberg和Rosemary Sullivan,Why is the Sum of Independent Normal Random VariablesNormal,Math.Magazine,2008,Vol.81,p 362-366)。因此减法的结果由以下等式给出：
然后两个索引为i和j的读数相减的结果由记录所述读数之间的时间差tj-ti＝f(j)-f(i)归一化，由
给出，并且是随机变量：
对于所有i和j值(其中j≠i)，n个读数的整个集合的所有减法的结果ηij的总和由以下等式给出：
并且是随机变量
因此，n个读数的集合中的任意两个的平均归一化减法(进行
次减法)具有以下分布：
最后，减法得到的平均归一化差值的分布等于
因此，从减法的平均归一化差值的计算中提供的线性趋势α估计的标准偏差取决于获取第i个读数的任意(用户定义的)函数f(i)并等于
如果函数f(i)也是随机变量，例如f(i)＝T0+δt·i+N(0,σt)，即获取连续读数之间的时间间隔Δf＝f(i+1)-f(i)是具有恒定的预期(平均)值δt和标准偏差σt的随机变量：Δf～N(δt,σt)，那么然后两个索引为i和j的读数相减的结果由记录所述读数之间的时间差
归一化(Bennett Eisenberg和Rosemary Sullivan,Why is the Sum of Independent Normal Random VariablesNormal,Math.Magazine,2008,Vol.81,p 362-366)，由
给出。
在本发明的实际应用中，总实验时间过程中信号的增加与来自测量装置的高频噪声的标准偏差值σ相当。此外，在实际应用中，获取连续读数之间的时间间隔值的相对分布
小于100％。因此，乘积ασt的平均值比来自测量装置的高频噪声的标准偏差值σ低n倍，其中n是读数的数目。由于优选的读数数目n大于12，两个读数相减的结果的标准偏差的增加小于1％。
因此，在获取连续读数之间存在随机时间间隔的情况下，两个读数相减的平均归一化差值的分布可以近似为在恒定时间间隔的情况下的两个读数相减的平均归一化差值的分布，即可以近似为
因此，由减法计算平均归一化差值，可提供标准偏差为
的线性趋势α的估值。
生长速率μ估计的不准确度σμ等于
其中σ是仪器高频噪声的标准偏差。
这意味着，定性或定量的敏感性确定的精确度(即，线性趋势α估计的标准偏差σα)仅取决于用于减法的差值的分布的读数数目和来自测量装置的高频噪声的标准偏差σ。此外，它与
成比例，这意味着，与现有技术的通常AST方法(例如最小二乘法，其中比例因子为
)相比，接种微生物样品的定性或定量敏感性确定的精确度随着读数的增加而增加得更快。
本发明的方面特别有利，因为本发明的方法和系统有助于在其中由于微生物群体生长引起的测量信号值的变化小于由于测量装置的高频噪声引起的信号值的变化的微生物生长阶段，进行n个测量的至少一部分。因此，本发明的方法允许比标准的现有技术的抗菌剂敏感性试验更早地确定微生物的定性和定量敏感性。特别地，本发明的方法是优选的，其中步骤e)中的测量在其中由于微生物生长导致的测量信号的增加等于或小于测量装置的高频噪声的3倍，优选等于或小于测量装置的高频噪声的2倍，更优选等于或小于测量装置的高频噪声的1倍的微生物生长阶段进行。因此，测量可以在EUCAST和CLSI各自的指南中规定的整个培养时间内进行，但是根据优选实施方案，测量也可以在小于通常的培养时间(对于细菌而言，大约16小时)，即微生物生长的时间内进行，其中由于微生物生长导致的测量信号的增加等于或小于测量装置的高频噪声的3倍，优选等于或小于测量装置高频噪声的2倍，更优选等于或小于测量装置高频噪声的1倍。
根据本发明的第一方面，线性趋势的一个或多个斜率α可以优选地通过计算作为测量装置的高频噪声的标准偏差σ和连续读数之间的时间间隔δt的函数的读数的最小数目n，以预定的标准偏差σα来估计。
为了计算读数的最小数目n，必须知道仪器高频噪声的标准偏差σ和连续读数之间的时间间隔δt。
计算可以从确定由n个读数的集合的分析提供的线性趋势α估计的最大允许标准偏差σα开始。
所述值σα决定了一个或多个线性趋势α评估的不准确度，这等于读数相对于时间的一阶导数
这间接决定了物理或生物系统的行为。读数的值x(即样品的物理或化学性质，例如光散射/透射性质、吸光度、光密度、浊度、粘度、压力、电量等)与目的实际参数y(即细菌培养物密度、分析物浓度、微生物数目等)之间的关系由双射校准函数f:x＝f(y)给出。所述参数α是读数系列的斜率，等于
因此它还与目的参数相对于时间的一阶导数
(即生长速率μ)有关，因为以下等式：
其中
并且
它可以改写为:α＝f′(y)·μ。如果f(y)是线性函数，则α和μ之间的关系简化为简单的线性缩放。
最大允许标准偏差σα可从增长率μ估计的最大允许标准偏差σμ计算得出：σα＝|f′(y)|·σμ。
知道校准函数x＝f(y)并确定最大允许标准偏差σμ和σα后，可以转换上一小节中导出的标准偏差α的公式，并使用以下等式计算n的最小值：
其中n>12，σ>0，σα>0，σμ>0，并且f′(y)≠0。
n的值决定了为了用所要求的最大允许标准偏差σμ评估生长率μ而必须采用的读数的最小数目。读数的最小数目n的实施方案是13或更多读数、100或更多读数、1000或更多读数、5000或更多读数、10000或更多读数、或100000或更多读数。获取的读数越多，频率增加得越多，即两个连续读数之间的时间间隔可以缩短，因此，整个测量时间可以保持得低，优选在4小时或更短的范围内。此外，可以通过增加读数的数目n和频率f来提高精确度。
通过使用两个或更多个隔室，优选100个或更多个隔室，更优选1000个或更多个隔室，可以进一步提高本发明方法的精确度，所述隔室包括相同的测试试验。在这方面，多于一个的载体可以顺序地或同时地，优选同时地用于本发明的方法。然后，在本发明方法的步骤e)中，通过将各自测试试验的分布进行平均来估计线性趋势的一个或多个斜率α，所述分布为一对读数值{xi}和{xj}(其中j>i)的成分相减的差值除以获取索引为i和j的读数之间的时间间隔δtij的分布，由此将在相应记录时间{ti}的n个读数值{xi}的部分或全部，但是至少13个或更多个的读数值{xi}，用于所述分布。在例如载体包含10种不同浓度的抗菌剂或抗菌剂组合的情况下，一个或多个载体的1/10th隔室可以包含相同的测试试验。
可以将本发明的第一方面的前述实施方案全部组合。特别地，本发明第一方面的不同优选实施方案可以相互组合。
包括与本发明第一方面相关的优选实施方案的组合的所有前述实施方案也可以用于本发明的第二方面。
本发明的第二方面涉及一种使用液体培养基稀释法进行表型抗菌剂敏感性试验(AST)的快速抗菌剂敏感性试验系统，所述系统包括：
a)适于容纳至少一个载体的培养组件，所述载体具有一个或多个隔室用于接收在生长培养基中稀释的微生物接种物样品，其中所述隔室或所述隔室的至少一部分分别包含单一抗菌剂或抗菌剂的组合，使得每个隔室都容纳各自的测试试验，其中所述培养组件被配置为在所述一个或多个隔室中提供所述一个或多个测试试验的培养和/或测量环境，
b)询问读取组件，其包括被配置为在一个或多个载体的培养期间询问和读取所述一个或多个测试试验的询问装置和测量装置，其中所述询问读取组件便于i)对于所述一个或多个测试试验中的每一个，以恒定或不恒定的频率f，对源自接种微生物的化学或物理性质的信号进行至少n次测量，其中所述信号表示在测量的测试试验中微生物数目的基本上单调的函数，以及ii)在相应的记录时间{ti}读取相应的值{xi}，其中i表示测量的索引号，由整数1至n表示，并且其中n表示13个或更多个测量的全整数，以及
c)计算组件，其包括一个或多个处理器和一个或多个存储指令的计算机可读介质，所述指令在被所述一个或多个处理器执行时使得所述一个或多个处理器执行操作，所述操作包括i)从询问读取组件接收读数的数目n、值{xi}以及相应的记录时间{ti}，以及ii)作为分布的函数，估计数据中线性趋势的一个或多个斜率α，所述分布为一对读数值{xi}和{xj}(其中j>i)的成分相减的差值除以获取索引为i和j的读数之间的时间间隔δtij的分布，由此将在相应记录时间{ti}的n个读数值{xi}的部分或全部，但是至少13个或更多个读数值{xi}，用于所述分布，以及iii)作为线性趋势的一个或多个斜率α的函数，确定所述接种微生物对单一抗菌剂或抗菌剂组合的定性或定量敏感性。
如本发明的第一方面所公开的，培养组件可以适于同时包括一个以上的载体，优选10个或更多，或100个或更多。这可以通过现有技术提供的合适装置来实现，例如适于容纳至少一个载体，优选10个或更多，或者100个或更多个载体的嵌套组件，所述载体分别具有一个或多个隔室。在多个载体的情况下，所述载体可以优选为微流体芯片，更优选为波兰专利申请PL 425106和PL 425107中公开的微流体芯片。
如本发明的第一方面所公开的，培养组件被配置成为包含在其中的一个或多个载体的测试试验提供合适的培养和/或测量环境。在本发明的上下文中，表述“合适的培养环境”是指提供了微生物生长的最佳条件，例如，温度在30-40℃的范围，优选为在35-37℃，气体交换，特别是为好氧微生物提供氧气等。合适的培养环境可以由培养组件和/或载体提供，例如微流体芯片，优选如专利申请425107中所述的微流体芯片。在本发明的上下文中，表述“合适的测量环境”是指培养组件和载体允许询问包含在载体的隔室中的一个或多个测试试验，并测量基本上单调相关的性质/信号。在测量光(散射光、荧光)的强度的情况下，优选将培养组件与不是由测试试验发射的光分开，换言之，将测试试验保持黑暗。
根据本发明第二方面的一个实施方案，询问读取组件包括询问装置和测量装置，其被配置为在一个或多个载体的培养期间对一个或多个测试试验进行询问和读取。特别地，询问读取组件可以优选地包括光学组件，所述光学组件被配置为在培养期间询问和读取测试试验的以下的至少一个：光(例如荧光或散射光)的强度；光密度、吸光度、浊度、光反射或其他光学性质；电导率、电容或其他电性质；微生物代谢涉及的气体分压、粘度或营养吸收。
所述询问读取组件有助于，i)对于一个或多个测试试验中的每一个，以恒定或不恒定的频率f，对源自接种微生物的化学或物理性质的信号进行至少n次测量，其中所述信号表示在测量的测试试验中微生物数目的基本上单调的函数，以及ii)在相应的记录时间{ti}读取相应的值{xi}，其中i表示测量的索引号，由整数1至n表示，并且其中n表示13个或更多个测量的全整数。
表1、表2和表3示出了以要求的分辨率评估线性趋势的一个或多个斜率所需的读数的最小数目，其被定义为线性趋势估计的标准偏差乘以实验总时间与测量系统高频噪声的比率。所述分辨率可以优选地以95％的置信度(表1)、90％的置信度(表2)和70％的置信度(表3)来实现。这些表格示出了在给定的实验时间内，以要求的分辨率评估趋势所需的信号的优选恒定频率值。
表1：
表1示出了以给定的具有95％置信度(k＝3)的分辨率评估数据线性趋势所需的读数的最小数目nmin。还给出了对于优选的实验次数获取读数的频率。
表2：
表2示出了以给定的具有90％置信度(k＝2)的分辨率评估数据线性趋势所需的读数的最小数目nmin。还给出了对于优选的实验次数获取读数的频率。
表3：
表3示出了以给定的具有70％置信度(k＝1)的分辨率评估数据线性趋势所需的读数的最小数目nmin。还给出了对于优选的实验次数获取读数的频率。
已经针对本发明的第一方面详细讨论了分析函数，包括优选实施方案的组合的实施方案也适用于本发明的第二方面。
此外，本发明第二方面的快速抗菌剂敏感性试验系统包括计算组件。该计算组件包括一个或多个处理器和一个或多个存储指令的计算机可读介质，所述指令在被所述一个或多个处理器执行时使得所述一个或多个处理器执行操作，所述操作包括i)从询问读取组件接收读数的数目n、值{xi}以及相应的记录时间{ti}，以及ii)作为分布的函数，估计数据中线性趋势的一个或多个斜率α，所述分布为一对读数值{xi}和{xj}(其中j>i)的成分相减的差值除以获取索引为i和j的读数之间的时间间隔δtij的分布，由此将在相应记录时间{ti}的n个读数值{xi}的部分或全部，但是至少13个或更多个读数值{xi}，用于所述分布，以及iii)作为线性趋势的一个或多个斜率α的函数，确定所述接种微生物对单一抗菌剂或抗菌剂组合的定性或定量敏感性。
所述计算装置可以由例如计算机、笔记本电脑、智能设备提供，或者在本发明的组件连接到互联网的情况下，由基于互联网的服务器提供，特别是基于互联网的云计算网络。
同样，已经针对本发明的第一方面详细讨论了分析函数，包括优选实施方案的组合的实施方案也适用于本发明的第二方面。
根据本发明第二方面的一个实施方案，所述计算组件还被配置成在每10次测量之后，优选地在每5次测量之后，更优选地在每次单次测量之后，执行估计和确定操作。估计和确定操作被执行得越快，结果被提供得越快，特别是它们可以被实时提供。然而，随着估计和确定操作的增加，例如在每次单次测量之后，处理量增加，因此需要适当的处理设备用于本发明的系统。
根据本发明第二方面的另一个优选实施方案，所述计算组件还被配置为通过计算作为测量装置的高频噪声的标准偏差σ和连续读数之间的时间间隔δt的函数的读数的最小数目n，以预定的标准偏差σα来估计线性趋势的一个或多个斜率α。已经针对本发明的第一方面详细描述了所述估计，并且其所有包括优选实施方案的组合的实施方案也适用于本发明的第二方面。
根据本发明的第三方面，公开了本发明第二方面的使用液体培养基稀释法进行表型抗菌剂敏感性试验(AST)的本发明的快速抗菌剂敏感性试验系统在确定接种微生物的定性和定量敏感性中的用途。包括本发明第一和第二方面的优选实施方案的组合的所有实施方案也适用于本发明的第三方面。
除了本发明的上述公开方面，即根据本发明第一方面的方法步骤e)和f)的估计和确定分析用于评估微生物生长的用途，本发明的分析方法还可以用于监测缓慢过程，该缓慢过程的进展基本上与可测量的性质(信号)单调相关，例如监测i)(缓慢)化学反应的进展，ii)部件特别是机械部件的磨损，和iii)罕见事件，例如核反应中的粒子计数。本领域技术人员将能够容易地根据所使用的其他过程来修改相应的环境。包括如本发明的第一和第二方面阐述的估计和确定的本发明的分析方法也可以应用于其他方法。
本发明还涉及用于快速测试抗菌剂敏感性的方法和系统，其中作为读数值的线性趋势的一个或多个斜率α的函数，确定接种的微生物对抗菌剂或抗菌剂组合的定性和定量的敏感性。然而，它也可以被用于评估所记录的数据的任何增加，并且如果增加缓慢并且测量装置的高频噪声高，则特别有利。例如，在机械部件或样品的体积和/或重量损失较低的情况下，本发明可用于帮助测量机械部件的磨损率(Tony L.Schmitz Jason E.ActionDavid L.Burris John C.Ziegert W.Gregory Sawyer,Wear-Rate UncertaintyAnalysis,Journal of Tribology,Vol.126,OCTOBER 2004,802-807,DOI:10.1115/1.1792675,Niklas Axén,Sture Hogmark,Staffan Jacobson,Friction and WearMeasurement Techniques,2001,http://home.ufam.edu.br/berti/nanomateriais/8403_PDF_CH13.pdf)。由于这种减少通常与测试周期数成线性关系，因此可以使用本发明进行评估。由于读数数目(测试周期)的缩放
这种测量的不确定性低于典型方法(即同一实验多次重复的平均结果的分布)。
本发明的另一个应用是监测会引起样品重量改变的缓慢的化学反应(包括生锈)的进程，或监测早期的化学反应，即监测聚合酶链反应的进程(Bartlett,J.M.S.；Stirling,D.(2003)."A Short History of the Polymerase Chain Reaction".PCRProtocols.Methods in Molecular Biology.226(2nd ed.).pp.3–6,A.A.Morley.DigitalPCR:A brief history.Biomolecular Detection and Quantification,1(1):1-2,2014,J.F.Huggett,S.Cowen,C.A.Foy,Considerations for digital PCR as an accuratemolecular diagnostic tool,Clinical Chemistry,61(1),79–88,2015)或环介导的等温扩增(Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T(2000)."Loop-mediated isothermal amplification of DNA".Nucleic Acids Res.28(12):E63)反应，所述反应可有助于核酸的检测和定量。
下面基于附图和示例性实施方案描述本发明，这些附图和示例性实施方案仅作为示例，不应限制本保护权利的范围。
附图的详细描述：
图1示出了在抗菌剂敏感性试验中微生物样品的示例性生长曲线(在实施例1中进一步描述)，其中虚线表示一种生长阶段的结束，在该生长阶段中由于微生物群体生长引起的测量信号值的变化小于由于测量装置的高频噪声引起的信号值的变化。实验性地测量了生长曲线。将含有微生物和抗生素的液体培养基稀释液在波兰专利申请PL 425106和PL425107中公开的微流控芯片的隔室中培养，并在培养期间将其暴露于光。用数码相机测量散射光的强度。散射光的总强度通过对对应于隔室面积的像素的光强度进行积分来评估。
图2示出了由于微生物生长导致的信号值(读数值)的增加，以测量装置的高频噪声的倍数显示，其中相对于测量装置的高频噪声信号的1倍、2倍和3倍增加的点用虚线表示。有关高频噪声的增加越大，就越有把握评估信号的增加。
图3示出了使用本发明的方法使用所有测量值针对图1所示的示例性生长曲线计算的线性趋势α的值，其中虚线表示一种生长阶段的结束，在该生长阶段中由于微生物群体生长而引起的测量信号值的变化小于由于测量装置的高频噪声引起的信号值的变化。线性趋势α被计算为两个读数相减(较晚的读数减去较早的读数)除以获取所述两个读数之间的时间间隔，再取平均值，所述两个读数来自从实验开始记录的所有读数对。
图4示出了使用本发明的方法使用所有测量值针对图1所示的示例性生长曲线计算的趋势α的相对不确定度(估计的标准偏差)，其中虚线表示一种生长阶段的结束，在该生长阶段中由于微生物群体生长而引起的测量信号值的变化小于由于测量装置的高频噪声引起的信号值的变化。线性趋势α被计算为两个读数相减(较晚的读数减去较早的读数)除以获取所述两个读数之间的时间间隔，再取平均值，所述两个读数来自从实验开始记录的所有读数对。所述不确定度被计算为相减结果的平均值的估计的标准偏差。
图5示出了使用本发明的方法以及最后进行的2000次测量针对图1所示的示例性生长曲线计算的线性趋势α的值，其中虚线表示一种生长阶段的结束，在该生长阶段中由于微生物群体生长而引起的测量信号值的变化小于由于测量装置的高频噪声引起的信号值的变化。线性趋势α被计算为两个读数相减(较晚的读数减去较早的读数)的结果除以获取所述两个读数之间的时间间隔，再取平均值，所述两个读数来自从最后记录的2000个读数创建的所有对。
图6示出了使用本发明的方法以及最后进行的2000次测量计算的趋势α的相对不确定度(估计的标准偏差)，其中虚线表示一种生长阶段的结束，在该生长阶段中由于微生物群体生长而引起的测量信号值的变化小于由于测量装置的高频噪声引起的信号值的变化。线性趋势α被计算为两个读数相减(较晚的读数减去较早的读数)的结果除以获取所述两个读数之间的时间间隔，再取平均值，所述两个读数来自从最后记录的2000个读数创建的所有对。所述不确定度被计算为相减结果(差值)的平均值的估计的标准偏差。
图7示出了趋势的估计的斜率α的标准偏差对读数数目的相关性。该图是通过蒙特卡罗模拟(Monte-Carlo simulations)获得的，其中每个点(估计的标准偏差)都是根据相同输入条件下的1000次重复模拟计算的。不确定性的行为类似于通过分析获得的公式，并随具有函数
的读数数目n进行缩放。
图8示出了趋势的估计斜率α的标准偏差对测量设备的高频噪声的相关性。该图是通过蒙特卡罗模拟(Monte-Carlo simulations)获得的，其中每个点(估计的标准偏差)都是根据相同输入条件下的1000次重复模拟计算的。不确定性的行为类似于通过分析获得的公式，并随仪器高频噪声σ的标准偏差线性缩放。
图9示出了使用不同抗菌剂浓度的抗菌剂敏感性试验的独立测试试验的十条生长曲线，以确定最低抑菌浓度。通过实验记录生长曲线，并且所述程序在实施例1中描述。具有符号为c1至c10的抗生素的浓度在实施例1的表4中描述。由于测量装置的高频噪声，曲线在培养开始时(最初4小时)重叠。
图10示出了使用不同抗菌剂浓度的抗菌剂敏感性试验的独立测试试验的十条生长曲线，以确定最低抑菌浓度。通过实验记录生长曲线，并且所述程序在实施例1中描述。散射光强度轴上的刻度变窄，绘制简单的移动平均曲线(之前200个读数的平均值)来区分增长曲线，而不是记录的信号。具有符号为c1至c10的抗生素的浓度在实施例1的表4中描述。
图11示出了使用不同抗菌剂浓度的抗菌剂敏感性试验的独立测试试验的三条生长曲线，以确定最低抑菌浓度。通过实验记录生长曲线，并且所述程序在实施例1中描述。具有符号为c4、c6和c7的抗生素的浓度在实施例1的表4中描述。由于测量装置的高频噪声，曲线重叠。
图12示出了如实施例1中所述使用现有技术的方法通过实验确定的最低抑菌浓度(MIC)值的变化。在培养5小时后，当正增长曲线与负增长曲线有明显区别时，最低抑菌浓度值会饱和。
图13示出了如实施例1中所述使用本发明通过实验确定的MIC值的变化。在培养3小时后，当正增长曲线仍无法与负增长曲线区分开时，最低抑菌浓度值会饱和。
实施例：
实施例1
将用于快速测试抗菌剂敏感性的本发明用于定量确定环丙沙星的最低抑菌浓度。准备了抗菌剂敏感性试验，以测试EUCAST和CLSI标准(欧洲抗菌剂敏感性试验委员会。EUCAST建议的用于MIC测定和纸片扩散法的常规和扩展的内部质量控制。版本8.0，2018。http://www.eucast.org；抗菌剂敏感性试验性能标准，第22版；CLSI文档M100-S22 Wayne，PA：临床和实验室标准协会；2012)所要求的抗生素浓度范围。
所述评估按以下步骤执行。
1.在适当的液体培养基(即阳离子调节的Mueller-Hinton II液体培养基)中制备了抗生素(环丙沙星)的系列稀释液；所述稀释液是两倍的(即0.25；0.5；1.0；2.0；4.0；8.0mg/l)，并且覆盖了EUCAST和CLSI标准中规定的抗生素浓度范围。制备的系列中抗生素的浓度是目标浓度的两倍，因为它们随后与细菌(大肠杆菌ATCC 25922)样品以1:1的比例混合。抗生素的目标浓度如下表4所示。
| 稀释液的符号 | 浓度 |
| c1: | 0.0009765625mg/l |
| c2: | 0.001953125mg/l |
| c3: | 0.00390625mg/l |
| c4: | 0.0078125mg/l |
| c5: | 0.015625mg/l |
| c6: | 0.03125mg/l |
| c7: | 0.0625mg/l |
| c8: | 0.125mg/l |
| c9: | 0.25mg/l |
| c10: | 0.5mg/l |
表4示出了实验中使用的抗生素(环丙沙星)的浓度。制备密度为106CFU/ml(菌落形成单位/ml)的微生物(细菌)悬浮液。
2.将等份(即100μl)的微生物悬浮液和所选的抗生素稀释液在允许测量样品的光学性能的多孔板(即
96Well
微孔板，https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls3340，CorningTMCostarTMFlat Bottom Cell CulturePlates，https://www.fishersci.com/shop/products/costar-cell-culture-plates-17/0720090)的孔中混合。对于每种浓度的抗生素，制备8次重复。
3.将所述板在35℃下培养16h，并在实验进程中记录由每个孔的内容物散射的光的强度。记录的生长曲线如图9至11所示。
4.对于每个孔，记录一系列读数，然后按照以下步骤同时独立地分析每个系列的读数：
a.对于每两个记录的值，计算从后一个值减去前一个值的差值，再除以两次读数之间的时间间隔。
b.在实验进行期间，针对所记录的读数的所有对，计算差值的平均值α。它是以任意单位计算的。计算的平均值等于记录数据的线性趋势，即所述系列读数的斜率。
c.假设记录的信号值的增加是由细菌的生长引起的，因此，细菌的生长速率被假设为等于所述系列读数的斜率。
d.数据中线性趋势的计算值作为抗生素浓度的函数给出。
e.将所述函数用双指数Gompertz函数拟合(Zwietering,M.H.；Jongenburger,I.；Rombout,F.M.；van't Riet,K.(1990),"Modeling of the Bacterial Growth Curve",Applied and Environmental Microbiology,56(6):1875–1881)。
f.最低抑菌浓度的值被确定为：生长速率与抗生素浓度相关性在最高斜率点的切线的交叉(Chorianopoulos,N.G.,Lambert,R.J.W.,Skandamis,P.N.,Evergetis,E.T.,Haroutounian,S.A.和Nychas,G.-J.E.(2006),A newly developed assay to study theminimum inhibitory concentration of Satureja spinosa essential oil.Journal ofApplied Microbiology,100:778–786.doi:10.1111/j.1365-2672.2006.02827.x；Lambert,R.J.W.和Pearson,J.(2000),Susceptibility testing:accurate andreproducible minimum inhibitory concentration(MIC)and non-inhibitoryconcentration(NIC)values.Journal of Applied Microbiology,88:784–790.doi:10.1046/j.1365-2672.2000.01017.x；Lambert,R.J.W.和Lambert,R.(2003),A model forthe efficacy of combined inhibitors.Journal of Applied Microbiology,95:734–743.doi:10.1046/j.1365-2672.2003.02039.x)，并与参考值进行比较。最低抑菌浓度的计算值及其时间演变如图13所示。
g.作为参考，使用现有技术方法计算最低抑菌浓度的值，即记录的信号的终点值。记录的信号的最后值也作为抗生素浓度的函数提供，以提供参考函数。
h.将参考函数用双指数Gompertz函数拟合(Zwietering,M.H.；Jongenburger,I.；Rombout,F.M.；van't Riet,K.(1990),"Modeling of the Bacterial Growth Curve",Applied and Environmental Microbiology,56(6):1875–1881)。
i.最低抑菌浓度的值被确定为：生长速率与抗生素浓度相关性在最高斜率点的切线的交叉(Chorianopoulos,N.G.,Lambert,R.J.W.,Skandamis,P.N.,Evergetis,E.T.,Haroutounian,S.A.和Nychas,G.-J.E.(2006),A newly developed assay to study theminimum inhibitory concentration of Satureja spinosa essential oil.Journal ofApplied Microbiology,100:778–786.doi:10.1111/j.1365-2672.2006.02827.x；Lambert,R.J.W.和Pearson,J.(2000),Susceptibility testing:accurate andreproducible minimum inhibitory concentration(MIC)and non-inhibitoryconcentration(NIC)values.Journal of Applied Microbiology,88:784–790.doi:10.1046/j.1365-2672.2000.01017.x；Lambert,R.J.W.和Lambert,R.(2003),A model forthe efficacy of combined inhibitors.Journal of Applied Microbiology,95:734–743.doi:10.1046/j.1365-2672.2003.02039.x)。最低抑菌浓度的计算值及其时间演变如图12所示。
前述实施例的各个特征可以单独创造性地与本发明的总体描述组合。
Claims (14)
1.一种使用液体培养基稀释法在表型抗菌剂敏感性试验(AST)中确定微生物接种物的定性或定量敏感性的计算机实施的方法，其特征在于，所述AST方法包括以下步骤或由以下步骤组成：
a)提供微生物接种物，并在适于液体培养基稀释法AST的培养基中稀释所述接种物，
b)提供载体，其包含一个或多个适于液体培养基稀释法AST的隔室，其中所述隔室或所述隔室的至少一部分分别包含单一的抗菌剂或抗菌剂的组合，
c)将步骤a)的包含稀释接种物的培养基样品分配到步骤b)的载体的隔室或隔室的至少一部分中，以使载体的一个或多个接种隔室包含各自的测试试验，
d)培养步骤c)的载体，所述载体包含各自的一个或多个测试试验，
e)在培养步骤d)期间，对于所述一个或多个测试试验中的每一个，以恒定或不恒定的频率f，对源自接种微生物的化学或物理性质的信号进行至少n次测量，其中所述信号表示在测量的测试试验中微生物数目的基本上单调的函数，并且在相应的记录时间{ti}读取相应的值{xi}，其中i表示测量的索引号，由整数1至n表示，并且其中n表示13个或更多个测量的全整数，
f)作为分布的函数，估计数据中线性趋势的一个或多个斜率α，所述分布为一对读数值{xi}和{xj}的成分相减的差值除以获取索引为i和j的读数之间的时间间隔δtij的分布，其中j>i，由此将在相应记录时间{ti}的n个读数值{xi}的部分或全部，但是至少13个或更多个的读数值{xi}，用于所述分布，以及
g)作为线性趋势的一个或多个斜率α的函数，确定接种微生物对单一抗菌剂或抗菌剂组合的定性或定量敏感性。
2.根据权利要求1所述的用于确定微生物接种物的定性或定量敏感性的计算机实施的方法，其中在步骤e)中，源自接种微生物的化学或物理性质的信号选自：光例如荧光或散射光的强度；光密度、吸光度、浊度、光反射或其他光学性质；电导率、电容或其他电性质；微生物代谢涉及的气体分压、粘度或营养吸收。
3.根据权利要求1或2所述的用于确定微生物接种物的定性或定量敏感性的计算机实施的方法，其中所述微生物选自由细菌、分枝杆菌和真菌组成的组。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用于确定微生物接种物的定性或定量敏感性的计算机实施的方法，其中所述频率f优选为1mHz或更大，更优选地f在10mHz至10Hz的范围中，甚至更优选地在100mHz至1Hz的范围中。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的用于确定微生物接种物的定性或定量敏感性的计算机实施的方法，其中步骤e)中的测量至少部分地在一种微生物生长阶段进行，在所述微生物生长阶段中由于微生物群体生长而引起的测量信号值的变化小于由于测量装置的高频噪声引起的信号值的变化。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的用于确定微生物接种物的定性或定量敏感性的计算机实施的方法，其中步骤e)中的测量在一种微生物生长阶段进行，在所述微生物生长阶段中由于微生物生长而引起的测量信号的增加等于或小于测量装置的高频噪声的3倍，优选等于或小于测量装置的高频噪声的2倍，更优选等于或小于测量装置的高频噪声的1倍。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的用于确定微生物接种物的定性或定量敏感性的计算机实施的方法，其中通过计算作为测量装置的高频噪声的标准偏差σ和连续读数之间的时间间隔δt的函数的读数的最小数目n，以预定的标准偏差σα来估计线性趋势的一个或多个斜率α。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的用于确定微生物接种物的定性或定量敏感性的计算机实施的方法，其中两个或更多个隔室，优选100个或更多个隔室包括相同的测试试验，并且步骤e)中的线性趋势的一个或多个斜率α是通过将各自测试试验的分布进行平均来估计的，所述分布为一对读数值{xi}和{xj}的成分相减的差值除以获取索引为i和j的读数之间的时间间隔δtij的分布，其中j>i。
9.一种使用液体培养基稀释法进行表型抗菌剂敏感性试验的快速抗菌剂敏感性试验系统，所述系统包括：
a)适于容纳至少一个载体的培养组件，所述载体具有一个或多个隔室用于接收在生长培养基中稀释的微生物接种物样品，其中所述隔室或所述隔室的至少一部分分别包含单一抗菌剂或抗菌剂的组合，使得每个接种的隔室都容纳各自的测试试验，其中所述培养组件被配置为在所述一个或多个隔室中提供一个或多个测试试验的培养和/或测量环境，
b)询问读取组件，其包括被配置为在所述一个或多个载体的培养期间询问和读取所述一个或多个测试试验的询问装置和测量装置，其中所述询问读取组件便于i)对于所述一个或多个测试试验中的每一个，以恒定或不恒定的频率f，对源自接种微生物的化学或物理性质的信号进行至少n次测量，其中所述信号表示在测量的测试试验中微生物数目的基本上单调的函数，并且ii)在相应的记录时间{ti}读取相应的值{xi}，其中i表示测量的索引号，由整数1至n表示，并且其中n表示13个或更多个测量的全整数，以及
c)计算组件，其包括一个或多个处理器和一个或多个存储指令的计算机可读介质，所述指令在被所述一个或多个处理器执行时使得所述一个或多个处理器执行操作，所述操作包括i)从询问读取组件接收读数的数目n、值{xi}以及相应的记录时间{ti}，以及ii)作为分布的函数，估计数据中线性趋势的一个或多个斜率α，所述分布为一对读数值{xi}和{xj}的成分相减的差值除以获取索引为i和j的读数之间的时间间隔δtij的分布，其中j>i，由此将在相应记录时间{ti}的n个读数值{xi}的部分或全部，但是至少13个或更多个读数值{xi}，用于所述分布，以及iii)作为线性趋势的一个或多个斜率α的函数，确定所述接种微生物对单一抗菌剂或抗菌剂组合的定性或定量敏感性。
10.根据权利要求9所述的快速抗菌剂敏感性试验系统，其中所述系统被配置为便于在一个或多个、优选10个或更多、更优选100个或更多个隔室中同时进行测试试验的多重测试。
11.根据权利要求9或10所述的快速抗菌剂敏感性试验系统，其中所述询问读取组件包括光学组件，所述光学组件被配置为在培养期间询问和读取测试试验的以下的至少一个：光例如荧光或散射光的强度；光密度、吸光度、浊度、光反射或其他光学性质；电导率、电容或其他电性质；微生物代谢涉及的气体分压、粘度或营养吸收。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的快速抗菌剂敏感性试验系统，其中所述计算组件还被配置为在每10次测量之后，优选地在每5次测量之后，更优选地在每次单次测量之后，执行估计和确定操作。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的快速抗菌剂敏感性试验系统，其中所述计算组件还被配置为通过计算作为测量装置的高频噪声的标准偏差σ和连续读数之间的时间间隔δt的函数的读数的最小数目n，以预定的标准偏差σα来估计线性趋势的一个或多个斜率α。
14.根据权利要求9-13中任一项所述的使用液体培养基稀释法进行表型抗菌剂敏感性试验(AST)的快速抗菌剂敏感性试验系统在确定接种微生物的定性和定量敏感性中的用途。
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